MIR-449 hemmer celledeling og er nedregulert i magekreft

MIR-449 hemmer celledeling og er nedregulert i magekreft
Abstract
Bakgrunn
Magekreft er den fjerde vanligste kreftformen i verden og den nest mest utbredte årsaken til kreft dødsfall. Utviklingen av magekreft er hovedsakelig forbundet med H. pylori
infeksjon som fører til et fokus i patologiske studier av bakteriell og miljømessige faktorer, og i mindre grad på den mekanistiske utvikling av tumoren. MicroRNAs er små ikke-kodende RNA-molekyler som er involvert i post-transcriptional genregulering. De er funnet gener som er involvert i forskjellige biologiske funksjoner og forandringer i mikroRNA ekspresjon har vært knyttet til patogenesen av mange ondartede sykdommer å regulere. Den aktuelle studien er fokusert på å identifisere microRNAs involvert i magekreftutvikling og å utforske sine mekanistisk relevans ved å karakterisere sine mål. Search Results
Invitrogen NCode miRNA microarrays identifisert MIR-449 til å bli redusert i en-åringen Gastrin
KO mus og i H. pylori
infiserte mage vev sammenlignet med vev fra villtype dyr. Veksthastighet for gastriske cellelinjer som over-uttrykker MIR-449 ble inhibert med 60% sammenlignet med kontroller. FACS-cellesyklusanalyse av MIR-449 over-uttrykkende celler viste en signifikant økning i sub-G en brøkdel indikativ for apoptose. ß-gal analyser indikerte en senescent fenotype av mage cellelinjer over-uttrykker Mir-449. Affymetrix 133v2 arrays identifisert GMNN
, MET, CCNE2, SIRT1 Hotell og CDK6
som Mir-449 mål. Luciferase analysene ble brukt til å bekrefte GMNN
, MET
, CCNE2 Hotell og SIRT1
som direkte mål. Vi viser også at MIR-449 overekspresjon aktivert p53 og dens nedstrøms mål p21 samt apoptose markører spaltes CASP3 og PARP. Viktigere, qPCR analyser viste et underskudd på MIR-449 uttrykk i kliniske mage svulster i forhold til normalt vev
. Konklusjoner
I denne studien dokumenterer vi et redusert uttrykk av MIR-449 i Gastrin
KO mus og ytterligere bekreftet sine tap i menneskelige mage svulster. Vi undersøkte funksjon av MIR-449 ved å identifisere sine direkte mål. Videre viser vi at MIR-449 induserer senescence og apoptose ved å aktivere p53 veien.
Bakgrunn
Magekreft er blant de fem mest vanlige kreftformer i verden og den nest mest utbredte årsaken til kreft-relaterte dødsfall [1] . Det er først og fremst, men ikke utelukkende, forårsaket av H. pylori-infeksjon
[2] som ikke alle av H. pylori
infiserte personer utvikler tumorer [3]. Andre faktorer som er involvert i utvikling av magekreft inkluderer graden og typen av den inflammatoriske respons [2], så vel som nivåene av Gastrin
hormon [4, 5]. Flere studier har vist at både hypergastrinemi [6, 7] og mangel på Gastrin [5] bidra til patogenesen av magekreft. Aklorhydri er et felles trekk ved musemodeller utsatt for å utvikle metaplasi og kreft [6, 8, 9]. Gastrin
knockout mus er achlorhydric [10], favoriserer en bakteriell magevekst [11, 12], og kroniske bakterielle mage infeksjoner føre til mage metaplasi som kan utvikle seg til magekreft [6, 12].
Siden deres oppdagelse microRNAs, har blitt funnet implisert i et svært bredt spekter av normale og patologiske prosesser [13]. MicroRNAs utøver sin regulerende funksjon posttranscriptionally ved å binde seg til delvis komplementære sekvens motiver, hovedsakelig 3 'UTR av mål- mRNA som resulterer i mRNA destabilisering og translasjonelle undertrykkelse [14]. Fra et biologisk synspunkt, er microRNAs utfordrende stedene å studere som de regulerer årskull av målgener, som ikke er lett identifisert. Fra et terapeutisk synspunkt, microRNAs er svært interessant som flere studier har vist kraft microRNAs som biomarkører og innledende prekliniske studier har fastslått at microRNAs kan terapeutisk målrettet in vivo [15].
