miR-449 hemmt die Zellproliferation und wird herunterreguliert im Magen-cancer

miR-449 Zellproliferation hemmt und wird herunterreguliert bei Magenkrebs
Zusammenfassung
Hintergrund
Magenkrebs die vierthäufigste Krebs in der Welt ist und die zweithäufigste Ursache von Krebs im Zusammenhang mit dem Tod. Die Entwicklung von Magenkrebs ist vor allem im Zusammenhang mit H. Pylori
Infektion in Pathologie Studien über bakterielle und Umweltfaktoren, und in geringerem Ausmaß auf der mechanistischen Entwicklung des Tumors zu einem Fokus führt. MicroRNAs sind kleine nicht-kodierende RNA-Moleküle beteiligt in posttranskriptionales Genregulation. Sie finden sich Gene in verschiedenen biologischen Funktionen und Veränderungen in der MikroRNA-Expression verknüpft wurden mit der Pathogenese von vielen Malignitäten verwickelt zu regulieren. Die aktuelle Studie konzentriert sich auf microRNAs beteiligt Magen-Krebsentstehung zu identifizieren und ihre mechanistische Relevanz zu erforschen, indem ihre Ziele zu charakterisieren.
Ergebnisse | Invitrogen NCode miRNA-Microarrays identifiziert miR-449 in 1-jährigen Gastrin verringert werden
KO-Mäusen und in H. Pylori
infizierten Magengewebe im Vergleich zu Gewebe von Wildtyp-Tiere. Wachstumsrate von Magen-Zelllinien Überexpression von miR-449 wurde um 60% gehemmt im Vergleich zur Kontrollgruppe. FACS Zellzyklusanalyse von miR-449 überexprimierenden Zellen zeigten eine signifikante Erhöhung der sub-G 1-Fraktion indikativ für Apoptose. ß-Gal Assays zeigten einen seneszenten Phänotyp von Magen-Zelllinien überexprimiert miR-449. Affymetrix 133v2 Arrays identifiziert GMNN
, MET, CCNE2, SIRT1
und CDK6
als miR-449 Ziele. Luciferase-Assays wurden verwendet GMNN
, MET
, CCNE2
und SIRT1
als direkte Ziele zu bestätigen. Wir zeigen auch, dass miR-449-Überexpression von p53 und seine nachgelagerten Ziel p21 sowie die Apoptose-Marker gespalten CASP3 und PARP aktiviert. Wichtig ist, dass Analysen qPCR einen Verlust von miR-449 Expression in menschlichen klinischen Magen-Tumoren im Vergleich zu normalen Geweben zeigte.
Schlussfolgerungen
In dieser Studie dokumentieren wir eine verminderte Expression von miR-449 in Gastrin
KO-Mäuse und weiter bestätigt seinen Verlust in menschlichen Magentumoren. Wir untersuchten die Funktion von miR-449 durch seine direkte Ziele zu identifizieren. Des Weiteren zeigen wir, dass miR-449 durch die Aktivierung des p53-Signalweg Seneszenz und Apoptose induziert.
Hintergrund
Magenkrebs unter den fünf häufigsten Krebsarten in der Welt und der zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle [1] . Es ist vor allem, aber nicht ausschließlich, verursacht durch H. Pylori
Infektion [2], da nicht alle von H. Pylori
infizierten Personen entwickeln Tumoren [3]. Andere Faktoren bei der Entwicklung von Magenkrebs beteiligt sind der Grad und die Art der Entzündungsreaktion [2] sowie die Pegel der Gastrin
Hormon [4, 5]. Mehrere Studien haben gezeigt, dass sowohl Hypergastrinämie [6, 7] und der Mangel an Gastrin [5] zur Pathogenese von Magenkrebs bei. Achlorhydria ist ein gemeinsames Merkmal von Mausmodellen anfällig für die Entwicklung Metaplasie und Krebs [6, 8, 9]. Gastrin
Knockout-Mäuse sind achlorhydrischen [10], eine bakterielle Magen-Überwucherung begünstigt [11, 12], und chronische bakterielle Magen-Infektionen zu Magen-Metaplasie führen, die in Magenkrebs entwickeln kann [6, 12].
Seit ihrer Entdeckung microRNAs wurden in einem sehr weiten Bereich von normalen und pathologischen Prozessen [13] beteiligt gefunden. MicroRNAs ihre regulatorischen Funktionen ausüben posttranskriptional durch Bindung an teilweise komplementäre Sequenzmotive überwiegend in der 3 'UTR von Ziel-mRNAs resultierenden mRNA in Destabilisierung und translationale Repression [14]. Aus biologischer Sicht sind eine Herausforderung microRNAs Objekte zu untersuchen, wie sie Kohorten von Zielgenen regulieren, die nicht ohne weiteres identifiziert werden. Vom therapeutischen Standpunkt aus sind microRNAs sehr interessant, da mehrere Studien, die die Leistung von microRNAs als Biomarker und erste präklinische Studien festgestellt haben, haben gezeigt, dass microRNAs therapeutisch in vivo gezielt werden kann [15].
