miR-449 inhiboi solujen lisääntymistä ja säätyy alas mahasyövän

miR-449 inhiboi solujen lisääntymistä ja säätyy alas mahasyövän
tiivistelmä
tausta
Mahasyöpä on neljänneksi yleisin syöpä maailmassa ja toiseksi yleisin syy syövän liittyvä kuolema. Kehittäminen mahalaukun syövän liittyy lähinnä H. pylori
infektio johtaa keskittyä patologian tutkimuksiin bakteeri- ja ympäristötekijöistä, ja vähäisemmässä määrin mekanistinen kehitystä kasvain. MikroRNA ovat pieniä ei-koodaavan RNA-molekyylien mukana transkription jälkeisen geenisäätelyn. Niitä löytyy säädellä geenien erilaisia ​​biologisia toimintoja ja muutoksia microRNA ilme on liitetty patogeneesiin monia syöpäsairauksia. Nykyinen tutkimus on keskittynyt tunnistamaan MikroRNA mukana mahasyövän ja tutkia niiden mekanistinen relevanssin mukaan luonteenomaiset tavoitteensa.
Tulokset
Invitrogen NCode miRNA mikrosiruja tunnistettu miR-449 on vähentynyt 1-vuotiaan Gastriini
KO hiiret ja H. pylori
tartunnan mahan kudoksissa verrattuna kudoksiin villityypin eläimistä. Kasvuvauhti mahalaukun solulinjojen yli-ilmentävät miR-449 estyi 60% kontrolleihin verrattuna. FACS solusyklin analyysi miR-449 over-ilmentäviä soluja kasvoi merkittävästi osa-G 1 osa osoittaa apoptoosin. ß-Gal määrityksissä osoitti senescent fenotyypin mahalaukun solulinjojen yli-ilmentävät miR-449. Affymetrix 133v2 taulukot tunnistettu GMNN
, MET, CCNE2, SIRT1
ja CDK6
kuin miR-449 tavoitteita. Lusiferaasimäärityksiä käytettiin vahvistamaan GMNN
, MET
, CCNE2
ja SIRT1
suorina tavoitteita. Osoitamme myös, että miR-449 yli-ilmentyminen aktivoituu p53 ja sen alavirrassa oleva kohde p21 sekä apoptoosin markkereita halkaistut CASP3 ja PARP. Tärkeää on, qPCR analyysit osoittivat menetys miR-449 ilmentymistä ihmisen kliinisissä mahalaukun kasvaimet verrattuna normaaleihin kudoksiin.
Johtopäätökset
Tässä tutkimuksessa olemme dokumentoida heikentynyt ilmentymä miR-449 Gastrin
KO hiiret ja lisäksi vahvistetaan sen menetys ihmisen mahalaukun kasvaimet. Tutkimme toiminta miR-449 tunnistamalla sen suoran tavoitteita. Lisäksi osoitamme, että miR-449 indusoi vanhenemista ja apoptoosia aktivoimalla p53-reitin.
Tausta
Mahasyöpä kuuluu viiden yleisimmistä syövistä maailmassa ja toiseksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien [1] . Se on pääasiassa, mutta ei yksinomaan, aiheuttamia H. pylori
infektion [2] koska kaikki H.pylori
tartunnan saaneiden kehittää kasvaimia [3]. Muut tekijät osallistuvat mahasyövän ovat aste ja tyyppi tulehdusvasteen [2], sekä tasojen gastriini
hormoni [4, 5]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että sekä hypergastrinemiaa [6, 7], ja puute gastriini [5] myötävaikuttaa patogeneesiin mahasyövän. Aklorhydrian on yhteinen piirre hiirimalleissa altis kehittämään metaplasia ja syöpään [6, 8, 9]. Gastriini
hiirten ovat hapoton [10], joka suosii bakteerien mahalaukun liikakasvu [11, 12], ja kroonisia bakteeri mahalaukun infektioiden johtaa mahalaukun metaplasiaa jotka voivat edetä mahasyövässä [6, 12].
Koska niiden löytö MikroRNA, on havaittu osallisena hyvin monia erilaisia ​​normaaleja ja patologisia prosesseja [13]. MikroRNA aikaansaavat sääntelytoiminnot posttranscriptionally sitoutumalla osittain täydentävää jaksoryhmittymät pääasiassa 3 'UTR kohde- mRNA: iden johtaa mRNA epävakautta ja translaation tukahduttaminen [14]. Biologiselta kannalta MikroRNA ovat haastavia esineitä tutkia, koska ne säätelevät ikäluokat kohdegeenien, joita ei ole helposti määriteltävissä. Vuodesta terapeuttinen näkökulmasta, MikroRNA ovat erittäin mielenkiintoinen, koska useat tutkimukset ovat osoittaneet voiman MikroRNA biomarkkereina ja alkuvaiheen prekliinisissä tutkimuksissa on todettu, että MikroRNA voidaan terapeuttisesti kohdennettua in vivo [15].