Profilering studier har dokumentert mikroRNA deregulering i et bredt spektrum av sykdommer som inkluderer alle større kreft [16]. MicroRNAs sannsynlig påvirke tumorer prosesser på to nivåer. For det første, har flere studier etablert pro-onkogene eller kreftundertrykkende roller enkelt microRNAs fast knytte disse til kreft etiologi som eksemplifisert ved MIR-155, MIR-10b og MIR-21 [17-19]. Dernest, mikroRNA regelverket i seg selv ser ut til å ha svulst undertrykkende funksjoner som genetisk ablasjon av nøkkel mikroRNA BIOGENESIS faktorer, som dicer sterkt øke kreft mottakelighet [20] og tap av funksjon mutasjoner har blitt identifisert i viktige microRNAs prosesseringsfaktorer i humane tumorer [21-23].
i denne studien tar vi viktigheten av microRNAs i magekreft dra nytte av Gastrin
knockout mus modell og H. pylori
infeksjon av villtype mus. Vi identifiserer MIR-449 som signifikant nedregulert eller tapt i musemodeller av magekreft, samt i primære humane mage svulster. Identifikasjon av mRNA mål avslører at dette mikroRNA sannsynlig utøver svulst undertrykkende funksjon gjennom felles regulering av en kohort av kreft-assosiert celle-syklus regulatorer inkludert MET, GMNN, CCNE2, SIRT1, og HDAC1.
Metoder
Mus
Tre ulike aldersgruppene (12-16 uker, 1 år eller 1 ½ år) av villtype (wt) eller gastrin
knockout (KO) mus ble brukt. Alle mus var på et blandet 129 /SVJ, C57BL /6J bakgrunn, backcrossed minst fire ganger til C57BL /6J [12]. Musene ble holdt under spesifikke patogen-frie forhold og overvåket i henhold til Federation of European Laboratory Animal Science Foreninger anbefaling [24] med 12 timer lys, 12 timer mørke sykluser.
H. pylori
infeksjon
C57BL6 /J-mus (n = 10) ble inokulert med en ikke-mus-tilpasset klon av H. pylori
belastning 67:21, opprinnelig isolert fra en biopsi antral oppnådd fra et svensk kvinnelig med magesår. Belastningen er Vaca + og inneholder hele Cag patogenitet øya (PAI) med genetisk stabilitet i Cag PAI [25]. Musene ble inokulert hver andre dag (tre ganger) i løpet av en 5-dagers periode. DNA ble ekstrahert og analysert for tilstedeværelse av Helicobacter arter ved hjelp av en semi-nested PCR-denaturerende gradient-gel-elektroforese-analyse, som er spesifikt for slekten helicobacter, som tidligere beskrevet [26]. En matchende gruppe av ikke-infiserte C57BL6 /J-mus ble anvendt som kontroller.
Den mager av alle mus ble dissekert i fundus og antrum før RNA-ekstrahering. Alle dyreforsøk ble godkjent av danske Animal Welfare Committee (2005 /562-40) og den danske Skog og natur Agency (20010077355/6).
Mus antrum seksjoner
Mus ble avlivet ved halshugging. Antrum ble fjernet, vasket forsiktig i iskald PBS, frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C til RNA-ekstraksjon.
Kliniske prøver analyser
Biopsi fra magekreft og de tilstøtende normale vev ble oppnådd fra pasienter operert for magekreft ved Institutt for Gastrointestinal kirurgi, Rigshospitalet. Inkludering fant sted i juli til desember 2008 og alle pasienter forutsatt signert, informert samtykke (Etisk komité godkjenning H-B-2008-049) og danske Data Protection Agency (2008-41-2138). Biopsiene ble plassert i RNAlater (Ambion) i operasjonsrommet og deretter frosset ved -80 ° C inntil RNA-ekstraksjon.
RNA-ekstraksjon og qPCR analyser
RNA ble ekstrahert ved bruk av TRIzol (Invitrogen) i følge produsentens. miRNA uttrykket profilen ble vurdert ved hjelp Taqman miRNA analyser (Applied Biosystems) for HSA /nm-MIR-449a og b, HSA /nm-MIR-34a, b og c og rnu44 eller HSA /nm-MIR-191. Primer sekvenser for Affymetrix mål validering er oppført i annen fil 1, tabell S1.