Studien Profilierungs microRNA Deregulierung bewiesen haben in ein breites Spektrum von Krankheiten, einschließlich aller wichtigen Krebserkrankungen [16]. MicroRNAs beeinflussen wahrscheinlich kanzerogene Prozesse auf zwei Ebenen. Erstens haben mehrere Studien etabliert pro-onkogenen oder tumorunterdrückende Rollen einzelner mikroRNAs fest diese Krebs Ätiologie Verknüpfung am Beispiel von miR-155, miR-10b und miR-21 [17-19]. Zweitens scheint die MikroRNA Regulierungssystem per se tumorunterdrückende Funktionen als genetische Ablation von Schlüssel MikroRNA Biogenese Faktoren wie Dicer haben, stark Krebsanfälligkeit erhöhen [20] und den Verlust der Funktionsmutationen in wichtigen mikroRNAs Verarbeitungsfaktoren in menschlichen Tumoren identifiziert wurden, [21-23].
in dieser Studie befassen wir die Bedeutung der microRNAs bei Magenkrebs Vorteil der Knockout-Maus-Modell und H. pylori-Infektion
von Wildtyp-Mäusen
Gastrin nehmen. Wir identifizieren miR-449 als signifikant herunterreguliert oder in Maus-Modellen von Magenkrebs sowie in primären humanen Tumoren des Magens verloren. Identifizierung von mRNA Ziele zeigt, dass diese microRNA wahrscheinlich tumorsuppressive Funktionen durch die aufeinander abgestimmte Regelung einer Kohorte von Krebs-assoziierten Zellzyklusregula einschließlich MET, GMNN, CCNE2, SIRT1 und HDAC1.
Methoden
Mäuse übt
Drei verschiedene Altersgruppen (12-16 Wochen, 1 Jahr oder 1 ½ Jahre) von Wildtyp (wt) oder Gastrin
Knockout (KO) Mäuse wurden verwendet. Alle Mäuse wurden auf einem Misch 129 /SVj, C57BL /6J-Hintergrund zurückgekreuzt mindestens viermal zu C57BL /6J [12]. Die Mäuse wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten und überwacht gemäß der Federation of European Laboratory Animal Science Associations Empfehlung [24] mit 12 h Licht, 12 h Dunkel-Zyklen.
H. pylori-Infektion

C57BL6 /J-Mäuse (n = 10) wurden mit einem nicht-Maus-adaptierten Klon von H. Pylori
Stamm 67:21, ursprünglich isoliert aus einer antral Biopsie aus einem schwedischen frau mit Magengeschwür erhalten geimpft. Der Stamm ist VacA + und enthält die gesamte Cag Pathogenitätsinsel (PAI) mit genetischen Stabilität in der Cag PAI [25]. Die Mäuse wurden jeden zweiten Tag (dreimal) während eines 5-tägigen Zeitraums inokuliert. DNA wurde extrahiert und auf das Vorhandensein von Helicobacter-Spezies unter Verwendung eines semi-nested Polymerase-Kettenreaktion-denaturierenden Gradienten-Gelelektrophorese-Assay, spezifisch für die Gattung Helicobacter verwenden, wie zuvor beschrieben [26]. Eine abgestimmte Gruppe von nicht-infizierten C57BL6 /J-Mäuse wurden als Kontrollen verwendet.
Die Mägen aller Mäuse in Fundus und Antrum zu RNA-Extraktion vor seziert wurden. Alle Tierversuche wurden von der dänischen Animal Welfare Committee (2005 /562-40) und dem dänischen Forst- und Naturbehörde (20010077355/6).
Mäuse Antrum Abschnitte genehmigt
Mäuse durch Genickbruch getötet wurden. Das Antrum wurde, entfernt sanft in eiskaltem PBS gewaschen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C bis zur RNA-Extraktion gelagert.
Klinische Proben analysiert
Biopsien von Magenkrebs und die benachbarten normalen Geweben wurden von Patienten erhalten in der Chirurgie für Magenkrebs in der Abteilung für Magen-Darm-Chirurgie, Rigshospitalet. Die Aufnahme erfolgte im Juli bis Dezember 2008 und alle Patienten unterzeichnet zu, informierte Zustimmung (Ethikkommission Genehmigung H-B-2008-049) und die dänische Datenschutzbehörde (2008-41-2138). Die Biopsien wurden in RNAlater (Ambion) im OP-Saal und anschließend eingefroren bei -80 ° C bis zur RNA-Extraktion.
RNA-Extraktion platziert und qPCR-Analysen
RNA extrahiert wurde mit TRIzol (Invitrogen) nach Hersteller. miRNA-Expressionsprofil wurde für hsa /MMU-miR-449a und b unter Verwendung von TaqMan-miRNA-Assays (Applied Biosystems) beurteilt, hsa /MMU-miR-34a, b und c und rnu44 oder hsa /MMU-miR-191. Die Primersequenzen für Affymetrix Ziele Validierung werden in zusätzlichen Datei 1, Tabelle S1 aufgelistet.
