Pasaulis-449 slopina ląstelių proliferaciją ir žemyn reguliuoja skrandžio cancer

Pasaulis-449 slopina ląstelių proliferaciją ir žemyn reguliuoja skrandžio vėžio
tezės
Background
Skrandžio vėžys yra ketvirtoji dažniausia vėžio pasaulyje ir antra labiausiai paplitusi priežastis, dėl vėžio susijusių mirties. Skrandžio vėžio vystymąsi daugiausia susijęs su Helicobacter pylori infekcija
dėl to patologija tyrimų dėmesio bakterijų ir aplinkos veiksnių, o mažesniu mastu dėl mechanistinio plėtros naviko. Mikro RNR yra mažų ne kodavimo RNR molekulės, dalyvaujančios po transkripcijos genų reguliavimo. Jie nustatė reguliuoti genus įvairių biologinių funkcijų ir pokyčių MicroRNA išraiška buvo susijęs su daugelio piktybinių navikų patogenezės. Dabartinė studija siekiama nustatyti mikro RNR dalyvauja skrandžio kancerogenezėje ir ištirti jų mechaniškai aktualumą apibūdindamas savo tikslus.
Rezultatai
Invitrogen NCODE Mirna mikrogardelių nustatytų Pasaulis-449 turi būti sumažėjo 1-erių metų gastrinas
KO pelėms ir H. pylori
užkrėstus skrandžio audinius, lyginant su audinių iš laukinio tipo gyvūnų. Augimo greitis skrandžio ląstelių linijose ekspresija MIR-449 buvo slopinamas 60%, palyginti su kontroline grupe. FACS ląstelių ciklo analizė miR-449 per ekspresija ląstelės žymiai išaugo į pietus-G 1 daliai orientacinio apoptozės. SS-Gal tyrimai parodė senstantis fenotipą skrandžio ląstelių linijose ekspresija MIR-449. Affymetrix 133v2 matricas nustatė GMNN
, susitiko, CCNE2, SIRT1 parsisiųsti ir CDK6
kaip Pasaulis-449 tikslų. Liuciferazės tyrimai buvo naudojamas patvirtinti GMNN
susitiko
, CCNE2 parsisiųsti ir SIRT1
kaip tiesioginių tikslų. Mes taip pat rodo, kad Pasaulis-449 per išraiškos aktyvuota p53 ir jos tolesnis tikslinę p21 taip pat apoptozę žymekliai nuskeltas CASP3 ir "Partnerystės taikos labui. Svarbu tai, kad qPCR analizė parodė, Pasaulis-449 raiškos nuostolių žmogaus klinikinių skrandžio auglių, palyginti su sveikų audinių.
Išvadas
Šiame tyrime mes dokumentuoti paplonintu išraišką PPN-449 Gastrino
KO pelėms ir dar kartą patvirtino savo nuostolių žmogaus skrandžio navikų. Mes ištirti PPN-449 funkcijos, nustatant tiesiogines tikslus. Be to, mes rodo, kad Pasaulis-449 skatina senėjimo ir apoptozę aktyvuojant p53 kelią.
Background
Skrandžio vėžys yra vienas iš penkių labiausiai paplitusių vėžio formų pasaulyje ir antra labiausiai paplitusi priežastis, dėl vėžio mirčių [1] , Tai daugiausia, bet ne išimtinai, sukelia Helicobacter pylori
infekcijos [2], kaip ne visi H. pylori
užsikrėtę asmenys kurti navikų [3]. Kiti veiksniai dalyvauja skrandžio vėžio vystymąsi įtraukti laipsnį ir tipą uždegiminio atsako [2], taip pat kaip gastrinas
hormono lygį [4, 5]. Keli tyrimai parodė, kad tiek hypergastrinemia [6, 7] ir gastrino stoka [5] prisidėti prie skrandžio vėžio patogenezės. Achlorhidrija yra bendras bruožas pelės modeliai linkę į besivystančių metaplazijos ir vėžio [6, 8, 9]. Gastrinas
pelç yra achlorhydric [10], palankiu bakterijų skrandžio sąžalynus [11, 12], ir chroniškų bakterinių skrandžio infekcijos sukelti skrandžio metaplazijos kuris gali progresuoti į skrandžio vėžio [6, 12].
Nuo jų atradimas mikro RNR, buvo nustatyta, padariusiu labai platų normaliomis ir patologinių procesų [13]. Mikro RNR daryti savo reguliavimo funkcijas posttranscriptionally, prisijungdamas iš dalies papildo seka daugiausia motyvų 3 "UTR tikslinių mRNR todėl iRNR destabilizacijos ir pritaikymo represijų [14]. Nuo biologiniu požiūriu, mikro RNR ginčija daiktų studijuoti, nes jie reguliuoja gretos tikslinių genų, kurių negalima lengvai identifikuoti. Nuo terapinės požiūriu, mikro RNR yra labai įdomu, kaip keli tyrimai parodė mikro RNR, kaip biologinių žymenų ir pradinių Ikiklinikinių tyrimų metu nustatė galią, mikro RNR gali būti terapiškai skirta in vivo [15].