Profilointi tutkimukset ovat todistaneet microRNA sääntelyn purkamista laajan kirjon sairaudet mukaan lukien kaikki suuret syövät [16]. MikroRNA todennäköisesti vaikuttaa kasvaimia prosesseja kahdella tasolla. Ensinnäkin, useat tutkimukset ovat osoittaneet pro-onkogeenisiä tai kasvain-suppressiivinen rooleja yksittäisten MikroRNA tiukasti yhdistää nämä syövän etiologia esimerkkinä miR-155, miR-10b ja miR-21 [17-19]. Toiseksi microRNA sääntelyjärjestelmä sinänsä näyttää olevan kasvaimen tukahduttava toimii geneettinen ablaatio keskeisten mikroRNA biogeneesiä tekijät, kuten Dicer, voimakkaasti lisätä syöpäalttiutta [20] ja toiminnan menetys mutaatioiden on tunnistettu tärkeitä MikroRNA jalostuskertoimet ihmisen kasvaimissa [21-23].
tässä tutkimuksessa puutumme tärkeyden MikroRNA mahasyövän hyödyntämällä gastriini
hiirimallissa, jossa hiirillä ja helikobakteeri
infektio villityypin hiirillä. Tunnistamme miR-449 niin merkittävästi alassäädetty tai kadonnut hiirimalleissa mahasyövän sekä ensisijainen ihmisen mahalaukun kasvaimet. Tunnistaminen mRNA tavoitteiden paljastaa, että tämä microRNA todennäköisesti kohdistaa kasvain tukahduttava toimintojen kautta yhdenmukaistetun sääntelyn kohortin syöpään liittyvän solusyklin sääntelyviranomaisten lukien MET, GMNN, CCNE2, SIRT1, ja HDAC1. Tool Menetelmät
Hiiret
kolme eri ikäryhmien (12-16 viikko, 1 vuosi tai 1½ vuotta) villityypin (wt) tai Gastrin
knockout (KO) hiiriä käytettiin. Kaikki hiiret olivat sekoitettu 129 /SvJ, C57BL /6J-tausta, takaisinristeytettiin vähintään neljä kertaa C57BL /6J [12]. Hiiret pidettiin erityinen patogeenivapaissa olosuhteissa ja seurattiin mukaan felasa suosituksen [24], jossa 12 tunnin valo, 12 h pimeä sykliä.
Helikobakteeri
infektio
C57BL6 /J-hiiriä (n = 10) inokuloitiin ei-hiiri-mukautettu klooni H. pylori
kanta 67:21, alun perin eristettiin antral biopsia on saatu ruotsalaisesta naaras mahahaava. Kanta on VacA + ja sisältää koko Cag patogeenisyyssaarekkeen (PAI), joilla on geneettinen vakauden Cag PAI [25]. Hiiret inokuloitiin joka toinen päivä (kolme kertaa) aikana 5 päivän aikana. DNA uutettiin ja analysoitiin läsnäolo helikobakteeri lajien käyttäen semi-nested polymeraasiketjureaktiolla-denaturoivalla gradientin geelielektroforeesia määritystä, joka on spesifinen suvun helikobakteeri, kuten aiemmin on kuvattu [26]. Yhdistetyn ryhmä infektoitumattomien C57BL6 /J-hiiriä käytettiin kontrolleina.
Vatsat kaikki hiiret leikeltiin osaksi silmänpohjan ja antrum ennen RNA: n uuttamista. Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin Tanskan Animal Welfare Committee (2005 /562-40) ja Tanskan Forest and Nature Agency (20010077355/6).
Hiiret antrum osat
Hiiret tapettiin taittamalla niiltä niskat. Antrumiin poistettiin, pestiin varovasti jääkylmällä PBS: llä, jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes RNA.
Kliiniset näytteet analysoidaan
Biopsiat mahasyövän ja viereisen normaaleissa kudoksissa saatiin potilailta leikkauspotilaiden mahasyövän laitoksella ruuansulatuskanavan leikkauksen, Rigshospitalet. Sisällyttäminen tapahtui heinäkuun ja joulukuun 2008 kaikki potilaat jos allekirjoitettu, tietoon perustuva suostumus (Ethical komitea hyväksyminen H-B-2008-049) ja Tanskan tietosuojavirasto (2008-41-2138). Koepaloja laitettiin RNAlater (Ambion) leikkaussalissa ja myöhemmin jäädytettiin -80 ° C: ssa, kunnes RNA.
RNA ja qPCR analysoi
RNA eristettiin käyttäen TRIzol (Invitrogen) valmistajan. miRNA mentymisprofiili arvioitiin käyttäen Taqman miRNA määrityksiä (Applied Biosystems) ja HSA /mmu-miR-449A ja b, HSA /mmu-miR-34a, b ja c sekä rnu44 tai HSA /mmu-miR-191. Alukesekvenssit Affymetrix tavoitteiden validointi luetellaan lisätiedosto 1, taulukko S1.
