MIR-449 inhiberer celleproliferation og nedreguleres i gastrisk cancer

miR-449 hæmmer celledeling og nedreguleres i mavekræft
Abstract
Baggrund
mavekræft er den fjerde mest almindelige kræftform i verden og den anden mest udbredte årsag til kræft dødsfald. Udviklingen af ​​mavekræft er hovedsageligt forbundet med H. Pylori
infektion fører til et fokus i patologiske undersøgelser af bakterielle og miljømæssige faktorer, og i mindre grad af mekanistiske udvikling af tumoren. MikroRNA'er er små ikke-kodende RNA-molekyler, der er involveret i post-transkriptionel genregulering. De findes at regulere gener involveret i forskellige biologiske funktioner og ændringer i microRNA ekspression er blevet knyttet til patogenesen af ​​mange maligniteter. Den aktuelle undersøgelse er fokuseret på at identificere microRNA involveret i gastrisk carcinogenese og at udforske deres mekanistiske relevans ved at karakterisere deres mål.
Resultater
Invitrogen NCode miRNA microarrays identificerede miR-449 til at være faldet i en-årige Gastrin
KO mus og i H. Pylori
inficerede gastrisk væv sammenlignet med væv fra vildtype dyr. Vækstrate på gastriske cellelinjer over-udtrykkende MIR-449 blev inhiberet med 60% sammenlignet med kontroller. FACS cellecyklusanalyse af MIR-449 over-udtrykkende celler viste en betydelig stigning i sub-G 1 fraktion indikerer apoptose. ß-gal assays indikerede en aldrende fænotype af gastriske cellelinjer over-udtrykkende MIR-449. Affymetrix 133v2 arrays identificeret GMNN
, MET, CCNE2, SIRT1
og CDK6
som miR-449 mål. Luciferaseassays blev brugt til at bekræfte GMNN
, MET
, CCNE2
og SIRT1
som direkte mål. Vi viser også, at MIR-449 overekspression aktiveret p53 og dets nedstrømsmål p21 samt apoptose markører spaltet CASP3 og PARP. Vigtigere er det, qPCR analyser viste et tab på miR-449-ekspression i humane kliniske gastriske tumorer sammenlignet med normale væv.
Konklusioner
I denne undersøgelse dokumenterer vi en formindsket udtryk for miR-449 i gastrin
KO mus og yderligere bekræftet dets tab i humane gastriske tumorer. Vi undersøgte funktionen af ​​miR-449 ved at identificere sine direkte mål. Derudover viser vi, at miR-449 inducerer ældning og apoptose ved at aktivere p53 pathway.
Baggrund
mavekræft er blandt de fem mest almindelige kræftformer i verden, og den anden mest udbredte årsag til kræft dødsfald [1] . Det er hovedsageligt, men ikke udelukkende, forårsaget af H. Pylori
infektion [2] som ikke alle H. Pylori
smittede udvikler tumorer [3]. Andre faktorer involveret i udviklingen af ​​gastrisk cancer indbefatter graden og typen af ​​den inflammatoriske reaktion [2] samt niveauerne af Gastrin
hormon [4, 5]. Adskillige undersøgelser har vist, at både hypergastrinæmi [6, 7] og manglen på Gastrin [5] bidrage til patogenesen af ​​gastrisk cancer. Aklorhydri er et fælles træk ved musemodeller tilbøjelige til at udvikle metaplasi og kræft [6, 8, 9]. Gastrin
knockout mus er achlorhydric [10], som fremmer en bakteriel gastrisk overvækst [11, 12], og kroniske bakterielle gastriske infektioner fører til gastrisk metaplasi, som kan udvikle sig til mavekræft [6, 12].
Siden deres opdagelse microRNA'er, er blevet fundet impliceret i en meget bred vifte af normale og patologiske processer [13]. MikroRNA'er udøver deres regulatoriske funktioner posttranscriptionally ved binding til delvis komplementær sekvensmotiver overvejende 3'UTR af target mRNA'er resulterer i mRNA destabilisering og translationel undertrykkelse [14]. Fra et biologisk synspunkt er microRNA udfordrende objekter til at studere, da de regulerer kohorter af målgener, som ikke let identificeres. Fra et terapeutisk synspunkt, microRNA er meget interessant, da flere undersøgelser har vist magt microRNA som biomarkører og indledende prækliniske undersøgelser har fastslået, at microRNA kan terapeutisk målrettet in vivo [15].
