микроРНК-449 ингибирует клеточную пролиферацию и подавляется при раке желудка

микроРНК-449 ингибирует клеточную пролиферацию и подавляется при раке желудка
Аннотация
фон
рака желудка является четвертым наиболее распространенным видом рака в мире и второй наиболее распространенной причиной рака, связанных смерти. Развитие рака желудка, главным образом связан с H. Pylori
инфекция ведет к сосредоточению в исследованиях патологии на бактериальных и факторов окружающей среды, и в меньшей степени на механистической развитие опухоли. MicroRNAs небольшие некодирующие молекулы РНК, участвующие в пост-транскрипционной регуляции генов. Они обнаружили, регулировать гены, участвующие в разнообразных биологических функций и изменений в экспрессии микроРНК, были связаны с патогенезе многих злокачественных опухолей. Настоящее исследование сосредоточено на выявлении микроРНК, участвующих в желудочном канцерогенезе и исследовать их механистической значимость, характеризуя их цели.
Результаты
Invitrogen NCode микроРНК микрочипов определены микроРНК-449 должен быть уменьшен в 1-летний гастрин <бр> мышей KO и в H. Pylori
зараженные ткани желудка по сравнению с тканями из животных дикого типа. Скорость роста желудочных клеточных линий сверхэкспресирующим MIR-449 ингибировали на 60% по сравнению с контрольной группой. FACS анализ клеточного цикла MIR-449 сверхэкспресирующим клетки показали значительное увеличение суб-G <> 1 к югу фракции индикативного апоптоза. ß-Gal анализы указывали на стареющий фенотип желудка клеточных линий сверхэкспресирующим MIR-449. Affymetrix 133v2 массивы определены GMNN
, Met, CCNE2, SIRT1
и CDK6
качестве микроРНК-449 мишеней. Люциферазы анализы были использованы для подтверждения GMNN
, Met
, CCNE2
и SIRT1
в качестве прямых целей. Мы также показали, что микроРНК-449 избыточная экспрессия активированного P53 и его целевое соотношение Р21, а также маркеры апоптозом расщепляется CASP3 и PARP. Важно отметить, что КПЦР анализ показал потерю экспрессии микроРНК-449 в клинических опухолей желудка человека по сравнению с нормальными тканями.
Выводы
В этом исследовании мы документально уменьшенное экспрессию микроРНК-449 в гастрин
мышей KO и еще раз подтвердил свою потерю в опухолях желудка человека. Мы исследовали функцию MIR-449 путем определения своих прямых целей. Кроме того, мы показали, что микроРНК-449 индуцирует апоптоз старении и путем активации р53 пути.
Фон
Рак желудка является одним из пяти наиболее распространенных видов рака в мире и второй наиболее распространенной причиной смертности от онкологических заболеваний [1] , Это в основном, но не исключительно, вызванные H. Pylori
инфекции [2], как не все антихеликобактерной
инфицированных развиваются опухоли [3]. Другие факторы, участвующие в развитии рака желудка включают степень и тип воспалительной реакции [2], а также уровни гастрина
гормона [4, 5]. Несколько исследований показали, что оба гипергастринемию [6, 7], и отсутствие гастрин [5] вносит вклад в патогенез рака желудка. Ахлоргидрия является общей особенностью моделей мышей склонными к развитию метаплазии и рака [6, 8, 9]. Гастрин
нокаутные мыши являются ахлоргидрия [10], в пользу бактериальной разрастание желудка [11, 12], а также хронические бактериальные инфекции желудка привести к желудочной метаплазии, которая может прогрессировать в рак желудка [6, 12].
Со времени их открытия микроРНК, были найдены замешан в очень широком диапазоне нормальных и патологических процессов [13]. MicroRNAs осуществляют свои регулирующие функции posttranscriptionally путем связывания с частично комплементарной последовательностью мотивы преимущественно в 3 'UTR целевых мРНК приводит к мРНК дестабилизации и трансляционной репрессии [14]. С биологической точки зрения, микроРНК являются сложными объектами для изучения, поскольку они регулируют когорты генов-мишеней, которые не легко идентифицировать. С терапевтическом точки зрения, микроРНК весьма интересны как некоторые исследования продемонстрировали мощь микроРНК в качестве биомаркеров и начальных доклинических исследований установлено, что микроРНК может быть терапевтически мишенью в естественных условиях [15].
