miR-449 inhibe la prolifération cellulaire et est régulée à la baisse dans cancer

gastrique miR-449 inhibe la prolifération cellulaire et est régulée à la baisse dans le cancer gastrique
Résumé de l'arrière-plan
Le cancer gastrique est le quatrième cancer le plus répandu dans le monde et la deuxième cause la plus répandue de cancer lié la mort. Le développement du cancer gastrique est principalement associée à une infection à H. pylori conduisant à une concentration dans les études de pathologie sur les facteurs bactériens et environnementaux et, dans une moindre mesure, sur le développement mécanique de la tumeur. Les microARN sont de petites molécules d'ARN non codantes impliquées dans la régulation génique post-transcriptionnelle. Ils se trouvent à réguler des gènes impliqués dans diverses fonctions biologiques et les altérations de l'expression de micro-ARN ont été liés à la pathogenèse de nombreuses tumeurs malignes. L'étude actuelle se concentre sur l'identification des microARN impliqués dans la carcinogenèse gastrique et d'explorer leur pertinence mécaniste en caractérisant leurs cibles.
Résultats
microarrays Invitrogen nCode miARN identifiés miR-449 à être diminuée en 1-year-old Gastrin
souris KO et chez H. pylori
tissus gastriques infectés comparé aux tissus provenant d'animaux de type sauvage. Taux de lignées de cellules gastriques surexprimant miR-449 croissance a été inhibée de 60% par rapport aux témoins. Analyse FACS du cycle cellulaire de miR-449 surexprimant les cellules a montré une augmentation significative de la sous-G 1 fraction indicative de l'apoptose. ß-Gal essais ont indiqué un phénotype de sénescence des lignées de cellules gastriques surexprimant miR-449. Affymetrix tableaux de 133v2 identifiés GMNN
, MET, CCNE2, SIRT1
et CDK6
que miR-449 cibles. dosages luciférase ont été utilisés pour confirmer GMNN
, MET
, CCNE2
et comme des cibles directes de SIRT1. Nous montrons également que miR-449 sur l'expression de p53 et de son activation en aval p21 cible, ainsi que les marqueurs de l'apoptose CASP3 clivée et PARP. Surtout, qPCR analyses ont montré une perte de miR-449 expression dans les tumeurs gastriques humaines cliniques par rapport aux tissus normaux
. Conclusions
Dans cette étude, nous documentons une expression diminuée de miR-449 en Gastrin
souris KO et en outre confirmé sa perte dans les tumeurs gastriques humaines. Nous avons étudié la fonction de miR-449 en identifiant ses cibles directes. En outre, nous montrons que miR-449 induit la sénescence et l'apoptose en activant la voie p53.
Contexte
Le cancer gastrique est parmi les cinq cancers les plus fréquents dans le monde et la deuxième cause la plus fréquente de décès liés au cancer [1] . Il est principalement, mais pas exclusivement, causée par l'infection de H. pylori [2] pas tous H. Pylori
personnes infectées développent des tumeurs [3]. D'autres facteurs impliqués dans le développement du cancer gastrique comprennent le degré et le type de la réponse inflammatoire [2], ainsi que les niveaux de l'hormone de la gastrine [4, 5]. Plusieurs études ont montré que les deux hypergastrinémie [6, 7] et le manque de gastrine [5] contribuent à la pathogenèse du cancer gastrique. Achlorhydrie est une caractéristique commune des modèles de souris sujettes à métaplasie en développement et le cancer [6, 8, 9]. Les souris knock-out de gastrine sont achlorhydriques [10], ce qui favorise une prolifération bactérienne gastrique [11, 12], et les infections gastriques bactériennes chroniques conduisent à une métaplasie gastrique qui peut évoluer vers un cancer gastrique [6, 12].
Depuis leur découverte microARN, ont été trouvés impliqués dans une très large gamme de processus normaux et pathologiques [13]. Les micro-ARN exercent leurs fonctions régulatrices posttranscriptionally par liaison à une séquence complémentaire en partie de motifs se situe principalement dans la région 3 'UTR ARNm cibles entraînant une déstabilisation de l'ARNm et de la répression traductionnelle [14]. D'un point de vue biologique, les microARN sont difficiles à étudier les objets comme ils régulent les cohortes de gènes cibles, qui ne sont pas facilement identifiables. D'un point de vue thérapeutique, les microARN sont très intéressants que plusieurs études ont démontré la puissance de microARN comme biomarqueurs et des études précliniques initiales ont établi que les microARN peuvent être thérapeutiquement ciblés in vivo [15].
