miR-449 remt celproliferatie en down-gereguleerd bij maagkanker

miR-449 remt celproliferatie en down-gereguleerd bij maagkanker
Abstracte achtergrond
Maagkanker is de vierde meest voorkomende kanker in de wereld en de tweede meest voorkomende oorzaak van kanker gerelateerde sterfgevallen. De ontwikkeling van maagkanker is voornamelijk geassocieerd met H. pylori infectie
leidt tot aandacht pathologie studies van bacteriën en omgevingsfactoren, en in mindere mate op de mechanistische ontwikkeling van de tumor. MicroRNAs zijn kleine niet-coderende RNA-moleculen die betrokken zijn bij post-transcriptionele genregulatie. Zij blijken genen betrokken bij diverse biologische functies en veranderingen in microRNA expressie zijn verbonden met de pathogenese van vele kwaadaardigheden regelen. De huidige studie is gericht op het identificeren van microRNAs die betrokken zijn bij de maag carcinogenese en hun mechanistische relevantie verkennen van de karakterisatie van targets.
Resultaten
Invitrogen nCode miRNA microarrays geïdentificeerd miR-449 moet worden verlaagd in 1-jarige Gastrine
KO muizen en in H. pylori
besmette maag weefsels in vergelijking met weefsel van wild type dieren. Groei van gastrische cellijnen overexpressie miR-449 werd geremd door 60% in vergelijking met controles. FACS celcyclus analyse van miR-449 overexpressie cellen vertoonden een significante toename in de sub-G 1 fractie indicatief voor apoptose. ß-Gal assays aangegeven een verouderend fenotype van de maag cellijnen overexpressie miR-449. Affymetrix 133v2 arrays geïdentificeerd GMNN
, BMO, CCNE2, SIRT1 Kopen en CDK6
als miR-449 targets. Luciferase assays werden gebruikt om GMNN
, BMO
, CCNE2 Kopen en SIRT1
directe targets te bevestigen. We tonen ook aan dat miR-449 overexpressie geactiveerd p53 en p21 downstream doelgenen evenals de apoptose merkers gekliefd en CASP3 PARP. Belangrijk is qPCR analyses
In deze studie toonde een verlies van miR-449-expressie in menselijke klinische maag-tumoren in vergelijking met normale weefsels.
Conclusies, documenteren we een verminderde expressie van miR-449 in Gastrine
KO muizen en verder bevestigd haar verlies in de menselijke maag-tumoren. We onderzochten de functie van miR-449 door het identificeren van de directe doelstellingen. Verder tonen we aan dat miR-449 induceert senescentie en apoptose door het activeren van het p53 route. Achtergrond
Maagkanker is een van de vijf meest voorkomende kanker in de wereld en de tweede meest voorkomende oorzaak van kankersterfte [1] . Het is vooral, maar niet uitsluitend, door H. pylori infectie
[2] als niet alle H. Pylori
geïnfecteerden tumoren ontwikkelen [3]. Andere factoren betrokken bij het ontstaan ​​van maagkanker omvatten de mate en de aard van de ontstekingsreactie [2] en de niveaus van het hormoon gastrine
[4, 5]. Verschillende studies hebben aangetoond dat zowel hypergastrinemia [6, 7] en het ontbreken van gastrine [5] bijdragen tot de pathogenese van maagkanker. Achloorhydrie is een gemeenschappelijk kenmerk van muismodellen vatbaar voor het ontwikkelen metaplasie en kanker [6, 8, 9]. Gastrine
knockout muizen zijn achloorhydrie [10], ten gunste van een bacteriële overgroei maag [11, 12], en chronische bacteriële infecties maag leiden tot maag metaplasie wat zich kan ontwikkelen tot maagkanker [6, 12].
Sinds hun ontdekking microRNAs, zijn gevonden betrokken bij een zeer breed scala van normale en pathologische processen [13]. MicroRNAs oefenen hun regulerende functies posttranscriptionally door binding aan gedeeltelijk complementaire sequentie motieven overwegend 3 'UTR van doelwit mRNA resulteert in mRNA destabilisatie en translationele repressie [14]. Vanuit biologisch oogpunt zijn microRNA uitdagend objecten te bestuderen en mocht cohorten van doelgenen, die moeilijk geïdentificeerd regelen. Vanuit een therapeutisch oogpunt, microRNAs zijn zeer interessant omdat verschillende studies de kracht van microRNA als biomarkers en de eerste preklinische studies hebben aangetoond hebben aangetoond dat microRNAs kan therapeutisch worden gericht in vivo [15].