Профилирование исследования свидетельствуют микроРНК дерегулирование в широкий спектр заболеваний, в том числе всех основных видов рака [16]. MicroRNAs вероятно, влияют на процессы tumourigenic на двух уровнях. Во-первых, несколько исследований установили про-онкогенные или опухоль-подавляющих роли отдельных микроРНК прочно связывающих их этиологии рака, как на примере микроРНК-155, MIR-10b и MIR-21 [17-19]. Во-вторых, система регулирования микроРНК сама по себе, как представляется, имеют функции опухоли подавляющие как генетическая абляции ключевых факторов микроРНК биогенеза, таких как Dicer, сильно повышают восприимчивость рака [20] и потеря функции мутации были выявлены в важных микроРНК технологических факторов в опухолях человека [21-23].
В данном исследовании мы рассматриваем важность микроРНК в развитии рака желудка Воспользовавшись гастрин
модели нокаута мыши и хеликобактерной
инфекции у мышей дикого типа. Мы определяем MIR-449, как значительно понижающей регуляции или потеряны в мышиных моделях рака желудка, а также в первичных опухолях желудка человека. Идентификация мРНК мишеней показывает, что эта микроРНК, вероятно, оказывает функции опухоль подавляющие через согласованные регулирования когорте регуляторов клеточного цикла раковых ассоциированных включая добычу полезных ископаемых, GMNN, CCNE2, SIRT1 и HDAC1.
Методы
Мыши <бр> были использованы три различных возрастных групп (12-16 недель, 1 год или 1 ½ лет) дикого типа (по массе) или гастрин
нокаутных мышей (KO). Все мыши были на смешанном 129 /SVJ, C57BL /6J фоне, возвратное скрещивание, по крайней мере четыре раза C57BL /6J [12]. Мышей содержали под конкретного патогена условиях и контролируются в соответствии Федерации рекомендации Европейской лаборатории зоотехния ассоциации [24] с 12 ч света, 12 ч темные циклов.
H. Pylori
инфекции
C57BL6 /J мышей (п = 10) были привиты с непостоянным мыши адаптированной клон H. Pylori
штамма 67:21, первоначально выделенных из антрального биопсии, полученной из шведской женщины с язвенной болезнью желудка. Штамм VacA + и содержит весь CAG островка патогенности (PAI) с генетической стабильности в КГП PAI [25]. Мышей заражают каждый второй день (три раза) в течение периода 5 дней. ДНК экстрагировали и анализировали на присутствие видов Helicobacter с использованием градиента анализа гель-электрофореза частично вложенным полимеразной цепной реакции денатурирующих, специфическую для рода Helicobacter, как описано ранее [26]. Согласованный группа неинфицированных мышей C57BL6 /J использовали в качестве контролей.
Желудки всех мышей препарировали в глазном дне и антрального до экстракции РНК. Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по датскому защиты животных (2005 /562-40) и датским лесов и природы агентства (20010077355/6) путем. Секций Антрум
Мыши
Мышей забивали путем смещения шейных позвонков. Антрум удаляли, постирать в охлажденном льдом PBS, замораживают в жидком азоте и хранили при -80 ° С до экстракции РНК.
Клинических образцов анализов
биопсий рака желудка и соседние нормальные ткани были получены от пациентов перенесших операцию по поводу рака желудка в отделении желудочно-кишечной хирургии, Rigshospitalet. Включение состоялось в июле по декабрь 2008 года и при условии, что все пациенты подписали информированное согласие (Этическое одобрение комитета H-B-2008-049) и Датское агентство по защите данных (2008-41-2138). Биопсии были помещены в RNAlater (Ambion) в операционной, а затем замораживали при -80 ° С до экстракции РНК. Экстракции
РНК и КПЦР анализы
РНК экстрагировали с использованием TRIzol (Invitrogen) в соответствии с производителем. Профиль экспрессии микроРНК оценивали с помощью анализов Taqman микроРНК (Applied Biosystems) для HSA /ММУ-MIR-449а и б, HSA /ММУ-MIR-34а, б и в и rnu44 или HSA /чных-MIR-191. Последовательности праймеров для проверки Affymetrix цели, перечисленные в дополнительном файле 1, таблица S1.
Клеточные культуры
SNU638 и MKN74 выращивали в среде RPMI-1640 (Gibco) с добавлением 10% FBS (Hyclone), 100U /мл пенициллина и 100 мкг /мл стрептомицина (Invitrogen), и инкубировали при 37 ° с в атмосфере 5% СО <суб> 2. НСТ116 клетки (вес и р53 - /- были выращены в 5А Маккоя (Gibco) с добавлением 10% FBS (Hyclone), и 100U /мл пенициллина и 100 мкг /мл стрептомицина (Invitrogen), и инкубировали при 37 ° С в 5% CO <. к югу от> 2 НЕК293 и MEF-клеток (вес и р53 - /-) выращивались в среде DMEM (Gibco) с добавлением 10% FBS (Hyclone), 100U /мл пенициллина и 100 мкг /мл стрептомицина (Invitrogen) и инкубировали при 37 ° C с 5% CO <югу> 2.
