miR-449 inhibe la proliferación celular y es el regulado en el cáncer gástrico

miR-449 inhibe la proliferación celular y es el regulado en el cáncer gástrico
Resumen Antecedentes

El cáncer gástrico es el cuarto cáncer más común en el mundo y la segunda causa más frecuente de muerte relacionada con el cáncer. El desarrollo de cáncer gástrico se asocia principalmente con H. Pylori
infección que conduce a un enfoque en estudios de patología en los factores bacterianos y del medio ambiente, y en menor medida en el desarrollo mecanicista del tumor. Los microARN son pequeñas moléculas de ARN no codificantes implicadas en la regulación de genes post-transcripcional. Se encuentran para regular los genes implicados en diversas funciones biológicas y las alteraciones en la expresión de microARN se han relacionado con la patogénesis de muchas enfermedades malignas. El presente estudio se centra en identificar microRNAs implicados en la carcinogénesis gástrica y para explorar su relevancia mecanicista mediante la caracterización de sus objetivos.
Resultados
microarrays Invitrogen nCode miARN miR-449 identificó a disminuir en 1 años de edad, gastrina
ratones KO y en H. Pylori
tejidos gástricos infectados en comparación con los tejidos de los animales de tipo salvaje. tasa de crecimiento de líneas de células gástricas sobre-expresión de miR-449 se inhibió en un 60% en comparación con los controles. El análisis del ciclo celular FACS de miR-449 sobre-expresión de las células mostró un aumento significativo en la sub-G 1 fracción indicativo de la apoptosis. ß-gal pruebas mostraron un fenotipo senescente de líneas de células gástricas sobre-expresión de miR-449. Affymetrix arrays 133v2 identificaron GMNN
, MET, CCNE2, SIRT1
y CDK6
como miR-449 objetivos. Los ensayos de luciferasa fueron utilizados para confirmar GMNN
, MET
, CCNE2 Opiniones y SIRT1
como objetivos directos. También mostramos que el miR-449 sobre-expresión activa p53 y p21 aguas abajo su objetivo, así como la CASP3 marcadores de apoptosis troceados y PARP. Es importante destacar que los análisis de PCR cuantitativa mostró una pérdida de miR-449 expresión en tumores gástricos clínicos en humanos en comparación con los tejidos normales.
Conclusiones
En este estudio, documentamos una expresión disminuida de miR-449 en ratones KO
gastrina y confirmado aún más su pérdida en tumores gástricos humanos. Hemos investigado la función de miR-449 mediante la identificación de sus objetivos directos. Además se muestra que el miR-449 induce la apoptosis y la senescencia mediante la activación de la vía de p53.
Antecedentes
El cáncer gástrico es uno de los cinco tipos de cáncer más comunes en el mundo y la segunda causa más frecuente de muerte por cáncer [1] . Es principalmente, pero no exclusivamente, causada por la infección por H. Pylori
[2] ya que no todos H. Pylori
las personas infectadas desarrollan tumores [3]. Otros factores implicados en el desarrollo de cáncer gástrico incluyen el grado y el tipo de la respuesta inflamatoria [2], así como los niveles de la hormona gastrina
[4, 5]. Varios estudios han demostrado que tanto la hipergastrinemia [6, 7] y la falta de gastrina [5] contribuyen a la patogénesis del cáncer gástrico. Aclorhidria es una característica común de modelos de ratones propensos a la metaplasia en desarrollo y el cáncer [6, 8, 9]. Gastrina
ratones knockout son aclorhidria [10], lo que favorece un crecimiento excesivo de bacterias gástrico [11, 12], y las infecciones bacterianas crónicas gástrico conduce a la metaplasia gástrica que puede progresar a cáncer gástrico [6, 12].
Desde su descubrimiento microRNAs, se han encontrado implicado en una gama muy amplia de procesos normales y patológicos [13]. MicroARNs ejercen sus funciones reguladoras posttranscriptionally mediante la unión a parte secuencia complementaria: motivos predominantemente en el 3 'UTR del ARNm diana que resultan en la desestabilización del mRNA y la represión de traducción [14]. Desde un punto de vista biológico, los microARNs son un reto para estudiar los objetos ya que regulan cohortes de genes diana, que no son fácilmente identificados. Desde un punto de vista terapéutico, los microARNs son muy interesantes ya que varios estudios han demostrado el poder de microARNs como biomarcadores preclínicos y estudios iniciales han establecido que los microARNs pueden ser dirigidos terapéuticamente in vivo [15].