Profiliavimo tyrimai liudija MicroRNA dereguliavimo plataus spektro ligų, įskaitant visų pagrindinių vėžio [16]. Mikro RNR greičiausiai įtakos navikų procesus dviem lygiais. Pirma, keli tyrimai nustatė PRO-onkogeninių arba auglio-slopinančio vaidmenis atskirų mikro RNR tvirtai susiejant šiuos vėžio etiologijos kaip matyti iš miR-155, PPN-10b ir miR-21 [17-19]. Antra, pasirodo MicroRNA reguliavimo sistema per se turi naviko slopinamąją funkcijas genetinės abliacijos pagrindinių MicroRNA BIOGENESIS veiksnių, tokių kaip Kauliukų žaidimai, stipriai padidinti vėžio jautrumą [20] ir nuostolių funkcija mutacijų nenustatyta svarbių mikro RNR perdirbimo veiksnių žmogaus navikų [21-23].
šiame tyrime mes spręsti mikro RNR svarbą skrandžio vėžio pasinaudojant gastrinas
nokautas pelės modelio ir H. pylori
infekcijos laukinio tipo pelėms. Mes nustatyti miR-449 kaip reikšmingai mažina reguliuojamas arba prarado pelių modelių skrandžio vėžio, taip pat turintis pirminių žmogaus skrandžio navikų. Identifikavimas mRNR tikslus atskleidžia, kad ši MicroRNA greičiausiai daro navikas slopinamąją funkcijas per suderintų reguliavimo vėžio susijusių ląstelių ciklo reguliavimo, įskaitant RER, GMNN, CCNE2, SIRT1 ir HDAC1 kohortos.
Metodai
Pelės
buvo naudojami trys skirtingų amžiaus grupių (12-16 savaičių, 1 metai ar 1 ½ metų) laukinio tipo (wT) arba gastrinas
nokautas (ko) pelėms. Visi pelėms buvo ant mišraus 129 /SVJ, linija C57BL /6J fone, backcrossed bent keturis kartus linija C57BL /6J [12]. Pelėms buvo laikomi tam tikromis patogenais neužkrėstų sąlygomis ir prižiūrima pagal Europos laboratorinių gyvūnų mokslo asociacijų rekomendacijas [24] 12 h šviesos ir 12 h tamsiai ciklų Federacijos.
H. pylori
infekcija
C57BL6 /J pelių (n = 10) buvo inokuliuojama ne-pelės-pritaikytą klonas H. pylori
štamo 67:21, iš pradžių izoliuotas iš antralinių biopsijos, gauto iš Švedijos patelės skrandžio opa. Kamienas yra Vaca + ir yra visą Cag patogeniškumo sala (PAI) su genetinės stabilumo CAG PAI [25]. Pelėms buvo pasėta kas antrą dieną (tris kartus) per 5 dienų laikotarpį. DNR buvo ekstrahuojamas ir analizuojami, siekiant identifikuoti Helicobacter rūšių, naudojant pusiau lizdine polimerazės grandininės reakcijos-denatūravimo gradiento gelio elektroforezės testą, specifinį genties Helicobacter buvimą, kaip aprašyta anksčiau [26]. Kontrolinės grupės sveikų C57BL6 /J pelių buvo naudojami kaip kontrolės.
Visų pelių skrandžiai buvo išpjaustytų į dugno ir antralinėje dalyje prieš RNR gavyba. Visi bandymai su gyvūnais
Pelės Ertmė skyrius
Pelės buvo paaukojo slankstelių dislokaciją buvo patvirtinta Danijos gyvūnų gerovės komiteto (2005 /562-40) ir Danijos miškų ir gamtos agentūros (20010077355/6).. Ertmė buvo pašalintas, plauti švelniai ledinio PBS, užšaldomos skystame azoto ir saugomi -80 ° C temperatūroje, kol RNR ekstrakcijos.
Klinikiniai mėginiai analizuoja
biopsijos iš skrandžio vėžio ir gretimuose normaliuose audiniuose buvo gauti iš pacientų, atliekama operacija dėl skrandžio vėžio tuo departamento Virškinimo chirurgijos Rigshospitalet. Įtraukimas įvyko liepos iki 2008 gruodžio ir jeigu pasirašė visi pacientai, pranešto sutikimo (Etikos komiteto pritarimu O-B-2008-049) ir Danijos duomenų apsaugos agentūra (2008-41-2138). Į biopsijos buvo dedamas RNAlater (Ambion) į darbo kambarį, o vėliau užšaldyti iki -80 ° C iki RNR gavyba.
RNR gavybos ir qPCR analizuoja
RNR išskirta naudojant TRIzol (Invitrogen) pagal gamintojo. Mirna išraiška profilis buvo įvertintas naudojantis Togman Mirna tyrimai (Pritaikyti BIOSYSTEMS) už HSA /MMU-miR-449a ir B HSA /MMU-miR-34a, b ir c ir rnu44 ar HSA /MMU-miR-191. Gruntas sekų Affymetrix taikiniai patvirtinimo išvardyti papildomą failą 1, stalo S1.