Soluviljely
SNU638 ja MKN74 kasvatettiin RPMI-1640 (Gibco), jossa 10% FBS (Hyclone), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Invitrogen), ja niitä inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO 2. HCT116-solut (paino- ja p53 - /- kasvatettiin McCoyn 5A-(Gibco), jossa oli 10% FBS: ää (Hyclone) ja 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Invitrogen), ja niitä inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO 2. HEK293 ja MEF-solut (paino- ja p53 - /-) kasvatettiin DMEM: ssä (Gibco), jossa oli 10% FBS: ää (Hyclone), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Invitrogen), ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5% CO 2.
miRNA esiasteiden ja siRNA
miRNA esiasteita ostettiin Ambion, HSA-miR-449A (PM11521), HSA-miR-449b (PM11127) ja HSA-miR-34a ( PM11030).
Cell kasvun analyysejä
SNU638-soluja siirrostettiin 24-kuoppalevyille ja transfektoitiin seuraavana päivänä 50 nM miRNA duplex tai siRNA käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen). solut vahvistettu ilmoitettuina ajankohtina 4% paraformaldehydiä , värjättiin 0,1% kristalliviolettiliuoksella ja suspendoitiin uudelleen 10% etikkahappoon. Näytteen absorbanssi mitattiin 620 nm: ssä.
Cell cycle FACS-analyysit
SNU638 ja MKN74 solut ympättiin 2 x 10 6 solua kohden 10 cm levy ja transfektoidaan 50 nM miRNA duplex (Ambion) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Solut kerättiin 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen, värjättiin DNA-pitoisuus käyttäen propidiumjodidia (PI) ja analysoitiin FACS Calibur virtaussytometrillä (Becton-Dickinson). Lyhyesti, solut kerättiin trypsinisaatiolla ja pestiin kerran PBS: llä ennen kuin se vahvistaa yön yli 70% EtOH. Värjätä DNA, solut pelletoitiin, suspendoitiin uudelleen 100 ui: aan EtOH: a ja värjättiin 1 tunnin ajan 300 ul: PI-liuosta (0,05 mg /ml PI, 20 ug /ml RNaasi A: 0,1% BSA).
Vanheneminen analyysit
SNU638 solut ympättiin 400.000 solua kohden 6-hyvin-levy ja transfektoidaan 50 nM miRNA duplex (Ambion) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Neljä päivää transfektion jälkeen solut pestiin PBS: llä ja fiksoitiin 5 minuutin ajan huoneen lämpötilassa 2% formaldehydi /0,2% glutaarialdehydiä. Solut pestiin kahdesti PBS: ssä, pH 6,0, ennen kuin ne värjättiin tuoreita vanhenemiseen liittyy β-Gal-värjäys-liuosta (1 mg /ml 5-bromi-4-kloori-3-indolyyli-βD-galaktosidi (X-Gal), 0,12 mM K 3Fe [CN] 6, 0,12 mM K 4Fe [CN] 6, 1 mM MgCl 2 PBS: ssä pH 6,0) yön yli 37 ° C: ssa ilman CO 2 tarjontaa . Solut pestiin kerran PBS: ssä (pH 6,0) kanssa ja sitä tarkasteltiin mikroskoopilla.
Vasta-aineet ja western blot-analyysit
SNU638 ympättiin 2 x 10 6 solua per 10 cm: n levy, transfektoitiin kahdesti kahden peräkkäisen päivää 50 nM miRNA duplexes käyttäen Lipofectamine 2000 mukaista valmistajan (Invitrogen). Solut kerättiin trypsinisaatiolla, pestiin kerran PBS: llä ja lyysattiin RIPA-puskuriin (150 mM NaCl, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS, 1% Igepal, 50 mM Tris-HCI, pH 8, 2 mM EDTA), jota oli täydennetty 1 mM DTT, 1 mM Pefabloc, 1 mM NaV3, 10 mM NaF ja 1 x täydellinen mini proteaasiestäjäseostabletit tablettia. 25 ug proteiinia /kaista erotettiin 4-20% NuPAGE Bis-Tris geeleillä (Invitrogen) ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Ensisijainen vasta käytettiin MET (Cell Signal 4560), MYC (Cell Signal 9402), GMNN (Santa Cruz Sc-53923), VCL (Sigma V9131), TP53 (Santa Cruz Sc-126), CDKN1A (Santa Cruz Sc-6246) , CDK6 (Santa Cruz Sc-177), HDAC1 (Santa Cruz Sc-7872), CCNE2 (Cell Signal 4132), TUBB (Abcam ab11304), PARP (Cell Signal 9542) ja halkaistut CASP3 (Cell Signal 9661).