Profileren studies hebben aangetoond microRNA deregulering in een breed spectrum van ziekten waarbij alle belangrijke kanker [16]. MicroRNA waarschijnlijk van invloed tumorverwekkend processen op twee niveaus. Ten eerste zijn verschillende studies pro-oncogene of tumor-onderdrukkende rol van de individuele microRNAs stevig koppelen van deze kanker etiologie opgericht als geïllustreerd door miR-155, miR-10b en miR-21 [17-19]. Ten tweede, het microRNA regelgeving zodanig lijkt tumor onderdrukkende functies genetische ablatie van belangrijke microRNA biogenese factoren, zoals Dicer, sterk toenemen kanker gevoeligheid [20] en functieverlies mutaties geïdentificeerd in belangrijke microRNA verwerkingsfactoren bij menselijke tumoren [21-23].
in deze studie gaan we in op het belang van microRNA's bij maagkanker te profiteren van de Gastrine
knockout muismodel en H. pylori
infectie van wild-type muizen. We identificeren miR-449 als significant neerwaarts gereguleerd of verloren in muismodellen van maagkanker en in primaire humane maagtumoren. Identificatie van mRNA targets blijkt dat deze microRNA waarschijnlijk oefent tumor onderdrukkende functies door middel van de gezamenlijke regeling van een cohort van kanker-geassocieerde celcyclus regelgevers waaronder BMO, GMNN, CCNE2, SIRT1, en HDAC1.
Methods
Muizen
Drie verschillende leeftijdsgroepen (12-16 weken, 1 jaar of 1 ½ jaar) van wild-type (wT) of Gastrine
knock-out (KO) muizen werden gebruikt. Alle muizen werden op een gemengde 129 /svj, C57BL /6J achtergrond, teruggekruist ten minste vier keer C57BL /6J [12]. De muizen werden onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden gehouden en gecontroleerd op basis van de Federation of European Laboratory Animal Science Associations aanbeveling [24] met 12 uur licht, 12 uur donker cycli.
H. pylori
infectie
C57BL6 /J-muizen (n = 10) werden geïnoculeerd met een niet-muis-aangepaste kloon van H. Pylori
67:21 stam, oorspronkelijk geïsoleerd uit een antrale biopsie verkregen uit een Zweedse vrouw met maagzweer. De stam is VacA + en bevat de volledige Cag pathogeniteit eiland (PAI) met genetische stabiliteit in de Cag PAI [25]. De muizen werden om de dag (driemaal) geïnoculeerd gedurende 5 dagen. DNA werd geëxtraheerd en geanalyseerd op de aanwezigheid van Helicobacter soort, volgens een semi-nested polymerasekettingreactie-denaturerende gradiënt gelelektroforese assay, specifiek voor de genus Helicobacter, zoals eerder [26] beschreven. Een gelijkaardige groep van geïnfecteerde C57BL6 /J muizen werden als controles gebruikt. Ondernemingen De magen van alle muizen werden ontleed in fundus en antrum voorafgaand aan RNA-extractie. Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Deense Animal Welfare Committee (2005 /562-40) en de Danish Forest and Nature Agency (20010077355/6).
Muizen antrum secties
Muizen door cervicale dislocatie werden geofferd. Antrum werd verwijderd, voorzichtig in ijskoud PBS gewassen, bevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C tot RNA-extractie.
Klinische monsters geanalyseerd
biopten van maagkanker en de aangrenzende normale weefsels werden verkregen van patiënten een operatie ondergaan voor maagkanker bij de afdeling Gastro-intestinale chirurgie, Rigshospitalet. De opname vond plaats in juli-december 2008 en alle patiënten ontvangen ondertekend, informed consent (ethische commissie goedkeuring H-B-2008-049) en de Deense bureau voor gegevensbescherming (2008-41-2138). De biopten werden RNAlater (Ambion) in de operatiekamer gebracht en vervolgens bij -80 ° C tot RNA-extractie bevroren.
RNA-extractie en analyses qPCR
RNA werd geëxtraheerd met behulp TRIzol (Invitrogen) volgens de fabrikant. miRNA expressie profiel werd beoordeeld met behulp van Taqman miRNA assays (Applied Biosystems) voor HSA /mmu-miR-449a en b, HSA /mmu-miR-34a, b en c en rnu44 of HSA /mmu-miR-191. Primersequenties voor Affymetrix targets validatie vermeld in toegevoegde bestand 1, tabel S1.