предшественники микроРНК и миРНК
предшественники микроРНК были приобретены у Ambion, HSA-микроРНК-449а (PM11521), HSA-микроРНК-449b (PM11127) и HSA-MIR-34а ( PM11030).
рост клеток анализы
SNU638 клетки высевали в 24-луночные планшеты и трансфицировали следующий день с 50нм микроРНК дуплексной или миРНК с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen). клетки фиксировали в указанные моменты времени в 4% параформальдегид , окрашивают в 0,1% растворе кристаллического фиолетового, и снова суспендируют в 10% -ной уксусной кислоты. образец измеряли оптическую плотность при длине волны 620 нм.
клеточного цикла FACS-анализ
SNU638 и MKN74 клетки высевали при 2 × 10 6 клеток на 10 см пластины и трансфицировали с 50нм микроРНК дуплекс (Ambion) с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen). Клетки собирали через 48 и 72 часов после трансфекции, окрашивали на содержание ДНК с использованием йодида пропидия (PI) и анализировали на проточном цитометре FACS Calibur (Becton-Dickinson). В кратком изложении, клетки собирали путем обработки трипсином и один раз промывали PBS перед фиксацией в течение ночи в 70% этаноле. Для того, чтобы окрасить ДНК, клетки осаждали, повторно суспендируют в 100 мкл этанола и окрашивали в течение 1 часа с 300 мкл раствора PI (0,05 мг /мл PI, 20 мкг /мл РНКазы А в 0,1% БСА).
Старение анализы
SNU638 клетки высевают в количестве 400.000 клеток на 6-луночного планшета и трансфицировали 50нм микроРНК дуплекс (Ambion) с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen). Через четыре дня после трансфекции клетки промывали в PBS и фиксировали в течение 5 мин при комнатной температуре в течение 2% формальдегида /0,2% глутаральдегида. Клетки дважды промывали в PBS рН 6.0 до того, окрашивали свежей Старение связанного бета-Gal раствор красителя (1 мг /мл 5-бром-4-хлор-3-индолил-βD-галактозида (X-Gal), 0.12mm K <к югу> 3Fe [CN] <суб> 6, 0.12mm K <суб> 4Fe [CN] <суб> 6, 1mM MgCl <суб> 2 в PBS рН 6.0) в течение ночи при 37 ° с без СО <суб> 2 питания , Клетки промывали один раз в PBS (рН 6.0) и наблюдали под микроскопом.
Антител и вестерн-блот анализ
SNU638 высевали при 2 × 10 6 клеток на 10 см пластины, трансфицированные дважды на два последовательных дней с 50nm микроРНК дуплексы с использованием Липофектамина 2000 в зависимости от производителя (Invitrogen). Клетки собирали путем обработки трипсином, промывали один раз PBS и лизируют в RIPA буфере (150 мМ NaCl, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS, 1% Igepal, 50 мМ Трис-HCl, рН 8, 2 мМ ЭДТА), дополненной 1 мМ DTT, 1 мМ Pefabloc 1мм NaV3, 10 мМ NaF и 1X полный мини ингибитор протеазы коктейль таблетки. 25 мкг белка /полоса разрешались на 4-20% NuPAGE Bis-Tris гели (Invitrogen) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Первичные антитела были использованы Met (Cell Signal 4560), MYC (Cell Signal 9402), GMNN (Santa Cruz Sc-53923), VCL (Sigma V9131), TP53 (Santa Cruz Sc-126), CDKN1A (Santa Cruz Sc-6246) , CDK6 (Santa Cruz Sc-177), HDAC1 (Santa Cruz Sc-7872), CCNE2 (Cell Signal 4132), Tubb (Abcam ab11304), ППА (Cell Signal 9542) и расщепленные CASP3 (Cell Signal 9661).
