Mir-449 bremst Zell Prolifératioun an ass erof-reglementéiert gastric Kriibs

Mir-449 bremst Prolifératioun Zell an Minus-reglementéiert gastric Kriibs VerfÜgung méiglech VerfÜgung Background VerfÜgung Gastric Kriibs d'véiert stäerkste gemeinsam Kriibs an der Welt ass an der zweeter stäerkste verwandelt Ursaach vum Kriibs Zesummenhang Doud. D'Entwécklung vun gastric Kriibs ass haaptsächlech verbonne mat H. pylori VerfÜgung Wonn an wirklech Studien op bakteriell an Ëmwelt Faktoren, an zu enger klenger Mooss op der mechanistic Entwécklung vun der entholl zu engem Schwéierpunkt Haaptfiguren. MicroRNAs si kleng Net-coding RNS Molekülle Équipe am Post-transcriptional Gentherapie Regulatioun. Si sinn fonnt Genen an diversen biologescher Funktiounen an hire Restaurant zu microRNA Ausdrock verbonne goufen zu der pathogenesis vu ville malignancies Équipe ze regléieren. Déi aktuell Etude ass de Schwéierpunkt op microRNAs Équipe an gastric carcinogenesis Erkenntnesser an hir mechanistic Relevanz beschen vun hiren Ziler characterizing. VerfÜgung Resultater VerfÜgung Invitrogen NCode miRNA microarrays identifizéiert Mir-449 an 1-Joer-ale Gastrin ofgeholl gin
KO Mais an H. pylori VerfÜgung Krankheet gastric Stoffer Verglach zu Stoffer aus Wëllschwäin Zort Déieren. Taux vun gastric Zell Zeilen iwwer-ausdrécken Mir-449 huet vun 60% inhibited Verglach zu Kontrollen. FACS Zell Zyklus Analyse vum Mir-449 méi-ausdrécken Zellen zougedréckt engem groussen Zouhuele vun der Sous-G 1 Ëmwandlung duerops apoptosis. SS-Gal assays uginn engem senescent phenotype vun gastric Zell Zeilen iwwer-ausdrécken Mir-449. Affymetrix 133v2 flamenden Ofgrond identifizéiert GMNN VerfÜgung, kennegeléiert, CCNE2, SIRT1 VerfÜgung an CDK6 VerfÜgung als Mir-449 Ziler. Luciferase assays sech benotzt GMNN VerfÜgung, kennegeléiert VerfÜgung, CCNE2 VerfÜgung an SIRT1 VerfÜgung als direkten Ziler ze confirméieren. Mir weisen awer och, datt Mir-449 méi-Ausdrock p53 a seng afgerappt Zil- p21 souwéi d'apoptosis lues eenalecn CASP3 an PARP ausgeléist. Wichtegst, Analysë qPCR e Verloscht vun Mir-449 Ausdrock vun mënschlecher Medeziner gastric erhéijen Verglach zu normal Stoffer zougedréckt. VerfÜgung Konklusiounen VerfÜgung An dëser Etude, Dokument mir eng manner Ausdrock vu Mir-449 zu Gastrin VerfÜgung KO Mais a weider bestätegt hir Verloscht vun mënschlech gastric erhéijen. Mir propagéieren d'Funktioun vum Mir-449 vun hirem direkten Ziler z'identifizéieren. Ausserdeem weist mir, datt Mir-449 vun activating der p53 Passerelle senescence an apoptosis induces. VerfÜgung Background VerfÜgung Gastric Kriibs ënnert de fënnef heefegen Cancers vun der Welt ass an der zweeter stäerkste verwandelt Ursaach vum Kriibs-Zesummenhang Doudesfäll [1] . Et ass virun allem, mä net exklusiv, ëmmer vun H. pylori VerfÜgung Wonn [2] als net all vun H. pylori VerfÜgung Krankheet Persoune entwéckelen erhéijen [3]. Aner Facteuren an der Entwécklung vun gastric Kriibs Équipe gehéiert de Diplome an Typ vun der demagogesch Äntwert [2] wéi och de Niveau vun der Gastrin VerfÜgung Hormon [4, 5]. Verschidden Etuden hu gewisen, datt béid hypergastrinemia [6, 7] an de Mangel vun Gastrin [5] bis den pathogenesis vun gastric Kriibs bäidroen. Achlorhydria ass eng gemeinsam Fonktioun vun Maus Modeller ufälleg fir Entwécklungslänner metaplasia a Kriibs [6, 8, 9]. Gastrin VerfÜgung Knockout Mais sinn achlorhydric [10], e bakteriell gastric overgrowth favoriséieren [11, 12], a chronescher bakteriell gastric Aids ze gastric metaplasia nodeems deen an gastric Kriibs Fortschrëtter kënnen [6, 12]. VerfÜgung Zënter hirer Entdeckung microRNAs, goufen an eng ganz breet Palette vu normal an agebousst Prozesser [13] agebonne fonnt. MicroRNAs hir reglementaresche Funktiounen vollt posttranscriptionally vun verbindlech bis deelweis ergänzen Haaptrei motifs Kannerbetreiung an der 3. 