Profilering undersøgelser har dokumenteret microRNA deregulering i et bredt spektrum af sygdomme, herunder alle større cancere [16]. MikroRNA'er sandsynligvis påvirke tumorogene processer på to niveauer. For det første har flere undersøgelser etableret pro-onkogene eller tumor-undertrykkende roller enkelte microRNA fast forbinder disse til kræft ætiologi som eksemplificeret af miR-155, miR-10b og miR-21 [17-19]. For det andet har microRNA reguleringssystem sig selv synes at have tumor suppressive fungerer som genetisk ablation af centrale microRNA biogenese faktorer, såsom Dicer, stærkt øge kræft modtagelighed [20] og tab af funktion mutationer er blevet identificeret i vigtige microRNAer forarbejdningsfaktorer i humane tumorer [21-23].
i denne undersøgelse har vi fat på betydningen af ​​microRNA i gastrisk cancer drage fordel af Gastrin
knockout musemodel og H. pylori
infektion af vildtypemus. Vi identificerer miR-449 som signifikant nedreguleret eller tabt i musemodeller af mavekræft samt i primære humane gastriske tumorer. Identifikation af mRNA-mål afslører, at denne microRNA sandsynligvis udøver tumor undertrykkende funktioner gennem den samordnede regulering af en kohorte af kræft-associerede celle-cyklus regulatorer herunder behandling, GMNN, CCNE2, SIRT1, og HDAC1.
Metoder
Mus
Tre forskellige aldersgrupper (12-16 uger, 1 år eller 1½ år) af vildtype (wt) eller Gastrin
knockout (KO) mus blev anvendt. Alle mus var på en blandet 129 /SVJ, C57BL /6J baggrund, tilbagekrydset mindst fire gange til C57BL /6J [12]. Musene blev holdt under specifikke patogenfrie betingelser og overvåges i henhold til Sammenslutningen af ​​Europæiske Laboratorium Animal Science Associations anbefaling [24] med 12 timers lys, 12 timer mørke cyklusser.
H. pylori
infektion
C57BL6 /J-mus (n = 10) blev inokuleret med en ikke-muse-tilpasset klon af H. Pylori
stamme 67:21, oprindeligt isoleret fra en antral biopsi opnået fra en svensk kvinde med mavesår. Stammen er VacA + og indeholder hele Cag patogenicitet ø (PAI) med genetisk stabilitet i Cag PAI [25]. Musene blev inokuleret hver anden dag (tre gange) i løbet af en 5-dages periode. DNA blev ekstraheret og analyseret for tilstedeværelsen af ​​Helicobacter art efter en semi-nested polymerasekædereaktion-denaturerende gradient gelelektroforese assay specifikt for slægten helicobacter, som tidligere [26] beskrevne. En tilsvarende gruppe på uinficerede C57BL6 /J-mus blev anvendt som kontroller.
Maverne for alle mus blev dissekeret i fundus og antrum før RNA-ekstraktion. Alle dyreforsøg blev godkendt af Dansk Animal Welfare Udvalg (2005 /562-40) og den danske Skov- og Naturstyrelsen (20010077355/6).
Mus antrum sektioner
Mus blev aflivet ved cervikal dislokation. Antrum blev fjernet, vasket forsigtigt i iskold PBS, frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil RNA-ekstraktion. Salg Kliniske prøver analyser
Biopsier fra mavekræft og de tilstødende normale væv blev opnået fra patienter undergår kirurgi for mavekræft ved Institut for Gastrointestinal Surgery, Rigshospitalet. Optagelsen fandt sted i juli til december 2008, og alle patienter forudsat underskrevet, informeret samtykke (Etisk godkendelse udvalg H-B-2008-049) og Dansk Datatilsynet (2008-41-2138). De biopsier blev anbragt i RNAlater (Ambion) i operationsstuen og efterfølgende nedfrosset ved -80 ° C indtil RNA-ekstraktion.
RNA-ekstraktion og qPCR analyser
RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRlzol (Invitrogen) ifølge fabrikanten. miRNA udtryk profil blev vurderet ved hjælp af Taqman miRNA analyser (Applied Biosystems) for HSA /mmu-miR-449a og b, HSA /mmu-miR-34a, b og c og rnu44 eller HSA /mmu-miR-191. Primersekvenser for Affymetrix mål validering er anført i yderligere fil 1, tabel S1.
