miR-449 zavira proliferacijo celic in dol-urejeno v želodcu cancer

miR-449 zavira proliferacijo celic in navzdol ureja raka želodca
Abstract
Ozadje
Rak želodca je četrti najpogostejši rak na svetu in druga najbolj razširjena vzrok raka povezanih smrti. Razvoj raka želodca je v glavnem povezana s H. pylori
okužba vodi do poudarkom na raziskavah patologije na bakterijske in okoljskih dejavnikov, in v manjši meri na mehanizmov razvoja tumorja. MicroRNAs so majhne molekule RNA nekodiranih vključeni v post-transkripcijske regulacije genov. Najdemo jih urediti genov, ki sodelujejo v različnih bioloških funkcijah in sprememb v microRNA izražanja so povezani s patogenezo številnih malignih bolezni. Sedanja študija se osredotoča na ugotavljanje microRNAs sodelujejo pri želodca rakotvornosti in raziskati njihovo sistematično pomen, ki ga označujejo svoje cilje.
Rezultati
Invitrogen nCODE miRNA mikromrež ugotovljenih miR-449, ki se je v 1-letni gastrin
KO miši in v H. pylori
okužene želodčne tkiva v primerjavi z tkiva živali divjega tipa. Rast linij želodčnih celic pretirano izražanje MIR-449 je zaviral za 60% v primerjavi s kontrolno skupino. FACS analizo celičnega ciklusa miR-449 več-izražanje celice so pokazale znatno povečanje v sub-G 1 frakcije okvirni apoptoze. ß-Gal testi pokazali starejšim fenotip linij želodčnih celic pretirano izražanje MIR-449. Affymetrix 133v2 nizi označene GMNN
, MET, CCNE2, SIRT1
in CDK6
kot miR-449 ciljev. Luciferazne teste smo uporabili za potrditev GMNN
, MET
, CCNE2
in SIRT1
kot neposredne cilje. Prav tako kažejo, da miR-449 prekomerno izražanje aktivira p53 in njenega pomena za ciljno p21 kot tudi apoptozo označevalci razcepljen CASP3 in PARP. Pomembno je, da qPCR analize so pokazale izgubo miR-449 izražanja v klinične želodčnih tumorjev v primerjavi z običajnimi tkiva.
Sklepe
V tej študiji smo dokument z zmanjšano izražanje miR-449 v gastrin
KO miši in dodatno potrjuje svojo izgubo človeških želodčnih tumorjev. Preučevali smo funkcijo miR-449 z opredelitvijo njenih neposrednih ciljev. Poleg tega smo pokazali, da miR-449 povzroči staranje in apoptozo z aktiviranjem p53 pot.
Ozadje
je rak želodca med pet najpogostejših rakov na svetu in druga najbolj razširjena vzrok smrti, povezanih z rakom [1] . To je predvsem, a ne izključno, s H. pylori
infekcije [2] in niso vsi H. pylori
okužene osebe razviti tumor [3]. Drugi dejavniki, vpleteni v razvoj raka želodca vključujejo stopnjo in vrsto vnetnega odziva [2], kot tudi raven v gastrin
hormona [4, 5]. Številne študije so pokazale, da sta hipergastrinemijo [6, 7] in pomanjkanje gastrin [5] prispevajo k patogenezi raka želodca. Aklorhidrija je skupna značilnost modelov miši nagnjeni k razvoju metaplazijo in raka [6, 8, 9]. Gastrin
knockout miši so achlorhydric [10], pri čemer daje bakterijski želodčne zaraščanje [11, 12], in kroničnih bakterijskih želodčnih okužb privede do želodca metaplazijo, ki lahko napreduje v raka želodca [6, 12].
Od njihovega odkritja microRNAs je bilo ugotovljeno, vpleten v zelo širokem razponu od normalnih in patoloških procesov [13]. MicroRNAs izvajajo svoje regulativne funkcije posttranscriptionally z vezavo na delno komplementarno zaporedje motivi pretežno v 3 'UTR ciljnih mRNA, ki izhajajo iz mRNA destabilizacije in translacijske represijo [14]. Z biološkega vidika, microRNAs izpodbijata predmete za študij, saj uravnavajo skupinama ciljnih genov, ki jih je težko opredeliti. S terapevtskega stališča, microRNAs so zelo zanimive, saj so številne študije pokazale moč microRNAs kot biomarkerjev in začetnih predkliničnih raziskavah se ugotavlja, da se microRNAs lahko terapevtsko usmerjena vivo [15].