Perfiles de estudios han evidenciado la desregulación en microARN un amplio espectro de enfermedades, incluyendo todos los principales tipos de cáncer [16]. Los microARN probable que afectan a los procesos tumorigénicos en dos niveles. En primer lugar, varios estudios han establecido funciones pro-oncogénicos o supresores tumorales de microARN que vinculan firmemente estos a la etiología del cáncer como se ejemplifica en el miR-155, miR-10b y miR-21 [17-19]. En segundo lugar, el sistema de regulación microRNA por sí parece tener funciones supresoras de tumores como la ablación genética de factores microARN biogénesis clave, como Dicer, aumentar fuertemente la susceptibilidad al cáncer [20] y la pérdida de función de las mutaciones han sido identificadas en importantes factores de procesamiento microRNAs en tumores humanos [21-23].
en este estudio, se aborda la importancia de microRNAs en cáncer gástrico aprovechando la gastrina
modelo de ratón knockout y H. pylori Red de ratones de tipo salvaje. Identificamos el miR-449 como significativamente las reguladas o perdido en modelos de ratón de cáncer gástrico, así como en los tumores gástricos primarios humanos. Identificación de los objetivos de mRNA revela que este microARN probable que ejerce funciones supresoras de tumores a través de la regulación concertada de una cohorte de los reguladores del ciclo celular asociados al cáncer, incluyendo MET, GMNN, CCNE2, SIRT1, y HDAC1.
Métodos Ratones

se utilizaron tres grupos diferentes de edad (12-16 semanas, 1 año o 1 ½ años) de tipo salvaje (wt) o de la gastrina
ratones knock-out (KO). Todos los ratones estaban en un mezclado /SvJ, C57BL /6J fondo 129, backcrossed al menos cuatro veces a ratones C57BL /6J [12]. Los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos y controlados de acuerdo con la Federación de Asociaciones Europeas de Animales de Laboratorio de Ciencias recomendación [24] con 12 h de luz y 12 h oscuridad ciclos.
H. pylori
C57BL6 /J ratones (n = 10) se inocularon con un clon adaptado la no-ratón de H. Pylori
cepa 67:21, aislado originalmente de una biopsia antral obtenido a partir de una hembra sueco con úlcera gástrica. La cepa es VacA + y contiene toda la isla de patogenicidad Cag (PAI) con la estabilidad genética en el cagPAI [25]. Los ratones se inocularon cada segundo día (tres veces) durante un período de 5 días. Se extrajo el ADN y se analizó para la presencia de especies de Helicobacter usando un ensayo de electroforesis en gel de gradiente de semi-anidada de reacción en cadena de polimerasa desnaturalizante, específico para el género Helicobacter, como se describe anteriormente [26]. Un grupo de referencia de ratones C57BL6 /J no infectados se utilizaron como controles.
Los estómagos de todos los ratones fueron disecados en fundus y antro antes de la extracción de ARN. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Danés Bienestar de los Animales (2005 /562-40) y la Agencia Danesa Forestal y de la Naturaleza (20010077355/6).
Secciones del antro Ratones
ratones fueron sacrificados por dislocación cervical. El antro se retiró, se lavó suavemente en PBS enfriada con hielo, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta la extracción de ARN.
Análisis de muestras clínicas
biopsias de cáncer gástrico y los tejidos normales adyacentes fueron obtenidas de pacientes someterse a una cirugía para el cáncer gástrico en el Departamento de cirugía gastrointestinal, Rigshospitalet. La inclusión se llevó a cabo en julio a diciembre de 2008 y todos los pacientes otorgaron su firma, el consentimiento informado (la aprobación del comité ético H-B-2008-049) y la Agencia de Protección de Datos de Dinamarca (2008-41-2138). Las biopsias se colocaron en RNAlater (Ambion) en la sala de operaciones y posteriormente se congelaron a -80 ° C hasta la extracción de ARN.
