miR-449 inibe a proliferação de células e é sub-regulada no cancro gástrico

miR-449 inibe a proliferação celular e é regulada para baixo no câncer gástrico da arte abstracta
Fundo
O câncer gástrico é o quarto tipo de câncer mais comum no mundo ea segunda causa mais comum de morte por câncer relacionados. O desenvolvimento do cancro gástrico é principalmente associada com a infecção por H. pylori
levando a um foco de estudos patológicos sobre os factores ambientais e bacterianas, e em menor extensão no desenvolvimento mecanicista do tumor. Os microRNAs são pequenas moléculas de RNA não-codificantes envolvidos na regulação gênica pós-transcricional. Eles são encontrados para regular os genes envolvidos em diversas funções biológicas e alterações na expressão de microARN têm sido associados à patogénese de muitas doenças malignas. O presente estudo se concentra na identificação microRNAs envolvidos na carcinogênese gástrica e explorar sua relevância mecanicista por caracterizar seus alvos.
Resultado
microarrays Invitrogen NCode miRNA identificados miR-449 a ser reduzida em 1-year-old gastrina
KO e no H. Pylori
tecidos gástricos infectados em comparação com tecidos de animais de tipo selvagem. A taxa de crescimento das linhas de células gástricas que sobre-expressam o miR-449 foi inibida em 60% em comparação com os controlos. FACS análise do ciclo celular de miR-449 que sobre-expressam células mostraram um aumento significativo na sub-L uma fracção indicativo de apoptose. ß-gal ensaios indicaram um fenótipo senescente de linhas de células gástricas que sobre-expressam o miR-449. Affymetrix matrizes 133v2 identificados GMNN
, MET, CCNE2, SIRT1 Comprar e CDK6
como miR-449 alvos. Os ensaios de luciferase foram utilizados para confirmar GMNN
, MET
, CCNE2 Comprar e SIRT1
como alvos diretos. Também mostram que o miR-449 sobre-expressão de p53 activada por p21 e o seu alvo a jusante, bem como o CASP3 marcadores de apoptose clivada e PARP. Importante, qPCR análises mostraram uma perda de miR-449 expressão em tumores gástricos clínicos em humanos em comparação com tecidos normais.

Conclusões Neste estudo, nós documentar uma expressão diminuída de miR-449 em ratinhos KO gastrina e
confirmou ainda mais a sua perda em tumores gástricos humanos. Nós investigamos a função de miR-449, identificando seus alvos diretos. Além disso, mostramos que miR-449 induz senescência e apoptose pela ativação da via p53.
Fundo
O câncer gástrico está entre os cinco cancros mais comuns no mundo e a segunda causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer [1] . É principalmente, mas não exclusivamente, causada pela infecção por H. pylori
[2] como nem todos de H. pylori
pessoas infectadas desenvolvem tumores [3]. Outros factores envolvidos no desenvolvimento do cancro gástrico incluem o grau e tipo de resposta inflamatória [2], bem como os níveis da hormona gastrina
[4, 5]. Vários estudos têm mostrado que tanto a hipergastrinemia [6, 7] e a falta de gastrina [5] contribuem para a patogénese do cancro gástrico. Acloridria é uma característica comum de modelos de ratos propensos ao desenvolvimento de metaplasia e câncer [6, 8, 9]. Gastrina
camundongos knockout são achlorhydric [10], favorecendo um crescimento excessivo de bactérias gástrica [11, 12], e infecções gástricas bacterianas crônicas levam a metaplasia gástrica que pode evoluir para câncer gástrico [6, 12].
Desde a sua descoberta microARNs, foram encontrados implicados numa grande variedade de processos normais e patológicos [13]. MicroRNAs exercer as suas funções reguladoras posttranscriptionally ligando-se a sequência complementar parcialmente motifs predominantemente na UTR 3 'de mRNAs alvo que resulta em ARNm e desestabilização repressão translacional [14]. De um ponto de vista biológico, microRNAs estão desafiando objetos para estudar como eles regulam coortes de genes-alvo, que não são facilmente identificados. De um ponto de vista terapêutico, microRNAs são altamente interessante como vários estudos têm demonstrado o poder de microRNAs como biomarcadores e estudos pré-clínicos iniciais estabeleceram que microRNAs podem ser terapeuticamente alvo in vivo [15].
