miR-449 gátolja a sejtek szaporodását, és lefelé szabályozni gyomorrák

miR-449 gátolja a sejtek szaporodását, és lefelé szabályozni a gyomorrák katalógusa Abstract Background katalógusa katalógusa gyomorrák a negyedik leggyakoribb rák a világon, és a második leggyakoribb oka a rák okozta halál. A fejlesztés a gyomorrák főleg kapcsolódó H. pylori
fertőzés, ami a hangsúly patológia vizsgálatok bakteriális és környezeti tényezők, valamint kisebb mértékben a mechanisztikus fejlődését a daganat. A mikroRNS-ek kicsik, nem kódoló RNS-molekulák részt vesznek poszt-transzkripciós gén szabályozása. Ezek megtalálhatók szabályozni részt vevő gének változatos biológiai funkciók és változtatások microRNS kifejezés már kapcsolódik patogenezisében sok rosszindulatú daganatok. A jelenlegi tanulmány középpontjában azonosítására mikroRNS részt gyomor carcinogenesis, és fedezze fel a mechanikus vonatkozású jellemezte a célokat. Katalógusa Eredmények katalógusa Invitrogen ncode miRNS microarray azonosított miR-449 csökkenteni kell az 1 éves gasztrin
KO egerek és a H. pylori
fertőzött gyomor szövetek szövetekhez viszonyítva a vad típusú állatokban. Növekedési sebesség gyomor sejtvonalak túl-expresszáló miR-449 gátolta 60% -kal a kontrollokhoz képest. FACS sejtciklus analízis a miR-449 over-expresszáló sejtek jelentős növekedést mutatott az al-G 1 frakció indikatív az apoptózis. SS-Gal vizsgálatok jelezték öregedő fenotípus gyomor sejtvonalak túl-expresszáló miR-449. Affymetrix 133v2 tömbök azonosított GMNN katalógusa, MET, CCNE2, SIRT1 katalógusa és CDK6 katalógusa mint a miR-449 célokat. Luciferáz vizsgálatokat használják megerősíteni GMNN katalógusa, MET katalógusa, CCNE2 katalógusa és SIRT1 katalógusa közvetlen célokat. Azt is mutatják, hogy a miR-449 túlzott expressziója aktivált p53 és downstream célpontja a p21, valamint az apoptózis markereinek hasítjuk CASP3 és PARP. Fontos, qPCR elemzések elvesztését mutatta miR-449 expresszió humán klinikai gyomor tumorok, mint a normális szövetekben.
Következtetések
Ebben a vizsgálatban, dokumentáljuk csökkentett expresszióját miR-449 gasztrin
KO egerek és további megerősítette veszteség az emberi gyomor tumorok. Megvizsgáltuk a funkció miR-449 azonosításával közvetlen célokat. Továbbá azt mutatják, hogy a miR-449 indukál öregedés és az apoptózis aktiválásával p53. Katalógusa Háttér katalógusa Gyomorrák egyike az öt leggyakoribb daganatos megbetegedés a világon, és a második leggyakoribb oka a rák összefüggő halálesetek [1] . Ez elsősorban, de nem kizárólag, H. pylori által okozott
fertőzés [2], mivel nem minden H. pylori
fertőzött személyek dolgozzon tumorok [3]. Más tényezők, részt vesz a fejlesztés gyomorrák közé tartozik a mértéke és típusa a gyulladásos válasz [2], valamint a szint a gasztrin katalógusa hormon [4, 5]. Számos tanulmány kimutatta, hogy mind a hipergasztrinémia [6, 7] és a hiányzó gasztrin [5] hozzájárulnak a patogenezisében gyomorrák. Achlorhydria közös jellemzője az egér modellek hajlamosak a fejlődő metaplázia és a rák [6, 8, 9]. A gasztrin katalógusa knockout egerek achlorhydric [10], előnyben bakteriális gyomor elszaporodását [11, 12], valamint a krónikus bakteriális fertőzések gyomor vezethet gyomor metaplasia, amelyek haladást gyomorrák [6, 12].
Felfedezésük óta mikroRNS, találtak játszik szerepet nagyon sokféle normál és kóros folyamatokat [13]. A mikroRNS fejtik ki szabályozó funkciók poszttranszkripciós kötődve részben komplementer szekvencia motívumok túlnyomórészt a 3 'UTR-target mRNS-ek eredményező mRNS destabilizáció és transzlációs elnyomás [14]. Egy biológiai szempontból, mikroRNS támadja objektumokat vizsgálatba, mivel ezek szabályozzák a kohorsz célgének, amelyek nem könnyen azonosítható. Egy terápiás szempontból mikroRNS nagyon érdekes, több tanulmány bizonyítja a mikroRNS mint biomarkerek és a kezdeti preklinikai vizsgálatok azt igazolták, hogy a mikroRNS lehet terápiásan célzott in vivo [15].