Celkweek
SNU638 en MKN74 werden gekweekt in RPMI-1640 (Gibco) met 10% FBS (Hyclone), 100 U /ml penicilline en 100 ug /ml streptomycine (Invitrogen) en geïncubeerd bij 37 ° C in 5% CO 2. HCT116-cellen (wt en p53 - /- werden gekweekt in McCoy's 5A (Gibco) met 10% FBS (Hyclone), en 100 U /ml penicilline en 100 ug /ml streptomycine (Invitrogen) en geïncubeerd bij 37 ° C in 5% CO <. sub> 2 HEK293 en MEF cellen (wt en p53 - /-) werden gekweekt in DMEM (Gibco) met 10% FBS (Hyclone), 100 U /ml penicilline en 100 ug /ml streptomycine (Invitrogen) en geïncubeerd bij 37 ° C met 5% CO 2.
miRNA precursoren en siRNA
miRNA voorlopers werden gekocht van Ambion, HSA-miR-449a (PM11521), HSA-miR-449b (PM11127) en HSA-miR-34a ( PM11030).
Celgroei analyses
SNU638 cellen werden gezaaid in 24-well uitgeplaat en de volgende dag met 50 nM siRNA of miRNA duplex met gebruik van Lipofectamine 2000 (Invitrogen). cellen werden gefixeerd op aangegeven tijdstippen in 4% paraformaldehyde , gekleurd met een 0,1% kristalviolet oplossing en opnieuw gesuspendeerd in 10% azijnzuur. Monster absorptie werd gemeten bij 620 nm.
Celcyclus FACS analyses
SNU638 en MKN74 cellen werden geënt bij 2 x 10 6 cellen per 10 cm plaat en getransfecteerd met 50 nM miRNA duplex (Ambion) met behulp van Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Cellen werden geoogst 48 en 72 uur na transfectie gekleurd DNA gehalte met behulp van propidiumjodide (PI) en geanalyseerd op een FACS Calibur flowcytometer (Becton-Dickinson). In het kort werden cellen geoogst door behandeling met trypsine en eenmaal met PBS alvorens de dienst overnacht in 70% EtOH gewassen. Om het DNA te kleuren cellen werden gepelleteerd, geresuspendeerd in 100 gl EtOH en gekleurd gedurende 1 uur met 300 pi PI oplossing (0,05 mg /ml PI, 20 ug /ml RNAse A in 0,1% BSA).
Senescentie analyses
SNU638 cellen werden gezaaid met 400.000 cellen per 6-well-plaat en getransfecteerd met 50 nM miRNA duplex (Ambion) met behulp van Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Vier dagen na transfectie werden de cellen gewassen in PBS en gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in 2% formaldehyde /0,2% glutaraldehyde gefixeerd. Cellen werden tweemaal gewassen in PBS pH 6,0 alvorens te worden gekleurd met verse senescence geassocieerde β-Gal kleuroplossing (1 mg /ml 5-broom-4-chloor-3-indolyl-βD-galactoside (X-gal), 0.12mm K 3FE [CN] 6, 0.12mm K 4Fe [CN] 6, 1mM MgClz 2 in PBS pH 6,0) gedurende de nacht bij 37 ° C zonder CO 2 supply . De cellen werden eenmaal in PBS (pH 6,0) onder de microscoop Antilichamen en western blot gewassen en geobserveerd.
Analyses
SNU638 werden geënt bij 2 × 10 6 cellen per 10 cm plaat, tweemaal getransfecteerd op twee opeenvolgende dagen met 50nM miRNA duplexappartementen met behulp van Lipofectamine 2000 volgens de fabrikant (Invitrogen). Cellen werden geoogst door behandeling met trypsine, eenmaal gewassen met PBS en gelyseerd in RIPA buffer (150 mM NaCl, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS, 1% Igepal, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM EDTA) aangevuld met 1 mM DTT, 1 mM Pefabloc, 1mM NaV3, 10mM NaF en 1X volledige mini proteaseremmer cocktail tabletten. 25 ug eiwit /baan werden gescheiden op 4-20% NuPAGE Bis-Tris-gels (Invitrogen) en overgebracht naar een nitrocellulosemembraan. Primaire antilichamen gebruikt werden, waren als marktgericht (Cell Signal 4560), MYC (Cell Signal 9402), GMNN (Santa Cruz Sc-53923), VCL (Sigma V9131), TP53 (Santa Cruz Sc-126), CDKN1A (Santa Cruz Sc-6246) , CDK6 (Santa Cruz Sc-177), HDAC1 (Santa Cruz Sc-7872), CCNE2 (Cell Signal 4132), TUBB (Abcam ab11304), PARP (Cell Signal 9542) en gekloofde CASP3 (Cell Signal 9661).