Cell kultur
SNU638 og MKN74 ble dyrket i RPMI-1640 (Gibco) med 10% FBS (Hyclone), 100U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen) og inkubert ved 37 ° C i 5% CO 2. HCT116-celler (wt og p53 - /- ble dyrket i McCoys 5A (Gibco) med 10% FBS (Hyclone) og 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen) og inkubert ved 37 ° C i 5% CO <. sub> 2 HEK293 og MEF-celler (wt og p53 - /-) ble dyrket i DMEM (Gibco) med 10% FBS (Hyclone), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen) og inkubert ved 37 ° C med 5% CO 2.
miRNA forløpere og siRNA
miRNA forløpere ble kjøpt fra Ambion, HSA-MIR-449a (PM11521), HSA-MIR-449b (PM11127) og HSA-MIR-34a ( PM11030).
Cellevekst vekst~~POS=HEADCOMP-analyser
SNU638-celler ble sådd ut i 24-brønners plater og transfekteres den neste dag med 50 nM miRNA dupleks eller siRNA ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen). cellene ble fiksert ved angitte tidspunkter i 4% paraformaldehyd , beiset i en 0,1% krystallfiolett-oppløsning, og resuspendert i 10% eddiksyre. Eksempel absorbans ble målt ved 620 nm.
cellesyklus FACS analyser
SNU638 og MKN74 celler ble sådd ut ved 2 x 10 6 celler per 10cm plate og tilført med 50 nM miRNA duplex (Ambion) med Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Cellene ble høstet 48 og 72 timer post-transfeksjon, farget for DNA-innhold ved hjelp av propidiumjodid (PI) og analysert på en FACS Calibur flowcytometer (Becton-Dickinson). I korthet ble cellene høstet ved trypsinering og vasket en gang med PBS før fiksering natten over i 70% EtOH. Å farge DNA, ble cellene pelletert, resuspendert i 100 ul EtOH og farget i 1 time med 300 ul PI-oppløsning (0,05 mg /ml PI, 20 pg /ml RNase A i 0,1% BSA).
Senescence analyser
SNU638 celler ble sådd på 400.000 celler per 6-brønn-plate og transfektert med 50 nM miRNA duplex (Ambion) med Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Fire dager etter transfeksjon, ble cellene vasket i PBS og fiksert i 5 minutter ved værelsestemperatur i 2% formaldehyd /0,2% glutaraldehyd. Celler ble vasket to ganger i PBS pH 6,0 før de ble farget med frisk senescens forbindelse β-Gal fargende oppløsning (1 mg /ml 5-brom-4-klor-3-indolyl-βD-galaktosid (X-Gal), 0,12 mM K 3fe [CN] 6, 0,12 mM K 4Fe [CN] 6, 1 mM MgCl 2 i PBS pH 6,0) over natten ved 37 ° C uten CO 2 forsyning . Celler ble vasket en gang i PBS (pH 6,0) og observert under mikroskop.
Antistoffer og western blot analyser
SNU638 ble sådd ut ved 2 x 10 6 celler pr 10 cm plate, transfekterte to ganger på to suksessive dager med 50 nM miRNA tomannsboliger ved hjelp Lipofectamine 2000 i henhold til produsenten (Invitrogen). Cellene ble høstet ved trypsinering, vasket en gang med PBS og lysert i RIPA-buffer (150 mM NaCl, 0,5% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS, 1% Igepal, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM EDTA) supplementert med 1 mM DTT, 1 mM Pefabloc, 1mM NaV3, 10 mM NaF og 1X komplett mini proteasehemmer cocktail tabletter. 25 ug protein /kjørefelt ble løst på 4-20% NuPAGE Bis-Tris-geler (Invitrogen) og overført til en nitrocellulosemembran. Primære antistoffer som ble brukt var MET (Cell Signal 4560), MYC (Cell Signal 9402), GMNN (Santa Cruz Sc-53923), VCL (Sigma V9131), TP53 (Santa Cruz Sc-126), CDKN1A (Santa Cruz Sc-6246) , CDK6 (Santa Cruz Sc-177), HDAC1 (Santa Cruz Sc-7872), CCNE2 (Cell Signal 4132), Tubb (Abcam ab11304), PARP (Cell Signal 9542) og spaltet CASP3 (Cell Signal 9661).