Extracción de ARN y análisis de qPCR
ARN fue extraído por medio de TRIzol (Invitrogen) según el fabricante. perfil de expresión de los genes miARN se evaluó mediante ensayos TaqMan miARN (Applied Biosystems) para HSA /MMU-miR-449a yb, HSA /MMU-miR-34a, byc y rnu44 o HSA /MMU-mir-191. primer secuencias de Affymetrix validación de objetivos se enumeran en el archivo adicional 1, el cuadro S1. El cultivo celular
SNU638 y MKN74 se cultivaron en medio RPMI-1640 (Gibco) con 10% de FBS (Hyclone), 100 U /ml de penicilina y 100 g /ml de estreptomicina (Invitrogen) y se incubaron a 37 ° C en 5% de CO 2. células HCT116 (WT y p53 - /- fueron cultivadas en 5A de McCoy (Gibco) con 10% de FBS (Hyclone), y 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (Invitrogen) y se incubaron a 37 ° C en 5% de CO <. sub> 2 HEK293 y células MEF (wt y p53 - /-) se cultivaron en DMEM (Gibco) con 10% de FBS (Hyclone), 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (Invitrogen) y se incubaron a 37 ° C con un 5% de CO 2.
precursores de miRNA y siRNA
miARN precursores fueron adquiridos de Ambion, hsa-miR-449a (PM11521), hsa-miR-449b (PM11127) y hsa-miR-34a ( PM11030). analiza el crecimiento de la célula
células SNU638
se sembraron en placas de 24 pocillos y se transfectaron al día siguiente con 50 nM miARN dúplex o siRNA utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). las células fueron fijadas en los puntos de tiempo indicados en paraformaldehído al 4% , manchada en una solución de cristal violeta 0,1%, y se resuspendió en ácido acético al 10%. absorbancia de la muestra se midió a 620 nm. ciclo celular
FACS análisis
células SNU638 y MKN74 se sembraron a 2 x 10 6 células por 10 cm de placa y se transfectaron con 50 nM miARN duplex (Ambion) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Las células se recogieron 48 y 72 horas después de la transfección, se tiñeron para contenido de ADN usando yoduro de propidio (PI) y se analizaron en un citómetro de flujo FACS Calibur (Becton-Dickinson). Brevemente, las células se recogieron por tripsinización y se lavaron una vez con PBS antes de fijar durante la noche en 70% EtOH. Para teñir el ADN, las células se sedimentaron, se resuspendieron en 100 l de EtOH y se tiñeron durante 1 hora con 300 l solución de PI (0,05 mg /ml PI, 20 mg /ml de ARNasa A en 0,1% de BSA) analiza.
Senescencia células
SNU638 se sembraron a 400.000 células por 6-placa de pocillos y se transfectaron con 50 nM miARN duplex (Ambion) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Cuatro días después de la transfección, las células se lavaron en PBS y se fijaron durante 5 minutos a temperatura ambiente en 2% de formaldehído /0,2% de glutaraldehído. Las células se lavaron dos veces en PBS pH 6,0 antes de ser teñido con solución fresca senescencia asociado β-Gal mancha (1 mg /ml 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ßD-galactósido (X-Gal), 0,12 mM K 3Fe [CN] 6, 0,12 mM K 4Fe [CN] 6, 1 mM de MgCl 2 en PBS, pH 6,0) durante la noche a 37 ° C sin CO 2 de suministro . Las células se lavaron una vez en PBS (pH 6,0) y se observaron bajo el microscopio.
Los anticuerpos y análisis de Western blot
SNU638 se sembraron a 2 x 10 6 células por placa de 10 cm, transfectadas dos veces en dos sucesivas días con 50 nM dúplex miARN utilizando Lipofectamine 2000 según el fabricante (Invitrogen). Se recogieron las células por tripsinización, se lavaron una vez con PBS y se lisaron en tampón RIPA (150 mM NaCl, 0,5% desoxicolato de sodio, 0,1% de SDS, 1% de Igepal, 50 mM Tris-HCl pH 8, EDTA 2 mM) suplementado con DTT 1 mM, 1 mM de Pefabloc, 1 mM de NaV3, 10 mM NaF y 1X completos comprimidos de cóctel inhibidor de la proteasa de mini almacenamiento. 25 g de proteína /carril se resolvieron en geles NuPAGE 4-20% Bis-Tris (Invitrogen) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Los anticuerpos primarios utilizados fueron MET (Señal Celular 4560), MYC (Señal Celular 9402), GMNN (Santa Cruz Sc-53923), VCL (Sigma V9131), TP53 (Santa Cruz Sc-126), CDKN1A (Santa Cruz Sc-6246) , CDK6 (Santa Cruz Sc-177), HDAC1 (Santa Cruz Sc-7872), CCNE2 (señal celular 4132), TUBB (Abcam ab11304), PARP (señal de la célula 9542) y se escindió CASP3 (señal celular 9661).