microarray analyse
Kleine RNAs (< 200 nt) werden geïsoleerd met Invitrogen PureLink miRNA Isolatie Kit van fundus en antrale weefsel van 1) gastrine
KO muizen en leeftijd en geslacht vergelijkbare C57BL6 /J controlemuizen en 2) C57BL6 /J muizen geïnfecteerd met H. pylori geïnfecteerde Kopen en leeftijd en geslacht vergelijkbare C57BL6 /J controlemuizen (n = 4 per groep). De kwaliteit van geïsoleerde kleine RNA's werd bepaald met behulp van de kleine RNA-test op een Agilent Bioanalyzer. 500 ng van kleine RNA werd gelabeld met Genisphere FlashTag Kit en gehybridiseerd met Invitrogen nCode Multi-Species miRNA microarray V2 in een Maui hybridisatie station. Verwerkte objectglaasjes werden gescand in een Agilent DNA microarray scanner. Resulterende beelden werd geanalyseerd en de verhouding van het mediaan genormaliseerd gebruik GenePix Pro 6.0. Biologische vier herhalingen werden voor elke vergelijking. De monsters werden gehybridiseerd tot vier arrays in een dual kleurstof swap microarray experimenteel ontwerp. BRB ArrayTools werden gebruikt voor voudige verandering en statistische berekeningen. MiRNA gekozen gegevens uit de array analyse gevalideerd met TaqMan real-time PCR assays miRNA. De gegevens zullen op ArrayExpress bij acceptatie.
MRNA arrays
SNU638 werden met 50 nm van miR-34a en miR-449b duplexen met Siglo siRNA gebruikt als negatieve controle worden gedeponeerd. Totaal RNA werd geëxtraheerd 24 uur na transfectie met behulp TRIzol reagens. Affymetrix microarray-analyse (HG-U133 Plus 2.0 mens) werd uitgevoerd bij de microarray Center, Rigshospitalet, Copenhagen University Hospital. Experimenten werden in drievoud of viervoud ofwel. De gegevens zullen op ArrayExpress bij de aanvaarding worden neergelegd.
Vectoren constructie en reporter assays
De 3'UTRs van HDAC1
, SIRT1
, BMO
, GMNN Kopen en CCNE2
Holding miR-449 bindende sites werden stroomafwaarts van de luciferase reporter in PMIR-REPORT vector-systeem (Ambion) gekloond. QuickChange plaats-gerichte mutagenese kit (Stratagene) werd gebruikt om twee puntmutaties induceert in het zaad gebied. Mutagenese primers sequenties zijn opgenomen in de aanvullende bestand 1, tabel S1.
HEK293-cellen werden gezaaid in 96 well platen en getransfecteerd met 20 nM miRNA voorloper of scrambled siRNA controle, 20-50ng van luciferase vector (PMIR-verslag) en 5 ng van Renilla vector (pRL-TK) met gebruik van Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Cellen werden geoogst 24 uur na transfectie en luciferaseactiviteit werd gemeten Dual-Glo luciferase assay (Promega).
Microarray analyse
microarray gegevens werden verwerkt met de 'affy' verpakking Bioconductor [27]. Probe set intensiteiten werden samengevat en kwantiel genormaliseerd met behulp van de Bioconductor RMA en VSN-pakketten. Differentiële expressie werd bepaald per probeset met een t-test. Probe sets werden toegewezen aan Ensembl transcripten (versie 49) met behulp van afbeeldingen voorzien aan Biomart. Probesets dat toegewezen aan twee verschillende Ensembl genen werden weggegooid.
Evalueren global down-regulatie van microRNA target genen Ondernemingen De 3'UTRs, 5'UTRs en coderende sequenties van de transcripten werden gescand voor het afstemmen van 6mer, 7mer en 8mer miRNA zaad sites (een aanvulling op positie 2-7, 2-8 en 2-9 van de miRNA). Globale analyse van miRNA doelwit down-regulatie werd geëvalueerd met behulp van de langste 3'UTR sequentie per gen om vertekening geïntroduceerd door genen met vele transcript isovormen voorkomen. We weggegooid transcripten met 3'UTR sequenties korter dan 50 nt. Wereldwijd beoordelen of miRNA doelwitgenen werden omlaag gereguleerd na miRNA transfectie we de nulhypothese dat de verandering expressie verdeling van miRNA targets (een 7mer doelplaats) gelijk aan de distributie van alle tot expressie gebrachte genen zonder voorspeld doelplaatsen met de was getest niet-parametrische Wilcoxon rank-sum-test. Een soortgelijke aanpak werd gebruikt om down-regulatie van genen met miRNA doelplaatsen in coderende gebieden en 5'UTRs van mRNA's te evalueren.