Profiling estudos têm evidenciado microRNA desregulamentação um largo espectro de doenças, incluindo todos os principais cancros [16]. MicroRNAs provável afetar os processos tumorigênicas em dois níveis. Em primeiro lugar, vários estudos estabeleceram papéis pró-oncogênicos ou tumor-supressora de microRNAs individuais que ligam firmemente estes a etiologia do câncer, como exemplificado por miR-155, miR-10b e miR-21 [17-19]. Em segundo lugar, o sistema de regulação microARN per se parece ter funções supressoras de tumor como a ablação genética de factores microARN biogênese chave, tais como Dicer, aumentar fortemente susceptibilidade a cancro [20] e a perda de mutações funcionais foram identificados em importantes factores de transformação microRNAs em tumores humanos [21-23].
neste estudo, abordamos a importância de microRNAs em câncer gástrico aproveitando a gastrina
modelo de camundongo knockout e H. pylori
de ratinhos de tipo selvagem. Identificamos miR-449 como significativamente regulada negativamente ou perdido em modelos de ratinho de cancro gástrico, bem como em tumores gástricos humanos primários. Identificação de alvos de mRNA revela que este microRNA provável exerce funções supressoras de tumor através da regulação concertada de uma coorte de reguladores do ciclo celular associados ao câncer, incluindo MET, GMNN, CCNE2, SIRT1, e HDAC1.
Métodos
Mice
foram utilizados três grupos diferentes de idade (12-16 semanas, 1 ano ou 1 ano e meio) de tipo selvagem (wt) ou gastrina
camundongos knockout (KO). Todos os ratinhos foram em uma mistura 129 /SvJ, C57BL /6J, retrocruzadas, pelo menos, quatro vezes a murganhos C57BL /6J [12]. Os ratos foram mantidos sob condições específicas livres de patógenos e monitorados de acordo com a Federação das Associações de Ciência Animal Laboratório Europeu recomendação [24] com 12 h de luz e 12 h ciclos escuros.
Infecção por H. pylori
C57BL6 /J ratinhos (n = 10) foram inoculados com um clone não-rato-adaptado de H. pylori
estirpe 67:21, originalmente isolado a partir de uma biópsia antral obtido a partir de uma fêmea sueca com úlcera gástrica. A tensão é VacA + e contém toda a patogenicidade ilha cag (PAI) com a estabilidade genética no Cag PAI [25]. Os ratinhos foram inoculados cada segundo dia (três vezes) durante um período de 5 dias. O ADN foi extraído e analisado para a presença de espécies de Helicobacter utilizando um ensaio de electroforese em gel de gradiente de semi-internos em cadeia da polimerase-desnaturante reacção, específica para o género Helicobacter, como descrito anteriormente [26]. Um grupo combinado de ratinhos C57BL6 /J não infectadas foram utilizadas como controlos.
Os estômagos de todos os murganhos foram dissecados em fundus e antro antes da extracção do ARN. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Dinamarquês Animal Welfare (2005 /562-40) e da Floresta dinamarquesa e Agência Natureza (20010077355/6). Seções antro
Ratos
ratos foram sacrificados por deslocamento cervical. O antro foi removido, lavado suavemente com PBS gelado, congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C até à extracção do ARN.
Analisa amostras clínicas
biopsias de cancro gástrico e os tecidos normais adjacentes foram obtidos a partir de pacientes submetidos a cirurgia para câncer gástrico no Departamento de cirurgia Gastrointestinal, Rigshospitalet. A inclusão ocorreu em julho a dezembro de 2008 e todos os pacientes assinaram documento de consentimento informado (Ethical aprovação do comitê de H-B-2008-049) e Agência de Protecção de Dados Dinamarquês (2008-41-2138). As biópsias foram colocados em RNAlater (Ambion) na sala de operações e subsequentemente congeladas a -80 ° C até à extracção do ARN.
Extracção de ARN e análises de qPCR
ARN foi extraído utilizando TRIzol (Invitrogen) de acordo com o fabricante. miRNA perfil de expressão foi avaliada usando ensaios Taqman miRNA (Applied Biosystems) para HSA /MMU-miR-449a e b, HSA /MMU-miR-34a, b e c e rnu44 ou HSA /MMU-miR-191. As sequências dos iniciadores para a validação de alvos Affymetrix estão listados no ficheiro adicional de 1, tabela S1. cultura celular
SNU638 e MKN74 foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibco) com 10% de FBS (Hyclone), 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina (Invitrogen) e incubou-se a 37 ° C em 5% de CO 2. células HCT116 (WT e p53 - /- foram cultivadas em 5A de McCoy (Gibco) com 10% de FBS (Hyclone), e 100 U /ml de penicilina e 100 ug /mL de estreptomicina (Invitrogen) e incubou-se a 37 ° C em 5% de CO <. sub> 2 HEK293 e células MEF (em peso e p53 - /-) foram cultivadas em DMEM (Gibco) com 10% de FBS (Hyclone), 100 U /ml de penicilina e 100 ug /mL de estreptomicina (Invitrogen) e incubou-se a 37 ° C com 5% de CO 2.