microarray analysoi
Pieni RNA: t (< 200 nt) on eristetty Invitrogen PureLink miRNA Isolation Kit fundic ja antral kudosta 1) gastriini
KO hiiret ja iän ja sukupuolen Hyväksytty C57BL6 /J verrokkihiirten, ja 2) C57BL6 /J hiiret infektoitiin H. pylori
ja infektoitumattomien iän ja sukupuolen Hyväksytty C57BL6 /J verrokkihiirten, (n = 4 kussakin ryhmässä). Laatu yksittäisiä pieniä RNA: iden määritettiin käyttämällä Small RNA Pitoisuus Agilent Bioanalyzer. 500 ng pienten RNA leimattiin Genisphere FlashTag Kit ja hybridisoitiin Invitrogen NCode Multi-Species miRNA Microarray V2 Maui hybridisaatio asemalle. Jalostettu objektilasit skannattiin Agilent DNA-siru skanneri. Olevia kuvia analysoitiin ja suhde mediaani normalisoidaan käyttäen GenePix Pro 6.0. Neljä biologiset rinnakkaista käytettiin kutakin vertailua. Näytteet hybridisoitiin neljä taulukot dual väri väriaine swap mikrosirujen koesuunnittelun. BRB ArrayTools käytettiin kertaluokkamuutos ja tilastollisia laskelmia. Valitut miRNA dataa erilaisia ​​analyysi validoitiin käyttäen TaqMan reaaliaikainen PCR miRNA määrityksiä. Tiedot talletetaan ArrayExpress hyväksymisen.
MRNA paneelit
SNU638 transfektoitiin 50 nM miR-34a tai miR-449b duplekseja siglo siRNA käytettiin negatiivisena kontrollina. Kokonais-RNA uutettiin 24 tuntia transfektion jälkeen käyttäen TRIzol reagenssia. Affymetrix mikrosiruanalyysi (HG-U133 Plus 2.0 ihmisen) suoritettiin klo sirukeskuksella, Rigshospitalet, Copenhagen University Hospital. Kokeet ajettiin joko kolmena rinnakkaisena tai nelinkertaisesti. Tiedot talletetaan ArrayExpress hyväksymisen.
Vektorit rakentaminen ja toimittaja analyysit
3'UTRs of HDAC1
, SIRT1
, MET
, GMNN
ja CCNE2
hallussapidosta miR-449 sitoutumiskohtia kloonattiin alavirtaan lusiferaasireportterigeenin in pMIR-REPORT vektori-järjestelmä (Ambion). Quickchange mutageneesillä (Stratagene) käytettiin indusoimaan kahden pisteen mutaatioita siemenen alueelle. Mutageneesialukkeiksi sekvenssit on lueteltu Additional tiedosto 1, taulukko S1.
HEK293-solut ympättiin 96-kuoppalevyille ja transfektoidaan 20 nM miRNA esiaste tai salattu siRNA ohjaus, 20-50ng of sivektorissa (pMIR-raportti) ja 5 ng Renillan vektori (PRL-TK) lipofektamiinin avulla 2000 (Invitrogen). Solut kerättiin 24 tuntia transfektion jälkeen ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä Dual-Glo lusiferaasianalyysissä (Promega).
Microarray-analyysi
Microarray ilmentymisen tulokset prosessoitiin käyttämällä "affy" paketti Bioconductor [27]. Koetinsarjaa voimakkuudet tehtiin yhteenveto ja quantile normalisoidaan käyttäen Bioconductor RMA ja VSN paketteja. Erilainen ekspressio määritettiin per probeset käyttäen t-testiä. Koetinsarjojen oli kartoitettu Ensembl selostukset (versio 49) käyttäen kuvaukset tarjotaan BioMart. Probesets, että kartoitetaan kahteen eri Ensembl geenejä heitettiin pois.
Arviointi maailmanlaajuisen down-regulation of mikroRNA kohdegeenien
3'UTRs, 5'UTRs ja koodaavat sekvenssit transkriptien skannattujen vastaavia 6mer, 7mer ja 8mer miRNA siemen sivustoja (täydentävä asentoon 2-7, 2-8, ja 2-9 on miRNA). Global analyysi miRNA kohde alassäätöä arvioitiin käyttämällä pisin 3'UTR sekvenssi per geeni välttää vääristymä geenien monia transkriptio isoformeja. Me hävittää selostukset kanssa 3'UTR sekvenssit lyhyempi kuin 50 nt. Globaalisti arvioida, miRNA kohdegeenien olivat alassäädetty jälkeen miRNA transfektion testasimme nollahypoteesi, että ilmaisu muutos jakelu miRNA tavoitteet (joiden 7mer kohdesivusto) oli yhtä suuri jakeluun ilmaisivat geenien ilman ennustaa kohdesivustot käyttämällä ei-parametrinen Wilcoxonin-sum test. Samanlaista lähestymistapaa käytettiin arvioimaan alas-säätely geenien kanssa miRNA tavoite sivustoja koodaavat alueet ja 5'UTRs mRNA.