'UTR vun Zil- mRNAs geplatzt mRNA Déstabiliséierung an respektiv Repressioun [14]. Vun enger biologescher Siicht, sinn usprochsvollen microRNAs Objeten ze studéieren wéi se cohorts vun Zil- Genen regléieren, déi net geschloe ginn identifizéiert ginn. Vun engem therapeutical Siicht, sinn microRNAs héich interessant, well e puer Studien d'Muecht vun microRNAs als biomarkers an initial preclinical Studien etabléiert hunn jo bewisen hunn, dass microRNAs therapeutically zu VIVO cibléiert ginn [15]. VerfÜgung Studien Profiling microRNA Dereguléierung Siicht hunn an engem breede Spektrum vu Krankheeten wéi all gréisser Cancers [16]. MicroRNAs Afloss wahrscheinlech tumourigenic Prozesser op zwee Niveauen. Eischtens, hunn e puer Studien etabléierten pro-oncogenic oder entholl-suppressive Rollen vun eenzelne microRNAs fest dëse zu Kriibs etiology Joreswiessel als Beispill duerch Mir-155, Mir-10b an Mir-21 [17-19]. Zweetens, schéngt de microRNA reglementaresche System pro se ze entholl suppressive Funktiounen wéi genetesch ablation vun Schlëssel microRNA biogenesis Facteuren, wéi Dicer hunn, betraff Kriibs waat Erhéijung [20] an Verloscht vun Funktioun kennen wichteg microRNAs Veraarbechtung Facteuren zu Mënsch erhéijen identifizéiert ginn [21-23]. VerfÜgung an dëser Etude, Adress mir d'Wichtegkeet vun microRNAs zu gastric Kriibs Virdeel vun der Knockout Maus Modell an H. pylori VerfÜgung Wonn vun wëll Typ Mais VerfÜgung Gastrin huelen. Mir identifizéiere Mir-449 als bedeitend erof-reglementéiert oder zu Maus Modeller vun gastric Kriibs souwéi am primäre Mënsch gastric erhéijen verluer. Identifikatioun vun mRNA Ziler verréid eis, datt dës microRNA wahrscheinlech entholl suppressive Funktiounen duerch d'onse Regulatioun vun engem Kohort vun Kriibs-verbonne Zell-Zyklus Legislateuren dorënner begéint, GMNN, CCNE2, SIRT1, an HDAC1. VerfÜgung Method VerfÜgung Mais enormen
dräi verschidde Alter Gruppen (12-16 Wochen, 1 Joer oder 1½ Joer) vun wëll Typ (virstellen) oder Gastrin VerfÜgung Knockout (KO) Mais sech benotzt. All Mais sech op e gemëschtent 129 /SvJ, C57BL /6J Hannergrond, backcrossed mannst véier Mol zu C57BL /6J [12]. De Mais goufen ënner bestëmmten pathogen-gratis Konditiounen gehaalen an iwwerwaacht no der Federatioun vun europäesche schafft Déieren Science Associatiounen Tipp [24] mat 12 h Liicht, 12 h donkel zouféieren. VerfÜgung H. pylori VerfÜgung Wonn VerfÜgung C57BL6 /J Mais (n = 10) huet sech mat engem Net-Maus-ugepasst Copie vun H. pylori VerfÜgung Deformatioun 67:21, ursprénglech vom eng antral Fro vun engem schwedesche weiblech mat gastric oppent kritt inoculated. D'Efforten ass VacA + an enthält de ganze Cag pathogenicity Insel (PAI) mat genetesch Stabilitéit an der Cag PAI [25]. De Mais goufen all zweeten Dag (dräimol) während engem 5-Dag Period inoculated. DNA gouf ofgebaut a fir d'Präsenz vun Helicobacter Arten analyséiert enger semi-gemaach polymerase Kette Reaktioun-denaturing packt gelies electrophoresis assay, speziell fir d'Gattung Helicobacter benotzt, wéi virdru beschriwwen [26]. A stemmt Grupp vun uninfected C57BL6 /J Mais sech als Kontrollen benotzt. VerfÜgung D'Mamm vun all Mais an fundus an antrum zu RNS Extraktioun virewech Leschten goufen. All Déier Experiment vum däneschen Déierenschutzorganisatiounen Comité (2005 /562-40) an den dänesche Forest an Natur intégration (20010077355/6). VerfÜgung Mais antrum Rubriken guttgeheescht VerfÜgung Mais vun cervical dislocation geaffert huet. D'antrum war, geläscht verbannen an Äis-kal PBS gewäsch, an flëssege Stéckstoff gefruer an bei -80 ° C bis RNS Extraktioun gespäichert. VerfÜgung Séminairen Echantillonen analyséiert VerfÜgung Biopsies aus gastric Kriibs an der bascht normal Stoffer sech vu Patiente kritt amgaang Agrëff fir gastric Kriibs bei de Pompjeeën vun Gastrointestinal befënnt, Rigshospitalet. Der Inclusioun stattfonnt vun Juli bis Dezember 2008 an all Patienten gëtt ënnerschriwwen, Awëllegung (ethneschen Comité averstaane H-B-2008-049) an Dänesch Dateschutz intégration (2008-41-2138). D'biopsies sech zu RNAlater (Ambion) an de Fonctionnementskäschten Zëmmer an dono gefruer bei -80 ° C bis RNS erauszéien. VerfÜgung RNS Extraktioun gesat an qPCR Analysë VerfÜgung RNS ofgebaut gouf benotzt TRIzol (Invitrogen) laut Hiersteller. miRNA Ausdrock Profil war fir kann awer