precursores de miRNA e siRNA
precursores de miRNA foram adquiridos da Ambion, hsa-miR-449a (PM11521), HSA-miR-449b (PM11127) e HSA-miR-34a ( PM11030). analisa o crescimento celular
células SNU638
foram semeadas em placas de 24 poços e transfectaram-se no dia seguinte com 50 nM de miARN duplex de siRNA ou usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). as células foram fixadas em pontos de tempo indicados em 4% de paraformaldeído , corado numa solução de violeta de cristal a 0,1% e ressuspensas em ácido acético a 10%. mediu-se a absorvância da amostra a 620 nm.
ciclo celular FACS analisa
células SNU638 e MKN74 foram semeadas a 2 x 10 6 células por placa 10 centímetros e transfectadas com 50 nM de miARN duplex (Ambion) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). As células foram colhidas 48 e 72 horas pós-transfecção, corou-se para o teor de ADN utilizando iodeto de propídio (PI) e analisadas num citómetro de fluxo FACS Calibur (Becton-Dickinson). Resumidamente, as células foram colhidas por tripsinização e lavadas uma vez com PBS antes de se fixar durante a noite em 70% de EtOH. Para corar o ADN, as células foram sedimentadas, ressuspensas em 100 ul de EtOH e coradas durante 1 hora com 300 ul de solução de PI (0,05 mg /ml de PI, 20 ug /ml de ARNase A em 0,1% de BSA) analisa.
Senescência células
SNU638 foram semeadas a 400.000 células por poço de 6-placa e transfectadas com 50 nM de miARN duplex (Ambion) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Quatro dias após a transfecção, as células foram lavadas em PBS e fixadas durante 5 minutos à temperatura ambiente em 2% de formaldeído /0,2% de glutaraldeído. As células foram lavadas duas vezes em PBS pH 6,0 antes de serem coradas com β-Gal solução senescência fresco associada mancha (1 mg /ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-βD-galactósido (X-Gal), 0,12 K 3Fe [NC] 6, 0.12mm K 4Fe [NC] 6, 1 mM de MgCl 2 em PBS pH 6,0) durante a noite a 37 ° C, sem CO 2 oferta . As células foram lavadas uma vez em PBS (pH 6,0) e observadas ao microscópio.
Anticorpos e análises de Western blot
SNU638 foram semeadas a 2 x 10 6 células por placa de 10 cm, transfectadas duas vezes em dois sucessivos dias com duplexes de 50 nM de miARN utilizando Lipofectamine 2000 de acordo com o fabricante (Invitrogen). As células foram recolhidas por tripsinização, lavadas uma vez com PBS e lisadas em tampão de RIPA (NaCl 150 mM, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, 1% Igepal, 50 mM Tris-HCl pH 8, EDTA 2 mM) suplementado com 1 mM de DTT, 1 mM de Pefabloc, 1mM NaV3, 10 mM de NaF e 1X completas mini-inibidores da protease comprimidos de cocktail. 25 ug de proteína /pista foram resolvidos em géis de NuPAGE 4-20% Bis-Tris (Invitrogen) e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. Os anticorpos primários utilizados foram MET (sinal de celular 4560), MYC (Signal celular 94.02), GMNN (Santa Cruz Sc-53923), VCL (Sigma V9131), TP53 (Santa Cruz Sc-126), CDKN1A (Santa Cruz Sc-6246) , CDK6 (Santa Cruz Sc-177), HDAC1 (Santa Cruz Sc-7872), CCNE2 (Cell Signal 4132), TUBB (Abcam ab11304), PARP (sinal de celular 9542) e cindiu CASP3 (sinal de celular 9661).