микрочипов анализ
малых РНК (&200 Лт; нт) были выделены с Invitrogen PureLink микроРНК Isolation Kit от фундального и антрального ткани из 1) мышей Гастрин
KO и по возрасту и полу соответствовали контрольных мышей C57BL6 /J и 2) C57BL6 /J мышей, инфицированных H. Pylori
и неинфицированных возраста и пола соответствием контрольных мышей C57BL6 /J, (п = 4 для каждой группы). Качество отдельных малых РНК определяли с использованием малых РНК Пробирной на Agilent Bioanalyzer. 500ng малых РНК метили Genisphere FlashTag Kit и гибридизуют Invitrogen NCode Многовидовые микроРНК Microarray V2 в гибридизация станции Maui. Обработанные слайды были отсканированы в микрочипов сканер компании Agilent ДНК. Полученные изображения анализировали и соотношение медианного нормализованы с помощью GenePix Pro 6.0. Четыре повторности биологические использовались для каждого сравнения. Образцы гибридизированных четырех массивов в двойной цвет красителя своп микрочипов эксперимента. BRB ArrayTools были использованы для кратном изменения и статистических расчетов. Отдельные данные микроРНК из анализа массива были проверены с использованием TaqMan ПЦР в реальном времени микроРНК анализы. Данные будут сданы на хранение в ArrayExpress при
принятии. Массивов мРНК
SNU638 трансфицированных 50 нМ микроРНК-34а или микроРНК-449b дуплексов с миРНК Siglo, используемых в качестве отрицательного контроля. Суммарную РНК экстрагировали через 24 ч после трансфекции с использованием реагента TRIzol. анализ микрочипов Affymetrix (HG-U133 Plus 2,0 человек) проводили в Microarray Центре, Rigshospitalet, Копенгаген университетской больницы. Эксперименты проводились либо в трехкратном повторе или quadruplicates. Данные будут сданы на хранение после принятия ArrayExpress.
Строительство векторов и репортер анализов
The 3'UTRs из HDAC1
, SIRT1
, Met
, GMNN
и CCNE2
холдинг микроРНК-449 сайты связывания были клонированы ниже по потоку от люциферазы репортера в векторной системе pMIR-REPORT (Ambion). QuickChange сайт-направленный мутагенез комплект (Stratagene), был использован для индукции двух точечных мутаций в запальной зоне. Мутагенеза последовательности праймеров приведены в дополнительном файле 1, таблица S1.
HEK293 клетки высевали в 96-луночные планшеты и трансфицировали с предшественником 20 нМ миРНК или вскарабкался контроль миРНК, 20-50ng люциферазы вектора (pMIR-отчет) и 5 ​​нг из Renilla вектор (PRL-ТК) с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen). Клетки собирали через 24 ч после трансфекции и активность люциферазы измеряли с использованием Dual-Glo анализа люциферазы (Promega). Обрабатывалась
микрочипов анализа
выражение микрочипов данных с помощью "AFFY" пакет в Bioconductor [27]. Набор интенсивности зондов были обобщены и квантиль нормированы с использованием пакетов Bioconductor RMA и ВСН. Дифференциальная экспрессия была определена на probeset с помощью Т-теста. наборы зондов были нанесены на карту в Ensembl транскриптов (версия 49) с использованием преобразования, предоставляемые в BioMart. Probesets, которые сопоставляются с двумя различными Ensembl генов были отброшены.
Оценки глобальных понижающую регуляцию генов-мишеней микроРНК
The 3'UTRs, 5'UTRs и кодирующие последовательности транскриптов были отсканированы для согласования 6mer, 7mer и 8mer микроРНК семенные участки (комплементарные позиции 2-7, 2-8 и 2-9 миРНК). Глобальный анализ целевой микроРНК понижающей регуляции оценивали, используя самую длинную последовательность 3'UTR на ген, чтобы избежать смещения введенного генов со многими транскриптов изоформ. Мы отброшены стенограммы с 3'UTR последовательностей короче, чем 50 нт. Для того, чтобы глобально оценить, если микроРНК гены-мишени были понижающей регуляции после миРНК трансфекции, мы протестировали нулевую гипотезу о том, что распределение изменение экспрессии мишеней микроРНК (имеющих целевой 7mer сайт) был равен распределению всех выраженных генов без прогнозируемых целевых сайтов с помощью непараметрический Wilcoxon тест суммы рангов. Аналогичный подход был использован для оценки понижающую регуляцию генов с микроРНК целевых сайтов в кодирующих областях и 5'UTRs из мРНК.
Exhaustive статистическую оценку слов коррелировало с понижающую регуляцию
Мы использовали ранее опубликованную Непараметрический Оценка на основе статистики исчерпывающе оценить соотношение употребляемых слов в 3'UTRs и изменения в экспрессии генов после трансфекции миРНК [28, 29]. Гены были отсортированы по изменению экспрессии индуцированного трансфекции MIR-34а или MIR-449b, а корреляция с понижающей регуляции была протестирована для всех слов длины 5-7 (N = 21 504).