Zellkultur
SNU638 und MKN74 wurden in RPMI-1640 gezüchtet (Gibco) mit 10% FBS (Hyclone), 100 U /ml Penicillin und 100 &mgr; g /ml Streptomycin (Invitrogen) und bei 37 ° C in 5% CO 2 inkubiert. HCT116-Zellen (wt und p53 - /- wurden in McCoy 5A (Gibco) mit 10% FBS (Hyclone) und 100U /ml Penicillin und 100 ug /ml Streptomycin (Invitrogen) und inkubiert bei 37 ° C in 5% CO gezüchtet <. sub> 2 HEK293 und MEF Zellen (wt und p53 - /-) wurden bei 37 ° C in DMEM (Gibco) mit 10% FBS (Hyclone), 100U /ml Penicillin und 100 ug /ml Streptomycin (Invitrogen) und inkubiert gezüchtet mit 5% CO 2.
miRNA Vorläufer und miRNA Vorläufer
siRNA wurden von Ambion gekauft, hsa-miR-449a (PM11521), hsa-miR-449b (PM11127) und hsa-miR-34a ( PM11030).
Zellwachstum analysiert
SNU638 Zellen wurden in 24-well Platten ausgesät und transfiziert am folgenden Tag mit 50 nM miRNA Duplex- oder siRNA unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (Invitrogen). die Zellen wurden zu den angegebenen Zeitpunkten in 4% Paraformaldehyd fixiert , in einer 0,1% igen Kristallviolett-Lösung angefärbt und in 10% Essigsäure resuspendiert. Probe Absorption bei 620 nm wurde gemessen.
Zellzyklus FACS
SNU638 und MKN74 Zellen wurden bei 2 × 10 6 analysiert Zellen pro 10 cm Platte und transfiziert mit 50 nM miRNA Duplex (Ambion) unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (Invitrogen). Die Zellen wurden 48 und 72 Stunden nach der Transfektion geerntet, gebeizt für den DNA-Gehalt unter Verwendung von Propidiumiodid (PI) und auf einem FACS Calibur Durchflußzytometer (Becton-Dickinson) analysiert. Kurz wurden durch Trypsinisierung geerntet, Zellen und einmal mit PBS gewaschen, bevor Nacht in 70% EtOH Fixierung über. Um die DNA färben, wurden die Zellen pelletiert, resuspendiert in 100 &mgr; l EtOH und 1 Stunde mit 300 ul PI-Lösung (0,05 mg /ml PI, 20 &mgr; g /ml RNAse A in 0,1% BSA) gefärbt.
Seneszenz-Analysen
SNU638 Zellen wurden bei 400.000 Zellen pro 6-Well-Platte und transfiziert mit 50 nM miRNA Duplex (Ambion) unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (Invitrogen). Vier Tage nach der Transfektion wurden die Zellen in PBS gewaschen und fixiert 5 Minuten bei Raumtemperatur in 2% Formaldehyd /0,2% Glutaraldehyd. Die Zellen wurden zweimal in PBS pH 6,0 gewaschen, bevor sie mit frischem Seneszenz assoziierten β-Gal Färbelösung gefärbt wird (1 mg /ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-βD-galactosid (X-Gal), 0,12 mm K 3 Fe [CN] 6, 0.12mm K 4Fe [CN] 6, 1 mM MgCl 2 in PBS pH 6,0) über Nacht bei 37 ° C ohne CO 2 Versorgung . Die Zellen wurden einmal in PBS (pH 6,0) und beobachtet unter dem Mikroskop gewaschen.
Antikörper und Western-Blot-Analysen
SNU638 bei ausgesät wurden 2 x 10 6 Zellen pro 10 cm Platte, transfiziert zweimal auf zwei aufeinanderfolgende Tage mit 50 nM miRNA Maisonetten mit Lipofectamine 2000 nach Hersteller (Invitrogen). Die Zellen wurden durch Trypsinisierung geerntet, einmal mit PBS gewaschen und in RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 0,5% Natriumdesoxycholat, 0,1% SDS, 1% Igepal, 50 mM Tris-HCl pH8, 2 mM EDTA), ergänzt mit 1 mM DTT lysiert, 1mM Pefabloc, 1mM nav3, 10 mM NaF und 1X komplette Mini-Protease-Inhibitor-Cocktail-Tabletten. 25 ug Protein /Bahn wurden auf 4-20% NuPAGE Bis-Tris Gelen (Invitrogen) und auf eine Nitrocellulose-Membran gelöst. Primäre Antikörper verwendet wurden, waren MET (Cell Signal 4560), MYC (Cell Signal 9402), GMNN (Santa Cruz Sc-53923), VCL (Sigma V9131), TP53 (Santa Cruz Sc-126), CDKN1A (Santa Cruz Sc-6246) , CDK6 (Santa Cruz Sc-177), HDAC1 (Santa Cruz Sc-7872), CCNE2 (Cell Signal 4132), TUBB (Abcam ab11304), PARP (Cell Signal 9542) und Cleaved CASP3 (Cell Signal 9661).