Tyhjentävä tilastollinen arvio sanojen korreloi alassäätöä
Käytimme aiemmin julkaistu parametriton rank-pohjainen statistiikkaa tyhjentävästi arvioida korrelaatio sanan esiintymät 3'UTRs ja muutos geenien ilmentyminen jälkeen miRNA transfektion [28, 29]. Geenit lajiteltiin ilmentyminen aiheuttama muutos transfektiolla miR-34a tai miR-449b, ja korrelaatio alassäätöä testattiin kaikki sanat pituudeltaan 5-7 (N = 21 504).
Tilastolliset testit
opiskelijat t-testi Welchin korjauksen.
tulokset
miR-449b on alaspäin säännellään antrum sekä gastriini
KO hiiret ja helikobakteeri
tartunnan hiirillä
Gastrin
hiirien ovat hapoton joilla on taipumusta kehittää antral liikakasvun ja mahalaukun adenoomien ajan (kuvio 1) [6, 12]. Jotta tiedettäisiin MikroRNA vapautettu kehittämisen aikana mahasyövän, tutkimme miRNA ekspressioprofiileja mahalaukun neoplasioihin alkaen Gastrin
hiirten avulla miRNA mikrosiruja. Kuten taulukosta 1, 20 MikroRNA merkittävästi vapautettiin tyrmäys hiirillä verrattuna villin tyypin pesuetove- valvontaa, kolme miRNA poikkeavat yli kaksinkertaiseksi, miR-7 on säädelty ja miR-709 ja miR-449b ollessa alassäädetty antrumin gastriini
hiirten verrattuna villin tyyppejä. Edelleen vahvistaa miR-449 vapauttamisen aikana mahasyöpä kehitystä, tarkastelimme ilmaisunsa villityypin hiiren antrum kudoksiin tartunnan H. pylori
. Mielenkiintoista, miRNA paneelit osoittanut erityistä alas-säätely miR-449b in H.pylori
tartunnan hiirillä (taulukko 2 ja Additional tiedosto 1, kuva S1). Kuva 1 Vanha Gastrin hiirten mahalaukun adenoomia. Antrum kohdat eristetty 12-16viikko ikäisten hiirten (vasen paneeli), 12-18 kuukausi vanhoja hiiriä (keskimmäinen paneeli) ja enintään 18 kuukautta hiirillä (oikea paneeli), villityypin (yläpaneeli) ja gastriini
hiirien (alempi paneeli). Kohdissa adenooma kehitystä antrumiin kudosten gastriini
aihiot verrattuna villin tyyppejä.
Taulukko 1 miRNA vapautettiin Gastrin
hiirien
miRNA Name
loki2-kertainen
p-arvo
miRNA Name

Log2-fold

p-value

mmu-miR-709
-1.73
7.0E-06
mmu-miR-422b
0.44
4.6E-02
mmu-miR-449b
-1.37
1.6E-03
mmu-miR-199a*
0.50
7.7E-03
mmu-miR-805
-1.01
7.5E-03
mmu-miR-25
0.51
1.6E-02
mmu-miR-706
-0.98
3.1E-03
mmu-miR-27b
0.56
5.1E-03
mmu-miR-467a
-0.88
2.8E-02
mmu-miR-182
0.56
1.8E-02
mmu-miR-696
-0.83
7.1E-03
mmu-miR-30a-3p
0.59
2.2E-02
mmu-miR-667
-0.66
2.3E-02
mmu-miR-10a
0.70
7.1E-03
mmu-miR-690
-0.28
1.7E-02
mmu-miR-152
0.70
2.3E-02
mmu-miR-18
0.29
3.7E-02
mmu-miR-1
0.77
7.1E-03
mmu-miR-143
0.34
2.3E-02
mmu-miR-7
1.06
4.9E-03
Luettelo merkittävästi vapautettiin miRNA mahalaukun neoplasioihin alkaen Gastrin
hiirten verrattuna villin tyyppejä.
Taulukko 2 miRNA vapautettiin H.pylori
tartunnan kudosten
miRNA nimi

Taita change

p-value

mmu-miR-122a
-3.247
0.000788
mmu-miR-449b
-0.879
0.045214
Luettelo merkittävästi vapautettiin miRNA villin tyypin hiirissä antrum tartunnan H.pylori
verrattuna ei-tartunnan antrumiin.