Profilírozó tanulmányok bizonyítják mikroRNS dereguláció széles spektrumú betegségek, beleértve az összes főbb rákok [16]. A mikroRNS-ek valószínűleg hatással tumorigen folyamatok két szinten. Először is, több tanulmány létre pro-onkogén vagy tumor-elnyomó szerepe egyes mikroRNS erősen összeköti ezeket a rák etiológiája ezt példázza a miR-155, miR-10b és miR-21 [17-19]. Másodszor, a mikro-RNS szabályozási rendszer önmagában úgy tűnik, hogy a tumor szuppresszív feladatokat genetikai ablációja kulcsfontosságú mikro-RNS biogenezis tényezők, mint például kockajátékos, erősen növeli a rák fogékonyság [20] és funkciójának elvesztése mutációt azonosítottak fontos mikroRNS feldolgozás tényezők a humán tumorokban [21-23]. katalógusa Ebben a tanulmányban foglalkozunk fontos a mikroRNS gyomorrákban kihasználva a gasztrin katalógusa knockout egér modell és a H. pylori fertőzés katalógusa vad típusú egerekben. Azonosítjuk miR-449, mint szignifikánsan down-szabályozott vagy elveszett egér modellekben a gyomorrák, valamint a primer humán gyomor tumorok. Azonosítása mRNS célok kiderül, hogy ez a mikro-RNS valószínűleg fejti tumor elnyomó funkció révén összehangolt szabályozása kohort rákkal kapcsolatos sejtciklus-szabályozó, beleértve a MET, GMNN, CCNE2, SIRT1 és HDAC1. Katalógusa Módszerek
Egerek
Három különböző korcsoportokban (12-16 hét, 1 év vagy 1½ év) a vad típusú (wT) vagy gasztrin
knockout (KO) egereket használtunk. Minden egerek egy vegyes 129 /SvJ, C57BL /6J háttér, visszakereszteztünk legalább négy alkalommal, hogy C57BL /6J [12]. Az egereket alatt tartottuk specifikus kórokozóktól mentes körülmények és megfigyeljük a Szövetség európai Laboratory Animal Science Egyesületek ajánlás [24] 12 h fény, 12 óra sötétség ciklus.
H. pylori fertőzés katalógusa katalógusa C57BL6 /J egereket (n = 10) beoltjuk a nem-egér-adaptált klón a H. pylori katalógusa törzs 67:21, az eredetileg izolált egy antrális biopsziával nyert svéd női gyomorfekély. A törzs VacA +, és tartalmazza a teljes Cag patogenitási sziget (PAI) genetikai stabilitás CAG PAI [25]. Az egereket oltottunk minden második nap (háromszor) alatt egy 5 napos időszakban. DNS-t extraháltunk és elemeztük a jelenléte a Helicobacter fajok alkalmazásával félig beágyazott polimeráz láncreakció-denaturáló gradiens gélelektroforézis vizsgálat specifikus a Helicobacter genus, a korábban leírtak szerint [26]. A párosított csoport a nem fertőzött C57BL6 /J egereket használtunk kontrollként.
A gyomor összes egerek boncolt fundus és antrum megelőzően RNS kivonása. A kísérleteket hagyta jóvá a dán Állatjóléti Bizottság (2005 /562-40) és a dán Erdő és Természetvédelmi Hivatal (20010077355/6). Katalógusa Egerek antrumból szakaszok katalógusa egereket megöljük. Az antrum eltávolítjuk, mosható jéghideg PBS-ben, folyékony nitrogénben lefagyasztjuk és -80 ° C-on, amíg az RNS extrakció.
Klinikai mintákat elemzések
származó biopsziák gyomorrák, és a szomszédos normál szöveteket betegektől nyert műtéten átesett gyomorrák Tanszékén gasztrointesztinális sebészet, Rigshospitalet. A felvétel júliusában került sor, hogy a 2008. decemberi és a betegek mindegyike aláírta, beleegyező nyilatkozat (Etikai Bizottság jóváhagyását H-B-2008-049) és a dán Adatvédelmi Ügynökség (2008-41-2138). A biopsziákat helyeztük RNAlater (Ambion) a műtőben, és ezt követően -80 ° C-on, amíg az RNS extrakció.
RNS extrakció és qPCR elemzések
RNS-t extraháltunk TRIzol (Invitrogen) alkalmazásával a gyártó. miRNS expressziós profil értékelték Taqman miRNS vizsgálatok (Applied Biosystems) HSA /MMU-miR-449a és b, hsa /MMU-miR-34a, b és c és rnu44 vagy HSA /MMU-miR-191. A primer szekvenciák az Affymetrix célok érvényesítés felsorolt ​​további fájl 1, táblázat S1.