Profiliranje študije so bili pridobljeni dokazi microRNA deregulacija v širok spekter bolezni, vključno z vsemi večjimi raka [16]. MicroRNAs verjetno vplivajo kancerogen procese na dveh ravneh. Prvič, so številne študije s sedežem pro-onkogeni ali tumorsko omejevalno vlogo posameznih microRNAs trdno povežejo z rakom etiologiji kot kaže miR-155, MIR-10b in pokoj-21 [17-19]. Po drugi strani se zdi, da microRNA regulativni sistem sam po sebi, da ima tumor omejevalno funkcije, kot je genska ablacijo ključnih microRNA BIOGENESIS dejavnikov, kot so Kocka, močno poveča dovzetnost za raka [20] in izguba funkcije mutacije so bile ugotovljene pomembne microRNAs dejavnikov za predelavo v človeških tumorjih [21-23].
V tej študiji smo obravnavali pomen microRNAs na raka želodca izkorišča v gastrin
modela knockout miške in H. pylori
okužbo miši divjega tipa. Prepoznamo MIR-449, da znatno navzdol regulirane ali izgubil v modelih miši raka želodca, kakor tudi v osnovnih želodčnih tumorjev pri ljudeh. Identifikacija ciljev mRNA kaže, da je to microRNA lahko izvaja tumor omejevalno funkcij prek usklajenega urejanja kohorte regulatorjev celičnega cikla, povezanimi z rakom, vključno MET, GMNN, CCNE2, SIRT1 in HDAC1.
Metode
miši
smo uporabili tri različne starostne skupine (12-16 tednov, 1 leto ali 1 ½ let) gastrina
knockout (KO) miših divjega tipa (wT) ali. Vse miši so na mešano 129 /SVJ, C57BL 6J ozadje /, backcrossed vsaj štirikrat na C57BL /6J [12]. Miši so pod posebnimi pogoji, brez patogenov in spremlja po mnenju zveze priporočila evropske znanosti o laboratorijskih živalih združenj [24] s 12 h svetlobe, 12 h temne ciklov.
H. pylori
okužbo
C57BL6 /J miši (n = 10) smo inokulirali z ne-miš-prilagojen klon H. pylori
seva 67:21, prvotno izoliran iz antralnih biopsijo, pridobljenih iz švedske samice z želodca. Sev je Váca + in vsebuje celoten OAS patogenosti otok (PAI) s genske stabilnosti v OAS PAI [25]. Miši smo cepili vsak drugi dan (trikrat), v 5-dnevnem obdobju. DNK smo ekstrahirali in analizirali prisotnost Helicobacter vrste z uporabo semi-nested verižne reakcije s polimerazo-denaturirane gradientne gel elektroforeze testom, specifično za rodu Helicobacter, kot smo že prej [26] opisano. Ujemajočo se skupino neokuženih C57BL6 /J miši so bili uporabljeni kot kontrole.
Želodci vseh miši razdeli na fundusa in antruma pred ekstrakcijo RNA. Vsi poskusi na živalih so bili potrjeni odbor danskega dobro počutje živali (2005 /562-40) in danski gozd in Agencije narave (20010077355/6).
Miške antruma dele
Miši so usmrtili s cervikalno dislokacijo. Antruma odstranimo, previdno speremo v ledeno mrzlo PBS, zamrznili v tekočem dušiku in shranili pri -80 ° C, dokler ekstrakcijo RNA.
Klinični vzorci analize
biopsije zaradi raka želodca in sosednje normalne tkiva so bili pridobljeni iz bolnikov operacijo zaradi raka želodca na Oddelek za operacijo na prebavilih, Rigshospitalet. Vključitev je potekala julija do decembra 2008 in vsi bolniki če podpisana privolitev (odobritev Etični odbor H-B-2008-049) in Danska agencija za varstvo podatkov (2008-41-2138). Biopsije damo v RNAlater (Ambion) v delovnem prostoru in nato zamrznemo pri -80 ° C, dokler ekstrakcijo RNA. Ekstrakcijo
RNA in qPCR analize
RNA smo ekstrahirali z uporabo TRIzola (Invitrogen) glede na proizvajalca. miRNA izraz profil je bil ocenjen z uporabo TaqMan Mirna testov (Applied Biosystems) za HSA /MMU-pokoj-449a in b, HSA /MMU-pokoj-34a, b in c in rnu44 ali HSA /MMU-pokoj-191. Primer zaporedja za Affymetrix cilje validacijo so navedene v posebnem dokumentu 1, namizni S1.