Microarray-Analysen
Kleine RNAs (< 200 nt) wurden isoliert mit Invitrogen Pure miRNA Isolation Kit von Fundus und Antrum Gewebe von 1) Gastrin
KO-Mäuse und Alter und Geschlecht angepasst C57BL6 /J Kontrollmäuse, und 2) C57BL6 /J-Mäuse mit H. Pylori
und nicht infizierten Alter und Geschlecht infiziert angepasst C57BL6 /J Kontrollmäusen (n = 4 für jede Gruppe). Die Qualität der isolierten kleinen RNAs wurde mit der Small RNA-Assay auf einem Agilent Bioanalyzer bestimmt. 500 ng von kleinen RNA wurde mit Genisphere FlashTag Kit markiert und hybridisiert an Invitrogen NCode Multi-Spezies-miRNA-Microarray-V2 in einer Hybridisierungsstation Maui. Verarbeitete Objektträger wurden in einem Agilent DNA Microarray-Scanner gescannt. Die resultierenden Bilder wurden analysiert, und das Verhältnis des Median normalisiert mit GenePix Pro 6.0. Vier biologischen Replikate wurden für jeden Vergleich verwendet. Proben wurden in einem Zweifarben-Farbstoff Auslagerungsmikroarray experimentelles Design zu vier Arrays hybridisiert. BRB ArrayTools wurden fache Veränderung und statistische Berechnungen verwendet. Ausgewählte miRNA Daten aus dem Array-Analyse wurden mit validierten TaqMan real-time PCR miRNA-Assays. Die Daten werden bei Array bei Annahme hinterlegt.
MRNA Arrays | SNU638 mit 50 nM von miR-34a oder miR-449b Maisonetten mit Siglo siRNA als negative Kontrolle verwendet transfiziert wurden. Gesamt-RNA wurde 24 Stunden nach der Transfektion mit Trizolreagenz extrahiert. Affymetrix Microarray-Analyse (HG-U133 Plus 2.0 human) wurde auf dem Microarray-Center, Rigshospitalet, Kopenhagen Universitätskrankenhaus durchgeführt. Die Experimente wurden in dreifacher Ausführung entweder oder vierfach ausgeführt werden. Die Daten werden bei Array bei Annahme hinterlegt.
Vektoren Konstruktion und Reporter-Assays
Die 3'UTRs von HDAC1
, SIRT1
, MET
, GMNN
und CCNE2
Halte miR-449-Bindungsstellen wurden stromabwärts des Luciferase-Reportergen kloniert in PMIR-REPORT Vektorsystem (Ambion). Quickchange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) wurde verwendet, um zwei Punktmutationen in der Seed-Region zu induzieren. Mutagenese-Primer-Sequenzen sind in den weiteren Datei 1, Tabelle S1 aufgelistet.
HEK293-Zellen wurden in 96-Well-Platten ausgesät und transfiziert mit 20 nM miRNA-Vorläufer oder verschlüsselt siRNA-Steuerung, 20-50ng der Luciferase-Vektor (PMIR-Bericht) und 5 ng von Renilla Vektor (pRL-TK) unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Transfektion und die Luciferase-Aktivität wurde geerntet Doppel-Glo Luciferase-Assay (Promega) gemessen.
Microarray-Analyse
Microarray-Expressionsdaten verarbeitet wurde mit der 'affy' Paket in BioConductor [27]. Sondensatz Intensitäten wurden zusammengefasst und Quantil normalisiert die BioConductor RMA und VSN-Pakete verwenden. Differentielle Expression wurde pro Probeset mit einem t-Test bestimmt. Probe-Sets wurden Ensembl Transkripte (Version 49) unter Verwendung von BioMart bereitgestellt Mappings abgebildet. Probesets, die auf zwei verschiedenen Ensembl Gene kartiert wurden. Verworfen
Bewertung globaler Down-Regulation von microRNA-Zielgene, Die 3'UTRs, 5'UTRs und kodierenden Sequenzen der Transkripte für passende 6mer, wurden gescannt 7mer und 8mer miRNA Saatgut-Sites (komplementär zu Position 2-7, 2-8 und 2-9 der miRNA). Globale Analyse von miRNA Zielherunterregulierung wurde mit der längsten 3'UTR-Sequenz pro Gen Voreingenommenheit zu vermeiden, indem sie Gene, die mit vielen Transkript Isoformen eingeführt bewertet. Wir verworfen Transkripte mit 3'UTR Sequenzen kürzer als 50 nt. Global auszuwerten, wenn miRNA Zielgene wurden herunterreguliert nach miRNA Transfektion die Nullhypothese, dass die Expression Änderungsverteilung miRNA Targets (mit einer 7mer Zielstelle) untersucht, um die Verteilung aller exprimierten Gene ohne vorausgesagten Zielstellen gleich wurde mit der nichtparametrischer Wilcoxon Rangsummentest. Ausgiebige statistische Auswertung von Wörtern mit Down-Regulation korreliert Ein ähnlicher Ansatz in kodierenden Regionen und 5'UTRs von mRNAs zu bewerten Down-Regulation von Genen mit miRNA-Zielstellen verwendet.