Profilage des études ont mis en évidence microRNA déréglementation un large éventail de maladies, y compris tous les cancers majeurs [16]. Les microARN affectent probablement les processus tumorigènes à deux niveaux. Tout d'abord, plusieurs études ont établi des rôles pro-oncogènes ou tumeur suppressive de microARN individuels reliant fermement ces à l'étiologie du cancer comme illustré par miR-155, miR-10b et miR-21 [17-19]. Deuxièmement, le système de réglementation microRNA en soi semble avoir des fonctions suppressives de tumeur ablation génétique des facteurs microRNA biogenèse clés tels que Dicer, augmenter fortement susceptibilité au cancer [20] et la perte de mutations de fonction ont été identifiés dans microARN importants facteurs de transformation dans les tumeurs humaines [21-23].
dans cette étude, nous abordons l'importance des microARN dans le cancer gastrique en profitant du modèle souris knockout de la gastrine et H. pylori
infection de souris de type sauvage. Nous identifions miR-449 comme significativement régulée à la baisse ou perdu dans les modèles murins de cancer de l'estomac, ainsi que dans les tumeurs gastriques humaines primaires. Identification des cibles ARNm révèle que ce microARN exerce probablement des fonctions suppressives de tumeur à travers la régulation concertée d'une cohorte de régulateurs du cycle cellulaire associés au cancer, y compris MET, GMNN, CCNE2, SIRT1 et HDAC1.
Méthodes
souris
Trois groupes d'âge différents (12-16 semaines, 1 an ou 1 an et demi) de type sauvage (en poids) ou knock-out (KO) les souris de gastrine ont été utilisés. Toutes les souris étaient sur un mélange 129 /SvJ, C57BL /6J, rétrocroisés au moins quatre fois C57BL /6J [12]. Les souris ont été maintenues dans des conditions exemptes d'organismes pathogènes spécifiques et contrôlés selon la Fédération des animaux de laboratoire Associations Européennes de Sciences recommandation [24] avec 12 h de lumière et 12 h cycles sombres.
H. pylori infection

C57BL6 /J souris (n = 10) ont été inoculées avec un clone non adapté aux souris de la souche de Helicobacter Pylori 67:21, isolé à l'origine à partir d'une biopsie antrale obtenue à partir d'une femelle suédoise ulcère gastrique. La souche est VacA + et contient toute l'île de pathogénicité Cag (PAI) avec la stabilité génétique dans le Cag PAI [25]. Les souris ont été inoculées tous les deux jours (trois fois) pendant une période de 5 jours. L'ADN a été extrait et analysé pour détecter la présence d'espèces d'Helicobacter en utilisant un gradient de dosage par électrophorèse sur gel semi-nichée dénaturant réaction en chaîne par polymerase, spécifique du genre Helicobacter, comme décrit précédemment [26]. Un groupe témoin de souris C57BL6 /J non infectées ont été utilisées comme témoins.
Les estomacs de toutes les souris ont été disséquées en fond d'oeil et de l'antre avant l'extraction de l'ARN. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés par le Comité danois bien-être animal (2005 /562-40) et la Forêt danoise et de l'Agence de la nature (20010077355/6). Sections de
antre Souris
souris ont été sacrifiées par dislocation cervicale. On a éliminé le sinus maxillaire, on lave doucement dans du PBS glacé, congelé dans l'azote liquide et stockés à -80 ° C jusqu'à l'extraction d'ARN.
Échantillons cliniques d'analyses
biopsies de cancer de l'estomac et les tissus adjacents normaux ont été obtenus à partir de patients subir une intervention chirurgicale pour le cancer gastrique au Département de gastro-Surgery, Rigshospitalet. L'inclusion a eu lieu en Juillet à Décembre 2008 et tous les patients à condition signé, le consentement éclairé (l'approbation du comité d'éthique H-B-2008-049) et de l'Agence danoise de protection des données (2008-41-2138). Les biopsies ont été placées dans du RNAlater (Ambion) dans la salle d'opération et ensuite congelé à -80 ° C jusqu'à l'extraction d'ARN.