Статистические тесты
студенты т-тест с коррекцией Уэлша.
Результаты
MIR-449b с понижением регулируется в антральном обоих мышей гастрин
KO и H. пилори
инфицированных мышей
гастрин
нокаутных мышей являются ахлоргидрия с тенденцией для развития антрального гиперплазию и аденомы желудка в течение долгого времени (рисунок 1) [6, 12]. В целях выявления микроРНК дерегулируемых при развитии рака желудка, мы исследовали профили экспрессии микроРНК в желудочном неоплазий из гастрин мышей
нокаутных с использованием микроРНК микрочипов. Как показано в таблице 1, 20 микроРНК были значительно дерегулирование в нокаутных мышей по сравнению с диким контроля типа однопометница, с тремя микроРНК, отличающихся более чем в два раза, микроРНК-7 будучи повышающей регуляции и микроРНК-709 и микроРНК-449b будучи понижающей регуляции в антральном гастрина
нокаутных мышей по сравнению с дикого типа. Для дальнейшего подтверждения микроРНК-449 дерегулирования во время развития рака желудка, мы исследовали его экспрессию в дикого типа мыши тканей Антрум инфицированных H. Pylori
. Интересно, что микроРНК массивы продемонстрировали специфический понижающей регуляции MIR-449b в H. Pylori
инфицированных мышей (таблица 2 и дополнительный файл 1, рисунок S1). Рисунок 1 Старый Гастрин нокаутных мышей развиваются аденомы желудка. Антрум участки изолированы от 12-16 недель старых мышей (левая панель), от 12 до 18 месяцев мышей (средняя панель) и старше 18 месяцев мышей (правая панель), от дикого типа (верхняя панель) и гастрин
нокаутных мышей (нижняя панель). Разделы показывают развитие аденомы в антральном тканях в Справочнике нокаутов гастрина по сравнению с диким типов.
Таблица 1 микроРНК дерегулируемых в гастрин
нокаутных мышей
микроРНК Имя

Log2 раза

р-значение

микроРНК Name

Log2-fold

p-value

mmu-miR-709
-1.73
7.0E-06
mmu-miR-422b
0.44
4.6E-02
mmu-miR-449b
-1.37
1.6E-03
mmu-miR-199a*
0.50
7.7E-03
mmu-miR-805
-1.01
7.5E-03
mmu-miR-25
0.51
1.6E-02
mmu-miR-706
-0.98
3.1E-03
mmu-miR-27b
0.56
5.1E-03
mmu-miR-467a
-0.88
2.8E-02
mmu-miR-182
0.56
1.8E-02
mmu-miR-696
-0.83
7.1E-03
mmu-miR-30a-3p
0.59
2.2E-02
mmu-miR-667
-0.66
2.3E-02
mmu-miR-10a
0.70
7.1E-03
mmu-miR-690
-0.28
1.7E-02
mmu-miR-152
0.70
2.3E-02
mmu-miR-18
0.29
3.7E-02
mmu-miR-1
0.77
7.1E-03
mmu-miR-143
0.34
2.3E-02
mmu-miR-7
1.06
4.9E-03
Список значительно нерегулируемых микроРНК в желудочном неоплазий из гастрин
нокаутных мышей по сравнению с дикого типа.
Таблица 2 микроРНК дерегулирование в h.pylori
инфицированных тканей
имя микроРНК

Fold change

p-value

mmu-miR-122a
-3.247
0.000788
mmu-miR-449b
-0.879
0.045214
Список значительно нерегулируемых микроРНК в мышей дикого типа антрума, инфицированных H. Pylori
по сравнению с неинфицированным антрума.