análisis de microarrays
ARN pequeños (< 200 nt) se aislaron con Invitrogen PureLink miARN Kit de aislamiento a partir de tejido fúndica y antral de 1) ratones gastrina
KO y la edad y los ratones de control C57BL6 /J sexo emparejado, y 2) C57BL6 /J ratones infectados con H. Pylori
y la edad y el sexo no infectada acertaron ratones de control C57BL6 /J, (n = 4 para cada grupo). Se determinó la calidad de los pequeños ARN aislado utilizando el ensayo de pequeños ARN en un Agilent Bioanalyzer. 500 ng de ARN pequeño se marcó con el kit Genisphere FlashTag y se hibrida a Invitrogen nCode de múltiples especies miARN microarrays V2 en una estación de hibridación Maui. portaobjetos procesados ​​se escanearon en un escáner de microarrays de ADN de Agilent. imágenes resultantes se analizaron y la relación de la mediana normalizaron mediante GenePix Pro 6.0. Cuatro repeticiones biológica se utilizaron para cada comparación. Las muestras se hibridan con cuatro matrices en un color de tinte de intercambio de microarrays diseño de doble experimental. ArrayTools BRB se utilizaron para el cambio veces y cálculos estadísticos. miARN datos seleccionados de la matriz de análisis se validaron utilizando en tiempo real ensayos de PCR TaqMan miARN. Los datos serán depositadas en ArrayExpress después de la aceptación.
Matrices de ARNm
SNU638 fueron transfectadas con 50 nM de miR-34a o miR-449b dúplex de siRNA Siglo utilizados como control negativo. ARN total fue extraído 24 horas después de la transfección usando el reactivo TRIzol. el análisis de microarrays de Affymetrix (HG-U133 Plus 2.0 humano) se llevó a cabo en el Centro de microarrays, Rigshospitalet, Hospital Universitario de Copenhague. Los experimentos se ejecutan en cualquiera de los triplicados o cuadruplicado. Los datos serán depositadas en ArrayExpress después de la aceptación.
Vectores construcción y ensayos de reportero Francia El 3'UTRs de HDAC1
, SIRT1
, MET
, GMNN Opiniones y CCNE2
celebración sitios de unión de miR-449 se clonaron aguas abajo del indicador de luciferasa en el sistema de vectores PMIR-INFORME (Ambion). se utilizó Quickchange dirigida al sitio kit de mutagénesis (Stratagene) para inducir dos mutaciones puntuales en la región de la semilla. secuencias de los cebadores de mutagénesis se enumeran en el archivo adicional 1, el cuadro S1.
células HEK293 fueron sembradas en placas de 96 pocillos y se transfectaron con 20 nM precursor de miARN o revueltos siRNA control, 20-50ng del vector de luciferasa (PMIR-informe) y 5 ng de Renilla vector (pRL-TK) utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Las células se recogieron 24 horas después de la transfección y la actividad luciferasa se midió usando un ensayo doble-Glo luciferasa (Promega). Se procesó Análisis de microarrays
de datos de microarrays de expresión utilizando el paquete 'affy' en BioConductor [27]. intensidades sonda conjunto se resumen y se normalizaron cuantil utilizando los paquetes BioConductor RMA y VSN. La expresión diferencial se determinó por probeset usando una prueba t. Probe conjuntos fueron asignadas a las transcripciones Ensembl (versión 49) utilizando asignaciones previstas en BioMart. Probesets mapeado en el que dos genes Ensembl diferentes fueron descartados.
Evaluación de la regulación por disminución global del microRNA genes diana
Los 3'UTRs, 5'UTRs y las secuencias de codificación de las transcripciones fueron analizados en busca de juego 6mer, 7mer y miARN 8mero sitios de semillas (complementarios a la posición 2-7, 2-8, 2-9 y del miARN). Análisis global de los genes miARN objetivo se evaluó la regulación negativa utilizando la secuencia de 3'UTR más larga por gen para evitar el sesgo introducido por los genes con muchas isoformas de transcripción. Se descartó transcripciones con secuencias 3'UTR más cortos de 50 nt. Para globalmente evaluamos si miARN objetivo genes se redujeron reguladas después de miARN transfección, se prueba la hipótesis nula de que la distribución de cambios de expresión de los genes miARN objetivos (que tienen un sitio de destino 7mer) era igual a la distribución de todos los genes expresados ​​sin sitios objetivo predichos utilizando el no paramétrica de Wilcoxon la suma de rangos. Un enfoque similar se utilizó para evaluar la baja regulación de los genes con genes miARN sitios objetivo en las regiones y 5'UTRs de ARNm de codificación.