Sejtkultúra
SNU638 és MKN74 RPMI-1640 (Gibco), amely 10% FBS-sel (Hyclone), 100 E /ml penicillint és 100 ng /ml sztreptomicinnel (Invitrogen), és inkubáljuk 37 ° C-on, 5% CO 2. HCT116 sejteket (WT és a p53 - /- neveltük McCoy 5A (Gibco), amely 10% FBS-sel (Hyclone), valamint 100 E /ml penicillint és 100 ng /ml sztreptomicin (Invitrogen), és inkubáljuk 37 ° C-on, 5% CO 2. HEK293 és MEF-sejtek (wT és a p53 - /-) DMEM (Gibco), amely 10% FBS-sel (Hyclone), 100 E /ml penicillint és 100 ng /ml sztreptomicin (Invitrogen), és inkubáljuk 37 ° C-on 5% CO 2.
miRNS prekurzorok és siRNS katalógusa miRNS prekurzorok vásároltunk Ambion, hsa-miR-449a (PM11521), hsa-miR-449b (PM11127) és hsa-miR-34a ( PM11030).
Cell növekedés elemzések
SNU638 sejteket szélesztettünk 24 mérőhelyes lemezeken, és transzfektáltuk a következő napon 50 nM miRNS duplex vagy siRNS Lipofectamine 2000 (Invitrogen). a sejteket rögzítettük jelzett időpontokban 4% paraformaldehidben , megfestettük 0,1% -os kristályibolya oldattal, és újra szuszpendáljuk 10% -os ecetsavban. minta abszorbanciáját mértük 620 nm-en.
sejtciklus FACS elemzések
SNU638 és MKN74 sejteket beoltottuk 2 × 10 6 sejt per 10cm lemez és transzfektáltuk 50 nM miRNS duplex (Ambion) Lipofectamine 2000 (Invitrogen). A sejteket 48 és 72 órával a transzfekció után, megfestett DNS-tartalom propidium-jodid (Pl), és elemeztük FACS Calibur áramlási citométerrel (Becton-Dickinson). Röviden, a sejteket tripszinezéssel és egyszer mossuk PBS-sel, mielőtt megállapítja éjszakán át 70% -os EtOH. Hogy folt a DNS-t, a sejteket ülepítjük, újra szuszpendáljuk 100 ul etanolban, és megfestettük 1 óra 300 ul PI-oldatot (0,05 mg /ml PI, 20 ng /ml RN-áz A 0,1% BSA).
Senescence elemzések
SNU638 sejteket ültettünk 400.000 sejt per 6-jól lemez és transzfektáltuk 50 nM miRNS duplex (Ambion) Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Négy nappal a transzfekciót követően, a sejteket PBS-ben mostuk és a rögzített 5 percig szobahőmérsékleten 2% formaldehid /0,2% glutáraldehid. A sejteket kétszer mostuk PBS-ben pH6.0 mielőtt festettük friss öregedés kapcsolódó β-Gal-folt-oldatot (1 mg /ml 5-bróm-4-klór-3-indolil-βD-galaktozid (X-gal), 0,12 mmól k 3fe [CN] 6, 0,12 mmól K 4Fe [CN] 6, 1 mM magnézium-klorid 2 PBS pH6.0) egy éjszakán át 37 ° C-on, anélkül CO 2 ellátás . A sejteket egyszer mossuk PBS-ben (pH6.0) és a megfigyelt a mikroszkóp alatt.