och sin /mmu-Mir-449a an b mat Taqman miRNA assays (Obwuel biosystems) évaluéieren, kann awer och sin /mmu-Mir-34a, b an c an rnu44 oder kann awer och sin /mmu-Mir-191. Primer Message fir Affymetrix Ziler validéiert ginn an zousätzlech Fichier 1, Dësch S1 opgezielt. VerfÜgung Zell Kultur VerfÜgung SNU638 an MKN74 sech zu RPMI-1640 ugebaut (Gibco) mat 10% FBS (Hyclone), 100U /ml penicillin an 100 μg /ml streptomycin (Invitrogen) a bei 37 ° C an 5% CO 2 incubated. HCT116 Zellen (virstellen an p53 - /- sech an Diggers d'5A (Gibco) mat 10% FBS (Hyclone), an 100U /ml penicillin an 100 μg /ml streptomycin (Invitrogen) an incubated bei 37 ° C an 5% CO ugebaut <. sub> 2 HEK293 an MEF Zellen (virstellen an p53 - /-) waren bei 37 ° C an DMEM (Gibco) mat 10% FBS (Hyclone), 100U /ml penicillin an 100 μg /ml streptomycin (Invitrogen) an incubated ugebaut mat 5% CO 2. VerfÜgung miRNA Etüd an miRNA Etüd VerfÜgung siRNA sech aus Ambion kaaft, kann awer och sin-Mir-449a (PM11521), kann awer och sin-Mir-449b (PM11127) a kann awer och sin-Mir-34a ( PM11030). VerfÜgung Zell Wuesstem analyséiert VerfÜgung SNU638 Zellen sech am 24-gutt Placke rakommen an transfected den Dag mat 50nM miRNA duplex oder siRNA benotzt Lipofectamine 2000 (Invitrogen). BTS sech um uginn Zäit Punkten zu 4% paraformaldehyde fixen , an engem 0,1% glaskloer mauve Léisung geschriwwen, an zu 10% acetic Seier resuspended. Sample absorbance bei 620 nm gemooss gouf. VerfÜgung Zell Zyklus FACS VerfÜgung SNU638 an MKN74 Zellen sech géint bei 2 × 10 6 analyséiert Zellen pro 10cm zappen an transfected mat 50nM miRNA duplex (Ambion) benotzt Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Zellen sech 48 an 72 Stonnen Post-transfection recoltéiert, Kierchefënster fir DNA Inhalt mat propidium Kaliumiodid (PI) an op enger FACS Calibur Flux cytometer (Becton-Dickinson) analyséieren. Kuerz sech duerch trypsinization recoltéiert, Zellen an eemol mat PBS Katakombe virun Nuecht an 70% EtOH Bauer iwwer. Fir d'DNA stain, goufen Zellen pelleted, bass-Spär vun 100 μl EtOH a fir 1 Stonn mat 300 μl PI Léisung (0.05mg /ml PI, 20 μg /ml RNAse A an 0,1% BSA) Kierchefënster. VerfÜgung Senescence analyséiert VerfÜgung SNU638 Zellen sech op 400.000 Zellen rakommen pro 6-Meter-Plack an transfected mat 50nM miRNA duplex (Ambion) benotzt Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Véier Deeg Post-transfection, goufen Zellen vun PBS gewäsch a fix fir 5 Minutte bei Raumtemperatur vun 2% formaldehyde /0,2% glutaraldehyde. Zellen sech zweemol zu PBS pH6.0 Katakombe ier mat frëschen senescence verbonne β-Gal stain Léisung Kierchefënster Wiesen (1mg /ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-βD-galactoside (X-Gal), 0.12mM K 3Fe [CN] 6, 0.12mM K 4Fe [CN] 6, 1mM MgCl 2 zu PBS pH6.0) Iwwernuechtung bei 37 ° C ouni CO 2 Energieversuergung . Zellen sech eemol am PBS (pH6.0) an observéiert ënnert der microscope gewäsch. VerfÜgung Antibodies a westlech blot Analysë VerfÜgung SNU638 um rakommen huet 2 × 10 6 Zellen pro 10 cm zappen, transfected zweemol op zwee successive Deeg mat 50nM miRNA duplexes benotzt Lipofectamine 2000 laut Hiersteller (Invitrogen). Zellen sech duerch trypsinization recoltéiert, gewäsch eemol mat PBS an Ripa Prellbock (150mM NaCl, 0,5% Natrium Deoxycholate, 0,1% SDS, 1% Igepal, 50mM Tris-HCl pH8, 2mM héich) ergänzt mat 1mM DTT lysed, 1mM Pefabloc, 1mM NaV3, 10mM NaF an 1x komplett Mini protease inhibitor Cocktail Pëllen. 25 μg vun FAQ /Keelebunn waren op 4-20% NuPAGE Bis-Tris gels (Invitrogen) an transferéiert zu engem nitrocellulose Membran geléist. Primärschoul antibodies benotzt sech kennegeléiert (Zell Signal 4560), MYC (Zell Signal 9402), GMNN (Santa Cruz sc-53923), VCL (Fläch V9131), TP53 (Santa Cruz sc-126), CDKN1A (Santa Cruz sc-6246) , CDK6 (Santa Cruz sc-177), HDAC1 (Santa Cruz sc-7872), CCNE2 (Zell Signal 4132), Tubb (Abcam ab11304), PARP (Zell Signal 9542) an eenalecn CASP3 (Zell Signal 9661). VerfÜgung Microarray Analysë VerfÜgung klenger RNAs (&si besteet; 200 NG) huet isoléiert mat Invitrogen PureLink miRNA Isolatioun Kit vun fundic an antral Otemschwieregkeeten aus 1) Gastrin VerfÜgung KO Mais an Alter a Geschlecht reagéiert C57BL6 /J Kontroll Mais, a 2) C57BL6 /J Mais mat H. pylori VerfÜgung an uninfected Alter a Geschlecht Krankheet reagéiert C57BL6 /J Kontroll Mais, (n = 4 fir all Grupp). D'Qualitéit vun isoléiert kleng RNAs war mat der klenger RNS Assay op eng Agilent Bioanalyzer alles. 