Cellekultur
SNU638 og MKN74 blev dyrket i RPMI-1640 (Gibco) med 10% FBS (Hyclone), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen) og inkuberet ved 37 ° C i 5% CO 2. HCT116-celler (WT og p53 - /- blev dyrket i McCoys 5A (Gibco) med 10% FBS (Hyclone), og 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen) og inkuberet ved 37 ° C i 5% CO <. sub> 2 HEK293 og MEF celler (wt og p53 - /-) blev dyrket i DMEM (Gibco) med 10% FBS (Hyclone), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen) og inkuberet ved 37 ° C med 5% CO 2.
miRNA forstadier og siRNA
miRNA forstadier blev købt fra Ambion, HSA-miR-449a (PM11521), HSA-miR-449b (PM11127) og HSA-miR-34a ( PM11030).
Cellevækst analyser Salg SNU638 celler blev podet i 24-brønds plader og transficeret den følgende dag med 50 nM miRNA duplex eller siRNA anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen). celler blev fikseret ved angivne tidspunkter i 4% paraformaldehyd , farvet i en 0,1% krystalviolet opløsning og resuspenderes i 10% eddikesyre. Prøve absorbansen blev målt ved 620 nm.
celle cyklus FACS analyser
SNU638 og MKN74 celler blev podet ved 2 × 10 6 celler pr 10cm plade og transfekteret med 50 nM miRNA duplex (Ambion) under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Celler blev høstet 48 og 72 timer efter transfektion, farvet for DNA-indhold ved anvendelse af propidiumiodid (PI) og analyseret på en FACS Calibur flowcytometer (Becton-Dickinson). Kort beskrevet blev celler høstet ved trypsinisering og vasket en gang med PBS, før fastsættelse nat over i 70% EtOH. At farve DNA'et, cellerne blev pelleteret, resuspenderet i 100 pi EtOH og farvet i 1 time med 300 pi PI-opløsning (0,05 mg /ml PI, 20 ug /ml RNAse A i 0,1% BSA).
Ældning analyser
SNU638 celler blev podet ved 400.000 celler pr 6-well-plade og transfekteret med 50 nM miRNA duplex (Ambion) under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Fire dage efter transfektion blev celler vasket i PBS og fikseret i 5 minutter ved stuetemperatur i 2% formaldehyd /0,2% glutaraldehyd. Celler blev vasket to gange i PBS pH 6,0 før den blev farvet med frisk senescens associeret β-Gal farveopløsning (1 mg /ml 5-brom-4-chlor-3-indolyl-βD-galactosid (X-Gal), 0.12mm K 3fe [CN] 6, 0.12mm K 4Fe [CN] 6, 1 mM MgCl 2 i PBS pH 6,0) natten over ved 37 ° C uden CO 2 forsyning . Celler blev vasket en gang i PBS (pH 6,0) og observeret under mikroskopet.
Antistoffer og western blot-analyser
SNU638 blev podet ved 2 × 10 6 celler pr 10 cm plade, transficerede to gange på to på hinanden dage med 50 nM miRNA duplexer anvendelse af Lipofectamine 2000 ifølge fabrikanten (Invitrogen). Cellerne blev høstet ved trypsinisering, vasket en gang med PBS og lyseret i RIPA-buffer (150 mM NaCl, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 1% Igepal, 50 mM Tris-HCI pH 8, 2 mM EDTA) suppleret med 1 mM DTT, 1 mM Pefabloc, 1 mM NaV3, 10 mM NaF og 1X komplette mini proteasehæmmere cocktail tabletter. 25 ug protein /lane blev opløst på 4-20% NuPAGE Bis-Tris-geler (Invitrogen) og overført til en nitrocellulosemembran. Primære anvendte antistoffer var MET (Cell Signal 4560), MYC (Cell Signal 9402), GMNN (Santa Cruz Sc-53923), VCL (Sigma V9131), TP53 (Santa Cruz Sc-126), CDKN1A (Santa Cruz Sc-6246) , CDK6 (Santa Cruz Sc-177), HDAC1 (Santa Cruz Sc-7872), CCNE2 (Cell Signal 4132), Tubb (Abcam ab11304), PARP (Cell Signal 9542) og spaltedes CASP3 (Cell Signal 9661).