MiR-449 estää solusyklin etenemisen ja aiheuttaa vanhenemista
osoittaneen alas-säätely miR-449 ilmentyminen mahasyövistä halusimme tutkia vaikutuksen uudelleen ilmentävien miR-449 mahasyövän solulinjoissa. Mielenkiintoista ole havaittavaa ekspressiota miR-449 perheen havaittiin yli paneeli mahalaukun solulinjojen SNU638, SNU5, SNU216, SNU601 ja MKN74 ylläpitää käsite miR-449, joilla on kasvain-suppressiivinen toimintoja (tuloksia ei ole esitetty). MIR-449 perhe koostuu miR-449A ja b ihmisissä ja miR-449A, b ja c hiirillä. Mielenkiintoista, niillä on sama siemen sekvenssi kuin miR-34 perheen ja ovat siten odotetaan säännellä päällekkäisiä ikäluokat kohdegeenien (kuvio 2a). Arvioimaan toimintaa miR-449 mahalaukun solulinjoissa me uudelleen käyttöön miR-449b in SNU638 ja MKN74 soluja. Verrattuna negatiivinen kontrolli MikroRNA, uudelleen käyttöönotto miR-449b voimakkaasti vaikuttanut leviämisen SNU638 soluja (kuvio 2b) ja silmämääräinen tarkastus soluista osoitti apoptoosin induktion ja solujen vanhenemista (kuva 2c, ja Additional tiedosto 1, kuva S2). Virtaussytometrianalyysin propidiumjodidia-värjätty transfektoitujen solujen miR-449b osoitti G 1 kertymistä 48 tuntia transfektion jälkeen, minkä jälkeen 72 tuntia transfektion ainetta kerääntyy solujen sub G 1 osa viittaavia solun kuolema (kuvio 2d). Induktiota solun vanhenemista varmistettiin happamien beeta gal-värjäyksellä käyttäen miR-34a positiivisena kontrollina microRNA (kuvio 2e). Poissulkemiseksi solulinjassa erityisiä vaikutuksia, toiminnalliset seuraukset miR-449 uudelleen käyttöön suhteen solukierron pysähtymisen tarkastettiin MKN74 soluissa (Additional tiedosto 1, kuva S3). Siten uudelleen aloittamisen miR-449 vaikuttaa kielteisesti leviämisen mahasyövän solulinjojen kanssa samanaikaisesti induktion vanhenemista ja apoptoosia yhdenmukaiset miR-449 ottaa kasvain ehkäisevästä toimintoja. Kuvio 2 miR-449 on osa miR-34 perheen ja estää soluproliferaatiota. A - miR-449 on osa miR-34 perheen ja on evolutiivisesti konservoitunut. B - miR-449 uudelleen käyttöön ihmisen mahan solulinjoihin (SNU638) estää soluproliferaatiota (punainen viiva) verrattuna Salatun ohjaus (sininen viiva) ja miR-146 ohjaus (musta viiva). Virhe pylväät edustavat S.D. C - silmämääräinen tarkastus soluproliferaation esto ja vanhenemista kaltainen fenotyypin miR-449 uudelleen viemistä SNU638 soluihin (alempi paneeli) verrattuna salattu transfektion ohjaus (ylempi paneeli). D - FACS solusyklin analyysi osoittaa sub-G1 kertymistä SNU638 solujen 72 tunnin kuluttua miR-449 uudelleen käyttöön (oikea histogrammi) verrattuna Salatun transfektio ohjaus (vasen histogrammi) Taulukossa esitetään solu kertymistä G1 murto upon miR-449 re -introduction verrattuna salattu RNA valvontaa 48 tuntia transfektion, jonka jälkeen siirtyminen osa-G1 jae 72 tuntia transfektion osoittaa solukuolemaa. E - senescent fenotyyppi SNU638 solujen upon miR-449 ja miR-34a positiivinen kontrolli uudelleen käyttöön esitetty hapan β-gal-määritys verrattuna RNA salattu valvontaa.
Yhteinen siemen sekvenssi miR-449b ja miR-34a aiheuttaa erittäin korreloi ilme muuttuu
luonnehtia selostukset ohjataan miR-449 ja onko miR-449 säätelee eri transkriptien kuin miR-34a, SNU638 solut ekspressioprofiileja tutkittiin 24 tuntia transfektion Mir-449b tai miR-34a ja differentiaalisesti ilmaisi selostukset tunnistettu. Huomasimme, että mRNA: iden ennustettu miRNA kohdesivustot (7 mer siemenet sivusto) 3'UTR olivat huomattavasti alassäädetty verrattuna mRNA: iden ilman ennakoi maalin sivustoja transfektion jälkeen miR-449b (p < 1.2E-70, kaksisuuntainen Wilcoxonin-sum test), (Additional tiedosto 1, kuva S4a). mRNA: t, jotka ovat ennustettu miRNA siemen kohdesivustot koodausalueilla todettiin myös olevan huomattavasti alassäädetty (p < 9.9e-25), kun taas mRNA: iden sivustoja 5'UTRs olivat vain marginaalisesti alassäädetty (p < 5.3e- 2). Ilmaisu aiheuttamien muutosten transfektiolla kypsä miR-449b ja miR-34a korreloivat voimakkaasti huolimatta eroavaisuuksia kypsän sekvenssien ulkopuolelle siemenen alueen (Pearsonin korrelaatiokerroin R = 0,94, p = 0), (Additional tiedosto 1, kuva S4b). Me tyhjentävästi arvioitiin kaikki oligonukleotidit (sanaa), jonka pituus on 5-7 korrelaation alassäätö jälkeen miR-449b ja miR-34a transfektio (katso menetelmät). Yhdenmukainen monien aiempien tutkimusten, tämä analyysi paljasti jaetun miR-34a /449b siemen sivuston 3'UTR sana eniten korreloi alassäätöä kahdessa kokeessa (Additional tiedosto 1, kuva S4c).