analisa microarray
pequenos RNAs (< 200 nt) foram isolados com Invitrogen PureLink miRNA kit de isolamento a partir de tecido fúndica e antral a partir de 1) ratos gastrina
KO e idade e controle camundongos C57BL6 /J sexo correspondentes, e 2) C57BL6 /J ratinhos infectados com H. pylori
idade e sexo correspondentes não infectado e ratinhos de controlo C57BL6 /J, (N = 4 para cada grupo). A qualidade de pequenos RNAs isoladas foi determinada utilizando o Ensaio de pequeno ARN num Agilent Bioanalyzer. 500 ng de RNA pequeno foi marcado com Kit Genisphere FlashTag e hibridado com Invitrogen NCode Multi-Species miRNA Microarray V2 em uma estação de hibridação Maui. lâminas processadas foram digitalizados em um scanner de DNA microarrays Agilent. imagens resultantes foi analisada e proporção de mediana normalizados utilizando GenePix Pro 6.0. Quatro réplicas biológicas foram usadas para cada comparação. As amostras foram hibridadas com quatro matrizes em um design dual permuta microarray corante de cor experimental. ArrayTools BRB foram utilizados para a mudança vezes e cálculos estatísticos. dados de miRNA selecionados a partir da análise de matriz foram validados utilizando em tempo real ensaios de PCR miRNA TaqMan. Os dados serão depositados na ArrayExpress após a aceitação.
Matrizes de mRNA
SNU638 foram transfectadas com 50 nM de miR-34a ou miR-449b duplexes com Siglo siRNA usados ​​como controle negativo. O ARN total foi extraída de 24 horas pós-transf ecção usando o reagente TRIzol. análise de microarray Affymetrix (HG-U133 mais 2,0 humana) foi realizada no Centro de Microarray, Rigshospitalet, Copenhagen University Hospital. Os experimentos foram executados tanto em triplicado ou quadruplicado. Os dados serão depositados na ArrayExpress após a aceitação.
Ensaios construção vetores e repórter
Os 3'UTRs de HDAC1
, SIRT1
, MET
, GMNN Comprar e CCNE2
exploração locais de ligação de miR-449 foram clonados a jusante do repórter luciferase no sistema de vector PMIR-REPORT (Ambion). Site-Directed Quickchange kit de mutagénese (Stratagene) foi utilizado para induzir a duas mutações pontuais na região da semente. sequências de iniciadores de mutagénese estão listados no arquivo adicionais 1, mesa de S1.
células HEK293 foram semeadas em placas de 96 poços e transfectadas com 20 nM miRNA precursor ou mexidos controle siRNA, 20-50ng de vector luciferase (PMIR-report) e 5 ng de Renilla vetor (pRL-TK), utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen). As células foram colhidas 24 horas após a transfecção e a actividade de luciferase foi medida utilizando um ensaio de Dual-Glo luciferase (Promega). Análise Microarray
dados expressão Microarray foi processado usando o pacote 'affy' em BioConductor [27]. conjunto de intensidades de sonda foram resumidos e quantil normalizados utilizando os pacotes BioConductor RMA e VSN. A expressão diferencial foi determinada por conjunto de sondas usando um teste t. conjuntos de sondas foram mapeados para transcrições ENSEMBL (versão 49) usando mapeamentos fornecidos pelo Biomart. Sondas que mapearam a dois genes ENSEMBL diferentes foram descartados.
Avaliando down-regulação global de microRNA genes alvo Tours A 3'UTRs, 5'UTRs e sequências de codificação das transcrições foram digitalizados para combinar 6mer, 7mer e miRNA 8MER locais de semente (complementares à posição 2-7, 2-8 e 2-9 da miARN). Análise global da meta miRNA infra-regulação foi avaliada usando a sequência mais longa 3'UTR per gene para evitar viés introduzido por genes com muitas isoformas transcrição. Foram descartados transcritos com sequências 3'UTR mais curtos do que 50 nt. Para globalmente avaliar se genes alvo de miRNA foram regulados negativamente após miRNA transfecção, foi testada a hipótese nula de que a distribuição mudança expressão de alvos de miRNA (com um site de destino 7mer) foi igual à distribuição de todos os genes expressos, sem sites de destino previsto usando o não-paramétrico de Wilcoxon teste da soma de classificação. Uma abordagem semelhante foi utilizada para avaliar a infra-regulação de genes com sítios-alvo de miRNA em regiões e 5'UTRs de mRNAs de codificação.