L'extraction de l'ARN et analyse qPCR
L'ARN a été extrait à l'aide Trizol (Invitrogen) selon le fabricant. miRNA profil d'expression a été évaluée en utilisant des essais Taqman miARN (de Applied Biosystems) pour hsa /mmu-miR-449a et b, hsa /mmu-miR-34a, b et c et rnu44 ou hsa /mmu-miR-191. Les séquences d'amorce pour Affymetrix la validation des cibles sont répertoriées dans le fichier supplémentaire 1, table S1. La culture cellulaire
SNU638 et MKN74 ont été cultivées dans RPMI-1640 (Gibco) avec 10% de FBS (Hyclone), 100U /ml de pénicilline et 100 ug /ml de streptomycine (Invitrogen) et on a incubé à 37 ° C dans 5% de CO 2. les cellules HCT116 (wt et p53 - /- ont été cultivées dans de McCoy 5A (Gibco) avec 10% de FBS (Hyclone) et 100 U /ml de pénicilline et 100 pg /ml de streptomycine (Invitrogen) et on a incubé à 37 ° C dans 5% de CO <. sub> 2 HEK293 et ​​des cellules MEF (wt et p53 - /-) ont été cultivées dans un milieu DMEM (Gibco) avec 10% de FBS (Hyclone), 100 U /ml de pénicilline et 100 pg /ml de streptomycine (Invitrogen) et on fait incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2.
précurseurs de miARN et les précurseurs de miARN de siARN ont été achetés chez Ambion, hsa-miR-449a (PM11521), hsa-miR-449b (PM11127) et hsa-miR-34a ( PM11030). les analyses
la croissance cellulaire des cellules SNU638
ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits et transfectées le jour suivant avec 50 nM miARN duplex ou ARNsi en utilisant la Lipofectamine 2000 (Invitrogen). les cellules ont été fixées aux points temporels indiqués dans 4% de paraformaldehyde , coloré dans une solution de cristal violet à 0,1% et remis en suspension dans de l'acide acétique à 10%. absorbance de l'échantillon a été mesurée à 620 nm.
cycle cellulaire par FACS analyse
cellules SNU638 et MKN74 ont été ensemencées à 2 x 10 6 cellules par 10cm plaque et transfectées avec 50 nM miRNA duplex (Ambion) en utilisant Lipofectamine 2000 (Invitrogen). On a récolté les cellules 48 et 72 heures après la transfection, colorées pour la teneur en ADN en utilisant l'iodure de propidium (PI) et analysé sur un flux FACS Calibur cytomètre (Becton-Dickinson). En bref, les cellules ont été récoltées par trypsinisation et lavées une fois avec du PBS avant de fixer pendant une nuit dans 70% d'EtOH. Pour colorer l'ADN, les cellules ont été centrifugées, remises en suspension dans 100 ul d'EtOH et colorées pendant 1 heure avec 300 ul de solution PI (0,05 mg /ml de PI, 20 ug /ml de RNase A dans 0,1% de BSA) de. Sénescence analyses cellules
SNU638 ont été ensemencées à 400.000 cellules par 6 puits-plaque et transfectées avec 50 nM miRNA duplex (Ambion) en utilisant Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Quatre jours après la transfection, les cellules ont été lavées dans du PBS et fixées pendant 5 minutes à température ambiante dans 2% de formaldéhyde /0,2% de glutaraldéhyde. Les cellules ont été lavées deux fois dans du PBS pH 6,0 avant d'être colorées avec une solution Gal-β sénescence associée aux taches fraîches (1 mg /ml de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-βD-galactoside (X-Gal), 0.12mm K 3Fe [CN] 6, 0.12mm K 4Fe [CN] 6, 1mM MgCl 2 dans du PBS pH 6,0) pendant la nuit à 37 ° C sans CO 2 offre . Les cellules ont été lavées une fois dans du PBS (pH 6,0) et observées au microscope.
Anticorps et western blot analyses
SNU638 ont été ensemencées à 2 x 10 6 cellules par 10 cm plaque, transfectées deux fois sur deux successives jours avec des duplexes 50nM miARN en utilisant la Lipofectamine 2000 selon le fabricant (Invitrogen). Les cellules ont été récoltées par trypsinisation, lavées une fois avec du PBS et lysées dans un tampon RIPA (NaCl 150 mM, 0,5% de désoxycholate de sodium, 0,1% de SDS, 1% d'Igepal, 50 mM de Tris-HCl pH 8, EDTA 2 mM) supplémenté avec 1 mM de DTT, 1 mM Pefabloc, 1 mM nav3, 10mM NaF et 1X complets mini-inhibiteurs de la protéase comprimés de cocktail. 25 ug de protéine /piste ont été résolus sur des gels NuPAGE à 4-20% de Bis-Tris (Invitrogen) et transférés sur une membrane de nitrocellulose. Les anticorps primaires utilisés étaient MET (Cell Signal 4560), MYC (Cell Signal 9402), GMNN (Santa Cruz Sc-53923), VCL (Sigma V9131), TP53 (Santa Cruz Sc-126), CDKN1A (Santa Cruz Sc-6246) , CDK6 (Santa Cruz Sc-177), HDAC1 (Santa Cruz Sc-7872), CCNE2 (Cell signal 4132), TUBB (Abcam ab11304), PARP (Cell signal 9542) et clivée CASP3 (Cell signal 9661).