Celične kulture
SNU638 in MKN74 gojimo v RPMI-1640 (Gibco) z 10% FBS (Hyclone), 100U /ml penicilina in 100 ug /ml streptomicina (Invitrogen) in inkubirali pri 37 ° C v 5% CO 2. HCT116 celice (WT in p53 - /- so bile gojene v McCoyev 5A (Gibco) v 10% FBS (Hycolne-a), in 100U /ml penicilina in 100 ug /ml streptomicina (Invitrogen) in inkubirali pri 37 ° C v 5% CO <. sub> 2 HEK293 in MEF celice (mas in p53 - /-) gojimo v DMEM (Gibco), z 10% FBS (Hyclone) 100U /ml penicilina in 100 ug /ml streptomicina (Invitrogen) in inkubirali pri 37 ° C s 5% CO 2.
Mirna predhodnimi sestavinami in siRNA
Mirna predhodniki so bile kupljene od Ambion, HSA-miR-449a (PM11521), HSA-miR-449b (PM11127) in HSA-pokoj-34a ( PM11030). analize
rast celic
SNU638 celice smo zasejali v 24 vdolbinami in transfektirali naslednji dan z 50nm miRNA dupleks ali siRNA uporabo Lipofectamine 2000 (Invitrogen). celice so bile določene na označenih časovnih točkah v 4% paraformaldehid , obarvajo v 0,1% raztopino kristal vijoličnega ter resuspendirali v 10% ocetne kisline. Vzorec absorbanco smo izmerili pri 620 nm.
Celični ciklus FACS analize
SNU638 in MKN74 celice so zasejali z 2 x 10 6 celic na 10 cm ploščo in transfekciji s 50nm miRNA duplex (Ambion) z Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Celice smo zbrali 48 in 72 ur po transfekciji, obarvamo za vsebnost DNA s pomočjo propidium jodida (PI) in analizirali na tok FACS Calibur citometrom (Becton-Dickinson). Na kratko, celice požanjemo s trypsinization in enkrat sprali s PBS pred določitvijo preko noči v 70% EtOH. Madež DNK, celice smo peletiramo, ponovno suspendiramo v 100 ml EtOH in obarvamo za 1 uro pri 300 ul raztopine PI (0.05mg /ml PI, 20 ug /ml RNaze A v 0,1% BSA).
Staranjem analizami
SNU638 celice smo zasejali na 400.000 celic na 6-ter-plošče in transfekciji s 50nm miRNA duplex (Ambion) z Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Štiri dni po transfekciji smo celice izprali v PBS in je določena za 5 minut pri sobni temperaturi v 2% formaldehida /0,2% glutaraldehida. Celice smo dvakrat izprali v PBS pH6.0 preden se obarvajo s svežo senescenco povezano beta-Gal raztopine madež (1 mg /ml 5-bromo-4-kloro-3-indolil-βD-galaktozidom (X-Gal), 0.12mM K 3Fe [CN] 6, 0.12mM K 4Fe [CN] 6, 1 mM MgCl 2 v PBS pH6.0) preko noči pri 37 ° C brez CO 2 oskrba . Celice so bile enkrat sprali v PBS (pH6.0) in opazuje pod mikroskopom.
Protitelesa in Western Blot analiz
SNU638 so zasejali z 2 x 10 6 celic na cm ploščo 10, dvakrat transficirane na dve zaporedni dni 50nm miRNA dupleksov uporabo Lipofectamine 2000 glede na proizvajalca (Invitrogen). Celice požanjemo s trypsinization, enkrat sprali s PBS in lizirali v RIPA pufra (150 mM NaCI, 0,5% natrijev deoksiholat, 0,1% SDS, 1% Igepal, 50 mM Tris-HCI pH 8, 2mM EDTA) z dodatkom 1 mM DTT, 1 mM Pefabloc, 1mm NAV3, 10 mM Naf in 1x celotna mini zaviralci proteaz koktajl tablet. 25 ig proteina /pas bila rešena na 4-20% NuPAGE Bis-Tris gele (Invitrogen) in prenesli na nitrocelulozno membrano. Primarna protitelesa, ki se uporabljajo so bili izpolnjeni (Cell Signal 4560), MYC (Cell Signal 9402), GMNN (Santa Cruz Sc-53923), DPP (Sigma V9131), TP53 (Santa Cruz Sc-126), CDKN1A (Santa Cruz Sc-6246) , CDK6 (santa Cruz Sc-177), HDAC1 (santa Cruz Sc-7872), CCNE2 (Cell Signal 4132), TUBB (Abcam ab11304), PARP (Cell Signal 9542) in razklani CASP3 (Cell Signal 9661).