500ng vu klenge RNS war mat Genisphere FlashTag Kit Fortgeschratten an hybridized zu Invitrogen NCode Multi-Art miRNA Microarray V2 zu engem hybridization Gare seng Entscheedung nach méi. Filteren drënner waren an eng Agilent DNA microarray Scanner gescannt. Schéine Biller analyséieren an Verhältnis vun Steiren normalized benotzt GenePix Pro 6.0. Véier biologescher gefaart huet fir all Verglach benotzt. Echantillon waren an engem Ofwaassersystem Faarf hannendrun gelaf microarray experimentell Design zu véier flamenden Ofgrond hybridized. BRB ArrayTools sech fir fantastesch änneren a statistesch Berechnungen benotzt. Ausgewielt miRNA Daten aus der Partie Analyse huet mat validéiert TaqMan real-Zäit Hinnen alleguer miRNA assays. Daten ginn um ArrayExpress op Akzeptanz verschéckt ginn. VerfÜgung mRNA flamenden Ofgrond VerfÜgung SNU638 mat 50 nm vum Mir-34a oder Mir-449b duplexes mat siGLO siRNA als negativ Kontroll benotzt transfected goufen. Total RNS war 24 Stonnen Post-transfection benotzt TRIzol reagent ofgebaut. Affymetrix microarray Analyse (HG-U133 Plus 2.0 Mënsch) war um Microarray Center, Rigshospitalet, Kopenhagen University Hospital gesuergt. Experiment an entweder triplicates oder quadruplicates lafen. Daten ginn um ArrayExpress op Akzeptanz verschéckt. VerfÜgung Vectors Bau an reporter assays VerfÜgung D'3'UTRs vun HDAC1 VerfÜgung, SIRT1 VerfÜgung, kennegeléiert VerfÜgung, GMNN VerfÜgung an CCNE2 VerfÜgung mengn Mir-449 bindend Siten sech afgerappt vun der luciferase reporter gekloonten zu pMIR-Dobäi Vecteure System (Ambion). Quickchange Site-Direkter mutagenesis Kit (Stratagene) war benotzt zwee Punkt kennen an de Som Regioun ze induce. Mutagenesis primers Message sinn zu Weider Fichier 1, Dësch S1 opgezielt. VerfÜgung HEK293 Zellen sech zu 96 och Telleren rakommen an transfected mat 20nM miRNA Virleefer oder Jacquerie siRNA Kontroll, 20-50ng vun luciferase Vecteure (pMIR-Rapport) an 5ng vun renilla Vecteure (Praxis-TkLanguage) benotzt lipofectamine 2000 (Invitrogen). Zellen sech 24 Stonnen Post transfection an luciferase Aktivitéit recoltéiert war Dual-Glo luciferase assay (Promega) gemooss benotzt. VerfÜgung Microarray Analyse VerfÜgung Microarray Ausdrock Donnéeën Filteren war mat der "affy Pauschal zu BioConductor [27]. Studiebäihëllefe Formatioun intensities sech zesummegefaasst an quantile normalized der BioConductor RMA an VSN Formulen benotzt. Ënnerscheed Ausdrock war pro probeset mat engem T-Test décidéiert. Studiebäihëllefe baut sech ze Ensembl gët (Versioun 49) benotzt um BioMart gëtt mappings Ëmgéigend. Probesets datt zu zwou verschiddene Ensembl Genen Ëmgéigend waren. Discarded VerfÜgung opgeworf global verwandelt-Regulatioun vun microRNA Zil- Genen VerfÜgung D'3'UTRs, 5'UTRs an coding Message vun der gët fir passende 6mer, si gescannt 7mer an 8mer miRNA Som Siten (ergänzen zu Positioun 2-7, 2-8 a 2-9 vun der miRNA). Global Analyse vun miRNA Zil- verwandelt-Regulatioun war mat der héchster Schoulausbildung 3'UTR Haaptrei pro Gentherapie Westen ze vermeiden duerch Genen mat ville ët isoforms agefouert bewäert. Mir discarded gët mat 3'UTR Message méi wéi 50 optimistesch. Fir weltwäit diskutéieren wann miRNA Zil- Genen huet verwandelt-reegelen der miRNA transfection, mir d'automatesch Hypothes, datt den Ausdrock änneren Verdeelung vun miRNA Ziler (no engem 7mer Zil- Site) getest an d'Verdeelung vun all ausgedréckt Genen ouni virausgesot Zil- Siten selwecht gouf mat der Net-parametric Wilcoxon Geleeënheet-Zomm Test. Ustrengend statistesch Beurteelung vun Wierder mat verwandelt-Regulatioun soll war Eng ähnlech Approche vun coding Regiounen an 5'UTRs vun mRNAs diskutéieren verwandelt-Regulatioun vun Genen mat miRNA Zil- Siten benotzt.