Evaluación estadística exhaustiva de palabras en correlación con la baja regulación
Se utilizó un no paramétrico publicado previamente clasificación basada en estadística para evaluar exhaustivamente la correlación de apariciones de palabras en 3'UTRs y el cambio en la expresión de genes después de la transfección de los genes miARN [28, 29]. Los genes fueron ordenados por el cambio de expresión inducida por transfección de miR-34a o miR-449b, y la correlación con la baja regulación se puso a prueba para todas las palabras de longitud 5-7 (N = 21 504). Las pruebas estadísticas
t de Student con corrección de Welch.
resultados
miR-449b es el regulado en el antro de los dos ratones KO
gastrina y H. pylori
ratones infectados
gastrina
ratones knockout son aclorhidria con una tendencia para el desarrollo de la hiperplasia antral gástrica y adenomas con el tiempo (Figura 1) [6, 12]. Con el fin de identificar microRNAs desregulados durante el desarrollo de cáncer gástrico, se examinaron los perfiles de expresión de miRNAs en las neoplasias gástricas de gastrina ratones knockout
utilizando microarrays miARN. Como se muestra en la tabla 1, 20 microARN fueron desregulados significativamente en los ratones deficientes en comparación con los controles de tipo camada salvajes, con tres miRNAs difieren más de dos veces, miR-7 siendo el miR-709 y miR-449b se redujeron reguladas hasta reguladas y en el antro de la gastrina
ratones knockout en comparación con los tipos silvestres. Para confirmar aún más el miR-449 desregulación durante el desarrollo de cáncer gástrico, se analizó su expresión en los tejidos del antro tipo de ratones silvestres infectados con H. Pylori
. Curiosamente, los arrays miARN demostraron una baja regulación específica de miR-449b en H. Pylori
ha ratones infectados (tabla 2 y la disposición 1, la figura S1). Figura 1 Old gastrina ratones knockout desarrollar adenomas gástricos. antro secciones aisladas de 12-16 semanas de edad ratones (panel izquierdo), de 12 a 18 meses de edad ratones (panel central) y mayores de 18 meses, los ratones (panel derecho), de tipo salvaje (panel superior) y la gastrina
ratones knockout (panel inferior). Secciones muestran el desarrollo de adenoma en los tejidos del antro en los gastrina
nocauts en comparación con los tipos silvestres.
Tabla 1 miRNAs desregulados en gastrina
ratones knockout
miARN Nombre
log2 veces
valor p
miARN Name

Log2-fold

p-value

mmu-miR-709
-1.73
7.0E-06
mmu-miR-422b
0.44
4.6E-02
mmu-miR-449b
-1.37
1.6E-03
mmu-miR-199a*
0.50
7.7E-03
mmu-miR-805
-1.01
7.5E-03
mmu-miR-25
0.51
1.6E-02
mmu-miR-706
-0.98
3.1E-03
mmu-miR-27b
0.56
5.1E-03
mmu-miR-467a
-0.88
2.8E-02
mmu-miR-182
0.56
1.8E-02
mmu-miR-696
-0.83
7.1E-03
mmu-miR-30a-3p
0.59
2.2E-02
mmu-miR-667
-0.66
2.3E-02
mmu-miR-10a
0.70
7.1E-03
mmu-miR-690
-0.28
1.7E-02
mmu-miR-152
0.70
2.3E-02
mmu-miR-18
0.29
3.7E-02
mmu-miR-1
0.77
7.1E-03
mmu-miR-143
0.34
2.3E-02
mmu-miR-7
1.06
4.9E-03
Lista de miRNAs desregulados significativamente en las neoplasias gástricas de gastrina
ratones knockout en comparación con los tipos silvestres.
Tabla 2 miRNAs desregulados en H.pylori
tejidos infectados
nombre de miARN Doblar
change

p-value

mmu-miR-122a
-3.247
0.000788
mmu-miR-449b
-0.879
0.045214
Lista de miRNAs desregulados significativamente en los ratones de tipo salvaje antro infectados con H. pylori en comparación con
antro no infectado.