microarray analyser
Small RNA (< 200 nt) ble isolert med Invitrogen PureLink miRNA Isolation Kit fra fundus og antrum vev fra 1) Gastrin
KO mus og alder og kjønn matchet C57BL6 /J kontroll mus, og 2) C57BL6 /J mus infisert med H. pylori Hotell og infisert alder og kjønn matchet C57BL6 /J kontroll mus, (n = 4 for hver gruppe). Kvaliteten på isolerte små RNA ble bestemt ved hjelp av små RNA-analysen på en Agilent Bioanalyzer. 500 ng av små RNA ble merket med Genisphere FlashTag Kit og hybridisert til Invitrogen NCode Multi-Species miRNA microarray V2 i en Maui hybridisering stasjon. Behandlet lysbilder ble skannet i en Agilent DNA microarray scanner. Resulterende bildene ble analysert og forholdet mellom median normalisert ved hjelp GenePix Pro 6.0. Fire biologiske replikater ble benyttet for hver sammenligning. Prøvene ble hybridisert til fire rekker i en dual farge fargestoff swap microarray eksperimentell design. BRB ArrayTools ble brukt for fold endring og statistiske beregninger. Utvalgte miRNA data fra rekke analyse ble validert ved hjelp av TaqMan real-time PCR miRNA analyser. Data vil bli deponert på ArrayExpress ved aksept.
MRNA arrays
SNU638 ble transfektert med 50 nM av MIR-34a eller MIR-449b tomannsboliger med Siglo siRNA brukt som negativ kontroll. Totalt RNA ble ekstrahert 24 timer etter transfeksjon ved bruk av TRIzol reagens. Affymetrix microarray analyse (HG-U133 Plus 2.0 human) ble utført på Microarray Center, Rigshospitalet, København universitetssykehus. Forsøk ble kjørt i enten triplikater eller quadruplicates. Data vil bli deponert på ArrayExpress ved aksept
. Vektorer konstruksjon og reporter analyser Bedrifter Den 3'UTRs av HDAC1
, SIRT1
, MET
, GMNN Hotell og CCNE2
beholdning MIR-449 bindingsseter ble klonet nedstrøms av luciferase reporter i pMIR-RAPPORT vektorsystem (Ambion). Quickchange seterettet mutagenese kit (Stratagene) ble anvendt for å indusere to punktmutasjoner i frøet regionen. Mutagenese grunning sekvenser er oppført i tilleggsfiler 1, tabell S1.
HEK293 celler ble sådd i 96 brønners plater og transfektert med 20nm miRNA forløper eller egge siRNA kontroll, 20-50ng av luciferase vektor (pMIR-rapporten) og 5 ng av Renilla vektor (PRL-TK) med lipofektamin 2000 (Invitrogen). Cellene ble høstet 24 timer etter transfeksjon og luciferase aktivitet ble målt ved hjelp av Dual-Glo luciferase assay (Promega).
Microarray analyse
Microarray uttrykk data ble behandlet ved hjelp av 'AFFY' pakke i BioConductor [27]. Probe sett intensiteter ble oppsummert og quantile normalisert ved hjelp av BioConductor RMA og VSN pakker. Differensial ble bestemt per probeset ved hjelp av en t-test. Probe sett ble kartlagt til Ensembl transkripsjoner (versjon 49) ved hjelp av kartlegginger som tilbys på BioMart. Probesets som avbildes i to forskjellige Ensembl gener ble forkastet.
Vurderer global nedregulering av mikroRNA målgener
Den 3'UTRs, 5'UTRs og koding sekvenser av transkripsjonene ble skannet for matchende 6mer, 7mer og 8MER miRNA frø områder (komplementære til stillingen 2-7, 2-8 og 2-9 miRNA). Global analyse av miRNA target nedregulering ble bedømt ved bruk av den lengste sekvens 3'UTR pr gen for å unngå skjevhet innført av gener med mange transkript isoformer. Vi forkastet utskrifter med 3'UTR sekvenser kortere enn 50 nt. Å globalt vurdere om miRNA målgener ble nedregulert etter miRNA transfeksjon, vi testet nullhypotesen at uttrykket endring fordeling av miRNA mål (som har en 7mer målområde) var lik fordelingen av alle uttrykte gener uten spådd målse bruker ikke-parametrisk Wilcoxon rank sum test. En tilsvarende metode ble anvendt for å evaluere nedregulering av gener med miRNA målse i kodende regioner og 5'UTRs av mRNA.