Mobilusis kultūra
SNU638 ir MKN74 buvo auginami RPMI-1640 (Gibco) su 10% FBS (Hyclone), 100U /ml penicilino ir 100 mikrogramai /ml streptomicino (Invitrogen) ir inkubuojama 37 ° C temperatūroje 5% CO 2. HCT116 ląstelių (WT ir p53 - /- buvo auginamos McCoy 5A (Gibco) su 10% FBS (Hyclone), ir 100U /ml penicilino ir 100 mikrogramų /ml streptomicino (Invitrogen) ir inkubuojama 37 ° C temperatūroje 5% CO <. sub> 2 HEK293 ir MEF ląstelės (masės ir p53 - /-) buvo auginamos DMEM (Gibco) su 10% FBS (Hyclone), 100 × /ml penicilino ir 100 mikrogramų /ml streptomicino (Invitrogen) ir inkubuojama 37 ° C temperatūroje su 5% CO 2.
Mirna pirmtakai ir siRNA
Mirna pirmtakai buvo įsigytas iš Ambion, HSA-Pasaulis-449a (PM11521), HSA-Pasaulis-449b (PM11127) ir HSA-miR-34a ( PM11030).
ląstelių augimas analizuoja
SNU638 ląstelės buvo pasėjamos į 24-duobučių lėkštelėse ir perkeltų šią dieną su 50nm Mirna dvipusis ar siRNA naudojant Lipofectamine 2000 (INVITROGEN). ląstelės buvo nustatytas nurodytu laiku kiekis 4% paraformaldehido , tamsintas į 0,1% violetinei tirpalu ir sumaišymo 10% acto rūgšties. Imties absorbcija buvo matuojamas 620 nm.
ląstelės ciklo FACS analizuoja
SNU638 ir MKN74 ląstelių buvo pasėtos ne 2 × 10 6 ląstelės per 10cm plokštės ir perkeltų su 50nm Mirna dvipusis (Ambion), naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Ląstelės buvo nuimta 48 ir 72 valandoms po transfekcija, tamsintas DNR turinį naudojant propidiumo jodido (PI) ir analizuojama FACS Calibur srauto citometro (Becton Dickinson-). Trumpai, ląstelės buvo surenkamos trypsinization ir plaunamas vieną kartą PBS prieš nustatant per naktį 70% EtOH. Dažyti DNR, ląstelės buvo granuliuoti, vėl suspenduotas 100 iL EtOH ir tamsintas 1 valandą 300 iL PI tirpalo (dozuotija po 0,05 mg /ml PI, 20 mikrogramai /ml RNAse A 0,1% BSA).
Senescence analizuoja
SNU638 ląstelės buvo pasėtos ne 400.000 ląstelių viename 6 šulinėlių plokštelės ir perkeltų su 50nm Mirna dvipusis (Ambion), naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Keturias dienas po transfekciją, ląstelės buvo išplautos PBS ir nustatyti 5 minučių kambario temperatūroje 2% formaldehido /0,2% glutaraldehido. Ląstelės buvo plaunamos du kartus PBS pH6.0 prieš nudažomi su šviežia senėjimas, susijusios beta-Gal dėmių tirpalo (1 mg /ml 5-brom-4-chlor-3-indolilo-βD-galactoside (X-Gal), 0.12mM K 3Fe [KN] 6, 0.12mM K 4FE [KN] 6, 1 mM MgCl 2 PBS pH6.0) naktį 37 ° C be CO 2 tiekimas , Ląstelės buvo išplauti kartą per PBS (pH6.0) ir stebima mikroskopu.
Antikūnus ir Vakarų dėmė analizė
SNU638 buvo pasėtos ne 2 × 10 6 ląstelės per 10 cm plokštė, Transfekuoti du kartus dviejų iš eilės dienos su 50nm Mirna per du aukštus, naudojant Lipofectamine 2000 pagal gamintojo (Invitrogen). Ląstelės buvo surinktos pagal trypsinization, plaunamas vieną kartą PBS ir lizuojamos į Ripa buferio (150 mm NaCl, 0,5% natrio deoksicholato, 0,1% SDS, 1% IGEPAL, 50 mM Tris-HCl, PH8, 2 mM EDTA), papildytoje 1 mM DTT, 1 mM Pefabloc, 1 mM NaV3, 10 mM Naf ir 1X pilnas mini proteazės inhibitorius kokteilis tabletės. 25 mikrogramų baltymo /juostos buvo išspręstas 4-20% NuPAGE bis-TRIS geliai (INVITROGEN) ir perkelti į nitroceliuliozinio membrana. Pirminiai antikūnai buvo naudojamos RER (Mobilusis Signalo 4560) Myc (Mobilusis Signalo 9402), GMNN (Santa Cruz SC-53.923), VCL ( "Sigma V9131), TP53 (Santa Cruz SC-126), CDKN1A (Santa Cruz SC-6246) , CDK6 (Santa Cruz SC-177), HDAC1 (Santa Cruz SC-7872), CCNE2 (Mobilusis signalo 4132), TUBB (Abcam ab11304), PARP (Mobilusis signalo 9542) ir prilipo CASP3 (Mobilusis signalo 9661).