microarray analyser
Small RNA'er (< 200 nt) blev isoleret med Invitrogen PureLink miRNA Isolation Kit fra fundiske og antral væv fra 1) Gastrin
KO-mus og alder og køn matchede C57BL6 /J kontrolmus, og 2) C57BL6 /J-mus inficeret med H. Pylori
uinficerede alder og køn matchede C57BL6 /J kontrolmus, (n = 4 for hver gruppe). Kvaliteten af ​​isolerede små RNA blev bestemt ved anvendelse af små RNA-analysen på en Agilent Bioanalyzer. 500 ng af små RNA blev mærket med Genisphere FlashTag Kit og hybridiseret til Invitrogen NCode Multi-Arter miRNA Microarray V2 i en Maui hybridisering station. Forarbejdede objektglas blev scannet i en Agilent mikromatrice scanner. Fremkomne billeder blev analyseret og forholdet mellem median normaliseret hjælp GenePix Pro 6.0. Fire biologiske replikater blev anvendt til hver sammenligning. Prøverne blev hybridiseret til fire arrays i en dobbelt farve farvestof swap microarray eksperimenterende design. BRB ArrayTools blev brugt til fold forandring og statistiske beregninger. Udvalgte miRNA data fra array analyse valideret ved anvendelse TaqMan real-time PCR miRNA analyser. Data vil blive deponeret på ArrayExpress efter accept.
MRNA arrays
SNU638 blev transficeret med 50 nM miR-34a eller miR-449b dobbelthuse med Siglo siRNA anvendes som negativ kontrol. Totalt RNA blev ekstraheret 24 timer efter transfektion under anvendelse af TRIzol-reagens. Affymetrix microarray analyse (HG-U133 Plus 2.0 menneske) blev udført på Microarray Center, Rigshospitalet, Rigshospitalet. Forsøg blev kørt i enten tredobbelte eller firdobbelte. Data vil blive deponeret på ArrayExpress efter accept.
Vektorer bygge- og reporter analyser
Den 3'UTRs af HDAC1
, SIRT1
, MET
, GMNN
og CCNE2
beholdning mIR-449 bindingssteder blev klonet nedstrøms for luciferase reporter i pMIR-RAPPORT vektorsystemet (Ambion). Quickchange stedorienteret mutagenese (Stratagene) blev anvendt til at inducere to punktmutationer i frøet region. Mutagenese-primere sekvenser er anført i supplerende fil 1, tabel S1.
HEK293-celler blev podet i plader med 96 brønde og transficeret med 20 nM miRNA precursor eller krypteret siRNA kontrol, 20-50ng af luciferase vektor (pMIR-rapporten) og 5 ng renilla vektor (pRL-TK) under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Celler blev høstet 24 timer efter transfektion og luciferaseaktiviteten blev målt ved hjælp af Dual-Glo luciferaseanalyse (Promega).
Microarray analyse
Microarray udtryk data blev behandlet ved hjælp af 'affy pakke i BioConductor [27]. Probe sæt intensiteter blev opsummeret og fraktil normaliseret ved hjælp af BioConductor RMA og VSN pakker. Differentiel ekspression blev bestemt pr probeset under anvendelse af en t-test. Probe sæt blev kortlagt til Ensembl udskrifter (version 49) ved hjælp af tilknytninger leveret på BioMart. Probesets der kortlagt til to forskellige Ensembl gener blev kasseret.
Evaluering global nedregulering af microRNA målgener
Den 3'UTRs, 5'UTRs og kodning sekvenser af udskrifter blev scannet for at matche 6mer, 7mer og 8mer miRNA frø sites (som supplement til position 2-7, 2-8 og 2-9 i miRNA). Global analyse af miRNA target nedregulering blev evalueret ved hjælp af den længste 3'UTR sekvens per gen for at undgå bias indført ved gener med mange transcript isoformer. Vi kasserede transkripter med 3'UTR sekvenser kortere end 50 nt. Til globalt vurdere, om miRNA målgener blev nedreguleret efter miRNA transfektion, testede vi nulhypotesen, at udtrykket ændre fordelingen af ​​miRNA mål (der har en 7mer target stedet) var lig med distribution af alle udtrykte gener uden forudsagte target websteder ved hjælp af ikke-parametrisk Wilcoxon rank-sum test. En lignende fremgangsmåde blev anvendt til at evaluere nedregulering af gener med miRNA target sites i kodende regioner og 5'UTRs af mRNA.