mikromrež analize
majhne RNA (< 200 nt) so bile izolirane z Invitrogen PureLink miRNA Izolacija Kit iz fundic in antralnih tkiva od 1) Gastrin
KO miši in starosti in spolu usklajenih nadzornih C57BL6 /J miši, in 2) C57BL6 /J miši, okuženih s H. pylori
in neokuženih starosti in spolu ujemajo C57BL6 /J kontrolne miši, (n = 4 za vsako skupino). Kakovost izoliranih majhnih RNA smo določili s pomočjo male RNA preskusa na Agilent Bioanalyzer. 500 ng malih RNA je bila označena z Genisphere FlashTag Kit in hibridizirali Invitrogen nCODE Multi-vrstah miRNA mikromrež V2 v hibridizacije postaji Maui. Predelani diapozitivi so bili skenirani v mikromrež skener za Agilent DNA. Izhajajo slike smo analizirali in razmerje mediane normalizirajo uporabo GenePix Pro 6.0. Štiri biološke ponovitve smo uporabili vsako primerjavo. Vzorce smo hibridizirali štiri polja v dvojni barvni barvila swap mikromrež eksperimentalnega oblikovanja. BRB ArrayTools so bili uporabljeni za kratno spremembo in statistične izračune. Izbrani podatki MIRNA iz analize matrike so bile potrjene z uporabo TaqMan realnem času PCR Mirna testov. Podatki se bodo deponirale ArrayExpress po sprejetju.
Nizi mRNA
SNU638 so transfekciji s 50 nM miR-34a ali miR-449b dupleksov z Siglo siRNA, ki se uporabljajo kot negativno kontrolo. Celotno RNA smo ekstrahirali 24 ur po transfekciji s pomočjo TRIzola reagenta. Affymetrix analizo mikromrež (HG-U133 Plus 2.0 človek) je bila izvedena na mikromrež Center, Rigshospitalet, University Hospital v Kopenhagnu. Poskusi so bili vodijo bodisi v treh izvodih ali quadruplicates. Podatki se bodo deponirale ArrayExpress po sprejemu.
Vektorji gradbenih in reporterske teste
3'UTRs za HDAC1
, SIRT1
, MET
, GMNN
in CCNE2
gospodarstvu miR-449 veznih mest so klonirali dolvodno od luciferazni novinar v vektorski sistem pMIR-POROČILO (Ambion). Quickchange site-usmerjeno mutagenezo Komplet (Stratagene) smo uporabili za indukcijo dva točkovne mutacije v regiji semen. Mutageneze primerji sekvence so navedena v dodatni datoteki 1, namizni S1.
HEK293 celice smo zasejali v 96 vdolbinicami in transfekciji s 20 nm miRNA predhodnik ali umešana siRNA nadzor, 20-50ng luciferaze vektorja (pMIR-poročilo) in 5 ng za renilla vektor (PRL-TK) z Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Celice smo zbrali 24 ur po transfekciji in merimo luciferazno aktivnost z uporabo Dual-Glo luciferazno testom (Promega).
Uporabo analize mikromrež
Mikromrežni izraz podatke smo obdelali z uporabo "affy" paket v BioConductor [27]. set intenzivnosti sonde so bili povzeti in kvantil normalizirali s pomočjo paketov BioConductor RMA in VSN. Diferencialna ekspresija je bila določena na probeset s pomočjo t-testa. Sonda kompleti so preslikani v Ensembl transkriptov (različica 49) s pomočjo preslikave, ki na BioMart. Probesets da poveže s dvema različnima Ensembl genov so bile zavržene.
Vrednotenje globalno navzdol regulacijo microRNA ciljni geni
3'UTRs, 5'UTRs in kodiranje zaporedja prepisih so bili pregledani ujemanje 6mer, 7mer in 8mer MIRNA seme strani (komplementarni položaj 2-7, 2-8 in 2-9 za miRNA). Globalna analiza tarče miRNA navzdol uredbe je bil ovrednoten z najdaljšo 3'UTR zaporedje na genu za preprečitev pristranskosti z geni s številnimi Prepis izooblik uveden. zavreči smo transkriptov z 3'UTR zaporedja krajših od 50 nt. Za globalno oceniti, če so Mirna ciljni geni navzdol urejeno po miRNA transfekciji smo testirali ničelno hipotezo, da je porazdelitev izraz sprememba tarč miRNA (s ciljno 7mer mesto), ki je enak distribucijo vseh izraženih genov brez predvidenih ciljnih strani, ki uporabljajo neparametrična Wilcoxonov rang test vsote. Podoben pristop je bil uporabljen za oceno navzdol regulacije genov z miRNA ciljnih območij v kodirnih regij in 5'UTRs iz mRNA.