МикроРНК-449 блокирует прогрессию клеточного цикла и вызывает старение
Продемонстрировав вниз регулирование MIR-449 выражение в рака желудка мы хотели исследовать эффект повторного выражения микроРНК-449 в желудочном линиях раковых клеток. Интересно никакой заметной экспрессии семейства микроРНК-449 не был обнаружен через панель желудочных клеточных линий, включая SNU638, SNU5, SNU216, SNU601 и MKN74 Укрепляющая понятие микроРНК-449, имеющих опухоль-подавляющей функции (данные не показаны). Семейство микроРНК-449 состоит из микроРНК-449а и б у людей и микроРНК-449а, б и у мышей. Интересно, что они разделяют ту же последовательность семян как микроРНК-34 семьи и, следовательно, как ожидается, регулировать перекрытие когорты генов-мишеней (рис 2а). Для оценки функции микроРНК-449 в желудочном клеточных линиях мы вновь введены MIR-449b в SNU638 и MKN74 клеток. По сравнению с отрицательными микроРНК контроля, повторное введение микроРНК-449b сильно влияет на пролиферацию SNU638 клеток (рисунок 2b) и визуальный осмотр клеток, указанных индукции апоптоза и клеточного старения (рисунок 2в, и дополнительный файл 1, рисунок S2). Цитометрический анализ Пропидиум йодида окрашенных клеток, трансфицированных MIR-449b показал G <суб> 1 накопление через 48 часов после трансфекции, а затем через 72 часа после трансфекции накоплением клеток в суб G <югу> 1 фракция наводит на мысль о клетке смерть (фигура 2d). Индукции клеточного старения была подтверждена кислой бета-гал окрашивания с использованием микроРНК-34а в качестве положительного контроля микроРНК (рисунок 2e). Чтобы исключить строки специфические эффекты клеток, функциональные последствия микроРНК-449 реинтродукции с точки зрения остановки клеточного цикла, были проверены в MKN74 клетках (дополнительный файл 1, рисунок S3). Таким образом, повторное введение MIR-449 отрицательно влияет на размножение желудочных линий раковых клеток, одновременно с индукцией апоптоза и старении в соответствии с микроРНК-449, имеющих опухолевые подавляющих функций. Рисунок 2 микроРНК-449 является частью семейства микроРНК-34 и ингибирует клеточную пролиферацию. A - микроРНК-449 является частью микроРНК-34 семейства и является эволюционно консервативными. B - микроРНК-449 повторное введение в желудочном клеточных линий человека (SNU638) ингибирует пролиферацию клеток (красная линия) по сравнению с зашифрованным контролем (синяя линия) и микроРНК-146 управления (черная линия). Усы представляют собой S.D. C - Визуальный контроль ингибирования пролиферации клеток и стареющих, как фенотипа при микроРНК-449 повторного введения в SNU638 клеток (нижняя панель) по сравнению с зашифрованным контроля трансфекции (верхняя панель). D - FACS анализ клеточного цикла, показывающий суб-G1 накопление SNU638 клеток через 72 часа после MIR-449 реинтродукции (правая гистограмма) по сравнению с зашифрованным контроля трансфекции (левая гистограмма) В таблице показано накопление клеток в G1 фракции при MIR-449 ре -внедрение по сравнению с зашифрованным контролем РНК через 48 часов после трансфекции, с последующим переходом к югу G1 фракции на 72 часов после трансфекции указывающего гибели клеток. E - стареющие фенотип SNU638 клеток на MIR-449 и микроРНК-34а положительного контроля повторного введения показано путем кислотного анализа β-гал по сравнению с РНК зашифрованным управления
Совместная последовательность семеноводства MIR-449b и микроРНК-34а вызывают высоко. коррелируется выражение меняет
чтобы охарактеризовать стенограммы контролируемых MIR-449 и увидеть, если микроРНК-449 регулирует различные стенограммы, чем микроРНК-34а, профили экспрессии SNU638 клетки исследуют через 24 часа после трансфекции MIR-449b или микроРНК-34а и дифференцированно выраженные транскрипты идентифицированы. Мы обнаружили, что с предсказанными мРНК целевых сайтов микроРНК (7 семян мерного участка) в 3'UTR были значительно понижающей регуляции по сравнению с прогнозируемыми без мРНК сайтов-мишеней после трансфекции MIR-449b (р &ЛТ; 1.2e-70, двумя хвостами Уилкоксона тест суммы рангов), (Дополнительный файл 1, рисунок S4a). мРНК предсказав микроРНК семян целевых участков в кодирующих областях также были обнаружены значительно быть понижающей регуляции (р &лт; 9.9e-25), в то время как с сайтами мРНК в 5'UTRs были лишь незначительно понижающей регуляции (р &л; 5.3e- 2). Изменения экспрессии, вызванные трансфекцией зрелого MIR-449b и микроРНК-34а сильно коррелировали несмотря расхождения зрелых последовательностей за пределами региона семян (Пирсона коэффициент корреляции R = 0,94, р = 0), (дополнительный файл 1, рисунок S4B). Мы исчерпывающе оценили все олигонуклеотиды (слов) длины 5-7 для корреляции с понижающей регуляции после MIR-449b и микроРНК-34а трансфекцией (см методы). В соответствии со многими предыдущими исследованиями, этот анализ показал /449b сайт семян совместно микроРНК-34а в качестве 3'UTR слова наиболее коррелировало с понижающую регуляцию в двух экспериментах (дополнительный файл 1, рисунок S4C).