Uitputtende statistische evaluatie van woorden correleerde met down-regulatie
We gebruikten een eerder gepubliceerde non-parametrische -ranking op basis statistiek uitputtend beoordeling van de correlatie van woord gebeurtenissen in 3'UTRs en de verandering in genexpressie na miRNA transfectie [28, 29]. Genen zijn gesorteerd op expressie verandering geïnduceerd door transfectie van miR-34a en miR-449b, en de correlatie met down-regulatie werd getest op alle woorden met een lengte van 5-7 (N = 21 504).
Statistische tests
studenten t-test met een correctie van Welch's.
Resultaten
miR-449b is vastgelegd geregeld in het antrum van beide Gastrine
KO muizen en H. pylori
geïnfecteerde muizen
Gastrine
knockout muizen achloorhydrie zijn met een neiging tot het ontwikkelen antrale hyperplasie en maag adenomen tijd (figuur 1) [6, 12]. Om microRNAs gedereguleerd tijdens de ontwikkeling van maagkanker identificeren, onderzochten we miRNAs expressieprofielen in maag neoplasieën van gastrine
knockout muizen, waarbij miRNA microarrays. Zoals getoond in tabel 1, werden 20 microRNA significant gedereguleerd in knockout muizen in vergelijking met wildtype nestgenoot controles, drie miRNAs verschillen meer dan tweevoudig, miR-7 wordt opgereguleerd en miR-709 en miR-449b worden down-gereguleerd in het antrum van Gastrine
knockout muizen in vergelijking met wild type. Om verder te bevestigen miR-449 deregulering in de maag de ontwikkeling van kanker, onderzochten we de expressie in wild type muis antrum weefsels die besmet zijn met H. pylori
. Interessant is dat miRNA arrays toonde een specifieke down-regulatie van miR-449b in H. pylori
geïnfecteerde muizen (tabel 2 en Aanvullende bestandsinformatie 1, figuur S1). Figuur 1 Old Gastrine knockout muizen ontwikkelen maag adenomen. Antrum secties geïsoleerd 12-16 weken oude muizen (linker paneel), 12 tot 18 maanden oude muizen (middelste paneel) en ouder dan 18 maanden muizen (rechter paneel), van wild-type (bovenste paneel) en Gastrine
knockout muizen (onderste paneel). Secties tonen adenoom ontwikkeling in antrum weefsels in de Gastrine
knockouts in vergelijking met de wilde soorten.
Tabel 1 miRNAs gedereguleerd in Gastrine
knockout muizen
miRNA Name
Log2-voudig
p-waarde
miRNA Name

Log2-fold

p-value

mmu-miR-709
-1.73
7.0E-06
mmu-miR-422b
0.44
4.6E-02
mmu-miR-449b
-1.37
1.6E-03
mmu-miR-199a*
0.50
7.7E-03
mmu-miR-805
-1.01
7.5E-03
mmu-miR-25
0.51
1.6E-02
mmu-miR-706
-0.98
3.1E-03
mmu-miR-27b
0.56
5.1E-03
mmu-miR-467a
-0.88
2.8E-02
mmu-miR-182
0.56
1.8E-02
mmu-miR-696
-0.83
7.1E-03
mmu-miR-30a-3p
0.59
2.2E-02
mmu-miR-667
-0.66
2.3E-02
mmu-miR-10a
0.70
7.1E-03
mmu-miR-690
-0.28
1.7E-02
mmu-miR-152
0.70
2.3E-02
mmu-miR-18
0.29
3.7E-02
mmu-miR-1
0.77
7.1E-03
mmu-miR-143
0.34
2.3E-02
mmu-miR-7
1.06
4.9E-03
Lijst van aanzienlijk gedereguleerde miRNAs in de maag neoplasieën van Gastrine
Knockout muizen in vergelijking met wild type.
Tabel 2 miRNAs gedereguleerd in H. pylori
geïnfecteerde weefsels
miRNA naam
Fold change

p-value

mmu-miR-122a
-3.247
0.000788
mmu-miR-449b
-0.879
0.045214
Lijst van aanzienlijk gedereguleerde miRNAs in wild-type muizen antrum geïnfecteerd met H. pylori
in vergelijking met niet-geïnfecteerde antrum.