Udtømmende statistisk vurdering af ord korreleret med nedregulering
Vi brugte en tidligere publiceret ikke-parametrisk Nummer-baseret statistik udtømmende at vurdere sammenhængen af ​​ordet forekomster i 3'UTRs og ændringen i genekspression efter miRNA transfektion [28, 29]. Gener blev sorteret ved ekspression ændring fremkaldt af transfektion af miR-34a eller miR-449b, og korrelationen med nedregulering blev testet for alle ord længde 5-7 (N = 21 504).
Statistiske tests
Studerende t-test med Welch korrektion.
Resultater
miR-449b er nedreguleret i antrum både Gastrin
KO mus og H. pylori
inficerede mus
Gastrin
knockout-mus er achlorhydric med en tendens til udvikling af antral hyperplasi og gastrisk adenomer over tid (figur 1) [6, 12]. For at identificere microRNA deregulerede under udviklingen af ​​mavekræft, vi undersøgte miRNA udtryk profiler i gastrisk neoplasier fra Gastrin
knockout-mus ved hjælp af miRNA microarrays. Som vist i tabel 1, blev 20 microRNA signifikant dereguleret i knockout-musene sammenlignet med vildtype kuld kontroller, med tre miRNA forskellige mere end to gange, MIR-7 er opreguleret og MIR-709 og MIR-449b bliver nedreguleret i antrum for gastrin
knockout-mus sammenlignet med vildtype-typer. For yderligere at bekræfte miR-449 deregulering under gastrisk udvikling af kræft, vi undersøgte sit udtryk i vilde Mus antrum væv inficeret med H. Pylori
. Interessant, miRNA arrays demonstreret en specifik nedregulering af miR-449b i H. Pylori
inficerede mus (tabel 2 og Ekstra fil 1, figur S1). Figur 1 Old Gastrin knockout mus udvikler gastriske adenomer. Antrum sektioner isoleret fra 12-16 uger gamle mus (venstre panel), 12 til 18 måneder gamle mus (midterste panel) og ældre end 18 måneder mus (højre panel), fra vildtype (øverste panel) og Gastrin
knockout-mus (nederste felt). Sektioner viser adenom udvikling i antrum væv i gastrin
knockouts i forhold til de vilde typer.
Tabel 1 miRNA dereguleret gastrin
knockout-mus
miRNA Name
log2-fold
p-værdi
miRNA Name

Log2-fold

p-value

mmu-miR-709
-1.73
7.0E-06
mmu-miR-422b
0.44
4.6E-02
mmu-miR-449b
-1.37
1.6E-03
mmu-miR-199a*
0.50
7.7E-03
mmu-miR-805
-1.01
7.5E-03
mmu-miR-25
0.51
1.6E-02
mmu-miR-706
-0.98
3.1E-03
mmu-miR-27b
0.56
5.1E-03
mmu-miR-467a
-0.88
2.8E-02
mmu-miR-182
0.56
1.8E-02
mmu-miR-696
-0.83
7.1E-03
mmu-miR-30a-3p
0.59
2.2E-02
mmu-miR-667
-0.66
2.3E-02
mmu-miR-10a
0.70
7.1E-03
mmu-miR-690
-0.28
1.7E-02
mmu-miR-152
0.70
2.3E-02
mmu-miR-18
0.29
3.7E-02
mmu-miR-1
0.77
7.1E-03
mmu-miR-143
0.34
2.3E-02
mmu-miR-7
1.06
4.9E-03
Liste over betydeligt deregulerede miRNA i gastrisk neoplasier fra Gastrin
Knockout mus sammenlignet med vilde typer.
Tabel 2 miRNA dereguleret i H. pylori
inficerede væv
miRNA navn myHotelVideo.com: Fold change

p-value

mmu-miR-122a
-3.247
0.000788
mmu-miR-449b
-0.879
0.045214
Liste over betydeligt deregulerede miRNA i vildtype mus antrum inficeret med H. Pylori
sammenlignet med ikke-inficerede antrum.