Mir engem virdrun publizéiert Net-parametric benotzt attributer-baséiert iwwerleen zu exhaustively der Korrelatioun vun Wuert Virgäng am 3'UTRs an d'Verännerung vun der Gentherapie Ausdrock der miRNA transfection [28, 29] bewäerten. Genen sech duerch Ausdrock Ännerung vun transfection vum Mir-34a oder Mir-449b, an der Korrelatioun mat verwandelt-Regulatioun war fir all Wierder vun Längt 5-7 (N = 21 504). VerfÜgung statistique Tester getest entschlof zortéiert VerfÜgung Schüler T-Test mat Welch d'Korrektur. VerfÜgung Resultater VerfÜgung Mir-449b Minus an der antrum souwuel Gastrin VerfÜgung KO reegelen Mais an H. pylori VerfÜgung Mais VerfÜgung Gastrin VerfÜgung Knockout Mais Krankheet sinn achlorhydric antral hyperplasia an gastric adenomas méi Zäit (Figur 1) [6, 12] fir Entwécklungslänner mat enger Tendenz. Fir microRNAs z'identifizéieren während der Entwécklung vun gastric Kriibs dereguléierte, iwwerpréift mir miRNAs Ausdrock Profiler an gastric neoplasias aus Gastrin VerfÜgung Knockout Mais benotzt miRNA microarrays. Als 1 zu Dësch gewisen, 20 microRNAs waren an der Knockout Mais am Verglach zu wëll Typ littermate Kontrollen, mat dräi miRNAs ënnerscheedlecher méi wéi zwee Weeër, Mir-7 Wiesen an-reglementéiert an Mir-709 an Mir-449b Wiesen verwandelt-reegelen vill dereguléierte an der antrum vun Gastrin VerfÜgung Knockout Mais am Verglach zu wëll Typen. Fir weider Mir-449 Dereguléierung während gastric Kriibs Entwécklung confirméieren, iwwerpréift mir seng Ausdrock vun wëll Typ Maus antrum Stoffer Krankheet mat H. pylori VerfÜgung. Spannen, bewisen miRNA flamenden Ofgrond engem spezifeschen verwandelt-Regulatioun vum Mir-449b an H. pylori Mais Krankheet VerfÜgung (Tabell 2 an Weider Fichier 1, Figur S1). Figur 1 Old Gastrin Knockout Mais gastric adenomas entwéckelen. Antrum Rubriken vom 12-16 Wochen al Mais (lénks Rot), 12 bis 18 Méint ale Mais (Mëtt Rot) an al ewéi 18 Méint Mais (riets Rot), aus Wëllschwäin Typ (ieweschte Rot) an Gastrin VerfÜgung Knockout Mais (ënneschten Rot). Sektiounen weisen adenoma Entwécklung vun antrum Stoffer an der Gastrin VerfÜgung knockouts Verglach zu der Wëllschwäin Typen. VerfÜgung Table 1 miRNAs dereguléierte zu Gastrin VerfÜgung Knockout Mais VerfÜgung miRNA Numm
Log2-fantastesch
p-Wäert
miRNA Name

Log2-fold

p-value

mmu-miR-709
-1.73
7.0E-06
mmu-miR-422b
0.44
4.6E-02
mmu-miR-449b
-1.37
1.6E-03
mmu-miR-199a*
0.50
7.7E-03
mmu-miR-805
-1.01
7.5E-03
mmu-miR-25
0.51
1.6E-02
mmu-miR-706
-0.98
3.1E-03
mmu-miR-27b
0.56
5.1E-03
mmu-miR-467a
-0.88
2.8E-02
mmu-miR-182
0.56
1.8E-02
mmu-miR-696
-0.83
7.1E-03
mmu-miR-30a-3p
0.59
2.2E-02
mmu-miR-667
-0.66
2.3E-02
mmu-miR-10a
0.70
7.1E-03
mmu-miR-690
-0.28
1.7E-02
mmu-miR-152
0.70
2.3E-02
mmu-miR-18
0.29
3.7E-02
mmu-miR-1
0.77
7.1E-03
mmu-miR-143
0.34
2.3E-02
mmu-miR-7
1.06
4.9E-03
Lëscht vun bedeitend dereguléierte miRNAs zu gastric neoplasias aus Gastrin VerfÜgung Knockout Mais am Verglach zu wëll Typen. VerfÜgung Table 2 miRNAs dereguléierte zu H.Pylori VerfÜgung Krankheet Stoffer VerfÜgung miRNA Numm
falen change

p-value

mmu-miR-122a
-3.247
0.000788
mmu-miR-449b
-0.879
0.045214
Lëscht vun bedeitend dereguléierte miRNAs zu wëll Typ Mais antrum mat H. pylori Krankheet VerfÜgung Verglach zu Net-Krankheet antrum. VerfÜgung Mir-449 Zell Zyklus Werdegang bremst a induces senescence VerfÜgung verwandelt-Regulatioun vun bewisen hunn Mir-449 Ausdrock vun gastric Cancers wollt mer den Effet Re-ausdrécken mir-449 zu gastric Kriibs Zell Zeilen ze iwwerpréifen. Spannen keng deitlech Ausdrock vun der Raumstatioun-449 Famill ganze engem Rot vu gastric Zell Linnen dorënner SNU638 nogewise gouf, SNU5, SNU216, SNU601 an MKN74 Gank d'Notioun vum Mir-449 mussen entholl-suppressive Funktiounen (Donnéeën net gewisen). De Mir-449 Famill besteet aus Mir-449a an b zu Mënschen an Mir-449a, b an c zu Mais. Spannen, deele se sech de selwechte Som Haaptrei wéi de Bord-34 Famill a sinn dohier phpNuke cohorts vun