MiR-449 remt de voortgang van de celcyclus en induceert senescence
hebben aangetoond down-regulatie van miR-449 expressie in maagkanker wilden we het effect van opnieuw expressie miR-449 in maagkanker cellijnen onderzocht. Interessant geen merkbare expressie van miR-449 familie werd gedetecteerd in een panel van gastrische cellijnen waaronder SNU638, SNU5, SNU216, SNU601 en MKN74 ondersteunen van het begrip van miR-449 met tumor-onderdrukkende functies (gegevens niet getoond). De familie miR-449 bestaat uit miR-449a en b bij de mens en miR-449a, b en c in muizen. Interessant is dat ze delen dezelfde zaad volgorde als de miR-34 familie en worden vandaar naar verwachting overlappende cohorten van target genen (figuur 2a) te reguleren. Om de functie van miR-449 in de maag cellijnen beoordelen we opnieuw geïntroduceerd miR-449b in SNU638 en MKN74 cellen. In vergelijking met de negatieve controle microRNAs, herintroductie van miR-449b sterk van invloed op de verspreiding van SNU638 cellen (figuur 2b) en visuele inspectie van de aangegeven inductie van apoptose en cellulaire senescence (figuur 2c, en Aanvullende bestandsinformatie 1, figuur S2) cellen. Flow cytometrische analyse van propidiumjodide gekleurde cellen getransfecteerd met miR-449b vertoonden een G 1 accumulatie 48 uur na transfectie, gevolgd gedurende 72 uur na transfectie door accumulatie van cellen in de sub G 1 fractie suggereren cel dood (figuur 2d). De inductie van cellulaire veroudering werd bevestigd door zure beta gal kleuring gebruikt miR-34a als een positieve controle microRNA (figuur 2e). Om uit te sluiten cellijn-specifieke effecten, werden de functionele gevolgen van miR-449 herintroductie in termen van de celcyclus gecontroleerd MKN74 cellen (Extra-bestand 1, figuur S3). Aldus herintroductie van miR-449 negatief effect proliferatie van maagkanker cellijnen gelijktijdig met de inductie van senescentie en apoptose in overeenstemming met miR-449 met tumor onderdrukkende functies. Figuur 2 miR-449 behoort tot de familie miR-34 en remt celproliferatie. A - miR-449 maakt deel uit van de miR-34 familie en is evolutionair geconserveerd. B - miR-449 re-introductie in de menselijke maag cellijnen (SNU638) remt cel proliferatie (rode lijn) in vergelijking met een gecodeerde controle (blauwe lijn) en miR-146 control (zwarte lijn). Error bars vertegenwoordigt S.D. C - Visuele inspectie van celproliferatie inhibitie en veroudering-achtige fenotype van miR-449 re-introductie in SNU638 cellen (onderste paneel) in vergelijking met roerei transfectiecontrole (bovenste paneel). D - FACS celcyclus analyse waarin sub-G1 ophoping van SNU638 cellen 72 uur na miR-449 herintroductie (rechts histogram) in vergelijking met een vervormd transfectie controle (linker histogram) De tabel toont cel accumulatie in G1 fractie van miR-449 re -Inleiding vergeleken gecodeerde RNA 48 uur na transfectie, gevolgd door een verschuiving naar de sub-G1 fractie bij 72 uur na transfectie indicatief celdood. E - Ouder wordende fenotype van SNU638 cellen na miR-449 en miR-34a positieve controle herintroductie getoond door zure β-gal-test in vergelijking met RNA scrambled controle Ondernemingen De gezamenlijke zaad sequentie van miR-449b en miR-34a induceren hoogst. gecorreleerde expressie verandert Belgique om de transcripties gecontroleerd door miR-449 en karakteriseren om te zien of miR-449 regelt verschillende transcripten dan miR-34a, werden SNU638 cellen expressie profielen onderzocht 24 uur na transfectie van miR-449b of miR-34a en differentieel uitgedrukt transcripten geïdentificeerd. We vonden dat mRNA's met voorspeld miRNA doelplaatsen (7 mer zaad ter plaatse) in de 3'UTR waren significant down-gereguleerd in vergelijking met mRNA zonder doel kan worden voorspeld plaatsen na transfectie van miR-449b (p < 1.2e-70, tweezijdig Wilcoxon rank-sum test), (Extra file 1, figuur S4a). mRNAs hebben voorspeld miRNA zaad doelplaatsen in coderende gebieden waren ook significant worden neerwaarts gereguleerd (p < 9.9e-25), terwijl mRNAs met vestigingen in 5'UTRs slechts marginaal neerwaarts gereguleerd (p < 5.3e- 2). De veranderingen expressie geïnduceerd door transfectie van volwassen miR-449b en miR-34a waren sterk gecorreleerd ondanks divergentie van de rijpe sequenties buiten het zaad regio (Pearson's correlatiecoëfficiënt R = 0,94, p = 0), (Extra file 1, figuur S4B). We uitvoerig geëvalueerd alle oligonucleotiden (woorden) met een lengte van 5-7 voor de correlatie met down-regulatie na miR-449b en miR-34a transfectie (zie methoden). In overeenstemming met vele eerdere studies, deze analyse bleek de gedeelde miR-34a /449b zaad site als de 3'UTR woord meest gecorreleerd met down-regulatie in de twee experimenten (Extra-bestand 1, figuur S4C).