MiR-449 inhibe la progresión del ciclo celular e induce la senescencia
Habiendo demostrado la regulación por disminución de miR-449 expresión en los cánceres gástricos que quería examinar el efecto de la re-expresión de miR-449 en líneas celulares de cáncer gástrico. Curiosamente no se detectó expresión notable de la familia miR-449 a través de un panel de líneas celulares gástricas incluyendo SNU638, SNU5, SNU216, SNU601 y MKN74 sostener la noción de miR-449 que tiene funciones de tumor supresor (datos no mostrados). La familia de miR-449 se compone de miR-449a yb en los seres humanos y miR-449a, b y c en ratones. Curiosamente, que comparten la misma secuencia de semillas como la familia de miR-34 y por lo tanto se espera que para regular cohortes superpuestas de genes diana (Figura 2a). Para evaluar la función de miR-449 en líneas de células gástricas que se reintroducen miR-449b en las células SNU638 y MKN74. En comparación con los microRNAs de control negativo, re-introducción de miR-449b afectó fuertemente la proliferación de SNU638 células (figura 2b) y la inspección visual de las células de la inducción de la apoptosis y la senescencia celular (figura 2c, y la disposición 1, figura S2) indicados. Análisis de citometría de flujo de células de yoduro de manchado de propidio transfectadas con miR-449b mostró una G 1 acumulación 48 horas después de la transfección, seguido a las 72 horas después de la transfección por una acumulación de células en el sub G 1 fracción sugestivo de célula la muerte (figura 2d). La inducción de la senescencia celular se confirmó mediante tinción gal beta ácida usando miR-34a como un control positivo microARN (figura 2e). Para descartar los efectos específicos de la línea de células, las consecuencias funcionales de miR-449 reintroducción en términos de la detención del ciclo celular se verificaron en MKN74 células (archivo adicional 1, figura S3). Por lo tanto, la reintroducción de miR-449 afecta negativamente la proliferación de líneas celulares de cáncer gástrico concomitantes con la inducción de la senescencia y la apoptosis en concordancia con el miR-449 funciones supresoras tumorales que tiene. Figura 2 miR-449 es parte de la familia miR-34 e inhibe la proliferación celular. A - miR-449 es parte de la familia de miR-34 y es conservado evolutivamente. B - miR-449 reintroducción en líneas de células gástricas humanas (SNU638) inhibe la proliferación celular (línea roja) en comparación con un control mezclado (línea azul) y el control de miR-146 (línea de color negro). Las barras de error representan S. D. C - La inspección visual de la inhibición de la proliferación celular y la senescencia fenotipo similar al de miR-449 reintroducción en SNU638 células (panel inferior) en comparación con el control de transfección revueltos (panel superior). D - análisis del ciclo celular FACS que muestra la acumulación de sub-G1 de SNU638 células 72 horas siguientes miR-449 re-introducción (histograma a la derecha) en comparación con un control de transfección revueltos (histograma de la izquierda) La tabla muestra la acumulación de células en la fracción de G1 a miR-449 re -Introducción comparación con el control de ARN codificado a las 48 horas después de la transfección, seguido por un cambio a la fracción sub-G1 a las 72 horas después de la transfección indicativo de la muerte celular. E - fenotipo senescente de SNU638 células tras el miR-449 y miR-34a control positivo reintroducción se muestra mediante el ensayo de β-gal ácida en comparación con el ARN control mezclado Francia El secuencia de semillas conjunta de miR-449b y miR-34a inducir altamente. cambia de expresión correlacionada
para caracterizar las transcripciones controlados por el miR-449 y para ver si el miR-449 regula diferentes transcripciones que miR-34a, se examinaron las células SNU638 perfiles de expresión de 24 horas después de la transfección de miR-449b o miR-34a y diferencialmente transcripciones expresadas identificados. Se encontró que el ARNm con sitios predichos miARN objetivo (sitio de semilla 7 mer) en el 3'UTR fueron significativamente las reguladas en comparación con los ARNm sin sitios objetivo previsto después de la transfección de miR-449b (p < 1.2e-70, de dos colas Wilcoxon la suma de rangos), (archivo adicional 1, figura S4a). ARNm que tienen predijo miARN sitios objetivo de semillas en las regiones de codificación también resultaron ser significativamente reducido regulado (p < 9.9E-25), mientras que los ARNm con sitios en 5'UTRs eran sólo marginalmente reducido regulado (p < 5.3e- 2). Los cambios en la expresión inducida por transfección de madurez de miR-449b y miR-34a están altamente correlacionados a pesar de la divergencia de las secuencias maduras fuera de la región de semillas (coeficiente de correlación r de Pearson = 0,94, p = 0), (1 de ficheros adicionales, figura S4b). Nosotros evaluamos de forma exhaustiva todos los oligonucleótidos (palabras) de longitud de 5-7 para la correlación con la regulación a la baja después de miR-449b y transfección de miR-34a (véase métodos). Consistente con muchos estudios previos, este análisis reveló el sitio de semilla compartida miR-34a /449b como la palabra 3'UTR más correlacionado con la regulación a la baja en los dos experimentos (archivo adicional 1, figura S4c).