mikrogardeliq analizuoja
Small RNR (< 200 nT) buvo izoliuotas su Invitrogen PureLink Mirna izoliacija Kit nuo fundic ir antralinių audinių iš 1) Gastrinas
KO pelių ir amžių ir lytį atitiko C57BL6 /J kontrolinės pelių ir 2) C57BL6 /J pelės infekuoti H. pylori
ir neužteršto amžių ir lytį atitiko C57BL6 /J kontrolės pelėms (n = 4 kiekvienai grupei). Izoliuotų mažų RNR kokybė buvo nustatoma naudojant Small RNR Analizės ant Agilent Bioanalyzer. 500ng mažų RNR buvo paženklinti Genisphere FlashTag Kit ir kryžminosi į Invitrogen NCODE "Multi-Species Mirna mikrogardeliq V2 į Maui hibridizacijos stoties. Perdirbti skaidres nuskaityta į "Agilent DNR mikrogardeliq skenerio. Atvaizdus buvo analizuojami ir santykis vidutiniškai normalizuoti naudojant GenePix Pro "6.0. Keturi biologiniai replikacijų buvo naudojama po palyginimu. Mėginiai buvo kryžminosi keturių matricos su dvigubomis spalva dažų apsikeitimo mikrogardeliq eksperimentinį dizainą. BRB ArrayTools buvo naudojami kartų kaitos ir statistinius skaičiavimus. Pasirinkti Mirna duomenys iš masyvo analizę buvo patvirtintas naudojant TaqMan realaus laiko PGR Mirna tyrimų. Duomenys bus deponuojami ArrayExpress priėmus.
MRNR masyvų
SNU638 buvo transfektuotose 50 nM PPN-34a arba Pasaulis-449b per du aukštus su Siglo siRNA naudojami kaip neigiamos kontrolės. Iš viso RNR išskirta 24 valandas po transfekcijq naudojant TRIzol reagentą. Affymetrix Mikrogardelė analizė (HG-U133 Plius 2,0 žmogaus) buvo atliktas mikrogardeliq centras, Rigshospitalet, Kopenhagos universitetinės ligoninės. Eksperimentai buvo paleisti arba trimis egzemplioriais arba quadruplicates. Duomenys bus deponuojami ArrayExpress priėmus.
Vektoriai statybos ir reporteris tyrimus, atliekamus
apie HDAC1
, SIRT1
susitiko
, GMNN
ir CCNE2
ūkyje 3'UTRs Pasaulis-449 jungimosi vietų buvo klonuotas pasroviui liuciferazės reporteris pMIR-ataskaitos vektoriaus sistema (Ambion). Quickchange sait-mutagenezės rinkinys (Stratagenas) buvo naudojami siekiant didesnio du taškines mutacijas į sėklų regione. Mutagenezes Gruntai sekos yra išvardyti papildomame faile 1, stalo S1.
HEK293 ląstelės buvo pasėjamos 96 duobučių lėkštelėse ir perkeltų su 20nm Mirna pirmtakas arba plakta siRNA kontrolė, 20-50ng iš liuciferazės vektoriaus (pMIR-ataskaita) ir 5NG iš renilla vektorius (PRL-TK), naudojant lipofectamine 2000 (Invitrogen). Ląstelės buvo nuimta po 24 valandų transfekcijq ir liuciferazės aktyvumas buvo matuojamas naudojant dvejopo GLO liuciferazės tyrimą (PROMEGA).
Mikrogardeliq analizė
mikrogardeliq išraiška duomenys apdoroti naudojant "affy" paketą BioConductor [27]. Probe rinkinys intensyvumas buvo apibendrinti ir kvantilio normalizuoti naudojant BioConductor RMA ir VSN paketus. Skirtumas išraiška lėmė už probeset naudojant t-testą. Probe rinkiniai buvo susietas su Ensembl nuorašai (versija 49), naudojant teikiamomis BioMart rodymo. Probesets kad atvaizduojamos dviejų skirtingų Ensembl genų buvo išmesti.
Vertinti pasaulinį žemyn reguliavimą MicroRNA tikslinės genai
3'UTRs, 5'UTRs ir kodavimo sekas nuorašai buvo nuskaitomi atitikimo 6mer, 7mer ir 8mer Mirna sėklų svetainės (papildantys padėtyje 2-7, 2-8 ir 2-9 iš Mirna). Pasaulinis analizė Mirna tikslą down-regulation buvo įvertintas naudojant ilgiausia 3'UTR seką už geno išvengti šališkumo įvestos genų su daugeliu stenograma izoformų. Mes išmesti nuorašai su 3'UTR sekų trumpesnės nei 50 nt. Pasauliniu mastu įvertinti, ar Mirna tikslinės genai buvo žemyn reguliuojama po Mirna transfekciją, mes patikrinome null hipotezę, kad pasakymas pokytis platinimas Mirna tikslų (turintys 7mer tikslinę vietoje) buvo lygus visų išreikštų genų platinti be numatomą taikinio svetainių naudojančių neparametriniai Vilkoksono rango suma testą. Panašus metodas buvo naudojamas įvertinti žemyn reguliavimą genų su Mirna tikslinių teritorijų kodavimo regionus ir 5'UTRs iš mRNR.