Izčrpen statistično oceno besed soodvisnih z zmanjšanjem števila
smo uporabili že objavljene neparametrska -rank temelji statistika izčrpno oceno korelacijo besednih pojavov v 3'UTRs in spremembe v izražanju genov po miRNA transfekciji [28, 29]. Geni so razporejene po spremembi izražanja z transfekciji pokoj-34a ali miR-449b inducirane in korelacijo z zmanjšanjem števila je bil testiran za vse besede dolžine 5-7 (N = 21 504).
Statistični testi
študenti t-test s korekcijo Welch je.
Rezultati
pokoj-449b je navzdol urejeno v antruma obeh gastrin
KO miši in H. pylori PODJETJA
okuženih miših
gastrin
knockout miši so achlorhydric s težnjo za razvoj antralnih hiperplazijo in želodčne adenome v daljšem časovnem obdobju (slika 1) [6, 12]. Da bi ugotovili microRNAs dereguliranih med razvojem raka želodca, smo pregledali miRNAs profile izražanja v želodcu neoplazij iz gastrin
knockout miših z Mirne mikromrež. Kot je prikazano v tabeli 1, je bilo 20 microRNAs precej liberaliziran v izločilnih miših v primerjavi s kontrolno skupino divjih tip littermate, s tremi miRNAs razlikujejo več kot dva krat, miR-7, ki se up-urejena in miR-709 in miR-449b se navzdol regulirano v antruma gastrina
knockout miših v primerjavi z divjimi vrstami. Da bi še dodatno potrditev miR-449 deregulacijo med razvojem raka želodca, smo pregledali njegovo izražanje pri divjih tip miši antruma tkivih okuženih s H. pylori
. Zanimivo je, da Mirna nizi dokazan poseben navzdol ureditev pokoj-449b v H. pylori PODJETJA
okuženih miši (tabela 2 in dodatno datoteke 1, slika S1). Slika 1 Old Gastrin knockout miši razvijejo želodca adenome. Antruma oddelki izolirani od 12-16 tednov stare miši (levi panel), od 12 do 18 mesecev stare miši (srednji panel) in starejši od 18 mesecev miši (desni panel), od gastrin
knockout miših divjega tipa (zgornja plošča) in (nižji plošča). Profili kažejo razvoj adenom v antruma tkivih v gastrin
Knockouts v primerjavi z divjimi vrstami.
Tabela 1 miRNAs dereguliranih v gastrin
knockout miših
miRNA Ime
log2-krat
p-vrednost
miRNA Name

Log2-fold

p-value

mmu-miR-709
-1.73
7.0E-06
mmu-miR-422b
0.44
4.6E-02
mmu-miR-449b
-1.37
1.6E-03
mmu-miR-199a*
0.50
7.7E-03
mmu-miR-805
-1.01
7.5E-03
mmu-miR-25
0.51
1.6E-02
mmu-miR-706
-0.98
3.1E-03
mmu-miR-27b
0.56
5.1E-03
mmu-miR-467a
-0.88
2.8E-02
mmu-miR-182
0.56
1.8E-02
mmu-miR-696
-0.83
7.1E-03
mmu-miR-30a-3p
0.59
2.2E-02
mmu-miR-667
-0.66
2.3E-02
mmu-miR-10a
0.70
7.1E-03
mmu-miR-690
-0.28
1.7E-02
mmu-miR-152
0.70
2.3E-02
mmu-miR-18
0.29
3.7E-02
mmu-miR-1
0.77
7.1E-03
mmu-miR-143
0.34
2.3E-02
mmu-miR-7
1.06
4.9E-03
Seznam bistveno dereguliranih miRNAs v želodcu neoplazij iz gastrin
knockout miših v primerjavi z divjimi vrstami.
Tabela 2 miRNAs Dereguliranim v H. pylori
okuženih tkivih
ime miRNA
Proste Zložite change

p-value

mmu-miR-122a
-3.247
0.000788
mmu-miR-449b
-0.879
0.045214
Seznam bistveno dereguliranih miRNAs v divji tip miši antruma okuženi s H. pylori PODJETJA
v primerjavi z ne-okuženega antruma.