MiR-449 regelt tal van celcyclus controllers Ondernemingen De expressie profielen werden gebruikt om differentieel tot expressie transcripten te identificeren in cellen die met miR-449b of controls (Extra-bestand 1, tabel S2). Een pathway activatie analyse op basis van het differentieel gereguleerde transcripten toont aan dat miR-449 controleert voornamelijk transcripten die coderen voor eiwitten die betrokken zijn in celbeschadiging reacties, controle van de celcyclus, ontstekingen en kanker trajecten (figuur 3a). Focussen op een reeks van vermeende doelwit genen met gerenommeerde rollen in tumorgenese, we bevestigd neerwaartse regulatie van miR-449 of met proto-oncogen (BMO
), cycline-afhankelijke kinase 6 (CDK6)
, geminin (GMNN )
, myelocytomatosis virale oncogenen homoloog (MYC)
, sirtuïne 1 (SIRT1
) en histondeacetylase 1 (HDAC1)
op het transcript niveau (figuur 3b). Western blot analyses bevestigde het vermogen van miR-449 naar beneden te reguleren BMO, GMNN, MYC, SIRT1, cycline E2 (CCNE2) en HDAC1 op het eiwit niveau in een mate vergelijkbaar met die bereikt door herintroductie van miR-34a (figuur 3c). Voor een deel van de target genen, waaronder BMO
, GMNN, CCNE2
, SIRT1
HDAC1
, bevestigd we directe interactie van miR-449 met het doelwit-gen 3 'UTR met behulp van luciferase assay (figuur 3d ). Figuur 3 miR-449 richt celcyclus controller genen. A - Ingenuity Pathway Analysis (IPA) van gedereguleerde genen van miR-449 re-introductie in SNU638 cellen waaruit verrijking voor het gen categorieën kanker, celdood en celcyclus pathways onder anderen. B - qPCR validatie van Affymetrix arrays tonen down-regulatie van BMO
, CDK6
, GMNN
, MYC Kopen en HDAC1
op miR-449 re-introductie in vergelijking met gecodeerde RNA controles. C - Western blot validatie van-down gereguleerde genen op miR-449 re-introductie in SNU638 cellen in vergelijking met gecodeerde RNA controles. Vinculin (VCL) en tubuline beta (TUBB) werden gebruikt voor het laden of controles D - verificatie van de directe en functionele doel binding met behulp van luciferase constructen die wild type 3'UTRs en gemuteerd 3'UTRs (twee mutaties in miR-449 bindingsplaats), * geeft statistische significantie in luciferase-expressie tussen wild type 3'UTRs getransfecteerd met miR449a /b vergeleken met RNA scrambled controle, # geeft statistisch verschil in luciferase-expressie tussen wild type 3'UTRs vergeleken met mutant 3'UTRs getransfecteerd met miR-449a en buitenspiegels 449b. 'Ns' niet significant p-waarde > 0,05, "*" of "#" significant 0,01 < p-waarde < 0,05, "**" of "##" zeer belangrijk 0,01 < p-waarde < 0.001, "***" of "###" zeer significant p-waarde < 0.001
Vandaar dat miR-449 richt zich rechtstreeks celcyclus regulator genen consistent met een tumor suppressor functie en met de celcyclus waargenomen bij miR-449 re-introductie in kanker cellijnen.