MiR-449 hæmmer cellecyklusprogression og inducerer ældning
have demonstreret nedregulering af miR-449 ekspression i gastriske cancere vi ønskede at undersøge virkningen af ​​re-udtrykkende mIR-449 i gastriske cancercellelinier. Interessant ingen mærkbar ekspression af MIR-449 familie blev detekteret tværs et panel af gastriske cellelinjer, herunder SNU638, SNU5, SNU216, SNU601 og MKN74 opretholde begrebet MIR-449 med tumor-undertrykkende funktioner (data ikke vist). MIR-449 familien består af miR-449a og b i mennesker og miR-449a, b og c i mus. Interessant, de deler den samme frø sekvens som miR-34 familie og er derfor forventes at regulere overlappende kohorter af målgener (figur 2A). For at vurdere funktionen af ​​miR-449 i gastrisk cellelinjer vi genindført miR-449b i SNU638 og MKN74 celler. Sammenlignet med negative kontrol microRNA'er, re-introduktion af miR-449b stærkt påvirket udbredelsen af ​​SNU638 celler (figur 2b) og visuel inspektion af cellerne angivne induktion af apoptose og cellulære aldring (figur 2c, og Ekstra fil 1, figur S2). Flowcytometrisk analyse af propidiumiodid-farvede celler transficeret med MIR-449b viste en G 1 akkumulering 48 timer efter transfektion efterfulgt ved 72 timer efter transfektion ved en ophobning af celler i sub G 1 fraktion tyder på celle dødsfald (figur 2d). Induktionen af ​​cellulær senescens blev bekræftet ved sur beta gal-farvning ved anvendelse af MIR-34a som en positiv kontrol microRNA (figur 2e). For at udelukke cellelinje-specifikke effekter, blev de funktionelle konsekvenser af miR-449 genindførelse i form af cellecyklusstop verificeret i MKN74 celler (ekstra fil 1, figur S3). Således re-introduktion af miR-449 påvirker negativt spredning af gastrisk kræft cellelinjer samtidig med induktion af degeneration og apoptose i konkordans med miR-449 har tumor undertrykkende funktioner. Figur 2 MIR-449 er en del af MIR-34 familien og inhiberer celleproliferation. A - MIR-449 er en del af MIR-34 familien og er evolutionært bevaret. B - miR-449 genindførelse i humane gastriske cellelinjer (SNU638) hæmmer celledeling (rød linje) i forhold til en kodet kontrol (blå linje) og miR-146 kontrol (sort linje). Fejl- søjler repræsenterer S.D. C - Visuel inspektion af celledeling hæmning og senescens-lignende fænotype på miR-449 genindførelse i SNU638 celler (nederste panel) sammenlignet med scrambled transfektion kontrol (øverste panel). D - FACS cellecyklus analyse, der viser sub-G1 ophobning af SNU638 celler 72 timer efter miR-449 re-introduktion (højre histogram) i forhold til en kodet transfektion kontrol (venstre histogram) Tabellen viser celle akkumulation i G1 fraktion på miR-449 re -Indledning sammenlignet med krypterede RNA kontrol ved 48 timer efter transfektion, efterfulgt af et skift til sub-G1 fraktion ved 72 timer efter transfektion indikerer celledød. E - ældede fænotype af SNU638 celler efter miR-449 og miR-34a positiv kontrol genindførelse vist med sure β-gal assay i forhold til RNA scrambled kontrol
fælles frø sekvens af miR-449b og miR-34a fremkalde højt. korreleret udtryk ændrer
at karakterisere udskrifter kontrolleres af miR-449 og se, om miR-449 regulerer forskellige udskrifter end miR-34a blev SNU638 celler udtryk profiler undersøgt 24 timer efter transfektion af miR-449b eller miR-34a og differentieret udtrykte udskrifter identificeret. Vi fandt, at mRNA med forudsagte miRNA target sites (7 mer frø websted) i 3'UTR var signifikant nedreguleret i forhold til mRNA uden forudsagte målsteder efter transfektion af miR-449b (p < 1.2e-70, to-halet Wilcoxon rank-sum test), (Ekstra fil 1, figur S4A). mRNA har forudsagt miRNA frø target sites i kodende regioner blev også fundet at være signifikant nedreguleret (p < 9.9e-25), mens mRNA med steder i 5'UTRs var kun marginalt nedreguleret (p < 5.3e- 2). Udtrykket forandringer som følge af transfektion af modent miR-449b og miR-34a var stærkt korreleret trods divergens af de modne sekvenser uden frø regionen (Pearsons korrelationskoefficient R = 0,94, p = 0), (Ekstra fil 1, figur s4b). Vi udtømmende evalueret alle oligonukleotider (ord) af længde 5-7 for korrelation med nedregulering efter miR-449b og miR-34a transfektion (se metoder). I overensstemmelse med mange tidligere undersøgelser, denne analyse afslørede delte miR-34a /449b frø websted som 3'UTR ord mest korreleret med nedregulering i de to forsøg (Ekstra fil 1, figur S4C).