Zil- Genen (Figur 2a) ze regléieren erwaart. Fir d'Funktioun vum Mir-449 zu gastric Zell Linnen évaluéiere mir du-agefouert Mir-449b an SNU638 an MKN74 Zellen. Am Verglach zu negativ Kontroll microRNAs, bass-Aféierung vum Mir-449b betraff staark Verbreedung vun SNU638 Zellen (Figur 2b) a visuell Inspektioun vun der Aféierungs- vun apoptosis uginn Zellen a bewosst senescence (Figur 2C, an Weider Fichier 1, Figur S2). Flow cytometric Analyse vun propidium Kaliumiodid-Kierchefënster Zellen transfected mat Mir-449b zougedréckt engem G 1 Heefung 48 Stonnen no transfection, um 72 Stonnen duerno Post transfection duerch eng Heefung vun Zellen am Sous G 1 Ëmwandlung suggestiv vun Zell Doud (Figur 2D). D'Aféierungs- vun bewosst senescence war vun dono Beta Meedchen staining benotzt Mir-34a als eng positiv Kontroll microRNA (Figur 2e) confirméiert. Fir ausschléissen Zell Linn-spezifesch Effekter, goufen d'funktionell Konsequenzen vum Mir-449 bass-Aféierung vun Conditioune vun Zell Zyklus verhaft Fra zu MKN74 Zellen (Zousätzleche Fichier 1, Figur S3). Sou, du-Aféierung vum Mir-449 schellt negatif Prolifératioun vu gastric Kriibs Zell Linnen concomitant mat der Aféierungs- vun senescence an apoptosis zu concordance mat Mir-449 mussen entholl suppressive Funktiounen. Figur 2 Mir-449 ass en Deel vun der Raumstatioun-34 Famill an bremst Zell Prolifératioun. E - Mir-449 ass en Deel vun der Raumstatioun-34 Famill an ass evolutionarily conserved. B - Mir-449 bass-Aféierung an mënschlechen gastric Zell Linnen (SNU638) bremst Zell Prolifératioun (rout Linn) am Verglach zu engem Jacquerie Kontroll (blo Linn) an Mir-146 Kontroll (schwaarz Linn). Feeler Baren vertrieden S.D. C - kale Inspektioun vun Zell Prolifératioun inhibition an senescence-wëll phenotype upon Mir-449 bass-Aféierung an SNU638 Zellen (ënneschten Rot) am Verglach zu Jacquerie transfection Kontroll (ieweschte Rot). D - FACS Analyse Zell Zyklus sub-G1 Heefung vun SNU638 Zellen 72 Stonnen folgenden Mir-449 bass-Aféierung (riets ugëtt) am Verglach zu engem Jacquerie transfection Kontroll (lénks ugëtt) D'Tabell weist Zell Heefung an G1 Ëmwandlung upon Mir-449 bass weisen -introduction Verglach zu Jacquerie RNS Kontroll bei 48 Stonnen Post transfection, gefollegt vun engem dréint op de Sous-G1 Ëmwandlung op 72 Stonnen Post transfection duerops Zell Doud. E - Senescent phenotype vun SNU638 Zellen op Mir-449 an Mir-34a positiver Kontroll du-Aféierung vun dono β-Meedchen assay Verglach zu RNS Jacquerie Kontroll dës VerfÜgung De gemeinsame Som Haaptrei vum Mir-449b an Mir-34a induce héich. soll Ausdrock Ännerungen VerfÜgung fir d'gët kontrolléiert vum Mir-449 Markenzeeche an ze kucken, ob Mir-449 verschidden gët wéi Mir-34a reguléieren, goufen SNU638 Zellen Ausdrock Profiler 24 Stonnen Post iwwerpréift transfection vum Mir-449b oder Mir-34a an differentially ausgedréckt gët identifizéiert. Mir hu fonnt, datt mRNAs mat virausgesot miRNA Zil- Siten (7 mer Som Site) an der 3'UTR mein erof-reegelen Verglach zu mRNAs ouni virausgesot Zil- Siten no transfection vum Mir-449b (p &Si besteet; 1.2e-70, zwee-tailed Wilcoxon Geleeënheet-Zomm Test), (Zousätzleche Fichier 1, Figur S4a). (; 9.9e-25 p &Si besteet), während mRNAs mat Siten zu 5'UTRs goufen nëmme liicht erof-reegelen (p &Si besteet; mRNAs miRNA Som Zil- Siten virausgesot dass Regiounen am coding waren och vill verwandelt-reglementéiert gin fonnt 5.3e- 2). Den Ausdrock Ännerungen entschlof vun transfection vun alen Mir-449b an Mir-34a sech duerchaus trotz Féiss vum alen Message ausserhalb Som Regioun (Pearson d'Korrelatioun souguer gemaach R = 0,94, p = 0) soll, (Zousätzleche Fichier 1, Figur S4b). Mir exhaustively all oligonucleotides (Wierder) vun Längt 5-7 fir Korrelatioun mat verwandelt-Reglement no Mir-449b an Mir-34a transfection (kuckt Methoden) bewäert. Konsequent mat ville Jore Studien, datt dës Analyse de gemeinsame Mir-34a /449b Som Site wéi d'3'UTR Wuert stäerkste soll mat