Išsamus duomenų statistinį įvertinimą tariant koreliavo su Dauno reguliavimo
Mes naudojome anksčiau paskelbtą neparametriniai rangas pagrindu statistika, kad išsamiai įvertinti Word įvykių koreliacija 3'UTRs ir genų ekspresijos pokytis po Mirna transfekciją [28, 29]. Genai buvo rūšiuojami pagal ekspresijos pokyčių sukeltos transfekciją PPN-34a arba miR-449b ir koreliacija su žemyn reguliavimo buvo išbandyta visų ilgis 5-7 žodžių (n = 21 504).
Statistiniai testai
studentai t-testas su Welch korekcijos.
rezultatai
miR-449b žemyn reguliuoja abiejų gastrinas
KO pelių ir H. pylori antralinėje dalyje
užsikrėtę Pelės
gastrinas
pelç yra achlorhydric su susirgti antralinių hiperplazija ir adenomų skrandžio laikui bėgant (1 paveikslas) [6, 12] tendencija. Siekiant nustatyti mikro RNR nereguliuojamos per skrandžio vėžio vystymąsi, mes išnagrinėjo miRNAs raiškos profilius skrandžio neoplasias iš gastrinas
pelç naudojant Mirna mikrogardelių. Kaip parodyta 1 lentelėje, 20 mikro RNR buvo žymiai nereguliuojama į pelç lyginant su laukinio tipo littermate kontrolės, su trimis miRNAs skirtingų daugiau nei du kartus, PPN-7 yra iki reguliuojama ir Pasaulis-709 ir Pasaulis-449b yra žemyn reguliuojama atsižvelgiant į gastrino
pelç antralinėje dalyje, palyginti su laukinių rūšių. Siekiant dar labiau patvirtina Pasaulis-449 reguliavimą metu skrandžio vėžio išsivystymo, mes išanalizavome savo išraišką laukinio tipo pelės Ertmė audinių užsikrėtę H. pylori
. Įdomu tai, kad Mirna matricas parodė specialus žemyn reguliavimo PPN-449b H. Pylori
užsikrėtę pelėms (2 lentelė ir papildomos failą 1, pav S1). 1 pav Senos Gastrinas pelç plėtoti skrandžio adenomų. Ertmė skyriai išskirti iš 12-16 savaičių amžiaus pelėms (kairėje skydelis), nuo 12 iki 18 mėnesių amžiaus pelėms (viduryje skydelio) ir vyresni nei 18 mėnesių pelių (dešinėje skydelio), iš laukinio tipo (viršutinis skydelis) ir gastrinas
pelç (apatinis skydelis). Profiliai parodyti adenoma plėtrą Ertmė audinių gastrinas
Knockouts palyginti su laukinių rūšių.
1 lentelė miRNAs nereguliuojamos Gastrino
pelç
Mirna Vardas
log2 kartus
p reikšmė
Mirna Name

Log2-fold

p-value

mmu-miR-709
-1.73
7.0E-06
mmu-miR-422b
0.44
4.6E-02
mmu-miR-449b
-1.37
1.6E-03
mmu-miR-199a*
0.50
7.7E-03
mmu-miR-805
-1.01
7.5E-03
mmu-miR-25
0.51
1.6E-02
mmu-miR-706
-0.98
3.1E-03
mmu-miR-27b
0.56
5.1E-03
mmu-miR-467a
-0.88
2.8E-02
mmu-miR-182
0.56
1.8E-02
mmu-miR-696
-0.83
7.1E-03
mmu-miR-30a-3p
0.59
2.2E-02
mmu-miR-667
-0.66
2.3E-02
mmu-miR-10a
0.70
7.1E-03
mmu-miR-690
-0.28
1.7E-02
mmu-miR-152
0.70
2.3E-02
mmu-miR-18
0.29
3.7E-02
mmu-miR-1
0.77
7.1E-03
mmu-miR-143
0.34
2.3E-02
mmu-miR-7
1.06
4.9E-03
Sąrašas gerokai liberalizuotas miRNAs skrandžio neoplasias iš gastrinas
pelç palyginti su laukinių rūšių.
2 lentelė miRNAs panaikintas reguliavimas yra H.pylori
infekuotų audinių
Mirna pavadinimas
Nemokama Sulenkite change

p-value

mmu-miR-122a
-3.247
0.000788
mmu-miR-449b
-0.879
0.045214
Sąrašas gerokai liberalizuotas miRNAs laukinių tipo pelėmis antralinėje dalyje užsikrėtę H. pylori
palyginti su neužkrečiama antralinėje dalyje.