MiR-449 regulerer mange cellecyklus controllere
udtrykket profiler blev brugt til at identificere differentielt udtrykte udskrifter i celler transficeret med miR-449b eller kontroller (Ekstra fil 1, tabel S2). En pathway aktivering analyse baseret på de differentielt regulerede transkripter viser, at MIR-449 primært styrer transkripter koder for proteiner involveret i celle skader responser, cellecykluskontrol, inflammation og cancer pathways (figur 3A). Fokus på et sæt af formodede målgener med veletablerede roller i tumorudvikling, bekræftede vi nedregulering af miR-449 af met onkogen (MET
), cyklin afhængige kinase 6 (CDK6)
, geminin (GMNN )
, myelocytomatosis viral onkogener homolog (MYC)
, sirtuin 1 (SIRT1
) og histon deacetylase 1 (HDAC1)
på udskrift niveau (figur 3b). Western blot-analyser bekræftede evnen hos MIR-449 at nedregulere MET, GMNN, MYC, SIRT1, cyclin E2 (CCNE2) og HDAC1 på proteinniveauet i et omfang svarende til den, der opnås ved re-introduktion af MIR-34a (figur 3c). For en delmængde af målgener herunder MET
, GMNN, CCNE2
, SIRT1
HDAC1
, bekræftede vi direkte interaktion af miR-449 med målgenet 3'UTR hjælp luciferaseanalyse (figur 3d ). Figur 3 MIR-449 målretter cellecyklus controller gener. A - Ingenuity Pathway Analysis (IPA) af deregulerede gener upon miR-449 genindførelse i SNU638 celler viser berigelse for gen-kategorierne kræft, celledød og cellecyklus veje blandt andre. B - qPCR validering af Affymetrix arrays viser nedregulering af MET
, CDK6
, GMNN
, MYC
og HDAC1
på miR-449 re-introduktion i forhold til scrambled RNA kontrol. C - Western blot validering af down-regulerede gener upon miR-449 genindførelse i SNU638 celler sammenlignet med scrambled RNA kontrol. Vinculin (VCL) og tubulin beta (Tubb) blev anvendt som lastning kontrol D - kontrol af direkte og funktionel mål bindende hjælp luciferase konstruktioner holder vildtype 3'UTRs og muterede 3'UTRs (to mutationer i miR-449 bindingssted), * angiver statistisk signifikans i luciferaseekspression mellem vildtlevende 3'UTRs typen transficeret med miR449a /b sammenlignet med RNA scrambled kontrol, # indikerer statistisk forskel i luciferaseekspression mellem vildtype 3'UTRs sammenlignet med mutant 3'UTRs transficeret med mIR-449a og miR- 449b. "Ns" ikke signifikant p-værdi > 0.05, "*" eller "#" betydelig 0.01 < p-værdi < 0.05, "**" eller "##" meget betydelig 0.01 < p-værdi < 0.001, "***" eller "###" ekstremt signifikant p-værdi < 0.001
Derfor MIR-449 direkte målrettet cellecyklus regulator gener i overensstemmelse med en tumorsuppressorfunktion og med cellecyklusstandsningen observeret ved MIR-449 genindførelse i cancercellelinjer.