MiR-449 säätelee lukuisia solusyklin ohjaimet
ilmentymisen profiilit käytettiin tunnistamaan ekspressoituu differentiaalisesti transkriptien transfektoiduissa soluissa miR-449b tai kontrolleihin (Additional tiedosto 1, taulukko S2). Polku aktivointi analyysi perustuu differentiaalisesti säännelty selostukset osoittaa, että miR-449 pääasiassa ohjaa selostukset koodaavat proteiineja, jotka liittyvät soluvaurioita vastausten solusyklikontrollin, tulehdus ja syöpään väyliä (kuva 3a). Keskittyminen joukko oletettuja kohdegeenien vakiintunut rooleja tuumorigeneesiä, varmistimme alassäätö by miR-449 met proto onkogeenin (MET
), sykliiniriippuvaiset kinaasi 6 (CDK6) B, geminin (GMNN ) B, myelocytomatosis virus- onkogeenien homologi (MYC) B, Sirtuin 1 (SIRT1
) ja histonideasetylaasi 1 (HDAC1) B on transkriptio tasolla (kuvio 3b). Western blot analyysit vahvistivat kykyä miR-449 vaimennussäätelevät MET, GMNN, MYC, SIRT1, sykliini E2 (CCNE2) ja HDAC1 proteiinitasolla siinä määrin samanlainen kuin saavutetaan uudelleen aloittamisen miR-34a (kuvio 3c). Osajoukon kohdegeenien, kuten MET
, GMNN, CCNE2
, SIRT1
ja HDAC1
, olemme vahvistaneet suoraa vuorovaikutusta miR-449 kohdegeenin 3 'UTR käyttäen Luciferase Assay (kuva 3d ). Kuva 3 miR-449 tavoitteet solukierron ohjain geenejä. A - Nerokkuus Pathway Analysis (IPA) on vapautettu geenien upon miR-449 uudelleen viemistä SNU638 soluihin osoittaa rikastuminen geenin luokkia syöpä, solukuoleman ja solusyklin polkuja mm. B - qPCR validointi Affymetrix paneelit osoittavat alas-säätely MET
, CDK6
, GMNN
, MYC
ja HDAC1
upon miR-449 uudelleen käyttöön verrattuna salattu RNA valvontaa. C - Western blot validointi alas geenien upon miR-449 uudelleen viemistä SNU638 soluihin verrattuna salattu RNA valvontaa. Vinkuliini (VCL) ja tubuliinin beeta (TUBB) käytettiin lastaus valvonta D - todentaminen suoran ja toiminnallisen tavoitteen sitova käyttämällä lusiferaasia konstruktioita tilalla villityypin 3'UTRs ja mutatoitunut 3'UTRs (kaksi mutaatiota miR-449 sitoutumiskohta), * ilmaisee tilastollista merkittävyyttä lusiferaasiekspressio väliin villityypin 3'UTRs transfektoitu miR449a /b verrattuna RNA salattu ohjaus, # merkitsee tilastollista eroa lusiferaasiekspressio väliin villityypin 3'UTRs verrattuna mutantti 3'UTRs transfektoitu miR-449A ja asennuspalveli- 449b. "Ns" ei merkittävää p-arvo > 0.05, "*" tai "#" merkittävä 0,01 < p-arvo < 0,05, "**" tai "##" erittäin merkittävä 0,01 < p-arvo < 0,001, "***" tai "###" erittäin merkittävä p-arvo < 0,001
Siten miR-449 suoraan suunnattu solusyklin säätelygeenien johdonmukaisia ​​tuumorisuppressorina funktio ja solukierron pidätyksen huomioitava miR-449 uudelleen tuomista syöpäsolulinjoja.