Antitestek és Western-blot-analízisekkel
SNU638 oltottunk 2 × 10 6 sejt per 10 cm-es lemez, transzfektált kétszer két egymást követő nap 50 nM miRNS duplexek Lipofectamine 2000 szerint gyártó (Invitrogen). A sejteket tripszines kezeléssel, egyszer mossuk PBS-sel, és lizáltuk RIPA-pufferben (150 mM NaCl, 0,5% nátrium-dezoxikolát, 0,1% SDS, 1% Igepal, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM EDTA) kiegészítve 1 mM DTT, 1 mM Pefabloc, 1 mM NaV3, 10 NaF és 1X teljes mini proteáz inhibitor koktél tabletták. 25 ug fehérje /sáv megoldódott 4-20% NuPAGE Bis-Tris gélekre (Invitrogen), és átvittük egy nitro-cellulóz-membránra. Elsődleges felhasznált antitestek MET (Cell Signal 4560), MYC (Cell Signal 9402), GMNN (Santa Cruz Sc-53923), VCL (Sigma V9131), TP53 (Santa Cruz sc-126), CDKN1A (Santa Cruz sc-6246) , CDK6 (santa Cruz sc-177), HDAC1 (santa Cruz sc-7872), CCNE2 (Cell Signal 4132), TUBB (ABCAM ab11304) PARP (Cell Signal 9542) és a hasított CASP3 (Cell Signal 9661). katalógusa Microarray elemzések
kis RNS (< 200 nt) izoláltunk az Invitrogen PureLink miRNS Isolation Kit fundus és antrális szövetet 1) a gasztrin
KO egerek és életkorú és nemű, C57BL6 /j kontroll egerek, és 2) a C57BL6 /J egereket fertőzött H. pylori
és a fertőzetlen életkorú és nemű, C57BL6 /j kontroll egerek, (n = 4 minden csoportban). A minőségi izolált kis RNS alkalmazásával határoztuk meg a Small RNS Assay Agilent Bioanalyzer. 500 ng kis RNS-t jelzett Genisphere FlashTag Kit hibridizáció Invitrogen ncode Multi-Species miRNS microarray V2 egy Maui hibridizáció állomás. Feldolgozott metszeteket beolvasott Agilent DNS chip szkennert. Kapott képek elemezték és aránya a medián normalizálódott a GenePix Pro 6.0. Négy biológiai ismétlést használunk minden egyes összehasonlítás. A mintákat hibridizáltuk négy tömbök egy dupla színes festék csere microarray kísérleti design. BRB ArrayTools használtak szeres változást és statisztikai számítások. Kiválasztott miRNS adatokat a tömb analízis validált TaqMan valós idejű PCR-miRNS vizsgálatokban. Az adatok kerülnek letétbe ArrayExpress átvételkor. Katalógusa mRNS tömbök katalógusa SNU638 transzfektáltuk 50 nM miR-34a vagy miR-449b duplex siGLO siRNS negatív kontrollként. Teljes RNS-t extraháltunk 24 órával a transzfekció TRIzol reagenssel. Affymetrix microarray analízis (HG-U133 Plus 2.0 humán) végeztük a Microarray Center, Rigshospitalet, Koppenhága Egyetemi Kórház. Méréseket végeztünk mindkét három sorozatban vagy négyszeresen. Az adatok kerülnek letétbe ArrayExpress átvételkor. Katalógusa vektorok építési és riporter assay katalógusa A 3'UTRs a HDAC1 katalógusa, SIRT1 katalógusa, MET katalógusa, GMNN katalógusa és CCNE2 katalógusa holding miR-449 kötőhelyeket klónoztuk downstream a luciferáz riporter pMIR-Report vektor rendszer (Ambion). QuickChange helyspecifikus mutagenezis kit (Stratagene) alkalmaztunk a indukálására két pontmutációt a mag régiót. Mutagenezis primereket szekvenciák felsorolása található a további fájl 1, táblázat S1.
HEK293 sejteket szélesztettünk 96 mérőhelyes lemezeken, és transzfektáltuk 20 nM miRNS prekurzor vagy kódolt siRNS-ellenőrzés, 20-50ng luciferáz vektor (pMIR-jelentés), és 5 ng Renilla vektor (pRL-TK) Lipofectamine 2000 (Invitrogen). A sejteket 24 órával a transzfekció és a luciferáz aktivitást mértük Dual-Glo Luciferase Assay (Promega).
Microarray analízis
microarray expressziós adatok felhasználásával feldolgozott "affy" csomagot Bioconductor [27]. Probe szett intenzitását össze és kvantilis normalizálta a Bioconductor RMA és VSN csomagokat. Differenciális expresszióját határoztuk per probeset alkalmazásával t-teszt. Próba készletek vannak hozzárendelve Ensembl átiratok (version 49) segítségével leképezést biztosított BioMart. Probesets hogy leképezett két különböző Ensembl géneket dobni. Katalógusa kiértékelése globális leszabályozza mikroRNS célgénjeinek
3'UTRs, 5'UTRs és kódoló szekvenciákat az átiratokat beolvasott illő 6mer, 7mer és 8mer miRNS vetőmag oldalak (komplementer helyzetben 2-7, 2-8, és 2-9 a miRNS). Global elemzése miRNS target leszabályozza értékeltük ki a leghosszabb 3'UTR szekvencia per gén előítéletek elkerülésére bevezetett gének sok átirat izoformák. Mi dobni átírási 3'UTR szekvenciák rövidebb 50 nt. A globálisan értékeli, hogy a miRNS target gének leszabályozott után miRNS transzfekció, teszteltük a nullhipotézist, hogy a kifejezés a változás eloszlása ​​miRNS célok (amelynek 7mer célterületre) egyenlő volt a forgalmazás minden expresszálódó gének nélkül adott cél oldalak segítségével a nem-paraméteres Wilcoxon rank-sum tesztet. Hasonló megközelítést használtuk a down-regulációja gén miRNS célzott helyek kódoló régió és 5'UTRs mRNS.