MIR-449 inducerer p53-ekspression, men er ikke reguleret af p53
som miR-34a tidligere blev fundet at fungere nedstrøms af p53 [30-33], analyserede vi hvis også miR-449a /b var knyttet til p53. Dette blev endvidere ansporet af tilstedeværelsen af ​​et formodet p53 bindingssted 10 kb opstrøms fra human MIR-449 (data ikke vist). Vi har derfor induceret p53 ved DNA-skader ved hjælp af UV eller 5-fluorouracil (5FU) i fire forskellige systemer, HCT116 og MEF vildtype og p53 knockout-celler (Ekstra fil 1, figur S5A). Imidlertid blev opdaget nogen signifikant ændring i miR-449-ekspression efter p53-aktivering (Ekstra fil 1, figur S5b). Afslutningsvis fandt vi ingen tegn på, at MIR-449 er en transkriptionel mål for p53. På den anden side, fandt vi, at MIR-449a /b er i stand til at inducere aktivering af p53, aktivering af p53 respons gener, såsom p21 og fremkaldelse af apoptose som påvist ved spaltning af caspase 3 (CASP3) og poly (ADP-ribose ) polymerase 1 (PARP) (figur 4). Til at forstå den mekanisme, ved hvilken MIR-449 gør dette undersøgte vi virkningen af ​​MIR-449 på SIRT1 og HDAC1. SIRT1 og HDAC1 er deacetylaser, som inhiberer bl.a. har aktiveringen af ​​p53 og MIR-34 vist sig at undertrykke SIRT1 [34]. Vi valideret den specifikke binding af MIR-449 til SIRT1 og HDAC1 hjælp 3'UTR luciferaseassays (figur 3d). Figur 4 MIR-449 aktiverer p53 pathway. Western blot-analyse, der viser en stigning i p53-proteinet ved MIR-449 og positiv kontrol MIR-34a genindførelse i SNU638 celler sammenlignet med RNA scrambled kontrol samt en aktivering af p53 downstream target p21 og apoptose markører spaltede CASP3 og PARP. Vinculin (VCL) og tubulin beta (tubb) blev anvendt som indlæsning kontroller.
Derfor har vi spekulere at MIR-449 inducerer apoptose ved at inhibere histondeacetylase HDAC1 og SIRT1 fører til p53-aktivering således induktionen af ​​apoptose markører spaltes CASP3 og PARP.
miR-449 er nedreguleret i humane gastrisk kræft
for at vurdere betydningen af ​​miR-449 i humane maligniteter vi næste undersøgt ekspressionen af ​​miR-449 i 10 mavekræft biopsier. Vigtigt er det, fandt vi begge miR-449a og b for at være betydeligt nedreguleret eller fraværende i 8 ud af 10 primære gastrisk kræft. Endvidere ekspressionen af ​​MIR-449a og b synes at være co-regulerede (figur 5a). Vi fandt ikke nogen sammenhæng mellem reduktionen i miR-449-ekspression og kliniske karakteristika for kræft (figur 5b). Analyser af det genomiske DNA fra tumorerne fandt ingen beviser for tab eller hyper-methylering af MIR-449 loci under anvendelse methyleringsspecifik smeltekurveanalyse (MS-MCA) indikerer transkriptionel nedregulering af ekspression (data ikke vist). Derfor, i overensstemmelse med data fra to musemodeller for gastrisk betændelse og hyperplasi, udtryk for miR-449 er nedreguleret i humane gastrisk kræft. Figur 5 MIR-449 nedreguleres i humane gastriske cancere. qPCR analyse (øvre panel) viser nedregulering af MIR-449-ekspression i 8 gastrisk cancer væv sammenlignet med MIR-449-ekspression i prøve-matchede kontroller (stiplet linje). U44 blev anvendt som endogen kontrol. Tabel viser kliniske oplysninger af patienterne (nederste panel). "Ns" ikke signifikant p-værdi > 0.05, "*" betydelig 0.01 < p-værdi < 0.05, "**" meget betydelig 0.01 < p-værdi < 0.001, "***" ekstremt signifikant p-værdi < 0.001
Diskussion
mavekræft er en meget dødelig malignitet med mere end 21.500 nye tilfælde hvert år i USA alene [35]. Sygdommen er ofte opdages sent, og 5-års overlevelse er derfor under 20% [36]. Det er derfor vigtigt at forstå de ætiologi og progression stadier af sygdommen. Betydningen af ​​de bakterielle, miljømæssige og vært genetiske risikofaktorer i gastrisk carcinogenese er blevet undersøgt, men ved mindre om den molekylære progression af sygdommen [37, 38]. Blandt andet er p53 pathway inaktivering rapporteret i 30-60% af gastrisk kræft [39, 40] og de seneste undersøgelser tyder på H. pylori
direkte modulation af p53-genet eller dens downstream mål [41]. En anden almindelig ændring i gastrisk cancer er den forstyrrelse af kontrol cellecyklus via overekspression af cyclin E1, som er forbundet med tumor aggressivitet og lymfeknudemetastaser [42, 43].

• Indflydelsen af ​​N-acetyl-L-cystein infusion på cytokinniveauer og gastrisk intramucosal pH under alvorlig sepsis
• Benign gastro-kolik fistel i en kvinde præsentere med vægttab og intermitterende opkastning: en sag report