Wir haben eine bisher veröffentlichten nichtparametrischer verwendet Rang-basierte Statistik erschöpfend die Korrelation von Wortvorkommen in 3'UTRs und die Veränderung der Genexpression nach miRNA-Transfektion [28, 29] zu bewerten. Die Gene wurden durch Expression Änderung durch Transfektion von miR-34a oder miR-449b und die Korrelation mit Down-Regulation wurde für alle Wörter der Länge 5-7 (N = 21 504).
Statistische Tests getestet induziert sortiert
Students t-Test mit Welch Korrektur.
Ergebnisse | miR-449b ist unten in der Kieferhöhle beider Gastrin
KO geregelt Mäuse und H. pylori
Mäuse
Gastrin
Knockout-Mäuse infiziert sind achlorhydrischen antral Hyperplasie und Magen-Adenome im Laufe der Zeit (Abbildung 1) [6, 12] für die Entwicklung mit einer Tendenz. Um microRNAs zu identifizieren, bei der Entwicklung von Magenkrebs dereguliert, untersuchten wir miRNAs Expressionsprofile in Magen Neoplasien von Gastrin
Knockout-Mäusen unter Verwendung von miRNA-Microarrays. Wie in Tabelle 1 gezeigt, 20 microRNAs wurden in den Knockout-Mäusen im Vergleich zum Wildtyp littermate Kontrollen, mit drei miRNAs unterschiedlicher mehr als zweifach, miR-7 wird hochreguliert und miR-709 und miR-449b werden herunterreguliert erheblich dereguliert in der Kieferhöhle von Gastrin
Knockout-Mäuse im Vergleich zu Wildtypen. Zur weiteren miR-449 Deregulierung bei Magenkrebs Entwicklung bestätigen, untersuchten wir seine Expression in Wildtyp-Maus Antrum Gewebe mit H. pylori infiziert
. Interessanterweise zeigte miRNA Arrays eine spezifische Herunterregulation von miR-449b in H. Pylori infizierten Mäusen
(Tabelle 2 und zusätzliche Datei 1, Abbildung S1). Abbildung 1 Old Gastrin-Knockout-Mäuse Magen-Adenome entwickeln. Antrum Abschnitte getrennt von 12-16 Wochen alten Mäusen (links), 12 bis 18 Monate alten Mäusen (Mitte) und älter als 18 Monate Mäuse (rechtes Bild), von Wildtyp (oberes Feld) und Gastrin
Knockout-Mäusen (unteres Bild). Abschnitte zeigen Adenom Entwicklung in Antrum Gewebe in den Gastrin
Vorprägungen im Vergleich zu den Wildtypen.
Tabelle 1 miRNAs dereguliert in Gastrin
Knockout-Mäuse
miRNA-Name
Log2-fach
p-Wert
miRNA Name

Log2-fold

p-value

mmu-miR-709
-1.73
7.0E-06
mmu-miR-422b
0.44
4.6E-02
mmu-miR-449b
-1.37
1.6E-03
mmu-miR-199a*
0.50
7.7E-03
mmu-miR-805
-1.01
7.5E-03
mmu-miR-25
0.51
1.6E-02
mmu-miR-706
-0.98
3.1E-03
mmu-miR-27b
0.56
5.1E-03
mmu-miR-467a
-0.88
2.8E-02
mmu-miR-182
0.56
1.8E-02
mmu-miR-696
-0.83
7.1E-03
mmu-miR-30a-3p
0.59
2.2E-02
mmu-miR-667
-0.66
2.3E-02
mmu-miR-10a
0.70
7.1E-03
mmu-miR-690
-0.28
1.7E-02
mmu-miR-152
0.70
2.3E-02
mmu-miR-18
0.29
3.7E-02
mmu-miR-1
0.77
7.1E-03
mmu-miR-143
0.34
2.3E-02
mmu-miR-7
1.06
4.9E-03
Liste der deutlich deregulierten miRNAs im Magen-Neoplasien von Gastrin
Knockout-Mäuse im Vergleich zu Wildtypen.
Tabelle 2 miRNAs dereguliert in H.Pylori
infizierten Geweben
miRNA Name
Falten change

p-value

mmu-miR-122a
-3.247
0.000788
mmu-miR-449b
-0.879
0.045214
Liste der deutlich deregulierten miRNAs in Wildtyp-Mäusen Antrum mit H. pylori infiziert
im Vergleich zu nicht-infizierten Antrum.