Kimerítő statisztikai értékelését szavak korrelált leszabályozza katalógusa használtunk korábban közzétett nem parametrikus rang-alapú statisztika kimerítően értékelni a korreláció szó előfordulások 3'UTRs és a változás génexpressziós után miRNS transzfekció [28, 29]. Géneket sorolva kifejezés előidéző ​​transzfekciója miR-34a vagy miR-449b, és a korreláció leszabályozza teszteltük minden szó hosszúságú 7/5 (N = 21 504). Katalógusa statisztikai tesztek katalógusa Student t-teszt Welch korrekció. katalógusa Eredmények katalógusa miR-449b van szabályozva az antrumban mind gasztrin katalógusa KO egerek és H. pylori
fertőzött egerek katalógusa gasztrin katalógusa egerek vannak achlorhydric hajlamos a fejlődő antrális hyperplasia és gyomor adenomák idővel (1. ábra) [6, 12]. Annak érdekében, hogy azonosítani mikroRNS szabályozatlan fejlesztése során a gyomorrák, megvizsgáltuk miRNS expressziós profilok gyomor neopláziák származó gasztrin
knockout egerek felhasználásával miRNS microarray. Amint az 1. táblázatból látható, 20 mikroRNS szignifikánsan deregulált a knockout egerekben, összehasonlítva a vad típusú alomból kontrollok, három miRNS eltérő több mint kétszeres, miR-7 esetén legfeljebb szabályozott és miR-709 és miR-449b, hogy le-szabályozott az antrumban gasztrin katalógusa knockout egerekben, mint a vad típusú. Ahhoz, hogy tovább erősítse a miR-449 dereguláció során gyomorrák fejlesztés, megvizsgáltuk expresszióját vad típusú egér antrumból szövetek fertőzött H. pylori katalógusa. Érdekes, hogy a miRNS tömbök bizonyította adott leszabályozza miR-449b H. pylori
fertőzött egerek (2. táblázat és kiegészítő fájl 1. ábra S1). 1. ábra Régi gasztrin egereknek fejleszteni gyomor adenoma. Antrum szakaszok elszigetelt 12-16 hetes egerek (bal oldali panel), 12-18 hónapos korig egerek (középső panel) és 18 hónapnál idősebb egerek (jobb panel), a vad típusú (felső panel) és gasztrin katalógusa egerek (alsó panel). Szakaszok mutatják adenoma fejlődés antrumban szövetek a gasztrin
kiütéssel összehasonlítva a vad típusú.
1. táblázat miRNS deregulált gasztrin
knockout egerekben
miRNS Név Matton log2-szeres Matton p-érték Matton miRNS Name

Log2-fold

p-value

mmu-miR-709
-1.73
7.0E-06
mmu-miR-422b
0.44
4.6E-02
mmu-miR-449b
-1.37
1.6E-03
mmu-miR-199a*
0.50
7.7E-03
mmu-miR-805
-1.01
7.5E-03
mmu-miR-25
0.51
1.6E-02
mmu-miR-706
-0.98
3.1E-03
mmu-miR-27b
0.56
5.1E-03
mmu-miR-467a
-0.88
2.8E-02
mmu-miR-182
0.56
1.8E-02
mmu-miR-696
-0.83
7.1E-03
mmu-miR-30a-3p
0.59
2.2E-02
mmu-miR-667
-0.66
2.3E-02
mmu-miR-10a
0.70
7.1E-03
mmu-miR-690
-0.28
1.7E-02
mmu-miR-152
0.70
2.3E-02
mmu-miR-18
0.29
3.7E-02
mmu-miR-1
0.77
7.1E-03
mmu-miR-143
0.34
2.3E-02
mmu-miR-7
1.06
4.9E-03
Listája jelentősen szabályozatlan miRNS a gyomor daganatok, honnan gasztrin katalógusa egerek, mint a vad típusú. Katalógusa 2. táblázat miRNS szabályozatlan a H. pylori katalógusa fertőzött szövetek katalógusa miRNS neve

Fold change

p-value

mmu-miR-122a
-3.247
0.000788
mmu-miR-449b
-0.879
0.045214
Listája jelentősen szabályozatlan miRNS vad típusú egerek antrumból H. pylori fertôzés
, mint a nem fertőzött antrumból.