МикроРНК-449 регламентирует многочисленные контроллеры клеточного цикла
профили экспрессии были использованы для идентификации дифференцированно выраженных транскриптов в клетках, трансфицированных MIR-449b или управления (дополнительный файл 1, таблица S2). Анализ активация пути на основе дифференциально регулируемых транскриптов показывает, что микроРНК-449 в основном управляет транскриптов, кодирующих белки, участвующие в реакциях повреждения клеток, контроль клеточного цикла, воспаления и путей рака (рис 3а). Сосредоточение на множестве предполагаемых генов-мишеней с хорошо установленными ролями в tumourigenesis, мы подтвердили понижающую регуляцию с помощью микроРНК-449 встретил прото онкоген (MET
), циклин зависимой киназы 6 (CDK6)
, geminin (GMNN )
, myelocytomatosis вирусные онкогены гомолог (MYC)
, Sirtuin 1 (SIRT1
) и гистондеацетилазу 1 (HDAC 1)
на уровне транскриптов (рисунок 3b). Вестерн-блот-анализ подтвердил способность MIR-449 к понижающей регуляции Met, GMNN, MYC, SIRT1, циклин E2 (CCNE2) и HDAC1 на уровне белка в той же степени, что достигается за счет повторного введения микроРНК-34а (рисунок 3в). Для подмножества генов-мишеней, в том числе MET
, GMNN, CCNE2
, SIRT1
и HDAC1
, мы подтвердили прямое взаимодействие MIR-449 с геном-мишенью 3 'UTR с использованием люциферазы (рисунок 3d ). Рисунок 3 микроРНК-449 предназначается для генов клеточного цикла контроллера. A - Изобретательность Тропинка анализа (МПА) нерегулируемых генов при микроРНК-449 повторного введения в SNU638 клеток с обогащением для путей категории гена рака, гибели клеток и клеточного цикла среди других. B - КПЦР проверка Affymetrix массивов, показывающий понижающую регуляцию MET
, CDK6
, GMNN
, MYC
и HDAC1
на микроРНК-449 реинтродукции по сравнению с яичницей контрольной РНК. C - Вестерн-блот проверка понижающей регуляции генов при микроРНК-449 повторного введения в SNU638 клеток по сравнению с яичницей контрольной РНК. Винкулина (VCL) и тубулина бета (Tubb) были использованы в качестве контроля загрузки D - проверка прямого и функционального связывания мишени с использованием люциферазы конструкции, удерживающие дикие 3'UTRs типа и мутантных 3'UTRs (две мутации в-449 микроРНК сайта связывания) * указывает на статистическую значимость в экспрессии люциферазы между 3'UTRs дикого типа, трансфицированных miR449a /б по сравнению с РНК вскарабкался контроль, # указывает на статистическую разницу в экспрессии люциферазы между дикими 3'UTRs типа по сравнению с мутантным 3'UTRs, трансфицированных MIR-449а и зер- 449b. "Нс" не значимая величина р > 0.05, "*" или "#" значительный 0,01 &л; Значение р &л; 0.05, "**" или "##" очень важно 0,01 &л; Значение р &л; 0,001, "***" или "###" чрезвычайно значительное значение р &л; 0,001
Следовательно, микроРНК-449 непосредственно нацелен на регуляторных генов клеточного цикла в соответствии с функцией супрессора и с арестом клеточного цикла наблюдается при MIR-449 повторного введения в линиях раковых клеток.