MiR-449 induceert p53-expressie, maar wordt niet gereguleerd door p53
als miR-34a eerder werd gevonden stroomafwaarts van p53 [30-33] om te functioneren, analyseerden we als ook miR-449a /b werden gekoppeld aan p53. Dit werd verder gestimuleerd door de aanwezigheid van een vermoedelijke p53 bindingsplaats 10 kb stroomopwaarts van humane miR-449 (gegevens niet getoond). Daarom p53 geïnduceerd door DNA-beschadiging met UV of 5-fluorouracil (5FU) in vier verschillende systemen, HCT116 en MEF wildtype en p53 knockout cellen (aanvullende bestandsinformatie 1, figuur S5a). Echter, geen significante verandering in miR-449 expressie werd gedetecteerd nadat p53-route activering (Extra-bestand 1, figuur S5B). Tot slot, vonden we geen bewijs dat miR-449 is een transcriptie doelwit van p53. Aan de andere kant vonden we dat miR-449a /b kan activering van p53 activering van p53 respons genen zoals p21 en de inductie van apoptose zoals blijkt uit klieving van caspase 3 (CASP3) en poly (ADP-ribose ) polymerase 1 (PARP) (figuur 4). Naar het begrijpen van het mechanisme waarmee miR-449 doet dit het effect van miR-449 op SIRT1 en HDAC1 onderzocht. SIRT1 en HDAC1 zijn deacetylase remmen die onder andere is de activering van p53 en miR-34 bleek te onderdrukken SIRT1 [34]. We gevalideerd de specifieke binding van miR-449 op SIRT1 en HDAC1 gebruik 3'UTR luciferase assays (figuur 3d). Figuur 4 miR-449 activeert de p53-route. Western blot analyse die een verhoging van de p53-eiwit na miR-449 en positieve controles miR-34a herintroductie in SNU638 cellen vergeleken met RNA gecodeerde controle en een activering van het p53 downstream doelgenen p21 en apoptose merkers gekliefd CASP3 en PARP. Vinculin (VCL) en beta tubuline (TUBB) werden als controles laden.
Derhalve speculeren wij dat miR-449 induceert apoptose door remming van histon deacetylase HDAC1 en SIRT1 leidt tot de p53 route activatie dus de inductie van apoptose merkers gekliefd CASP3 en PARP.
miR-449 wordt neerwaarts gereguleerd in menselijke maagkanker
het belang van miR-449 in humane maligniteiten we vervolgens onderzocht de expressie van miR-449 in 10 maagkanker biopten evalueren. Belangrijk is, vonden we zowel miR-449a en b zijn aanzienlijk neerwaarts gereguleerd of afwezig is in 8 van de 10 primaire maagkanker. Verder is de expressie van miR-449a en b lijken co gereguleerd (figuur 5a) zijn. We hadden geen verband tussen de afname van miR-449 expressie en klinische kenmerken van de kanker (figuur 5b) te vinden. Analyses van het genomische DNA van de tumor vond geen bewijs voor verlies of hyper-methylatie van de miR-449 loci middels methylering-specifieke smeltcurveanalyse (MS-MCA) aangeeft transcriptionele neerwaartse regulatie van expressie (gegevens niet getoond). Vandaar dat, in overeenstemming met de gegevens van twee muismodellen van maagontsteking en hyperplasie, de expressie van miR-449 is down-gereguleerd in menselijke maagkanker. Figuur 5 miR-449 is vastgelegd gereguleerd in menselijke maagkanker. qPCR analyse (bovenste paneel) geeft neerwaartse regulatie van miR-449 expressie in 8 maagkanker weefsels vergeleken met miR-449 expressie in-monster gematchte controles (stippellijn). U44 werd als endogene controle. Tabel met klinische gegevens van de patiënten (onderste paneel). 'Ns' niet significant p-waarde > 0,05, "*" significant 0,01 < p-waarde < 0,05, "**" zeer belangrijk 0,01 < p-waarde < 0.001, "***" zeer significant p-waarde < 0.001
Discussie
Maagkanker is een zeer dodelijke maligniteit met meer dan 21.500 nieuwe gevallen per jaar in de Verenigde Staten alleen al [35]. De ziekte wordt vaak te laat ontdekt en de 5-jaarsoverleving is dus minder dan 20% [36]. Het is daarom belangrijk dat de etiologie en progressie stadia van de ziekte te begrijpen. Het belang van de bacteriële gastheer milieu- en genetische risicofactoren maagkanker bestudeerd, maar minder bekend over de moleculaire progressie van de ziekte [37, 38]. Onder andere wordt p53 route inactivering gemeld bij 30-60% van maagkanker [39, 40] en recente studies suggereren H. pylori
directe modulatie van het p53-gen of daarvan afgeleide doelstellingen [41]. Een ander gemeenschappelijk wijziging van maagkanker is de verstoring van de celcyclus via de overexpressie van cycline E1, die wordt geassocieerd met tumor agressiviteit en lymfeknoop metastase [42, 43].

• De invloed van N-acetyl-L-cysteïne infusie op cytokine niveaus en maag darmslijmvlies pH tijdens ernstige sepsis
• Goedaardige gastro-koliek fistel in een vrouw die met gewichtsverlies en intermitterende braken: een case report