MiR-449 indusoi p53 ilmaus mutta ei säännellä p53
As miR-34a aiemmin oli toimisi alavirtaan p53 [30-33], analysoimme jos myös miR-449A /b liittyivät p53. Tämä on lisäksi kannustanut läsnäolo oletetun p53 sitoutumiskohdan 10 kb ylävirtaan ihmisen miR-449 (tuloksia ei ole esitetty). Siksi aiheuttama p53 DNA vaurioita UV tai 5-fluorourasiilin (5FU) neljässä eri järjestelmissä, HCT116 ja MEF villityypin ja p53 Knockout soluja (Additional tiedosto 1, kuva S5a). Kuitenkaan mitään merkittävää muutosta miR-449 ekspressiota havaittiin jälkeen p53-reitin aktivaatio (Additional tiedosto 1, kuva S5b). Lopuksi emme löytäneet mitään todisteita siitä, että miR-449 on transkription kohteena p53. Toisaalta olemme havainneet, että miR-449A /b pystyy aiheuttamaan aktivaatioon p53, aktivointi p53-vaste-geenejä, kuten p21 ja apoptoosin induktion osoituksena pilkkomalla kaspaasi 3 (CASP3) ja poly (ADP-riboosi ) polymeraasi 1 (PARP) (kuva 4). Kohti ymmärtää mekanismi, jonka miR-449 tekee tämän olemme tutkineet vaikutusta miR-449 on SIRT1 ja HDAC1. SIRT1 ja HDAC1 ovat deasetylaaseja jotka estävät muun muassa aktivointi p53 ja miR-34: n on osoitettu tukahduttaa SIRT1 [34]. Me validoitu spesifistä sitoutumista miR-449 SIRT1 ja HDAC1 käyttäen 3'UTR Lusiferaasimäärityksiä (kuvio 3d). Kuvio 4 miR-449 aktivoi p53-reitin. Western blot-analyysi jossa kasvua p53-proteiinin upon miR-449 ja positiivinen kontrolli miR-34a uudelleen viemistä SNU638 soluihin verrattuna RNA salatun ohjaus sekä aktivointi p53 alavirran kohde p21 ja apoptoosin markkereita lohkaistiin CASP3 ja PARP. Vinkuliinin (VCL) ja tubuliinin beta (TUBB) käytettiin lastaus valvontaa.
Näin ollen meidän spekuloida, että miR-449 indusoi apoptoosia estämällä histonideasetylaasi HDAC1 ja SIRT1 johtaa p53-reitin aktivointi siten apoptoosin markkereita pilkkoa CASP3 ja PARP.
miR-449 säätyy alas ihmisen syöpien
arvioimiseksi tärkeyden miR-449 ihmisen maligniteettien tutkimme seuraavaksi ilmentymistä miR-449 10 mahasyövässä koepaloja. Mikä tärkeintä, löysimme molemmat miR-449A ja b olevan huomattavasti alassäädetty tai puuttuu 8 10 ensisijaisen syöpien. Lisäksi ilmaus miR-449A ja b näyttävät olevan yhteistyön säännelty (kuva 5a). Emme löytäneet mitään korrelaatiota väheneminen miR-449 ilmaisun ja kliiniset ominaisuudet syöpä (kuva 5b). Analyysit genomisen DNA kasvaimista ei löytänyt näyttöä katoamisesta tai hyper-metylaatio miR-449 loci käyttäen metylaatiospesifistä sulamiskäyräanalyysi (MS-MCA) osoittaa transkription säätely alaspäin ilmaisun (tuloksia ei esitetty). Siten kanssa tietoja kahdella hiiren mallia mahalaukun tulehdusta ja hyperplasiaa, ilmaus miR-449 on alassäädetty ihmisen syöpien. Kuva 5 miR-449 on alaspäin säännellään ihmisen syöpien. qPCR analyysi (ylempi paneeli) osoittaa alaspäin säätely miR-449 ilmentymistä 8 mahasyövän kudoksiin verrattuna miR-449 ilmentymisen näytteessä verrokit (katkoviiva). U44 käytettiin endogeeninen kontrolli. Taulukko kliinistä tietoa potilaista (alempi kuva). "Ns" ei merkittävää p-arvo > 0.05, "*" merkittävä 0,01 < p-arvo < 0,05, "**" erittäin merkittävä 0,01 < p-arvo < 0,001, "***" erittäin merkittävä p-arvo < 0,001
Keskustelu
Mahalaukun syöpä on erittäin tappava maligniteetti yli 21500 uutta tapausta vuosittain pelkästään Yhdysvalloissa [35]. Tauti on usein havaitaan myöhässä ja 5 vuoden pysyvyys on näin ollen alle 20% [36]. Näin ollen on tärkeää ymmärtää etiologiassa ja etenemisen vaiheissa taudin. Tärkeys bakteeri-, ympäristö- ja isäntä geneettisiä riskitekijöitä mahasyövän on tutkittu, mutta vähemmän tiedetään molekyylitason sairauden etenemistä [37, 38]. Muun muassa p53-reitin inaktivointi ilmoitetaan 30-60% mahasyövistä [39, 40] ja viimeaikaiset tutkimukset viittaavat helikobakteeri
suoraan modulaatio p53-geenin tai sen loppupään tavoitteet [41]. Toinen yleinen muutos, mahalaukun syöpä on häiriön solusyklin ohjaus yli ilmentyminen sykliini E1, joka liittyy kasvaimen aggressiivisuus ja imusolmukkeiden etäpesäkkeiden [42, 43].

• Vaikutus N-asetyyli-L-kysteiiniä infuusiona sytokiinitasoja ja mahalaukun intramucosal pH vakavissa sepsis
• Hyvänlaatuinen maha-koliikki avanne on nainen esittelee laihtuminen ja ajoittainen oksentelu: tapausselostus