MiR-449 gátolja a sejtciklus előrehaladását, és kiváltja az öregedés katalógusa Miután kimutattuk, leszabályozza a miR-449 kifejezés a gyomor rákos akartunk hatásának vizsgálata újbóli kifejező miR-449 a gyomor rákos sejtvonalak. Érdekes módon nem észrevehető kifejezése a miR-449 család volt kimutatható az egész egy panel a gyomor sejtvonalak, beleértve a SNU638, SNU5, SNU216, SNU601 és MKN74 fenntartásában fogalmát miR-449, amelynek tumor-szuppresszív funkciók (az adatokat nem mutatjuk be). A miR-449 család áll miR-449a és b emberekben és miR-449a, b és c egerekben. Érdekes, hogy ugyanazt a magot a sorrendben, mint a miR-34 család, és így várhatóan szabályozni átfedő korosztályok target gének (2a ábra). Annak megállapítására, a funkció a miR-449 a gyomor sejtvonalak akkor újra be miR-449b a SNU638 és MKN74 sejteket. Összehasonlítva a negatív kontroll mikroRNS újra bevezetése miR-449b erősen befolyásolja elterjedése SNU638 sejtek (2b ábra), és tegyék a sejtek jelzett apoptózis indukálása és a sejtöregedés (2c ábra, és további fájl 1 ábra, S2). Áramlási citometriás elemzése propidium-jodid festett sejtek transzfektált miR-449b mutatott G 1 akkumuláció 48 órával a transzfekció után, majd 72 órával a transzfekció után egy felhalmozódása sejtek a sub G 1 frakció utaló sejt halál (ábra 2d). A indukciója sejtöregedés igazoltuk savas béta gal-festés alkalmazásával miR-34a, mint pozitív kontroll mikro-RNS (ábra 2e). Hogy kizárjuk sejtvonal-specifikus hatások, a funkcionális következményei miR-449 újbóli bevezetése szempontjából sejtciklusmegállás ellenőrizték a MKN74 sejtek (Plusz fájl 1. ábra S3). Így újra bevezetése miR-449 negatívan befolyásolja elterjedése gyomor rákos sejtvonalak egyidejű az indukciós öregedés és az apoptózis egyeznek miR-449, amely a tumor elnyomó funkcióit. 2. ábra miR-449 része a miR-34 család és gátolja a sejtproliferációt. A - miR-449 része a miR-34 család, és evolúciósan konzervált. B - miR-449 újra bevezetése az emberi gyomor sejtvonalak (SNU638) gátolja a sejtosztódást (piros vonal), összehasonlítva a kevert kontroll (kék vonal) és a miR-146 vezérlő (fekete vonal). Hibazászlók S.D. C - szemrevételezése proliferációt gátló és öregedés-szerű fenotípus alapján miR-449 újra behurcolása SNU638 sejtek (alsó panel), mint az összekevert transzfekciós kontroll (felső panel). D - FACS sejtciklus analízis mutatja sub-G1 felhalmozódása SNU638 sejtek után 72 órán miR-449 ismételt bevezetése (jobb hisztogram) összehasonlítva egy kódolt transzfekciós kontroll (bal hisztogram) A táblázat azt mutatja sejt felhalmozódása G1 frakció upon miR-449 újbóli -Bevezetés összehasonlítva kódolt RNS-ellenőrzés transzfekció után 48 órával, majd egy eltolódás az al-G1 frakció után 72 órával a transzfekció indikatív sejthalál. E - Az elöregedett fenotípus SNU638 sejteken miR-449 és miR-34a pozitív kontroll újbóli bevezetése mutatja savas β-gal vizsgálattal összehasonlítva RNS kevert kontroll.
A közös mag sorozata miR-449b és miR-34a indukál nagyon korrelált kifejezés változik katalógusa jellemzésére az átiratok által ellenőrzött miR-449 és látni, hogy a miR-449 szabályozza a különböző átiratok, mint a miR-34a, SNU638 sejtek expressziós profilok vizsgáltuk 24 órával a transzfektálás miR-449b vagy miR-34a és differenciáltan kifejezett átiratok azonosítottak. Azt találtuk, hogy mRNS megjósolta miRNS célwebhelyet (7 tagú mag helyén) 3'UTR szignifikánsan leszabályozott képest mRNS nélkül adott cél oldalak transzfekció után a miR-449b (p < 1.2e-70, két farkú Wilcoxon rank-sum tesztet), (Plusz fájl 1. ábra S4A). mRNS miután megjósolta miRNS vetőmag célzott helyek kódoló régiókban is szignifikánsan lecsökkent (p < 9.9E-25), míg a mRNS helyek 5'UTRs csak marginálisan lecsökkent (p < 5.3e- 2). A kifejezés által létrehozott változásoknak transzfekciója érett miR-449b és miR-34a nagymértékben korreláltak ellenére divergencia az érett szekvenciák kívül mag régió (Pearson-féle korrelációs együttható R = 0,94, p = 0), (Plusz fájl 1. ábra S4b). Mi kimerítő értékelése minden oligonukleotid (szó) hosszúságú 5-7 korreláció leszabályozza után miR-449b és miR-34a transzfekciós (lásd a módszereket). Összhangban számos korábbi tanulmány, ez az elemzés kimutatta a megosztott miR-34a /449b mag helyszínen 3'UTR szó leginkább korrelál leszabályozza a két kísérlet (Plusz fájl 1. ábra S4C).