MiR-449 zavre potek celičnega ciklusa in povzroča staranje
Ob dokazali navzdol ureditev miR-449 izraz v želodčnih rakov smo želeli, da preuči učinek ponovno izraža miR-449 v želodcu raka celičnih linijah. Zanimivo ni bilo opaziti izraz družine miR-449 zazna čez plošči linij želodčnih celic, vključno SNU638, SNU5, SNU216, SNU601 in MKN74 utrpela pojem miR-449 ima tumor-omejevalno funkcij (podatki niso prikazani). Družina miR-449 je sestavljena iz pokoj-449a in b pri ljudeh in pokoj-449a, b in c pri miših. Zanimivo je, da imata isto seme zaporedje kot družina miR-34 in se zato pričakuje, da bo urejanje prekrivajoče skupinama ciljnih genov (slika 2a). Za oceno funkcijo miR-449 v celičnih linijah želodcu smo ponovno uvedel MIR-449b v SNU638 in MKN74 celic. V primerjavi z negativnimi kontrolnimi microRNAs, ponovna uvedba pokoj-449b močno vplival na proliferacijo SNU638 celic (slika 2b) in vizualni pregled celic, navedenih indukcijo apoptoze in celično staranje (slika 2c, in dodatnega datoteka 1, slika S2). Analiza toka citometrična od propidijevim celic jodida obarvanih transfektiranih z miR-449b pokazala G 1 akumulacija 48 ur po transfekciji, čemur po 72 urah po transfekciji s kopičenje celic v sub G 1 frakcija nakazujejo celice smrt (slika 2d). Indukcija celično staranje je potrdil kislo beta gal barvanjem uporabo MIR-34a, kot pozitivna kontrola microRNA (slika 2e). Da bi izključili učinke celične linije specifične, so funkcionalne posledice miR-449 ponovni uvedbi v smislu ustavitev celičnega cikla preveriti v MKN74 celic (Dodatni datotek 1, slika S3). Tako je ponovno uvajanje miR-449 negativno vpliva na širjenje želodca raka celičnih linij sočasno z indukcijo staranje in apoptoze v soglasju z miR-449 ima tumor supresivno funkcij. Slika 2 miR-449 je del družine miR-34 in inhibira proliferacijo celic. A - miR-449 je del družine miR-34 in evolucijsko ohranjeni. B - miR-449 ponovna uvedba v človeške želodčne celičnih linijah (SNU638) zavira proliferacijo (rdeča črta) v primerjavi z umešana kontroli (modra črta) in miR-146 nadzorom (črna črta). Napaka palice predstavlja Š.D. C - Vizualni pregled inhibicijo celične proliferacije in staranje, kot fenotip ob miR-449 ponovnem vnosu SNU638 celic (manjše plošče) v primerjavi z umešana nadzor transfekciji (zgornji plošči). D - FACS analize celični cikel prikazuje nabiranje sub-G1 v SNU638 celic 72 ur po miR-449 ponovni uvedbi (desno histogram), v primerjavi z umešana nadzor transfekciji (levo histograma) Tabela prikazuje kopičenje celic v G1 frakcije na miR-449 re -Predstavitev primerjavi z umešana nadzor RNA v 48 urah po transfekciji, sledi premik k frakciji sub-G1 v 72 urah po transfekciji okvirno celične smrti. E - starejšim fenotip SNU638 celic na miR-449 in miR-34a pozitivni kontrolni ponovni uvedbi s kislo β-gal testu pokazale, v primerjavi z RNA umešana nadzor
skupno zaporedje semen Mir-449b in pokoj-34a povzroči visoko. korelacija izraz spreminja
Karakterizacija prepise, ki jih miR-449 in nadzorovane, da vidim, če miR-449 ureja različne prepisov od pokoj-34a, so bili pregledani SNU638 celice izraz profili 24 ur po transfekciji mir-449b ali miR-34a in različno izražena prepisi identificirati. Ugotovili smo, da mRNA z napovedanimi miRNA ciljnih območij (7 mer seme strani) v 3'UTR bili občutno navzdol urejena v primerjavi z mRNA brez predvidenih ciljnih mestih po transfekciji pokoj-449b (p < 1.2e-70, dvo-tailed Test Wilcoxonov rang-sum), (dodatna datoteka 1, slika S4A). mRNA, ki je napovedal, Mirna semena ciljnih mest v kodirnih regij je bilo tudi ugotovljeno, da znatno dol regulirano (p < 9.9e-25), medtem ko so bili mRNA z območij v 5'UTRs le nekoliko navzdol urejeno (p < 5.3e- 2). Spremembe, izraz, ki ga transfekciji zrelega pokoj-449b in pokoj-34a inducirani so zelo povezane, kljub različni zrelih sekvenc zunaj regije semen (Pearsonov korelacijski koeficient r = 0,94, p = 0), (Dodatni datotek 1, številka S4b). Mi izčrpni oceni vse oligonukleotide (besed) dolžine 5-7 za korelacijo z zmanjšanjem števila po pokoj-449b in miR-34a transfekciji (glej metode). V skladu s številnimi prejšnjih študij, ta analiza je pokazala skupna miR-34a /449b semena Mesta kot 3'UTR besedo najbolj korelaciji z zmanjšanjem števila v dveh poskusih (Dodatni datoteka 1, slika S4c).