analyses microarray
petits ARN (< 200 nt) ont été isolés avec le kit Invitrogen PureLink miARN d'isolement du tissu fundique et antrale de 1) souris Gastrin
KO et de l'âge et de souris témoins C57BL6 /J sexuels appariés, et 2) C57BL6 /J souris infectées par H. pylori
et l'âge et le sexe non infectées appariés souris témoins C57BL6 /J, (n = 4 pour chaque groupe). La qualité des ARN isolés petits a été déterminée en utilisant le dosage de petits ARN sur un Bioanalyzer Agilent. 500ng de petits ARN a été marqué avec Kit Genisphere FlashTag et hybridé à Invitrogen nCode multi-espèces miRNA Microarray V2 dans une station d'hybridation Maui. diapositives transformés ont été numérisés dans un scanner de puces à ADN Agilent ADN. Les images résultantes ont été analysées et le rapport de la médiane normalisées en utilisant GenePix Pro 6.0. Quatre répétitions biologiques ont été utilisés pour chaque comparaison. Les échantillons ont été hybridées à quatre tableaux dans une teinture de couleur échange microarray design expérimental double. ArrayTools BRB ont été utilisés pour le changement pli et les calculs statistiques. données miARN sélectionnés à partir de l'analyse du tableau ont été validés en utilisant TaqMan en temps réel des tests PCR miARN. Les données seront déposées à ArrayExpress lors de l'acceptation de. Les réseaux d'ARNm
SNU638 ont été transfectées avec 50 nM de miR-34a ou miR-449b duplex avec Siglo siRNA utilisés comme témoin négatif. L'ARN total a été extrait 24 heures après la transfection en utilisant le réactif Trizol. Affymetrix analyse des microréseaux (HG-U133 Plus 2.0 humain) a été réalisée au Centre Microarray, Rigshospitalet, Hôpital Universitaire de Copenhague. Les expériences ont été effectuées soit dans triplicats ou quatre exemplaires. Les données seront déposées à ArrayExpress lors de l'acceptation
. Vecteurs de construction et de reporter les essais
Les 3'UTRs de HDAC1
, SIRT1
, MET
, GMNN
et CCNE2 de la tenue les sites de liaison miR-449 ont été clonées en aval du rapporteur de la luciférase dans le système de vecteur PMIR-REPORT (Ambion). QuickChange Site-directed mutagenesis kit (Stratagene) a été utilisée pour induire deux mutations ponctuelles dans la région de la graine. amorces de mutagenèse séquences sont répertoriées dans les fichiers supplémentaires 1, tableau S1.
cellules HEK293 ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits et transfectées avec le précurseur 20 nM miRNA ou brouillées siRNA contrôle, 20-50ng de vecteur de luciférase (PMIR-rapport) et 5 ng de Renilla vecteur (pRL-TK) en utilisant la lipofectamine 2000 (Invitrogen). Les cellules ont été récoltées 24 heures après transfection et l'activité de la luciférase a été mesurée en utilisant Dual-Glo luciférase dosage (Promega).
Analyse des microréseaux
données d'expression de biopuces a été traité en utilisant le package 'affy' dans BioConductor [27]. Jeu de sondes intensités ont été résumées et quantile normalisées en utilisant les packages BioConductor RMA et VSN. L'expression différentielle a été déterminée par probeset en utilisant un t-test. ensembles de sondes ont été mises en correspondance avec les transcriptions Ensembl (version 49) en utilisant les correspondances prévues au BioMart. Probesets que mappés à deux gènes Ensembl différents ont été mis au rebut.
Évaluation régulation à la baisse globale des microARN gènes cibles
Les 3'UTRs, 5'UTR et séquences des transcrits codant ont été scannées pour faire correspondre 6mer, 7mer et miRNA 8MER sites de semences (complémentaires à la position 2-7, 2-8 et 2-9 du miRNA). Analyse globale de la cible miARN régulation à la baisse a été évaluée en utilisant la séquence 3'UTR plus longue par gène pour éviter les biais introduits par des gènes avec de nombreuses isoformes de transcription. Nous jeté transcrits avec des séquences 3'UTR plus courtes que 50 nt. Pour globalement évaluer si les gènes cibles miARN ont été régulés à la baisse après miRNA transfection, nous avons testé l'hypothèse nulle que la distribution des changements d'expression des cibles miARN (ayant un site cible de 7mer) était égale à la distribution de tous les gènes exprimés sans sites cibles prédites en utilisant le non-paramétrique de Wilcoxon test de la somme des rangs. Une approche similaire a été utilisée pour évaluer la régulation des gènes avec des sites cibles miARN dans les régions et 5'UTR d'ARNm codant.