MiR-449 regula numerosos controladores del ciclo celular
se utilizaron los perfiles de expresión para identificar las transcripciones expresados ​​diferencialmente en las células transfectadas con el miR-449b o controles (archivo adicional 1, el cuadro S2). Un análisis de activación de la vía sobre la base de los transcritos regulados diferencialmente demuestra que miR-449 controla principalmente las transcripciones que codifican para proteínas implicadas en las respuestas de daño celular, el control del ciclo celular, la inflamación y las vías de cáncer (Figura 3A). Enfoque de un conjunto de genes diana putativos con roles bien establecidos en la génesis tumoral, se confirmó la baja regulación de miR-449 de oncogén conocido proto (MET
), quinasa dependiente de ciclina 6 (CDK6)
, geminin (GMNN )
, mielocitomatosis oncogenes virales homólogo (MYC)
, SIRT1 (SIRT1
) y la histona deacetilasa 1 (HDAC1)
en el nivel de transcripción (Figura 3b). Los análisis de Western blot confirmó la capacidad de miR-449 para regular a la baja MET, GMNN, MYC, SIRT1, la ciclina E2 (CCNE2) y HDAC1 a nivel de proteínas en una medida similar a la alcanzada por la re-introducción de miR-34a (figura 3c). Para un subconjunto de genes diana, incluyendo MET
, GMNN, CCNE2
, SIRT1 Opiniones y HDAC1
, que confirmó la interacción directa de miR-449 con el objetivo de genes UTR 3 'usando el ensayo de luciferasa (figura 3d ). Figura 3 miR-449 se dirige a los genes del regulador del ciclo celular. A - Análisis ingenio Pathway (IPA) de los genes desregulados sobre el miR-449 reintroducción en SNU638 células que muestran el enriquecimiento de las vías de cáncer de categorías de genes, la muerte celular y ciclo celular entre otros. B - qPCR validación de los vectores Affymetrix que muestra la baja regulación de MET
, CDK6
, GMNN
, MYC Opiniones y HDAC1
sobre el miR-449 reintroducción en comparación con los controles de ARN revueltos. C - validación de transferencia Western de reguladas por los genes sobre el miR-449 reintroducción en SNU638 células en comparación con los controles de ARN revueltos. Vinculina (VCL) y la beta tubulina (TUBB) se utilizaron como controles de carga D - verificación de blanco directo y funcional de unión utilizando construcciones de luciferasa que sostienen 3'UTRs de tipo salvaje y mutadas 3'UTRs (dos mutaciones en el miR-449 sitio de unión), * indica la significación estadística en la expresión de luciferasa entre 3'UTRs de tipo salvaje transfectadas con miR449a /b en comparación con el control de ARN revueltos, # indica diferencia estadísticamente significativa en la expresión de luciferasa entre 3'UTRs de tipo salvaje en comparación con 3'UTRs mutantes transfectadas con miR-449a y miR 449b. "Ns" no es significativo el valor de p > 0.05, "*" o "#" significativo 0,01 < valor de p < 0.05, "**" o "##" muy significativo 0,01 < valor de p < 0.001, "***" o "###" extremadamente importante valor de p < 0.001
Por lo tanto, el miR-449 se dirige directamente a genes reguladores del ciclo celular consistentes con una función supresora de tumores y con la detención del ciclo celular observado en el miR-449 reintroducción en líneas celulares de cáncer.