МикроРНК-449 индуцирует экспрессию р53, но не регулируется p53
Как микроРНК-34а ранее было установлено, функционирует ниже по потоку от р53 [30-33], мы проанализировали, если также микроРНК-449а /б были связаны с р53. Кроме того, это было спровоцировано наличием предполагаемого участка связывания p53 10 кб вверх по течению от человеческого MIR-449 (данные не показаны). Поэтому мы индуцированное р53 повреждения ДНК с помощью УФ или 5-фторурацил (5-ФУ) в четырех различных системах, HCT116 и MEF типа и p53 нокаутных клеток дикого (дополнительный файл 1, рисунок S5A). Тем не менее, никаких существенных изменений в экспрессии микроРНК-449 не был обнаружен после того, как р53 пути активации (дополнительный файл 1, рисунок S5B). В заключение, мы не нашли никаких доказательств того, что микроРНК-449 является транскрипционный мишенью р53. С другой стороны, мы обнаружили, что микроРНК-449а /б способен индуцировать активацию р53, активацию генов отклика р53, такие как р21 и индукции апоптоза, о чем свидетельствует расщепление каспазы 3 (CASP3) и поли (АДФ-рибоза ) полимеразы 1 (ППА) (рисунок 4). На пути к пониманию механизма, с помощью которого микроРНК-449 делает это мы исследовали влияние микроРНК-449 на SIRT1 и HDAC1. SIRT1 и HDAC1 являются деацетилазы, которые тормозят, в частности, активация р53 и MIR-34 было показано, чтобы репрессировать SIRT1 [34]. Мы подтверждено специфическое связывание MIR-449 с SIRT1 и HDAC1 использованием 3'UTR люцифераза анализа (рисунок 3d). Рисунок 4 микроРНК-449 активирует p53 путь. Вестерн-блот-анализ, показывающий увеличение белка р53 при MIR-449 и положительного контроля микроРНК-34а повторное введение в SNU638 клеток по сравнению с РНК вскарабкался контроля, а также активацию р53 вниз по течению мишени p21 и апоптоз маркеров расщепленных CASP3 и ППА. Винкулина (VCL) и тубулина бета (Тубб) использовали в качестве контролей нагрузки.
Следовательно, мы полагаем, что микроРНК-449 индуцирует апоптоз путем ингибирования гистона дезацетилазы HDAC1 и SIRT1, что приводит к активации р53 затрагивающего пути, таким образом, индукция маркеров апоптоза расщепляется CASP3 и ППА.
микроРНК-449 подавляется при раке желудка человека
Для того, чтобы оценить важность микроРНК-449 в злокачественных опухолей человека мы в следующий раз исследовали экспрессию микроРНК-449 в 10 желудочных биопсий рака. Важно отметить, что мы нашли как микроРНК-449а и Ь, значительно понижающей регуляции или отсутствует в 8 из 10 первичных злокачественных опухолей желудка. Кроме того, экспрессия микроРНК-449а и б кажутся совместно регламентировано (рисунок 5а). Мы не нашли никакой корреляции между снижением экспрессии микроРНК-449 и клинических характеристик рака (рисунок 5б). Анализ геномной ДНК из опухолей не обнаружено никаких доказательств потери или гипер-метилирование микроРНК-449 локусов с использованием анализа кривой плавления метилирования специфических (MS-MCA), указывающего транскрипционный понижающую регуляцию экспрессии (данные не показаны). Следовательно, в соответствии с данными из двух мышиных моделях воспаления желудка и гиперплазии, экспрессия микроРНК-449 подавляется при раке желудка человека. Рисунок 5 микроРНК-449 вниз регулируется при раке желудка человека. Анализ КПЦР (верхняя панель), показывая вниз регуляции экспрессии микроРНК-449 в 8 желудка тканей рака по сравнению с микроРНК-449 в выражении выборки из контрольной группы (пунктирная линия). U44 был использован в качестве эндогенного контроля. Таблица показывает клиническую информацию пациентов (нижняя панель). "Нс" не значимая величина р > 0,05, "*" значительный 0,01 &л; Значение р &л; 0.05, "**" очень важно 0,01 &л; Значение р &л; 0,001, "***" чрезвычайно важным значение р &л; 0.001
Обсуждение
Рак желудка является весьма смертоносным злокачественность с более чем 21500 новых случаев каждый год только в Соединенных Штатах [35]. Заболевание часто выявляется поздно, и уровень 5-летней выживаемости, следовательно, ниже 20% [36]. Поэтому важно понимать этиологию и прогрессированию стадии заболевания. Важность бактериальных, экологических и принимающих генетических факторов риска в желудочном канцерогенезе были изучены, однако меньше известно о молекулярном прогрессирования заболевания [37, 38]. Среди прочего, инактивация р53 путь сообщается в 30-60% от рака желудка [39, 40], и недавние исследования показывают, H. Pylori
прямой модуляции гена р53 или его вниз по течению цели [41]. Другим распространенным изменением при раке желудка является возмущение контроля клеточного цикла через выражение над циклин E1, которая связана с агрессивностью опухоли и метастазов в лимфатических узлах [42, 43].

• Влияние N-ацетил-L-цистеин настой на уровни цитокинов и желудочного intramucosal рН во время тяжелой sepsis
• Доброкачественные заболевания желудочно-колики свищ в женщине представление с потерей веса и перемежающейс…