Évaluation statistique exhaustive des mots en corrélation avec la régulation
Nous avons utilisé un non-paramétrique publiée précédemment sur la base du rang de statistique pour évaluer de manière exhaustive la corrélation des occurrences de mots dans 3'UTRs et le changement dans l'expression des gènes après transfection miRNA [28, 29]. Les gènes ont été triés par le changement d'expression induite par transfection de miR-34a ou miR-449b, et la corrélation avec la régulation a été testé pour tous les mots de longueur 5-7 (N = 21 504). Les tests statistiques
test t de Student avec correction de Welch.: Résultats
miR-449b est régulés à la baisse dans l'antre des deux souris Gastrin
KO et H. pylori
infectés gastrine
les souris knock-out de souris sont achlorhydriques avec une tendance pour le développement de l'hyperplasie antrale et adénomes gastriques au fil du temps (figure 1) [6, 12]. Afin d'identifier les microARN déréglementés pendant le développement du cancer de l'estomac, nous avons examiné miARN profils d'expression dans les néoplasies gastriques de gastrine souris
knock-out à l'aide de biopuces miARN. Comme le montre le tableau 1, 20 microARN ont été significativement déréglementés dans les souris knock-out par rapport aux sauvages contrôles de type même portée, avec trois miARN différents plus de deux fois, miR-7 étant régulée à la hausse et miR-709 et miR-449b étant régulée à la baisse dans l'antre des souris knock-out de gastrine par rapport aux types sauvages. Pour confirmer davantage miR-449 déréglementation au cours du développement du cancer de l'estomac, nous avons examiné son expression dans les tissus de souris de type antre sauvages infectés par H. pylori
. Fait intéressant, les tableaux miARN ont démontré une spécifique régulation négative de miR-449b chez H. pylori
infecté des souris (tableau 2 et les fichiers supplémentaires 1, figure S1). Figure 1 Old Gastrin knockout souris développent des adénomes gastriques. sections Antrum isolées à partir de 12-16 semaines souris (panneau de gauche), 12 à 18 mois vieille souris (panneau du milieu) et plus de 18 mois souris (panneau de droite), de type sauvage (panneau supérieur) et les souris knock-out de gastrine (panneau inférieur). Les articles montrent le développement des adénomes dans les tissus antre dans les gastrine
KO par rapport aux types sauvages.
Tableau 1 miARN déréglementés en knockout les souris de gastrine
miRNA Nom
Log2 fois
p-valeur
miRNA Name

Log2-fold

p-value

mmu-miR-709
-1.73
7.0E-06
mmu-miR-422b
0.44
4.6E-02
mmu-miR-449b
-1.37
1.6E-03
mmu-miR-199a*
0.50
7.7E-03
mmu-miR-805
-1.01
7.5E-03
mmu-miR-25
0.51
1.6E-02
mmu-miR-706
-0.98
3.1E-03
mmu-miR-27b
0.56
5.1E-03
mmu-miR-467a
-0.88
2.8E-02
mmu-miR-182
0.56
1.8E-02
mmu-miR-696
-0.83
7.1E-03
mmu-miR-30a-3p
0.59
2.2E-02
mmu-miR-667
-0.66
2.3E-02
mmu-miR-10a
0.70
7.1E-03
mmu-miR-690
-0.28
1.7E-02
mmu-miR-152
0.70
2.3E-02
mmu-miR-18
0.29
3.7E-02
mmu-miR-1
0.77
7.1E-03
mmu-miR-143
0.34
2.3E-02
mmu-miR-7
1.06
4.9E-03
Liste des miARN significativement dérégulés dans les néoplasies gastriques à partir des souris knock-out de gastrine par rapport aux types sauvages.
Tableau 2 miARN dérégulés dans les tissus infectés de H.Pylori
Nom miRNA Plier de
change

p-value

mmu-miR-122a
-3.247
0.000788
mmu-miR-449b
-0.879
0.045214
Liste des miARN significativement dérégulés dans des souris de type sauvage antrum infectés par H. pylori
comparé à antrum non infecté.