MiR-449 szabályoz számos sejtciklus szabályozók
expressziós profilok azonosítására használtuk eltérően expresszált átiratok transzfektált sejtekben a miR-449b vagy vezérlők (Plusz fájl 1. táblázat S2). Egy útvonal aktivációs analízis alapján differenciáltan szabályozott átiratok azt mutatja, hogy a miR-449 elsősorban szabályozza átiratok fehérjéket kódoló szerepet játszik a sejtek károsodását válaszok sejtciklus szabályozásában, gyulladás vagy rák utak (3a) ábrát. Összpontosítva egy sor feltételezett célgének jól bevált szerepeket tumorgenesisben, azt megerősítette, down-szabályozás miR-449 met proto-onkogén (MET katalógusa), ciklin dependens kináz 6 (CDK6) hotelben, geminin (GMNN ) hotelben, myelocytomatosis virális onkogének homológ (MYC) hotelben, Sirtuin 1 (SIRT1 katalógusa) és a hiszton deacetiláz 1 (HDAC1) hotelben a átirat szinten (3b ábra). Western blot vizsgálatok megerősítették a képességét miR-449 leszabályoz MET, GMNN, MYC, SIRT1 ciklin E2 (CCNE2) és HDAC1 fehérje szinten, hogy hasonló mértékben elérni, újra megjelennek a miR-34a (alak 3c). Egy részhalmaza célgénjeinek beleértve MET katalógusa, GMNN, CCNE2 katalógusa, SIRT1 katalógusa és HDAC1 katalógusa, azt megerősítette, közvetlen kapcsolat a miR-449 a cél gén 3 'UTR segítségével iuciferázvizsgáió (ábra 3d ). 3. ábra miR-449 megcélozza sejtciklus szabályozó gének. A - Ingenuity Út Analysis (IPA) a szabályozatlan gének upon miR-449 újra behurcolása SNU638 mutató sejtek gazdagodásának gén kategóriák rák, a sejthalál és sejtciklus többek között. B - qPCR érvényesítése Affymetrix tömbök mutató leszabályozza MET katalógusa, CDK6 katalógusa, GMNN katalógusa, MYC katalógusa és HDAC1 katalógusa upon miR-449 újra bevezetése képest kódolt RNS ellenőrzéseket. C - Western blot érvényesítése le gének upon miR-449 újra behurcolása SNU638 sejtekben, mint a kódolt RNS ellenőrzéseket. Vinculin (VCL) és tubulin beta (TUBB) alkalmaztunk Loading kontrollok D - ellenőrzése közvetlen és funkcionális cél kötő segítségével luciferáz konstrukciók holding vad típusú 3'UTRs és mutáns 3'UTRs (két mutációt miR-449 kötőhely), * jelzi a statisztikai szignifikancia luciferáz expresszió között vad típusú 3'UTRs transzfektált miR449a /b képest RNS kevert kontroll, # jel statisztikai különbség luciferáz expresszió között vad típusú 3'UTRs képest mutáns 3'UTRs transzfektált miR-449a és miR 449b. "Ns" nem szignifikáns p érték > 0,05, "*" vagy "#" jelentős 0,01 < p-érték < 0,05 "**" vagy "##" nagyon jelentős 0.01 < p-érték < 0.001, "***" vagy "###" rendkívül jelentős p érték < 0,001
Ezért, miR-449 közvetlenül célozza sejtciklus-szabályozó gének összhangban egy tumor szuppresszor funkcióját, és a sejtciklus figyelhető meg miR-449 újbóli bevezetés rákos sejtvonal.