MiR-449 Zellzyklus hemmt und induziert Seneszenz
Down-Regulation der demonstriert haben miR-449 Expression in Magenkrebs wollten wir die Wirkung von Re-exprimierenden miR-449 in Magenkrebs-Zelllinien zu untersuchen. Interessanter keinen spürbaren Ausdruck der miR-449-Familie über eine Gruppe von Magen-Zelllinien, einschließlich SNU638 erkannt wurde, SNU5, SNU216, SNU601 und MKN74 Erhaltung der Begriff der miR-449 mit tumorunterdrückende Funktionen (Daten nicht gezeigt). Die miR-449-Familie besteht aus miR-449a und b in Menschen und miR-449a, b und c in Mäusen. Interessanterweise teilen sie die gleiche Samen Sequenz wie die miR-34 Familie und sind daher überlappende Kohorten von Zielgenen (Abbildung 2a) zu regulieren, zu erwarten. Um die Funktion von miR-449 in Magen-Zelllinien beurteilen wir wieder eingeführt miR-449b in SNU638 und MKN74 Zellen. Im Vergleich zu Negativkontrolle microRNAs, Wiedereinführung von miR-449b beeinflusst stark die Proliferation von SNU638 Zellen (Abbildung 2b) und visuelle Inspektion der Induktion von Apoptose bezeichnet Zellen und zelluläre Seneszenz (Abbildung 2c und zusätzliche Datei 1, Abbildung S2). Durchflusszytometrische Analyse von Propidiumiodid-gefärbten Zellen, transfiziert mit miR-449b zeigte ein G 1 Akkumulations 48 Stunden nach der Transfektion 72 Stunden, gefolgt nach der Transfektion durch eine Ansammlung von Zellen in der Unter G 1-Fraktion andeutend Zell Tod (2d). Die Induktion der zellulären Seneszenz wurde durch saure beta gal-Färbung unter Verwendung von miR-34a als positive Kontrolle MikroRNA (Figur 2e) bestätigt. Um auszuschließen, Zelllinie spezifische Effekte wurden die funktionellen Konsequenzen von miR-449 Wiedereinführung in Bezug auf die Zellzyklusarrest verifiziert in MKN74 Zellen (Weitere Datei 1, Abbildung S3). Somit Wiedereinführung von miR-449 wirkt sich negativ auf die Proliferation von Magenkrebs-Zelllinien gleichzeitig mit der Induktion von Seneszenz und Apoptose in Übereinstimmung mit miR-449, die Tumor-Unterdrückungsfunktionen. Abbildung 2 miR-449 ist Teil der miR-34 Familie und hemmt die Zellproliferation. A - miR-449 ist Teil der miR-34 Familie und ist evolutionär konserviert. B - miR-449 Wiedereinführung in die menschliche Magen-Zelllinien (SNU638) hemmt die Zellproliferation (rote Linie) im Vergleich zu einer verschlüsselten Steuer (blaue Linie) und miR-146-Steuerung (schwarze Linie). Die Fehlerbalken stellen S. D. C - Sichtkontrolle der Zellproliferationshemmung und Seneszenz-ähnlichen Phänotyp auf miR-449 Wiedereinführung in SNU638 Zellen (unten) im Vergleich zu verschlüsselten Transfektionskontrolle (oberes Bild). D - FACS-Analyse des Zellzyklus sub-G1 Anhäufung von SNU638 Zellen 72 Stunden nach der miR-449 Wiedereinführung (rechts Histogramm) im Vergleich zu einem verschlüsselten Transfektionskontrolle (linke Histogramm) Die Tabelle zeigt Zellakkumulation in G1-Fraktion auf miR-449 Re zeigt -Einführung Vergleich zu verwürfelten RNA Kontrolle bei 48 Stunden nach der Transfektion, gefolgt von einer Verschiebung zu dem Sub-G1-Fraktion bei 72 Stunden nach der Transfektion indikativ für den Zelltod. E - seneszenten Phänotyp SNU638 Zellen auf miR-449 und miR-34a positive Kontrolle Wiedereinführung durch saure β-gal-Assay im Vergleich zu RNA verschlüsselten Kontrolle gezeigt
Die gemeinsame Saatgut Folge von miR-449b und miR-34a induzieren hoch. korrelierte Ausdruckswechsel
um die Transkripte gesteuert von miR-449 charakterisieren und zu sehen, ob miR-449 verschiedene Transkripte als miR-34a regelt, wurden SNU638 Zellen Expressionsprofile 24 Stunden nach der Transfektion untersucht von miR-449b oder miR-34a und differentiell ausgedrückt Transkripte identifiziert. Wir fanden heraus, dass mRNAs mit den vorhergesagten miRNA-Zielstellen (7 mer Samen-Website) in der 3'UTR waren signifikant herunterreguliert im Vergleich zu mRNAs ohne vorhergesagten Zielstellen nach der Transfektion von miR-449b (p < 1.2E-70, two-tailed Wilcoxon-Rangsummentest), (Weitere Datei 1, Abbildung S4a). (; 9.9E-25 p <), während mRNAs mit Standorten in 5'UTRs waren nur geringfügig herunterreguliert (p < mRNAs miRNA Samen Zielstellen vorhergesagt haben Regionen bei der Codierung wurden ebenfalls deutlich nach unten reguliert werden gefunden 5.3e- 2). Die Expression Veränderungen durch Transfektion von reifen miR-449b und miR-34a wurden hoch trotz Divergenz der reifen Sequenzen außerhalb der Seed-Region (Pearson-Korrelationskoeffizient R = 0,94, p = 0) korreliert, (zusätzliche Datei 1, Abbildung S4b). Wir erschöpfend alle Oligonukleotide (Wörter) mit einer Länge von 5-7 für die Korrelation mit Down-Regulation nach miR-449b und miR-34a Transfektion (siehe Methoden) bewertet. In Übereinstimmung mit vielen früheren Studien zeigte diese Analyse die gemeinsamen miR-34a /449b Samen Standort wie der 3'UTR Wort am meisten korreliert mit Down-Regulation in den beiden Experimenten (Weitere Datei 1, Abbildung S4c).