MiR-449 inhibe la progression du cycle cellulaire et induit la sénescence
Après avoir démontré la régulation de miR-449 expression dans les cancers gastriques nous avons voulu examiner l'effet de re-exprimant miR-449 dans des lignées cellulaires de cancer gastrique. Il est intéressant de remarquer qu'aucune expression de la famille miR-449 a été détectée sur un panel de lignées de cellules gastriques, notamment SNU638, SNU5, SNU216, MKN74 SNU601 et le maintien de la notion de miR-449 ayant des fonctions suppressives de tumeur (données non montrées). La famille miR-449 se compose de miR-449a et b chez l'homme et miR-449a, b et c chez les souris. Fait intéressant, ils partagent la même séquence de graines que la famille miR-34 et sont donc censés réguler les cohortes de chevauchement des gènes cibles (figure 2a). Pour évaluer la fonction de miR-449 dans des lignées cellulaires gastriques nous réintroduits miR-449b dans les cellules SNU638 et MKN74. Par rapport à microARN de contrôle négatif, la réintroduction de miR-449b a fortement affecté la prolifération des SNU638 cellules (figure 2b) et l'inspection visuelle des cellules d'induction de l'apoptose et la sénescence cellulaire (figure 2c, et fichiers supplémentaires 1, figure S2) indiqués. l'analyse par cytométrie de flux de cellules d'iodure teinté propidium transfectées avec miR-449b a montré un G 1 accumulation de 48 heures après la transfection, suivi à 72 heures après la transfection par une accumulation de cellules dans la sous G 1 fraction suggestive de la cellule la mort (figure 2d). L'induction de la sénescence cellulaire a été confirmée par le bêta acide gal coloration en utilisant miR-34a comme un microARN contrôle positif (figure 2e). Pour exclure des effets spécifiques aux lignes cellulaires, les conséquences fonctionnelles de miR-449 réintroduction en termes d'arrêt du cycle cellulaire ont été vérifiées dans MKN74 cellules (fichier additionnel 1, figure S3). Ainsi, la réintroduction de miR-449 affecte négativement la prolifération de lignées cellulaires de cancer gastrique concomitante avec l'induction de la sénescence et l'apoptose en concordance avec miR-449 ayant une tumeur des fonctions suppressives. Figure 2 miR-449 fait partie de la famille miR-34 et inhibe la prolifération cellulaire. A - miR-449 fait partie de la famille miR-34 et est évolutivement conservée. B - miR-449 re-introduction dans des lignées de cellules gastriques humaines (SNU638) inhibe la prolifération cellulaire (ligne rouge) par rapport à un contrôle brouillé (ligne bleue) et miR-146 contrôle (ligne noire). Les barres d'erreur représentent E.T. C - Contrôle visuel de l'inhibition de la prolifération cellulaire et la sénescence comme phénotype sur miR-449 réintroduction dans SNU638 cellules (panneau inférieur) par rapport au contrôle de transfection brouillés (panneau supérieur). D - FACS analyse du cycle cellulaire montrant l'accumulation sous-G1 de SNU638 cellules 72 heures après miR-449 réintroduction (histogramme à droite) par rapport à un contrôle de transfection brouillé (histogramme de gauche) Le tableau montre l'accumulation de cellules dans la fraction G1 sur miR-449 re -Introduction par rapport à brouillées contrôle de l'ARN à 48 heures après la transfection, suivi d'un passage à la fraction sous-G1 à 72 heures après la transfection indicative de la mort cellulaire. E - phénotype de SNU638 cellules En déclin sur miR-449 et miR-34a contrôle positif réintroduction montré par acide test β-gal par rapport à l'ARN contrôle brouillé
La séquence d'amorçage commune de miR-449b et miR-34a induisent fortement. expression corrélée change
pour caractériser les transcriptions contrôlées par miR-449 et pour voir si miR-449 régule différents transcrits que miR-34a, profils d'expression SNU638 cellules ont été examinées 24 heures après la transfection de miR-449b ou miR-34a et différentiellement transcrits exprimés identifiés. Nous avons trouvé que les ARNm avec des sites prévus miARN cibles (site de semences 7 mer) dans le 3'UTR étaient significativement régulée à la baisse par rapport aux ARNm sans sites cibles prédites après transfection de miR-449b (p < 1.2e-70, deux tailed Wilcoxon test de la somme des rangs), (fichier supplémentaire 1, figure S4a). ARNm ayant prédit miRNA semences sites cibles dans les régions de codage ont également été trouvés pour être significativement régulée à la baisse (p < 9.9E-25), tandis que les ARNm avec des sites en 5'UTR étaient seulement marginalement régulée vers le bas (p < 5.3e- 2). Les changements d'expression induits par transfection mature miR-449b et miR-34a étaient fortement corrélées malgré la divergence des séquences matures en dehors de la région de semences (coefficient de corrélation de R Pearson = 0,94, p = 0), (fichiers supplémentaires 1, figure S4b). Nous exhaustivement évalué tous les oligonucléotides (mots) de longueur 5-7 pour la corrélation avec la régulation après miR-449b et miR-34a transfection (voir méthodes). Conformément à de nombreuses études antérieures, cette analyse a révélé le /site de semences 449b miR-34a partagé comme le mot 3'UTR plus corrélée avec la régulation dans les deux expériences (fichier additionnel 1, figure S4c).