Pasaulis-449 slopina ląstelinį ciklą ir skatina sočią senatvę
įrodė žemyn reguliavimas miR-449 išraiška skrandžio vėžio norėjome išnagrinėti pakartotinai išreikšti miR-449 poveikį skrandžio vėžio ląstelių linijas. Įdomu ne pastebimas išraiška Mir-449 šeimos buvo aptikta visoje skrandžio ląstelių linijas, įskaitant SNU638, SNU5, SNU216, SNU601 ir MKN74 patyrusio miR-449, turintis auglio-slopinančio funkcijas sąvoką plokštės (duomenys neparodyti). Mir-449 šeima susideda iš miR-449a ir B žmonėms ir miR-449a, b ir c pelių. Įdomu tai, kad jie turi tą pačią sėklų seka kaip Mir-34 šeimoje ir todėl tikimasi, kad reguliuoti sutampančių gretos tikslinių genų (2a pav). Siekiant įvertinti PPN-449 funkcijos skrandžio ląstelių linijų mes vėl pristatė MIR-449b į SNU638 ir MKN74 ląsteles. Palyginti su neigiamos kontrolės mikro RNR, iš naujo diegti miR-449b stipriai paveikė SNU638 ląstelių proliferaciją (2b pav) ir apžiūra langeliams, pažymėtiems sukeliama apoptozė ir ląstelių senėjimo (pav 2c ir papildomų failų 1 pav S2). Tėkmės citometrijos analizė propidiumo jodido tamsintas ląstelių transfektuotose miR-449b parodė G 1 kaupimas 48 valandos po transfekciją, ir po to 72 valandas rašyti transfekcijq kurį ląstelių kaupimosi sub G 1 dalis, rodo ląstelių mirtis (pav 2d). Iš ląstelių senėjimo indukcija buvo patvirtinta rūgštus beta Gal dažymo naudojant MIR-34a kaip teigiama kontrolė MicroRNA (pav 2e). Norėdami paneigti ląstelių linija konkrečių pasekmių, funkcinės pasekmės PPN-449 pakartotinai įvedimo požiūriu ląstelių ciklo suėmimo buvo patikrintas MKN74 ląstelių (Papildoma failų 1, pav S3). Taigi, vėl įvedimas miR-449 neigiamai veikia platinimu skrandžio vėžio ląstelių linijų lydinčių su senėjimo ir apoptozės indukcija nuoseklūs su miR-449, turintis naviko Slopinamoji funkcijas. 2 pav Pasaulis-449 yra dalis Mir-34 šeimos ir slopina ląstelių proliferaciją. A - Pasaulis-449 yra dalis Mir-34 šeimai ir yra evoliuciškai apsaugą. B - Pasaulis-449 pakartotinai įvežant į žmogaus skrandžio ląstelių linijas (SNU638) slopina ląstelių proliferaciją (raudona linija), palyginti su plakta kontrolės (mėlyna linija) ir Pasaulis-146 valdymo (juoda linija). Klaida barai atstovauti Š.D. C - Vizuali apžiūra ląstelių proliferacijos slopinimu ir dėl senėjimo panašaus fenotipo ant Pasaulis-449 pakartotinai įvežant į SNU638 ląstelių (apatinio), palyginti su plakta transfekciją kontrolės (viršutinis meniu). D - FACS ląstelių ciklo analizė rodo Sub-G1 kaupimosi SNU638 ląstelių 72 valandas po miR-449 pakartotinai įvedimo (dešinėje histogramos), palyginti su plakta transfekciją kontrolės (kairėje histogramos) Iš lentelės matyti, ląstelių kaupimąsi G1 frakcija ant miR-449 RE -Įvadas palyginti su plakta RNR kontrolės Praėjus 48 valandoms po transfekciją, po to pereinant prie sub-G1 frakcija 72 valandas rašyti transfekcijq orientacinį ląstelių mirtį. El - senstantis fenotipas SNU638 ląstelių nuo miR-449 ir ​​Pasaulis-34a teigiamos kontrolės pakartotinio įvedimo parodė rūgščioje β-gal testo palyginus su RNR plakta kontrolės
bendrą sėklų seka PPN-449b ir miR-34a sukelti labai. koreliuoja išraiška pasikeičia
apibūdinti nuorašai kontroliuojamas miR-449 ir ​​pamatyti, jei Pasaulis-449 reglamentuoja skirtingas išklotines nei miR-34a, buvo išnagrinėti SNU638 ląstelių ekspresijos profilius 24 valandos po transfekcijq PPN-449b ar miR-34a ir diferencijuotai išreikšti nuorašai identifikuoti. Mes nustatėme, kad mRNR su prognozuojama Mirna tikslinių teritorijų (7 Mer sėklų vietoje) į 3'UTR srities buvo gerokai žemyn reguliuojama palyginti su mRNR be numatomą taikinio vietų po transfekciją PPN-449b (p < 1.2E-70, du-tailed Vilkoksono rango suma testas), (Papildoma failą 1, pav S4A). mRNR to, prognozuojama Mirna sėklų tikslines svetaines kodavimo regionai taip pat buvo nustatyta, kad žymiai būti žemyn reguliuojama (p < 9.9e-25), o mRNR su svetainių 5'UTRs buvo tik nežymiai žemyn reguliuojama (p < 5.3e- 2). Sąvoka pokyčius, kuriuos sukelia transfekciją brandaus miR-449b ir miR-34a stipriai koreliavo nepaisant skirtumų, subrendusių sekų ribų sėklų regione (Pirsono koreliacijos koeficientas r = 0,94, p = 0), (Papildoma failų 1, pav S4b). Mes išsamiai įvertino visas oligonukleotidai (žodžių) ilgis 5-7 koreliuoti su Dauno reguliavimo po miR-449b ir Pasaulis-34a transfekciją (žr metodus). Suderinamas su daugeliu ankstesnių tyrimų, ši analizė atskleidė pasidalino Pasaulis-34A /449b sėklų vietoje kaip 3'UTR žodžio dauguma koreliuoja su žemyn reguliavimo dviejų eksperimentų (papildomas failą 1 pav S4C).