MiR-449 reguliert zahlreiche Zellzyklus-Controller | Die Expressionsprofile verwendet wurden unterschiedlich exprimiert Transkripte in Zellen mit miR-449b oder Kontrollen (Weitere Datei 1, Tabelle S2) transfiziert zu identifizieren. Ein Weg Aktivierungsanalyse auf den differentiell regulierten Transkripte basierend zeigt, dass miR-449 hauptsächlich Transkripte in Zellschäden Reaktionen, Zellzykluskontrolle, Entzündung und Krebs-Pathways (Bild 3a) beteiligt Proteine ​​kodieren, steuert. Die Konzentration auf eine Reihe von vermeintlichen Zielgene mit etablierten Rollen in Tumorigenese bestätigten wir, Down-Regulation von miR-449 von met Proto-Onkogen (MET
), Cyclin-abhängige Kinase 6 (CDK6)
, Geminin (GMNN )
, myelocytomatosis virale Onkogene homolog (MYC)
Sirtuin 1 (SIRT1
) und Histon-Deacetylase 1 (HDAC1)
auf Transkriptebene (Abbildung 3b). Western-Blot-Analysen die Fähigkeit von miR-449 bestätigt herunterregulieren MET, GMNN, MYC, SIRT1, Cyclin E2 (CCNE2) und HDAC1 auf Proteinebene in einem Ausmaß, ähnlich wie das erreicht durch Wiedereinführung von miR-34a (Figur 3c). Für eine Teilmenge von Zielgenen einschließlich MET
, GMNN, CCNE2
, SIRT1
und HDAC1
bestätigten wir die direkte Interaktion von miR-449 mit dem Zielgen 3 'UTR unter Verwendung von Luciferase-Assay (Abbildung 3d ). Abbildung 3 miR-449 zielt auf Zellzyklus-Controller Gene. A - Ingenuity Pathway Analysis (IPA) deregulierter Gene auf miR-449 Wiedereinführung in SNU638 Zellen für die Gen Kategorien Krebs, Zelltod und Zellzyklus-Bahnen unter anderem zeigen Bereicherung. B - qPCR Validierung von Affymetrix-Arrays zeigt Herunterregulierung der MET
, CDK6
, GMNN
, MYC
und HDAC1
auf miR-449 Wiedereinführung im Vergleich zu verschlüsselten RNA steuert. C - Western-Blot-Validierung nach unten reguliert Gene auf miR-449 Wiedereinführung in SNU638 Zellen im Vergleich zu verschlüsselten RNA steuert. Überprüfung der direkten und funktionellen Ziel Luciferase-Konstrukten Bindung mit Haltewildtyp 3'UTRs und mutierte 3'UTRs (zwei Mutationen in miR-449-Bindungsstelle), * - Vinculin (VCL) und Tubulin-beta (TUBB) wurden als Lade Kontrollen D verwendet zeigt statistische Signifikanz in Luciferase-Expression zwischen 3'UTRs Wildtyp mit miR449a transfizierten /b im Vergleich zu RNA-Kontrolle Rühr- und zeigt # statistisch signifikanter Unterschied in Luciferase-Expression zwischen Wildtyp 3'UTRs im Vergleich zu mutierten 3'UTRs transfiziert mit miR-449a und mir- 449b. "Ns" nicht signifikant p-Wert > 0,05, "*" oder "#" signifikant 0,01 < p-Wert < 0,05, "**" oder "##" sehr bedeutsam 0,01 < p-Wert < 0,001, "***" oder "###" äußerst signifikanten p-Wert < 0,001
Daher miR-449 zielt direkt auf Zellzyklus-Regulatorgene, die mit einem Tumor-Suppressor-Funktion und mit dem Zellzyklusarrest beobachtet auf miR-449 Wiedereinführung in Krebszelllinien.