MiR-449 régule de nombreux contrôleurs du cycle cellulaire
Les profils d'expression ont été utilisés pour identifier les transcrits exprimés de manière différentielle dans les cellules transfectées avec miR-449b ou des contrôles (fichiers supplémentaires 1, table S2). Une analyse d'activation de la voie sur la base des relevés de notes différentiellement réglementées démontre que miR-449 contrôle principalement transcrits codant pour des protéines impliquées dans les dommages cellulaires réponses, le contrôle du cycle cellulaire, l'inflammation et les voies de cancer (Figure 3a). En se concentrant sur un ensemble de gènes cibles putatifs avec des rôles bien établis dans la tumorigenèse, nous avons confirmé la régulation par miR-449 de oncogène met proto (MET
), kinase dépendante de la cycline 6 (CDK6) de
, Geminin (GMNN )
, myélocytomatose oncogènes virale homolog (MYC)
, sirtuines 1 (SIRT1
) et histone déacétylase 1 (HDAC1)
au niveau de la transcription (figure 3b). Western blot analyses ont confirmé la capacité de miR-449 à réguler vers le bas MET, GMNN, MYC, SIRT1, cycline E2 (CCNE2) et HDAC1 au niveau de la protéine dans une mesure similaire à celle obtenue par la réintroduction de miR-34a (figure 3c). Pour un sous-ensemble de gènes cibles, y compris MET
, GMNN, CCNE2
, SIRT1
et HDAC1
, nous avons confirmé l'interaction directe de miR-449 avec le gène cible 3 'UTR en utilisant un dosage de la luciférase (figure 3d ). La figure 3 miR-449 cible des gènes de régulation du cycle cellulaire. A - Ingenuity Pathway Analysis (IPA) des gènes dérégulés sur miR-449 re-introduction dans SNU638 cellules présentant un enrichissement pour les catégories de gènes cancer, la mort cellulaire et le cycle cellulaire des voies entre autres. B - validation qPCR des tableaux Affymetrix montrant la régulation du MET
, CDK6
, GMNN
, MYC
et HDAC1
sur miR-449 réintroduction par rapport aux contrôles d'ARN brouillés. C - validation par Western blot des gènes régulés à la baisse sur miR-449 re-introduction dans SNU638 cellules par rapport aux témoins d'ARN brouillés. Vinculine (VCL) et la tubuline bêta (TUBB) ont été utilisés en tant que témoins de charge D - vérification de cible directe et fonctionnelle de liaison en utilisant des constructions luciférase de maintien 3'UTRs de type sauvage et 3'UTRs mutées (deux mutations dans miR-449 site de liaison), * indique la signification statistique dans l'expression luciférase entre 3'UTRs de type sauvage transfectées avec miR449a /b par rapport à l'ARN brouillé contrôle, # indique une différence statistique dans l'expression luciférase entre 3'UTRs de type sauvage par rapport à 3'UTRs mutants transfectées avec miR-449a et Mir- 449b. "Ns" pas significatif valeur >p; 0,05, "*" ou "#" significative 0,01 < valeur p < 0,05, "**" ou "##" très significatif 0,01 < valeur p < 0,001, "***" ou "###" extrêmement importante valeur de p < 0,001
Ainsi, miR-449 cible directement les gènes de régulation du cycle cellulaire compatible avec une fonction de suppresseur de tumeur et à l'arrêt du cycle cellulaire observée lors de miR-449 réintroduction dans des lignées cellulaires cancéreuses.