Pasaulis-449 reglamentuos daug ląstelės ciklo valdikliai Viesbutis The ekspresijos profilius buvo naudojami siekiant nustatyti diferencijuotai išreikštas nuorašai ląstelėse transfektuotose miR-449b ar kontrolės (papildomas failą 1 lentelė S2). Kelią, aktyvavimo analizė grindžiama skirtingai reglamentuojamų nuorašai rodo, kad Pasaulis-449 daugiausia kontroliuoja nuorašai kodavimo baltymus dalyvaujančių ląstelių pažeidimą atsakymų, ląstelės ciklo kontrolės, uždegimas ir vėžio kelius (3a pav.) Dėmesys nuo tariamų tikslinių genų su solidžiomis vaidmenis tumorogenezės rinkinys, mes patvirtino žemyn reglamentavimą miR-449 MET Proto onkogeno (RER pervežimas), cikloniniai priklauso kinazės 6 (CDK6)
, geminin (GMNN )
, myelocytomatosis virusinė Onkogeny homologas (MYC)
, 1 sirtuin (SIRT1
) ir Histonas deacetilazės 1 (HDAC1)
čia stenograma lygis (3b pav). Vakarų dėmė analizė patvirtino PPN-449 gebėjimą žemyn reguliuoti RER, GMNN, Myc, SIRT1, cikloniniai E2 "(CCNE2) ir HDAC1 tuo baltymų lygio tiek panaši į tą pasiekti naujo įvedimo PPN-34a (paveikslas 3c). Dėl tikslinių genų, įskaitant RER
, GMNN, CCNE2
, SIRT1
ir HDAC1
pogrupyje, mes patvirtino tiesioginę sąveiką PPN-449 su taikinio geno 3 'UTR naudojant liuciferazės tyrimą (pav 3d ). 3 pav Pasaulis-449 skirta ląstelės ciklo reguliatoriaus genus. A - Išradingumas Kelias analizė (PNPP) ir nereguliuojamų genų upon Pasaulis-449 pakartotinai įvežti į SNU638 ląstelių rodomi turtinimo geno kategorijos vėžio ląstelių žūtį ir ląstelinio ciklo kelius tarp kitų. B - qPCR įteisinimas Affymetrix matricos rodo žemyn reguliavimą RER
, CDK6
, GMNN
Myc
ir HDAC1
ant Pasaulis-449 pakartotinai įvedus palyginti su plakta RNR kontrolės. C - Vakarų dėmė įteisinimas žemyn reguliuoja genų upon Pasaulis-449 pakartotinai įvežimo į SNU638 ląstelių, palyginti su plakta RNR kontrolės. Vinculin (VCL) ir tubulino beta (TUBB) buvo naudojamas kaip krovinio kontrole D - patikrinimas tiesiogiai ir funkcinio taikinio privalomas naudojant liuciferazės konstruktus laikančius laukinių tipo 3'UTRs ir mutavo 3'UTRs (du mutacijas Pasaulis-449 privalomą vietoje), * rodo statistinis reikšmingumas liuciferazės išraiškos tarp laukinio tipo 3'UTRs transfektuotose miR449a /b lyginant su RNR plakta kontrolę, # rodo statistinį skirtumą liuciferazės išraiškos tarp laukinio tipo 3'UTRs palyginti su mutantas 3'UTRs transfektuotose miR-449a ir miR- 449b. "Ns" nėra reikšminga p reikšmė > 0,05, "*" arba "#" reikšmingas 0,01 < p reikšmė < 0,05, "**" ar "##" labai reikšmingas 0,01 < p reikšmė < 0,001 "***" arba "###" labai reikšmingas p reikšmė < 0.001
Taigi, PPN-449 tiesiogiai skirta ląstelės ciklo reguliatorius genus atitinkančius auglio slopinamojo funkcijos ir ląstelės ciklo arešto iškristi miR-449 pakartotinai įvežti į vėžio ląstelių linijų.