MiR-449 induce la expresión de p53, pero no está regulada por p53
Como se observó anteriormente miR-34a para funcionar aguas abajo de p53 [30-33], analizamos si también miR-449a /b estaban relacionados con p53. Esto fue además estimulado por la presencia de un sitio de unión putativo p53 10 kb aguas arriba de humano miR-449 (datos no mostrados). Por lo tanto, induce p53 por daño en el ADN utilizando UV o 5-fluorouracilo (5-FU) en cuatro sistemas diferentes, HCT116 y células MEF tipo salvaje y knockout p53 (archivo adicional 1, figura S5a). Sin embargo, no se detectó ningún cambio significativo en la expresión de miR-449 después de la activación de la vía de p53 (archivo adicional 1, figura S5B). En conclusión, no se encontraron pruebas de que el miR-449 es un objetivo transcripcional de p53. Por otra parte, se encontró que miR-449a /b es capaz de inducir la activación de p53, la activación de genes de respuesta a p53 como p21 y la inducción de apoptosis como se evidencia por la escisión de la caspasa 3 (CASP3) y poli (ADP-ribosa ) 1 polimerasa (PARP) (figura 4). Hacia la comprensión del mecanismo por el cual el miR-449 hace esto se examinó el efecto de miR-449 en SIRT1 y HDAC1. SIRT1 y HDAC1 son desacetilasas que inhiben, entre otros, la activación de p53 y miR-34 se ha demostrado que reprimir SIRT1 [34]. Hemos validado la unión específica de miR-449 de SIRT1 y HDAC1 usando ensayos de luciferasa 3'UTR (Figura 3d). Figura 4 miR-449 activa la vía de p53. El análisis de transferencia Western que muestra un aumento de la proteína p53 a miR-449 y el control positivo miR-34a re-introducción en SNU638 células en comparación con ARN revueltos control, así como una activación de las aguas abajo marcadores p21 objetivo y la apoptosis de p53 CASP3 y PARP escindida. Vinculina (VCL) y la tubulina beta (TUBB) se utilizaron como controles de carga.
Por lo tanto, se especula que miR-449 induce la apoptosis mediante la inhibición de la histona deacetilasa HDAC1 y SIRT1 que conduce a la activación de la vía p53 por lo tanto la inducción de marcadores de apoptosis escindido CASP3 y PARP.
miR-449 es el regulado en los cánceres gástricos humanos
Para evaluar la importancia de miR-449 en tumores malignos humanos próximo examinado la expresión de miR-449 en 10 biopsias de cáncer gástrico. Es importante el descubrimiento tanto de miR-449a yb ser significativamente las reguladas o ausente en 8 de cada 10 cánceres gástricos primarios. Por otra parte, la expresión de miR-449a yb parece ser co-regulados (figura 5a). No hemos encontrado ninguna correlación entre la reducción de la expresión de miR-449 y las características clínicas del cáncer (figura 5b). Los análisis del ADN genómico de los tumores no encontraron ninguna evidencia de la pérdida o hiper-metilación de los miR-449 loci utilizando el análisis de curva de fusión específica de metilación (MS-MCA) que indica transcripcional baja regulación de la expresión (datos no mostrados). Por lo tanto, de acuerdo con los datos de dos modelos de ratón de inflamación gástrica y la hiperplasia, la expresión de miR-449 es el regulado en los cánceres gástricos humanos. Figura 5 miR-449 es el regulado en los cánceres gástricos humanos. El análisis qPCR (panel superior) que muestra la baja regulación de la expresión de miR-449 en 8 tejidos de cáncer gástrico en comparación con el miR-449 expresión en muestras controles emparejados (línea de puntos). U44 se utilizó como control endógeno. Tabla que muestra la información clínica de los pacientes (panel inferior). "Ns" no es significativo el valor de p > 0.05, "*" significativo 0,01 < valor de p < 0.05, "**" muy significativo 0,01 < valor de p < 0.001, "***" extremadamente importante valor de p < 0,001
Discusión
El cáncer gástrico es un tumor maligno altamente letal con más de 21.500 nuevos casos cada año sólo en los Estados Unidos [35]. La enfermedad a menudo se detecta tarde y la tasa de supervivencia a 5 años es por lo tanto inferior al 20% [36]. Por tanto, es importante comprender las etapas etiología y progresión de la enfermedad. La importancia de los factores de riesgo genéticos bacterianos, ambientales y del huésped a la carcinogénesis gástrica han sido estudiados, sin embargo, se sabe menos acerca de la progresión molecular de la enfermedad [37, 38]. Entre otros, se informa de la inactivación vía de p53 en 30-60% de los cánceres gástricos [39, 40] y estudios recientes sugieren H. pylori
modulación directa del gen de p53 o sus objetivos de abajo [41]. Otra alteración común en el cáncer gástrico es la perturbación del control del ciclo celular a través de la expresión de la ciclina E1 sobre, que se asocia con la agresividad del tumor y la metástasis de los ganglios linfáticos [42, 43].

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