Uttømmende statistisk bearbeiding av ord korrelert med nedregulering
Vi brukte en tidligere publisert ikke-parametrisk rang-baserte statistikken til uttømmende vurdere korrelasjon av ordet forekomster i 3'UTRs og endringen i genekspresjon etter miRNA transfeksjon [28, 29]. Gener er sortert etter uttrykket endring indusert av transfeksjon av MIR-34a eller MIR-449b, og korrelasjonen med nedregulering ble testet for alle ord med lengde 5-7 (N = 21 504).
Statistiske tester
studenter t-test med Welch korreksjon. Search Results
MIR-449b er nedregulert i antrum både gastrin
KO mus og H. pylori
infiserte mus
gastrin
knockout mus er achlorhydric med en tendens til å utvikle antral hyperplasi og gastrisk adenomer over tid (figur 1) [6, 12]. For å identifisere microRNAs deregulerte under utviklingen av magekreft, undersøkte vi mirnas uttrykk profiler i mage neoplasier fra gastrin
knockout mus bruker miRNA mikromatriser. Som vist i tabell 1, ble 20 microRNAs betydelig deregulert i knockout mus sammenlignet med villtype kull kontroller, med tre mirnas ulike mer enn to ganger, MIR-7 blir oppregulert og MIR-709 og MIR-449b blir nedregulert i antrum av gastrin
knockout mus sammenlignet med villtyper. For ytterligere å bekrefte MIR-449 deregulering under magekreft utvikling, undersøkte vi uttrykk i villtype mus antrum vev infisert med H. pylori
. Interessant, miRNA arrays demonstrerte en spesifikk nedregulering av MIR-449b i H. pylori
infiserte mus (tabell 2 og tilleggsfiler 1, figur S1). Figur 1 Old Gastrin knockout mus utvikler mage adenomer. Antrum seksjoner isolert fra 12-16 uker gamle mus (venstre panel), 12 til 18 måneder gamle mus (i midten panel) og eldre enn 18 måneder mus (høyre panel), fra villtype (øvre panel) og gastrin
knockout mus (nedre panel). Avsnittene viser adenom utvikling i antrum vev i gastrin
knockouts i forhold til villtyper.
Tabell 1 mirnas deregulerte i gastrin
knockout mus
miRNA Navn
log2 ganger
p-verdi
miRNA Name

Log2-fold

p-value

mmu-miR-709
-1.73
7.0E-06
mmu-miR-422b
0.44
4.6E-02
mmu-miR-449b
-1.37
1.6E-03
mmu-miR-199a*
0.50
7.7E-03
mmu-miR-805
-1.01
7.5E-03
mmu-miR-25
0.51
1.6E-02
mmu-miR-706
-0.98
3.1E-03
mmu-miR-27b
0.56
5.1E-03
mmu-miR-467a
-0.88
2.8E-02
mmu-miR-182
0.56
1.8E-02
mmu-miR-696
-0.83
7.1E-03
mmu-miR-30a-3p
0.59
2.2E-02
mmu-miR-667
-0.66
2.3E-02
mmu-miR-10a
0.70
7.1E-03
mmu-miR-690
-0.28
1.7E-02
mmu-miR-152
0.70
2.3E-02
mmu-miR-18
0.29
3.7E-02
mmu-miR-1
0.77
7.1E-03
mmu-miR-143
0.34
2.3E-02
mmu-miR-7
1.06
4.9E-03
Liste over betydelig deregulerte miRNAs i mage neoplasier fra gastrin
Knockout mus sammenlignet med villtyper.
Tabell 2 mirnas deregulerte i h.pylori
infisert vev
miRNA navn

Brett change

p-value

mmu-miR-122a
-3.247
0.000788
mmu-miR-449b
-0.879
0.045214
Liste over betydelig deregulerte miRNAs i villtype mus antrum infisert med H. pylori
sammenlignet med ikke-infiserte antrum.