Pasaulis-449 skatina p53 išraišką, bet nereglamentuoja p53
Kaip Pasaulis-34a anksčiau buvo nustatyta, kad veiktų pasroviui p53 [30-33], mes analizuoti, ar taip pat Pasaulis-449a /b buvo susiję su p53. Tai buvo be paskatino į spėjamą p53 privalomą svetainėje akivaizdoje 10 KB tiekėjų iš žmogaus miR-449 (duomenys neparodyti). Todėl sukeltas p53 DNR žalą naudojant UV arba 5-fluorouracilu (5FU) keturių skirtingų sistemų, HCT116 ir MEF laukinių rūšių ir p53 Knockout ląsteles (papildomas failą 1 paveiksle S5a). Tačiau jokių reikšmingų pokyčių Pasaulis-449 raiškos nutatytas p53 rūšyse aktyvavimo (papildomas failą 1 pav S5b). Taigi, mes nerado įrodymų, kad Pasaulis-449 yra transkripcijos tikslas p53. Kita vertus, mes nustatėme, kad miR-449a /b yra gali sukelti aktyvavimą p53, aktyvavimo p53 reagavimo genų, tokių kaip p21 ir apoptozės indukcija, kaip matyti iš skilimo kaspazės 3 (CASP3) ir poli (ADP-ribozės ) polimerazės 1 (PARP) (4 pav). Link suprasti mechanizmą, pagal kurį Pasaulis-449 daro tai mes išnagrinėjo PPN-449 poveikį SIRT1 ir HDAC1. SIRT1 ir HDAC1 yra deacetilazių slopinantys, be kita ko, p53 ir miR-34 aktyvacijos buvo įrodyta, kad nuslopinti SIRT1 [34]. Mes patvirtintas konkretus privalomas miR-449 į SIRT1 ir HDAC1 naudojant 3'UTR liuciferazės tyrimai (pav 3D). 4 pav Pasaulis-449 aktyvina p53 kelią. Vakarų dėmė analizė rodė, kad p53 baltymo ant miR-449 ir ​​teigiamos kontrolės Pasaulis-34a pakartotinio įvedimo padidėjimą į SNU638 ląstelių, palyginti su RNR plakta kontrolę, taip pat yra p53 tolesniems tikslas P21 ir apoptozę žymekliai atskeliamos CASP3 ir "Partnerystės taikos labui aktyvacijos. Vinculin (VCL) ir tubulino beta (TUBB) buvo naudojamas kaip krovinio kontrolę.
Taigi, mes spėlioti, kad Pasaulis-449 indukuoja apoptozę slopindamas histono deacetilazės HDAC1 ir SIRT1 todėl p53 rūšyse aktyvavimo taigi apoptozės žymekliai indukcijos suskaldyti CASP3 ir PARP.
Pasaulis-449 yra žemyn reguliuojama žmogaus skrandžio vėžio
įvertinti PPN-449 svarba žmogaus piktybinių navikų kitą kartą išnagrinėjo PPN-449 išraišką 10 skrandžio vėžiu biopsijos. Svarbu tai, mes nustatėme, tiek MIR-449a ir B bus gerokai žemyn reguliuojama arba išvykęs į 8 iš 10 pirminių skrandžio vėžio. Be to, miR-449a ir b išraiška, atrodo, būti bendrai reguliuojama (pav 5a). Neradome jokio tarpusavio ryšio tarp Pasaulis-449 raiškos mažinimo ir klinikinių charakteristikų vėžio (pav 5b). Analizė genomo DNR navikų nerado įrodymų praradimo arba hiper-metilinimas Mir-449 lokusų naudojant metilinimo konkrečių lydymosi kreivės analizė (MS-MCA), nurodant transkripcijos žemyn reguliavimą išraiškos (duomenys neparodyti). Taigi, susitarusi su duomenimis, gautais iš dviejų pelės modelių skrandžio uždegimą ir hiperplaziją, kad miR-449 išraiška yra žemyn reguliuojama žmogaus skrandžio vėžio. 5 paveikslas Pasaulis-449 yra žemyn reguliuojama žmogaus skrandžio vėžio. qPCR analizė (viršutinis skydelis), kuriame žemyn reguliavimą Pasaulis-449 išraiškos 8 skrandžio vėžio audiniuose, palyginti su Pasaulis-449 raiškos pavyzdžių atitikimo kontrolę (punktyrinės linijos). U44 buvo naudojamas kaip endogeninio kontrolės. Lentelė, kurioje klinikinį informaciją pacientams (mažiau skydelio). "Ns" nėra reikšminga p reikšmė > 0,05, "*" reikšminga 0,01 < p reikšmė < 0,05, "**" labai reikšmingas 0,01 < p reikšmė < 0,001 "***" labai reikšmingas p reikšmė < 0.001
diskusija
Skrandžio vėžys yra labai mirtinas piktybinis navikas su kiekvienais metais daugiau nei 21.500 naujų atvejų vien Jungtinėse Valstijose [35]. Liga dažnai aptinkamas per vėlai ir 5 metų išgyvenamumas yra todėl mažiau kaip 20% [36]. Todėl svarbu suprasti, etiologija ir tolesnio ligos stadijose. Bakterijose, aplinkos ir priimančiosios genetinių rizikos veiksnių skrandžio kancerogenezėje svarba buvo ištirtas, tačiau mažiau yra žinoma apie molekulinę ligos progresavimą [37, 38]. Be kita ko, p53 kelias inaktyvacijai yra pranešta 30-60% skrandžio vėžio [39, 40] ir naujausi tyrimai rodo, H. pylori
Tiesioginiai moduliavimo p53 geno arba jo tolesnius tikslus [41].

• N-acetil-L-cisteino infuzijos citokinų lygis ir skrandžio intramucosal pH įtaka Sunkaus sepsio
• Gerybinė skrandžio ir diegliai fistulė į moterį pasireiškianti svorio ir su pertrūkiais vėmimo atveju apie