Avaliação estatística exaustiva das palavras correlacionadas com a regulação negativa
Usamos um não-paramétrico publicado anteriormente -rank com base estatística para avaliar exaustivamente a correlação de ocorrências de palavras em 3'UTRs ea mudança na expressão gênica após miRNA transfecção [28, 29]. Genes foram classificadas pela mudança expressão induzida por transfecção de miR-34a ou miR-449b, ea correlação com a regulação negativa foi testado para todas as palavras de comprimento 5-7 (N = 21 504).
Os testes estatísticos
teste t de Student com correção de Welch.
Resultado
miR-449b é regulada negativamente no antro de ambos os ratos gastrina
KO e H. pylori
camundongos infectados
gastrina
camundongos knockout são achlorhydric com uma tendência para o desenvolvimento de hiperplasia antral gástrica e adenomas ao longo do tempo (figura 1) [6, 12]. A fim de identificar microRNAs desregulados durante o desenvolvimento de câncer gástrico, examinamos miRNAs perfis de expressão em neoplasias gástricas de gastrina camundongos knockout
usando microarrays miRNA. Como mostrado na Tabela 1, 20 microARNs foram significativamente desregulado nos ratinhos knockout comparação com os controlos tipo ninhada selvagem, com três miARNs diferentes mais do que duas vezes, o miR-7 ser regulada para cima e miR-709 e miR-449b a ser sub-regulada no antro da gastrina
camundongos knockout em comparação com tipos selvagens. Para confirmar ainda mais miR-449 desregulamentação durante o desenvolvimento do câncer gástrico, examinamos a sua expressão em tecidos antro tipo de rato selvagens infectados com H. Pylori
. Curiosamente, as matrizes de miRNA demonstrou uma específica regulação negativa de miR-449b no H. Pylori
camundongos infectados (tabela 2 e arquivo adicionais 1, figura S1). A Figura 1 velho gastrina camundongos knockout desenvolver adenomas gástricas. seções antro isoladas de 12-16 semanas de idade camundongos (painel esquerdo), 12 a 18 meses de idade camundongos (painel do meio) e idade superior a 18 meses camundongos (painel direito), de tipo selvagem (painel superior) e gastrina
camundongos knockout (painel inferior). Seções apresentam desenvolvimento adenoma em tecidos antro nos gastrina
nocautes em comparação com os tipos selvagens.
Tabela 1 miRNAs desregulados da gastrina
camundongos knockout
miRNA Nome
Log2 vezes
valor-p
miRNA Name

Log2-fold

p-value

mmu-miR-709
-1.73
7.0E-06
mmu-miR-422b
0.44
4.6E-02
mmu-miR-449b
-1.37
1.6E-03
mmu-miR-199a*
0.50
7.7E-03
mmu-miR-805
-1.01
7.5E-03
mmu-miR-25
0.51
1.6E-02
mmu-miR-706
-0.98
3.1E-03
mmu-miR-27b
0.56
5.1E-03
mmu-miR-467a
-0.88
2.8E-02
mmu-miR-182
0.56
1.8E-02
mmu-miR-696
-0.83
7.1E-03
mmu-miR-30a-3p
0.59
2.2E-02
mmu-miR-667
-0.66
2.3E-02
mmu-miR-10a
0.70
7.1E-03
mmu-miR-690
-0.28
1.7E-02
mmu-miR-152
0.70
2.3E-02
mmu-miR-18
0.29
3.7E-02
mmu-miR-1
0.77
7.1E-03
mmu-miR-143
0.34
2.3E-02
mmu-miR-7
1.06
4.9E-03
Lista de miRNAs significativamente desregulados em neoplasias gástricas de gastrina
camundongos knockout em comparação com tipos selvagens.
Tabela 2 miRNAs desregulados em H.pylori
tecidos infectados
nome miRNA
Dobre change

p-value

mmu-miR-122a
-3.247
0.000788
mmu-miR-449b
-0.879
0.045214
Lista de miARNs desregulamentação significativa em ratinhos de tipo selvagem antro infectado por H. pylori
antro comparação com não-infectada.