MiR-449 ureja številni kontrolorji celičnega cikla
profili izraz so uporabili za identifikacijo različno izraženih prepisov v celicah transfekciji s pokoj-449b ali nadzora (Dodatni datoteka 1, tabela S2). Analiza aktivacija pot temelji na različno urejenih prepisov dokazuje, da miR-449 v glavnem nadzoruje prepisov, ki kodirajo proteine, ki sodelujejo pri škodnih celic odgovorov, kontrolo celičnega cikla, vnetja in poti rakom (slika 3a). Osredotočanje na vrsti domnevnih ciljnih genov z uveljavljenimi vloge v tumourigenesis smo potrdili navzdol predpis, ki ga miR-449 z dne spoznal proto onkogena (MET
), ciklin odvisne kinaze 6 (CDK6)
, geminin (GMNN )
, myelocytomatosis virusna onkogeni homolog (MYC)
, Sirtuin 1 (SIRT1
) in histon 1 (HDAC1)
na ravni Prepis (slika 3b). Western blot analiz potrdili sposobnost miR-449 za navzdol urejanje MET, GMNN, myc SIRT1, ciklin E2 (CCNE2) in HDAC1 na ravni proteina v obsegu podoben tistemu, ki doseže s ponovnim uvajanjem pokoj-34a (slika 3c). Za podskupino ciljnih genov, vključno MET
, GMNN, CCNE2
, SIRT1
in HDAC1
smo potrdili neposredno interakcijo miR-449 s ciljno gen 3 'UTR uporabo luciferazno testa (slika 3d ). Slika 3 miR-449 je namenjen celična cikla krmilnika gene. A - Iznajdljivost Pathway Analysis (IPA) za dereguliranih genov ob miR-449 ponovni uvedbi v SNU638 celic, ki kažejo obogatitev za poti genske vrste raka, celične smrti in celičnega ciklusa med drugim. B - qPCR validacija Affymetrix nizi kaže navzdol ureditev MET
, CDK6
, GMNN
, myc
in HDAC1
na miR-449 ponovni uvedbi primerjavi z umešana nadzora RNA. C - Western blot potrjevanje v primerjavi z umešana kontrole RNA navzdol reguliranih genov ob miR-449 ponovnem vnosu SNU638 celic. Vinculin (DPP) in tubulin beta (TUBB) so bili uporabljeni kot kontrol nakladalne D - preverjanje neposredne in funkcionalno cilj zavezujoč uporabo luciferazno konstrukte, ki imajo divje 3'UTRs tipa in mutiral 3'UTRs (dve mutacije v pokoj-449 vezavno mesto), * označuje statistično značilnost v luciferazno izražanja med 3'UTRs divjega tipa transfekciji z miR449a /b primerjavi z RNA umešana nadzor, # označuje statistično razliko v luciferazno izražanja med 3'UTRs divjega tipa v primerjavi z mutiranim 3'UTRs transfekciji s pokoj-449a in miR- 449b. "Ns" ni pomembna vrednost p > 0.05, "*" ali "#" pomemben 0.01 < Vrednost p < 0.05, "**" ali "##" zelo pomembna 0.01 < Vrednost p < 0,001, "***" ali "###" zelo pomembna vrednost p < 0,001
Zato miR-449 neposredno namenjen mobilni cikla regulator genov, skladne s funkcijo zaviralnih in z aretacijo v celičnega ciklusa opazili na miR-449 ponovni uvedbi v raka celičnih linijah.