MIR-449 hemmer cellesyklusprogresjon og induserer senescence
Etter å ha demonstrert nedregulering av MIR-449 uttrykk i mage kreft vi ønsket å undersøke effekten av gjen uttrykker Mir-449 i mage kreft cellelinjer. Interessant ingen merkbar uttrykk for Mir-449 familien ble oppdaget over et panel av mage cellelinjer inkludert SNU638, SNU5, SNU216, SNU601 og MKN74 opprettholde forestillingen om MIR-449 har tumor-undertrykkende funksjoner (data ikke vist). Mir-449 familie består av MIR-449a og b hos mennesker og MIR-449a, b og c i mus. Interessant, de deler samme frø sekvens som MIR-34 familie og forventes derfor å regulere overlapp årskull av målgener (figur 2a). For å vurdere funksjon av MIR-449 i mage cellelinjer vi re-introdusert MIR-449b i SNU638 og MKN74 celler. Sammenlignet med negative kontroll microRNAs, re-innføring av MIR-449b sterkt påvirket spredning av SNU638-celler (figur 2b), og visuell inspeksjon av cellene indikerte induksjon av apoptose og cellebegynnende alderdom (figur 2c, og tilleggsfiler 1, figur S2). Strømningscytometrisk analyse av propidiumjodid-fargede celler transfektert med MIR-449b viste en G en ansamling 48 timer etter transfeksjon, etterfulgt etter 72 timer etter transfeksjon ved akkumulering av celler i sub G en brøkdel forenlig med cellen død (figur 2d). Induksjon av cellulær senescens ble bekreftet ved sur beta-gal-farging ved hjelp av MIR-34a som en positiv kontroll mikroRNA (figur 2e). For å utelukke cellelinje-spesifikke effekter, ble de funksjonelle konsekvensene av MIR-449 re-introduksjon i form av cellesyklus arrest bekreftet i MKN74 celler (tilleggsfiler 1, figur S3). Dermed gjeninnføring av MIR-449 påvirker negativt spredning av magekreft cellelinjer samtidige med induksjon av senescence og apoptose i samsvar med MIR-449 har svulst undertrykkende funksjoner. Figur 2 mir-449 er en del av MIR-34 familien og hemmer celleproliferasjon. A - MIR-449 er en del av MIR-34 familie og er evolusjonært konservert. B - MIR-449 re-innføring i menneskelige mage cellelinjer (SNU638) hemmer celledeling (rød linje) sammenlignet med en egge kontroll (blå linje) og Mir-146 kontroll (svart linje). Feilfelt representerer S.D. C - Visuell inspeksjon av celleproliferasjon hemming og senescence-lignende fenotype på MIR-449 re-innføring i SNU638 celler (nedre panel) sammenlignet med egge transfeksjon kontroll (øvre panel). D - FACS cellesyklus analyse som viser sub-G1 opphopning av SNU638 celler 72 timer etter MIR-449 re-introduksjon (høyre histogram) sammenlignet med en egge transfeksjon kontroll (venstre histogram) Tabellen viser celle akkumulering i G1 brøkdel på MIR-449 re Innføring sammenlignet med egge RNA kontrollen ved 48 timer etter transfeksjon, fulgt av en overgang til den sub-G1 fraksjon ved 72 timer etter transfeksjon indikativ for celledød. E - senescent fenotype av SNU638 celler på MIR-449 og MIR-34a positiv kontroll gjeninnføring vist av surt β-gal-analysen i forhold til RNA egge kontroll
felles frø sekvens av MIR-449b og MIR-34a indusere høyt. korrelert uttrykk endrer
å karakter transkripsjoner kontrollert av MIR-449, og for å se om MIR-449 regulerer ulike transkripsjoner enn MIR-34a, ble SNU638 celler uttrykk profiler undersøkt 24 timer etter transfeksjon av MIR-449b eller MIR-34a og forskjellig uttrykt transkripsjoner identifisert. Vi fant ut at mRNA med spådd miRNA målwebområder (7 mer frø språk) i 3'UTR var signifikant nedregulert i forhold til mRNA uten forutsagte målse etter transfeksjon av MIR-449b (p < 1,2E-70, to-tailed Wilcoxon rank sum test), (tilleggsfiler 1, figur S4a). mRNA ha spådd miRNA frø målse i koding regioner ble også funnet å være signifikant nedregulert (p < 9.9e-25), mens mRNA med områder i 5'UTRs var bare marginalt nedregulert (p < 5.3e- 2). Uttrykket endringer indusert av transfeksjon av modne MIR-449b og MIR-34a ble sterkt korrelert til tross divergens av de modne sekvenser utenfor frø regionen (Pearsons korrelasjonskoeffisient R = 0,94, p = 0), (Tilleggs fil 1, figur S4B). Vi uttømmende evaluert alle oligonukleotider (ord) av lengde 5-7 for korrelasjon med nedregulering etter MIR-449b og MIR-34a transfeksjon (se metoder). I samsvar med mange tidligere studier, denne analysen avslørte delte MIR-34a /449b frø området som 3'UTR ordet mest korrelert med nedregulering i de to forsøkene (tilleggsfiler 1, figur S4C).