MiR-449 induit l'expression de p53, mais est pas réglementé par p53
Comme miR-34a a déjà été trouvé pour fonctionner en aval de p53 [30-33], nous avons analysé si étaient liés aussi miR-449a /b pour p53. Ceci a été en outre stimulé par la présence d'un site de liaison de p53 supposée 10 kb en amont de miR-449 humaine (données non montrées). Nous avons donc induit p53 par des dommages de l'ADN en utilisant UV ou 5-fluorouracile (5FU) dans quatre systèmes différents, HCT116 et les cellules MEF de type sauvage et p53 knock-out (fichiers supplémentaires 1, la figure S5a). Toutefois, aucun changement significatif dans l'expression de miR-449 a été détectée après activation de la voie p53 (fichier additionnel 1, figure S5b). En conclusion, nous avons trouvé aucune preuve que miR-449 est une cible transcriptionnelle de p53. D'autre part, nous avons découvert que miR-449a /b est capable d'induire l'activation de p53, l'activation des gènes de réponse à p53, tels que p21 et l'induction de l'apoptose comme en témoigne le clivage de la caspase 3 (CASP3) et de poly (ADP-ribose ) polymérase 1 (PARP) (figure 4). Vers la compréhension du mécanisme par lequel miR-449 fait cela, nous avons examiné l'effet de miR-449 sur SIRT1 et HDAC1. SIRT1 et HDAC1 sont désacétylases qui inhibent, entre autres, l'activation de p53 et de miR-34 a été montré pour réprimer SIRT1 [34]. Nous avons validé la liaison spécifique de miR-449 à SIRT1 et HDAC1 en utilisant des essais de luciférase 3'UTR (figure 3d). La figure 4 miR-449 active la voie p53. Une analyse par transfert de Western montrant une augmentation de la protéine p53 sur miR-449 et contrôle positif miR-34a réintroduction dans SNU638 cellules par rapport à l'ARN brouillés contrôle ainsi qu'une activation des p53 en aval p21 cible et l'apoptose des marqueurs CASP3 et PARP clivé. Vinculine (VCL) et la tubuline bêta (TUBB) ont été utilisés comme témoins de charge.
Par conséquent, nous pensons que miR-449 induit l'apoptose en inhibant la HDAC1 histone déacétylase et SIRT1 conduisant à l'activation de la voie p53 ainsi l'induction de marqueurs d'apoptose clivée CASP3 et PARP.
miR-449 est régulée à la baisse dans les cancers gastriques humaines
Pour évaluer l'importance de miR-449 dans les tumeurs malignes humaines nous avons ensuite examiné l'expression de miR-449 dans 10 biopsies de cancer gastrique. Surtout, nous avons trouvé deux miR-449a et b significativement régulée à la baisse ou absente dans les cancers gastriques primaires 8 sur 10. En outre, l'expression de miR-449a et b semble être co-régulé (figure 5a). Nous ne avons trouvé aucune corrélation entre la réduction de l'expression de miR-449 et les caractéristiques cliniques du cancer (figure 5b). L'analyse de l'ADN génomique à partir de la tumeur n'a trouvé aucune preuve de perte ou de l'hyper-méthylation des miR-449 locus en utilisant une analyse de courbe de fusion spécifique de la méthylation (MS-MCA) qui indique la transcription régulation négative de l'expression (données non présentées). Par conséquent, en accord avec les données de deux modèles de souris d'inflammation gastrique et l'hyperplasie, l'expression de miR-449 est régulée à la baisse dans les cancers gastriques humaines. Figure 5 miR-449 est bas réglementée dans les cancers gastriques humains. analyse qPCR (panneau supérieur) montrant la régulation de l'expression de miR-449 dans 8 tissus de cancer gastrique par rapport à miR-449 expression dans les contrôles d'échantillons appariés (ligne pointillée). U44 a été utilisé comme contrôle endogène. Tableau montrant l'information clinique des patients (panneau inférieur). "Ns" pas significatif valeur >p; 0,05, "*" significative 0,01 < valeur p < 0,05, "**" très significatif 0,01 < valeur p < 0,001, "***" extrêmement importante valeur de p < Le cancer gastrique de 0,001
Discussion est une tumeur maligne hautement létale avec plus de 21.500 nouveaux cas chaque année aux États-Unis seulement [35]. La maladie est souvent détectée tardivement et le taux de survie à 5 ans est par conséquent inférieure à 20% [36]. Il est donc important de comprendre les étapes de l'étiologie et la progression de la maladie. L'importance des facteurs de risque génétiques bactériennes, l'environnement et l'hôte dans la carcinogenèse gastrique ont été étudiés, mais on en sait moins sur la progression moléculaire de la maladie [37, 38]. Entre autres, la voie de l'inactivation de p53 est rapportée dans 30-60% des cancers gastriques [39, 40] et des études récentes suggèrent Helicobacter pylori de la modulation directe du gène p53 ou ses cibles en aval [41].

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