verwandelt-Regulatioun vun de zwee Experimenter (Zousätzleche Fichier 1, Figur S4c). VerfÜgung Mir-449 reguléieren vill Zell Zyklus controllers VerfÜgung Den Ausdrock Profiler benotzt goufen differentially ausgedréckt gët vun Zellen mat Mir-449b oder Kontrollen (Zousätzleche Fichier 1, Dësch S2) transfected z'identifizéieren. Eng Passerelle Aktivéierung Analyse op d'differentially reglementéiert gët baséiert Sarkasmus Mir-449 haaptsächlech gët fir zu Zell Schued Äntwerte, Zell Zyklus Kontroll, inflammation a Kriibs Édouard (Figur 3A) Équipe Proteinen coding Kontrollen. Schwéierpunkt op engem Set vu putative Zil- Genen mat gutt etabléiert Rollen an tumourigenesis, bestätegt mir verwandelt-Regulatioun duerch Mir-449 vun begéint proto oncogene (begéint VerfÜgung), cyclin ofhängeg kinase 6 (CDK6) VerfÜgung, geminin (GMNN ) VerfÜgung, myelocytomatosis Haren oncogenes homolog (MYC) VerfÜgung, sirtuin 1 (SIRT1 VerfÜgung) an histone deacetylase 1 (HDAC1) VerfÜgung um ët Niveau (Figur 3B). Western blot analyséiert d'Fähegkeet vum Mir-449 bestätegt bis erof-regléieren begéint, GMNN, MYC, SIRT1, cyclin E2 (CCNE2) an HDAC1 op d'FAQ fir en Ausmooss gläicht dat erreecht duerch nei-Aféierung vum Mir-34a (Figur 3C). Fir eng Ziel vun Zil- Genen och erfëllt VerfÜgung, GMNN, CCNE2 VerfÜgung, SIRT1 VerfÜgung an HDAC1 VerfÜgung, bestätegt mir direkt Interaktioun vun Mir-449 mat der Zil- Gentherapie 3 'UTR benotzt luciferase assay (Figur 3D ). Figur 3 Mir-449 Ziler Zell Zyklus ziemlech Genen. A - Ingenuity Passerelle Analys (QFont) vun dereguléierte Genen op Mir-449 bass-Aféierung an SNU638 Zellen vun der Gentherapie Kategorien Kriibs, vum Doud a Zell Zyklus Weeër ënner anerem weist verschärfen. B - qPCR Confirmatioun vun Affymetrix flamenden Ofgrond weist verwandelt-Regulatioun vun begéint VerfÜgung, CDK6 VerfÜgung, GMNN VerfÜgung, MYC VerfÜgung an HDAC1 VerfÜgung upon Mir-449 bass-Aféierung Verglach zu Jacquerie RNS Kontrollen. C - Western blot Confirmatioun vun verwandelt-reegelen Genen op Mir-449 bass-Aféierung an SNU638 Zellen am Verglach zu Jacquerie RNS Kontrollen. Kontrollen vun den direkten a funktionell Zil- luciferase gesond verbindlech mat mengn wëll Typ 3'UTRs an mutated 3'UTRs (zwee Projet'en am Mir-449 bindend Site), * - Vinculin (VCL) an tubulin Beta (Tubb) huet als Luede Kontrollen D benotzt beweist statistesch Bedeitung vun luciferase Ausdrock tëscht 3'UTRs wëll Typ mat miR449a transfected /b Verglach zu RNS Kontroll Jacquerie, beweist # statistesch Ënnerscheed zu luciferase Ausdrock tëscht Wëllschwäin Typ 3'UTRs Verglach zu Mann- 3'UTRs transfected mat Mir-449a an miR- 449b. "NS" net relevant p Wäert > 0,05, "*" oder "#" bedeitendst 0,01 &Si besteet; p Wäert &Si besteet; 0,05, "**" oder "##" ganz wichteg 0,01 &Si besteet; p Wäert &Si besteet; 0,001, "***" oder "###" extrem wichteg p Wäert &Si besteet; 0,001 VerfÜgung Blosinstrumenter, Mir-449 Ziler direkt Zell Zyklus regulator Genen konsequent mat engem entholl suppressor Funktioun a mat der Zell Zyklus verhaft observéiert upon Mir-449 bass-Aféierung Kriibsfuerschung Zell Linnen. VerfÜgung Mir-449 induces p53 Ausdrock awer Als mir-34a virdrun afgerappt vun p53 zu Funktioun fonnt gouf ass net duerch p53 VerfÜgung reegelen [30-33], analyséiert mir wann och mir-449a /b zu p53 verbonne waren. Dëst donieft vun der Präsenz vun enger putative p53 bindend Site 10 KB Offloss vum Mënsch Mir-449 begrënnt war (Donnéeën net gewisen). Mir also p53 duerch DNA Schued entschlof UV benotzt oder 5-fluorouracil (5FU) zu véier verschidde Systemer, HCT116 an MEF wëll Typ an p53 Knockout Zellen (Zousätzleche Fichier 1, Figur S5A). Allerdéngs war no p53 Passerelle Aktivéierung (Zousätzleche Fichier 1, Figur S5b) kee groussen Verännerung Mir-449 Ausdrock fonnt. Zu der Konklusioun, hunn mir keng Beweiser datt Mir-449 engem transcriptional Zilscheif vun p53 ass. Wéinst dem fonnt mir dat Mir-449a /b gebass ass Aktivatioun vun p53 zu induce, Aktivatioun