MIR-449 regulerer mange cellesykluskontrollere
uttrykket profiler ble brukt til å identifisere forskjellig uttrykt transkripsjoner i celler transfektert med MIR-449b eller kontroller (tilleggsfiler 1, tabell S2). En sti aktivering analyse basert på forskjellig regulerte transkripsjoner viser at MIR-449 styrer hovedsakelig transkripsjoner som koder for proteiner involvert i celleskade responser, cellesykluskontroll, betennelse og kreft baner (figur 3a). Med fokus på et sett av mulige målgener med godt etablerte roller i tumorgenesen, bekreftet vi nedregulering av MIR-449 fra møtte proto onkogen (MET
), cyclin avhengig kinase 6 (CDK6)
, geminin (GMNN )
, myelocytomatosis viral onkogener homolog (MYC)
, Sirtuin 1 (SIRT1
) og histondeacetylase 1 (HDAC1)
på karakterutskriften nivå (figur 3b). Western blot-analyser bekreftet evnen til MIR-449 for å ned-regulere MET, GMNN, MYC, SIRT1, cyklin E2 (CCNE2) og HDAC1 på proteinnivået til en grad lik den som oppnås ved re-innføring av MIR-34a (figur 3c). For en undergruppe av målgener inkludert MET
, GMNN, CCNE2
, SIRT1 Hotell og HDAC1
vi bekreftet direkte interaksjon av MIR-449 med målgenet 3 'UTR hjelp luciferase assay (figur 3d ). Figur 3 MIR-449 retter seg mot cellesyklus kontrolleren gener. A - Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) i deregulerte gener ved MIR-449 re-innføring i SNU638 celler som viser berikelse for gense kategorier kreft, celledød og cellesyklus trasé blant andre. B - qPCR validering av Affymetrix arrays viser nedregulering av MET
, CDK6
, GMNN
, MYC Hotell og HDAC1
på MIR-449 re-introduksjon i forhold til egge RNA kontroller. C - Western blot validering av nedregulert gener ved MIR-449 re-introduksjon til SNU638 celler i forhold til egge RNA kontroller. Vinculin (VCL) og tubulin beta (Tubb) ble brukt som laste kontroller D - verifisering av direkte og funksjonelle mål bindende bruker luciferasepreparater konstruksjoner som holder villtype 3'UTRs og muterte 3'UTRs (to mutasjoner i MIR-449 bindingssete), * indikerer statistisk signifikans i luciferaseekspresjon mellom villtype 3'UTRs transfektert med miR449a /b sammenlignet med RNA egge kontroll, indikerer # statistisk forskjell i luciferaseekspresjon mellom villtype 3'UTRs sammenlignet med mutant 3'UTRs transfektert med MIR-449a og speil 449b. "Ns" ikke signifikant p-verdi > 0.05, "*" og "#" betydelig 0,01 < p-verdi < 0.05, "**" eller "##" svært viktig 0,01 < p-verdi < 0.001, "***" eller "###" ekstremt viktig p-verdi < 0.001
Derfor MIR-449 er rettet direkte cellesyklus regulatoriske gener forenlig med en tumor suppressor funksjon og med cellesyklus arrest observert på MIR-449 re-introduksjon til kreft cellelinjer.