MiR-449 inducira p53 izraz, ampak ga p53
ni urejena, kot je bilo miR-34a prej ugotovili, da delujejo v smeri toka od p53 [30-33], smo analizirali, če bi tudi miR-449a /b vezan na p53. To je nadalje spodbudila s prisotnostjo domnevni p53 veznega mesta 10 kb gorvodno od človeškega miR-449 (podatki niso prikazani). Zato povzroča p53 s poškodbami DNK s pomočjo UV ali 5-fluorouracil (5-FU) v štirih različnih sistemih, HCT116 in MEF tipa in p53 knockout celicami divjega (Dodatne datoteke 1, številka S5a). Vendar pa je bila odkrita nobena bistvena sprememba v miR-449 izražanja po p53 pot aktivacije (Dodatni datoteka 1, slika S5b). Na koncu smo ugotovili nobenih dokazov, da je miR-449 transkripcijski tarča p53. Po drugi strani pa smo ugotovili, da je miR-449a /b sposoben inducirati aktivacijo p53, aktivacijo odzivnih p53 genov kot p21 in indukcijo apoptoze, kot je razvidno s cepitvijo kaspaze 3 (CASP3) in poli (ADP-riboza ) polimeraze 1 (PARP) (slika 4). K razumevanju mehanizma, s katerim miR-449 Ali to smo proučevali vpliv miR-449 na SIRT1 in HDAC1. SIRT1 in HDAC1 so deacetilaze, ki zavirajo, med drugim je bila aktivacija p53 in pokoj-34 je prikazano, da zatirajo SIRT1 [34]. Mi potrjena specifične vezave miR-449 za SIRT1 in HDAC1 uporabo 3'UTR luciferazne teste (slika 3d). Slika 4 miR-449 aktivira p53 pot. blot analiza Western kaže povečanje proteina p53 ob miR-449 in pozitivni kontrolni miR-34a ponovni uvedbi v SNU638 celic v primerjavi z RNA umešana nadzor kot tudi aktiviranje nadaljnjih ciljne P21 in apoptoze markerjev P53 razcepljenih CASP3 in PARP. Vinculin (DPP) in tubulin beta (TUBB) so bili uporabljeni kot kontrola nakladanja.
Zato smo špekulirajo, da miR-449 inducira apoptozo z zaviranjem histon HDAC1 se in SIRT1 vodi do aktivacije p53 poti, v Tako indukcijo apoptoze markerjev razcepljen CASP3 in PARP.
miR-449 je navzdol urejeno v želodcu raka človekovih
Za oceno pomembnosti miR-449 v človeške malignimi boleznimi, ki smo zraven preučil izražanje miR-449 v 10 želodčnih biopsije raka. Pomembno je, da smo našli tako MIR-449a in b, da bo občutno navzdol urejeno ali ni v 8 od 10 primarnih želodca raka. Nadalje izraz miR-449a in b zdi, da se sodelujoči regulirano (slika 5a). Nismo našli nobene povezave med zmanjšanjem miR-449 izražanja in kliničnih značilnosti raka (slika 5b). Analize genomske DNK iz tumorjev ni našla nobenega dokaza za izgubo ali hiper-metilacije MIR-449 lokusov z uporabo analize melting curve metilacijo specifične (MS-MCA) kaže transkripcijski navzdol regulacije izražanja (podatki niso prikazani). Zato v dogovoru s podatki iz dveh modelov miši iz želodca vnetja in hiperplazijo izraz miR-449 je zelo regulirana v želodcu raka pri ljudeh. Slika 5 miR-449 je navzdol urejeno v želodcu raka pri ljudeh. qPCR analize (zgornja ploskev), ki kaže navzdol ureditev miR-449 izražanja v 8 želodčnega tkiva raka v primerjavi z miR-449 izražanja v kontrolah, vzorcev ujemanjem (črtkana črta). U44 je bil uporabljen kot endogeni kontrolo. Tabela prikazuje klinične informacije o bolnikih (spodnja plošča). "Ns" ni pomembna vrednost p > 0.05 "*" pomemben 0.01 < Vrednost p < 0.05, "**" Zelo pomembno 0.01 < Vrednost p < 0,001, "***" zelo pomembna vrednost p < 0,001
razpravo
rak želodca je zelo smrtonosna malignosti z vsako leto več kot 21.500 novih primerov samo v ZDA [35]. Bolezen se pogosto odkrijejo pozno in 5-letno preživetje je torej pod 20% [36]. Zato je pomembno, da razumemo faze etiologija in napredovanja bolezni. Pomen bakterij, okoljskih in gostijo dejavnikov genetska tveganja v želodcu kancerogenosti so proučevali, vendar manj je znanega o molekularni napredovanja bolezni [37, 38]. Med drugim je p53 pot inaktivacijo poročali pri 30-60% želodca raka [39, 40] in nedavne študije kažejo, H. pylori
neposredno modulacijo gena p53 ali njenih nadaljnjim ciljev [41].

• Vpliv N-acetil-L-cisteinskim infuzijo na ravni citokinov in želodčnega intramucosal pH med hude sepse
• Benigna gastro-kolike fistula v žensko, ki predstavlja z izgubo telesne teže in prekinitvami bruhanje: prikaz primera