vun p53 Äntwert Genen wéi p21 an der Aféierungs- vun apoptosis wéi déi Rëss vun caspase 3 (CASP3) an puer dovun (Kréien-ribose Siicht ) polymerase 1 (PARP) (Figur 4). Géint Mechanismus Verständnis vun deem Mir-449 heescht dat iwwerpréift mir den Effet vum Mir-449 op SIRT1 an HDAC1. SIRT1 an HDAC1 deacetylases sinn déi, ënner anerem, d'Aktivatioun vun p53 an Mir-34 inhibit gouf SIRT1 [34] dës Distanz zu géint. Mir validéiert de spezifeschen bindend vum Mir-449 zu SIRT1 an HDAC1 3'UTR luciferase assays (Figur 3D) benotzt. Figur 4 Mir-449 activéiert der p53 Passerelle. Western blot Analyse eng Erhéijung vun der p53 FAQ upon Mir-449 a positiv Kontroll Mir-34a du-Aféierung an SNU638 Zellen am Verglach zu RNS weist Jacquerie Kontroll souwéi eng Aktivéierung vun der p53 afgerappt Zil- p21 an apoptosis lues eenalecn CASP3 an PARP. Vinculin (VCL) an tubulin Beta (Tubb) als Luede Kontrollen benotzt goufen. VerfÜgung Blosinstrumenter, spekuléieren mir dat Mir-449 der histone deacetylase HDAC1 vun inhibiting an SIRT1 Spëtzekandidat bei der p53 Passerelle Aktivéierung also d'Aféierungs- vun apoptosis lues eenalecn apoptosis induces CASP3 an PARP. VerfÜgung mir-449 ass erof-reglementéiert Mënsch gastric Cancers VerfÜgung d'Wichtegkeet vum mir-449 zu Mënsch malignancies ze diskutéieren mer de Beweis vun mir-449 zu 10 gastric Kriibs biopsies nächst iwwerpréift. Wichtegst, fonnt mir souwuel Mir-449a an b bedeitend erof-reglementéiert oder feelen an 8 vun 10 Primärschoul gastric Cancers gin. Doriwwer eraus, wie den Ausdrock vun Mir-449a an b Co-reegelen (Figur 5a) ze ginn. Mir fannen awer keng Korrelatioun tëschent der Reduktioun Mir-449 Ausdrock a Krankheete Charakteristiken vun de Kriibs (Figur 5b). Analysen vun der Frankräich DNA aus der erhéijen keng Beweiser fir Verloscht oder zwéinHyperfeinstrukturniveaue-methylation vun der methylation-spezifesch vermëschen rop Analyse (MS-Yauch) besot transcriptional verwandelt-Regulatioun vun Ausdrock benotzt Mir-449 loci fonnt (Donnéeën net gewisen). Dohier, am Accord mat Daten aus zwee Maus Modeller vun gastric inflammation an hyperplasia, den Ausdrock vum Mir-449 ass erof-reglementéiert Mënsch gastric Cancers. Figur 5 Mir-449 ass duerch mënschlechen gastric Cancers reegelen. qPCR Analyse (ieweschte Rot) weist verwandelt-Regulatioun vum Mir-449 Ausdrock vun 8 gastric Kriibs Stoffer Verglach zu Mir-449 Ausdrock vun Prouf-stemmt Kontrollen (agekreest Linn). U44 war den endogenous Kontroll benotzt. Table weist Medeziner Informatiounen vun Patienten (ënneschten Rot). "NS" net relevant p Wäert > 0,05, "*" bedeitendst 0,01 &Si besteet; p Wäert &Si besteet; 0,05, "**" ganz wichteg 0,01 &Si besteet; p Wäert &Si besteet; 0,001, "***" extrem wichteg p Wäert &Si besteet; 0,001 VerfÜgung Diskussioun VerfÜgung Gastric Kriibs ass eng absolut spektakulärer malignancy mat méi wéi 21.500 nei Fäll all Joer an d'USA eleng [35]. D'Krankheet ass dacks spéit fonnt an der 5-Joer Iwwerliewe Taux ass doduercher ënner 20% [36]. Et ass also wichteg déi etiology an Werdegang Etappe vun der Krankheet ze verstoen. D'Wichtegkeet vun der bakteriell, Ëmwelt- a Provider genetesch Risiko Facteuren zu gastric carcinogenesis muss studéiert ginn, awer manner ass iwwer de molekulare Werdegang vun der Krankheet bekannt [37, 38]. Ënner anerem, ass zu 30-60% vun gastric Cancers gemellt p53 Passerelle inactivation [39, 40] a rezent Studien proposéiere H. pylori VerfÜgung direkt modulation vun der p53 Gentherapie oder seng afgerappt Ziler [41]. Aner gemeinsam Verfall vun gastric Kriibs ass d'perturbation vun der Zell Zyklus Kontroll iwwer der Regioun Ausdrock vun Cyclin E1, déi mat entholl aggressiveness an lymph Node Metastasen assoziéiert ass [42, 43].

• Den Afloss vun der N-acetyl-L-cystein infusion op cytokine Niveauen a gastric intramucosal pH während schwéieren sepsis
• Benign Gastro-Linga fistula zu enger Fra mat Gewiichtsverloscht a liicht iwelzeg presentéieren: e Fall report