MiR-449 indukálja a p53 expressziós de nem szabályozza a p53 katalógusa Mivel miR-34a korábban megállapították, hogy működjön downstream p53 [30-33], elemeztük ha még miR-449a /b kötődtek p53. Ezt továbbá ösztönözte a jelenléte egy feltételezett p53 kötőhelyet 10 kb upstream humán miR-449 (az adatokat nem mutatjuk be). Ezért indukált p53 DNS károsodás UV vagy 5-fluorouracil (5FU) négy különböző rendszerek, HCT116 és MEF vad típusú p53 kiütött sejtek (Plusz fájl 1. ábra S5a). Azonban nincs jelentős változás a miR-449 expresszió után is kimutatható volt p53 aktiváció (Plusz fájl 1. ábra S5b). Összefoglalva, nem találtunk bizonyítékot arra, hogy a miR-449 egy transzkripciós célpont p53. Másrészt, azt találtuk, hogy a miR-449a /b képes indukálni aktiválását p53 aktiválása, p53 válasz gének, mint például a p21 és az apoptózis indukcióját, amint azt hasításával kaszpáz-3 (CASP3) és a poli (ADP-ribóz ) polimeráz 1 (PARP) (4. ábra). Megértése felé a mechanizmus, amellyel a miR-449 működik ez felmértük a miR-449 a SIRT1 és HDAC1. SIRT1 és HDAC1 vannak dezacetilázok, amelyek gátolják többek között, az aktiválási p53 és miR-34 kimutatták, hogy elnyomják a SIRT1 [34]. Mi validált specifikus kötődését a miR-449 SIRT1 és HDAC1 segítségével 3'UTR luciferáz vizsgálati eljárás (ábra 3d). 4. ábra miR-449 aktiválja a p53. Western-blot analízis számának növekedését mutatja a p53 fehérje upon miR-449 és a pozitív kontroll miR-34a újbóli bevezetés SNU638 sejtek összehasonlítva RNS kevert kontroll valamint aktiválja a p53 downstream célpontja a p21 és az apoptózis markereinek hasítjuk CASP3 és PARP. Vinculin (VCL) és tubulin beta (TUBB) alkalmaztunk Loading kontrollként.
Ezért azt feltételezzük, hogy a miR-449 apoptózist indukál gátlásával a hiszton-dezacetiláz HDAC1 és SIRT1 vezető p53 aktiváció így az apoptózis indukcióját markerek hasítjuk CASP3 és PARP.
miR-449 is lefelé szabályozni az emberi gyomorrák
értékelni fontos a miR-449 humán rosszindulatú mi mellett kifejeződését vizsgáltuk miR-449 10 gyomorrák biopszia. Fontos, hogy megtaláltuk mind a miR-449a és ab jelentősen lefelé szabályozni, vagy hiányzik a 10-ből 8 primer gyomor rák. Emellett azt a kifejezést a miR-449a és b tűnnek ko-regulált (5a ábrát). Nem találtunk összefüggést a csökkenés miR-449 expresszió és a klinikai jellemzők a rák (5B). Az elemzések a genomi DNS-t a daganat nem talált bizonyítékot elvesztéséért vagy hiper-metilezése a miR-449 lókuszok alkalmazásával metiláció-specifikus olvadási görbe analízisen (MS-MCA), jelezve, transzkripciós down-regulációja kifejezés (az adatokat nem mutatjuk be). Így egyetértésben adatok két egér modell gyomor gyulladás és megnagyobbodás, a kifejezés a miR-449 is lefelé szabályozni az emberi gyomor rák. 5. ábra miR-449 van szabályozva az emberi gyomor rák. qPCR elemzés (felső panel) mutatja leszabályozza a miR-449 expresszió 8 gyomorrák szövetek képest miR-449 expresszió minta illesztett (szaggatott vonal). U44 használtunk endogén kontroll. Táblázat mutatja a klinikai adatokat a betegek (alsó panel). "Ns" nem szignifikáns p érték > 0,05, "*" jelentős 0,01 < p-érték < 0,05 "**" nagyon jelentős 0.01 < p-érték < 0.001, "***" rendkívül jelentős p érték < 0.001 katalógusa Vita katalógusa Gyomorrák rendkívül halálos rosszindulatúság több mint 21.500 új esetet évente csak az Egyesült Államokban [35]. A betegség gyakran észlelt későn és az 5 éves túlélési arány következésképpen 20% alatt [36]. Ezért fontos megérteni a etiológiája és progresszió fázisában a betegség. A fontos bakteriális, környezeti és a fogadó genetikai kockázati tényezőket a gyomor karcinogenezis vizsgálták, azonban kevesebbet tudunk molekuláris a betegség progresszióját [37, 38]. Többek között p53 inaktiválás tűnik, 30-60% -át a gyomor rákos megbetegedések [39, 40], és a legújabb vizsgálatok szerint a H. pylori
közvetlen modulálása a p53-gén vagy a downstream célpontok [41]. Egy másik gyakori módosulása gyomorrák a perturbáció a sejtciklus-szabályozás keresztül felett expresszióját Ciklin E1, amely kapcsolatban van a tumor agresszivitás és nyirokcsomó-metasztázis [42, 43].

• A hatása az N-acetil-L-cisztein infúzió citokin szintek és gyomor intramucosalis során a pH súlyos sepsis
• Jóindulatú gyomor-kólika sipoly egy nőt, a fogyás és a szakaszos hányás: eset report