MIR-449 induserer p53 uttrykk, men er ikke regulert av p53
Som MIR-34a ble tidligere funnet å fungere nedstrøms p53 [30-33], analyserte vi om også MIR-449a /b var knyttet til p53. Dette ble dessuten ansporet av tilstedeværelsen av en antatt p53-bindingssete 10 kb oppstrøms fra human MIR-449 (data ikke vist). Vi indusert derfor p53 ved DNA-skader ved bruk av UV eller 5-fluorouracil (5-FU) i fire forskjellige systemer, HCT116 og MEF villtype og p53 knockout celler (tilleggsfiler 1, figur s5a). Imidlertid ble ingen signifikant endring i Mir-449 uttrykk oppdaget etter p53 pathway aktivering (tilleggsfiler 1, figur S5b). I konklusjonen, fant vi ingen bevis for at MIR-449 er en transkripsjons mål av p53. På den annen side har vi funnet at MIR-449a /b er i stand til å indusere aktivering av p53, aktivering av p53 responsgener slik som p21 og induksjon av apoptose som vist ved spaltning av kaspase 3 (CASP3) og poly (ADP-ribose ) polymerase 1 (PARP) (figur 4). Mot forstå mekanismen som Mir-449 gjør dette undersøkte vi effekten av MIR-449 på SIRT1 og HDAC1. SIRT1 og HDAC1 er deacetylases som inhiberer blant annet har den aktivering av p53 og MIR-34 blitt vist å undertrykke SIRT1 [34]. Vi validert den spesifikke binding av MIR-449 til SIRT1 og HDAC1 hjelp 3'UTR luciferase analysene (figur 3d). Figur 4 MIR-449 aktiverer p53 veien. Western blot-analyse som viser en økning i p53-protein ved MIR-449 og positiv kontroll MIR-34a gjeninnføring inn i SNU638 celler sammenlignet med RNA omkastet kontroll samt en aktivering av p53 nedstrøms mål p21 og apoptose markører spaltes CASP3 og PARP. Vinculin (VCL) og tubulin beta (tubb) ble anvendt som kontroller lasting.
Derfor spekulere vi at MIR-449 induserer apoptose ved å inhibere histon deacetylase HDAC1 og SIRT1 fører til p53 pathway aktiverings således induksjonen av apoptose markører spaltet CASP3 og PARP.
MIR-449 er nedregulert i humane mage kreft
å evaluere betydningen av MIR-449 i humane kreftformer vi neste undersøkt uttrykk for MIR-449 i 10 magekreft biopsier. Viktigere, fant vi både MIR-449a og b for å være betydelig nedregulert eller fraværende i 8 av 10 primær mage kreft. Videre uttrykk for MIR-449a og b synes å være co-regulert (figur 5a). Vi fant ikke noen sammenheng mellom reduksjon i Mir-449 uttrykk og kliniske kjennetegn ved kreft (figur 5b). Analyser av genomisk DNA fra tumorene ikke funnet bevis for tap eller hyper-metylering av Mir-449 loci ved hjelp av metylering-spesifikk smeltekurve analyse (MS-MCA) som viser transkripsjonen nedregulering av ekspresjonen (data ikke vist). Derfor, i enighet med data fra to musemodeller av mage betennelse og hyperplasi, er uttrykk for MIR-449 nedregulert i humane mage kreft. Figur 5 MIR-449 er nedregulert i humane mage kreft. qPCR-analyse (øvre panel) som viser nedregulering av MIR-449-ekspresjon i 8 magekreft vev sammenlignet med MIR-449-ekspresjon i sample-kontrollpersoner (prikket linje). U44 ble anvendt som endogene kontroll. Tabellen viser klinisk informasjon av pasientene (nedre panel). "Ns" ikke signifikant p-verdi > 0.05, "*" betydelig 0,01 < p-verdi < 0.05, "**" svært viktig 0,01 < p-verdi < 0.001, "***" ekstremt viktig p-verdi < 0.001
Diskusjon
Magekreft er en svært dødelig kreft med mer enn 21.500 nye tilfeller hvert år i USA alene [35]. Sykdommen er ofte oppdages sent og 5-års overlevelse er altså under 20% [36]. Det er derfor viktig å forstå etiologi og progresjon stadier av sykdommen. Betydningen av de bakterielle, miljømessige og vert genetiske risikofaktorer i magekreftutvikling har blitt undersøkt, men mindre er kjent om den molekylære progresjon av sykdommen [37, 38]. Blant annet er p53 sti inaktive rapportert hos 30-60% av magekreft [39, 40] og nyere studier tyder på H. pylori
direkte modulering av p53-genet eller nedstrøms mål [41]. En annen vanlig endring i magekreft er endringen av cellesykluskontroll med en i forhold til ekspresjon av syklin E1, som er forbundet med tumor aggressivitet og lymfeknutemetastase [42, 43].

• Påvirkningen av N-acetyl-L-cystein infusjon på cytokinnivåer og gastrisk intramucosal pH-verdien under kraftig sepsis
• Benign gastro-kolikk fistel i en kvinne som presenterer med vekttap og intermitterende oppkast: a case report