MiR-449 induziert p53-Expression, aber Als miR-34a zuvor hinter p53 zu funktionieren gefunden wurde, wird nicht durch p53
geregelt [30-33], untersuchten wir, ob auch miR-449a /b an p53 verbunden waren. Dies weiterhin durch die Anwesenheit eines mutmaßlichen p53-Bindungsstelle 10 kb stromaufwärts vom menschlichen miR-449 angetrieben wurde (Daten nicht gezeigt). Wir haben daher p53 durch DNA-Schädigung induziert mit UV-oder 5-Fluorouracil (5-FU) in vier verschiedenen Systemen, HCT116 und MEF-Wildtyp und p53-Knockout-Zellen (zusätzliche Datei 1, Abbildung S5a). Jedoch wurde nach dem p53-Signalweg-Aktivierung (Weitere Datei 1, Abbildung S5b) keine signifikante Veränderung der miR-449 Expression nachgewiesen. Abschließend fanden wir keine Hinweise darauf, dass miR-449 ein Transkriptionsziel von p53 ist. Auf der anderen Seite fanden wir, dass miR-449a /b der Lage ist, die Aktivierung von p53 zu induzieren, die Aktivierung von p53 Antwortgene wie p21 und die Induktion von Apoptose, wie durch Spaltung von Caspase-3 (CASP3) und Poly (ADP-ribose bewiesen ) Polymerase 1 (PARP) (Abbildung 4). Auf dem Weg zu den Mechanismus zu verstehen, durch die miR-449 dies tut suchten wir die Wirkung von miR-449 auf SIRT1 und HDAC1. SIRT1 und HDAC1 Deacetylasen sind, die, unter anderem, die Aktivierung von p53 und miR-34 inhibiert wurde SIRT1 [34] gezeigt, zu unterdrücken. Wir validiert die spezifische Bindung von miR-449 zur SIRT1 und HDAC1 3'UTR Luciferase-Assays (Abbildung 3d) verwendet wird. Abbildung 4 miR-449 aktiviert den p53-Signalweg. Western-Blot-Analyse eine Zunahme des p53-Proteins auf miR-449 und der positiven Kontrolle miR-34a Wiedereinführung in SNU638 Zellen im Vergleich zu RNA zeigt verwürfelten Steuerung sowie eine Aktivierung der p53 nachgeschalteten Ziel p21 und Apoptose Markern gespalten CASP3 und PARP. Vinculin (VCL) und Tubulin-beta (TUBB) als Belastungskontrollen verwendet wurden.
Daher spekulieren wir, dass miR-449, die Histon-Deacetylase-HDAC1 durch Hemmen und SIRT1 was zu der p53-Signalweg-Aktivierung somit die Induktion der Apoptose Markern gespalten Apoptose induziert CASP3 und PARP.
miR-449 wird herunterreguliert in menschlichen Magenkrebs
die Bedeutung von miR-449 in menschlichen Tumoren zu bewerten wir die Expression von miR-449 in 10 Magenkrebs Biopsien nächsten sucht. Wichtig ist, fanden wir beide miR-449a und b deutlich herunterreguliert oder abwesend in 8 von 10 primären Magenkrebs sein. Darüber hinaus scheinen die Expression von miR-449a und b ko-regulierte (5a) zu sein. Wir fanden keine Korrelation zwischen der Reduktion der miR-449 Expression und klinischen Eigenschaften des Krebs (Abbildung 5b). Die Analyse der genomischen DNA aus den Tumoren keine Anzeichen für den Verlust oder hyper-Methylierung der methylierungsspezifischen Schmelzkurvenanalyse (MS-MCA), die transkriptionale Herunterregulierung der Expression unter Verwendung von miR-449 Loci gefunden (Daten nicht gezeigt). Daher kann im Einvernehmen mit den Daten aus zwei Mausmodellen von Magen-Entzündung und Hyperplasie, die Expression von miR-449 herunterreguliert in menschlichen Magenkrebs. Abbildung 5 miR-449 wird nach unten in den menschlichen Magen-Krebs reguliert. qPCR-Analyse (oberes Feld) zeigt Herunterregulation von miR-449 Expression in 8 Magenkrebsgewebe im Vergleich zu miR-449 Expression in Probe abgestimmte Kontrollen (gestrichelte Linie). U44 wurde als endogene Kontrolle verwendet. Tabelle mit klinischen Daten von Patienten (unteres Bild). "Ns" nicht signifikant p-Wert > 0,05, "*" signifikante 0,01 < p-Wert < 0,05, "**" sehr bedeutsam 0,01 < p-Wert < 0,001, "***" äußerst signifikanten p-Wert < 0,001
Diskussion
Magenkrebs ist eine sehr tödliche Bösartigkeit mit mehr als 21.500 neue Fälle pro Jahr in den Vereinigten Staaten allein [35]. Die Krankheit wird oft zu spät erkannt und die 5-Jahres-Überlebensrate beträgt somit weniger als 20% [36]. Es ist daher wichtig, die Ätiologie und Progression Stadien der Erkrankung zu verstehen. Die Bedeutung der bakteriellen, Umwelt- und Host genetischen Risikofaktoren in Magen Karzinogenese untersucht worden, jedoch weniger ist über die molekulare Fortschreiten der Krankheit bekannt [37, 38]. Unter anderem wird in 30-60% der Magenkarzinome berichtet p53-Weg Inaktivierung [39, 40] und neuere Studien legen nahe, H. pylori
direkte Modulation des p53-Gens oder seiner stromabwärtigen Zielen [41].

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