MiR-449 inibe a progressão do ciclo celular e induz a senescência
Tendo demonstrado a sub-regulação de miR-449 expressão em cancros gástricos queríamos para examinar o efeito da expressão de re-miR-449 em linhas celulares de cancro gástrico. Curiosamente nenhuma expressão visível da família de miR-449 foi detectado através de um painel de linhas de células gástricas incluindo SNU638, SNU5, SNU216, SNU601 e MKN74 sustentar a noção de miR-449 com função supressora de tumor-(dados não mostrados). A família de miR-449 consiste de miR-449a e b, em seres humanos e miR-449a, b e c em ratinhos. Curiosamente, eles compartilham a mesma sequência de sementes como a família miR-34 e, portanto, são esperados para regular coortes sobrepostas de genes-alvo (Figura 2A). Para avaliar a função de miR-449 em linhas de células gástricas que re-introduziu miR-449b em células SNU638 e MKN74. Em comparação com microRNAs de controlo negativo, re-introdução de miR-449b afetou fortemente a proliferação de SNU638 células (Figura 2B) e inspeção visual das células de indução de apoptose e senescência celular (Figura 2C, e de arquivo adicionais 1, figura S2) indicados. A análise de citometria de fluxo de células coradas com iodeto de propídio transfectadas com miR-449b mostrou um G uma acumulação de 48 horas após a transfecção, seguido de 72 horas após a transfecção por uma acumulação de células na sub L uma fracção sugestivo de célula morte (Figura 2D). A indução de senescência celular foi confirmada por gal coloração beta ácida usando miR-34a como um controle de microRNA positivo (Figura 2E). Para descartar efeitos específicos de linha de células, as conseqüências funcionais de miR-449 re-introdução em termos de interrupção do ciclo celular foram verificadas em MKN74 células (arquivo adicional 1, figura S3). Assim, a re-introdução de miR-449 afecta negativamente a proliferação de linhas celulares de cancro gástrico concomitante com a indução de apoptose e senescência em concordância com miR-449 tendo funções supressoras de tumor. Figura 2 o miR-449 é parte da família de miR-34 e inibe a proliferação celular. A - miR-449 é parte da família de miR-34 e é evolutivamente conservada. B - miR-449 re-introdução em linhas de células humanas gástricas (SNU638) inibe a proliferação de células (linha vermelha) em comparação com um controlo scrambled (linha azul) e miR-146 de controlo (linha preta). As barras de erro representam S.D. C - A inspeção visual da inibição da proliferação celular e fenótipo senescência-like sobre miR-449 re-introdução SNU638 células (painel inferior) em relação ao controle de transfecção mexidos (painel superior). D - FACS análise do ciclo celular mostrando a acumulação sub-G1 da SNU638 células 72 horas após o miR-449 re-introdução (histograma direita) comparada com um controlo de transfecção mexidos (histograma esquerda) A tabela mostra a acumulação de células na fracção G1 sobre o miR-449 re -introdução comparação com o controlo de ARN codificado às 48 horas pós transfecção, seguido por uma mudança para a fracção sub-G1 às 72 horas após a transfecção indicativa de morte celular. E - fenótipo senescentes de SNU638 células mediante miR-449 e controle positivo re-introdução miR-34a mostrado por ensaio β-gal ácida comparação com RNA controle mexidos
A sequência de sementes conjunta de miR-449b e miR-34a induzir altamente. muda de expressão correlacionada
para caracterizar as transcrições controladas por miR-449 e para ver se miR-449 regula transcrições diferentes do que miR-34a, perfis de expressão SNU638 células foram examinados 24 horas após a transfecção de miR-449b ou miR-34a e diferencialmente transcritos expressos identificados. Descobrimos que mRNAs com os locais previstos miRNA-alvo (do SEED 7 mer) na 3'UTR foram significativamente regulada para baixo em comparação com mRNAs sem sites de destino previstos após transfecção de miR-449b (p < 1.2E-70, two-tailed teste de Wilcoxon rank-sum), (arquivo adicionais 1, figura S4a). mRNAs ter previsto sítios-alvo de sementes de miRNA em regiões de codificação também foram encontrados para ser significativamente regulada para baixo (p < 9.9E-25), enquanto mRNAs com os locais em 5'UTRs foram apenas marginalmente regulada para baixo (p < 5.3e- 2). As mudanças de expressão induzida por transfecção de madura miR-449b e miR-34a foram altamente correlacionados apesar divergência das sequências maduras fora da região de sementes (de Pearson coeficiente de correlação R = 0,94, p = 0), (arquivo adicional 1, figura S4B). Nós exaustivamente avaliados todos os oligonucleotídeos (palavras) de comprimento 5-7 para correlação com a regulação negativa após miR-449b e transfecção miR-34a (ver métodos). Consistente com muitos estudos anteriores, esta análise revelou o site semente compartilhada miR-34a /449b como a palavra 3'UTR mais correlacionada com a regulação negativa nos dois experimentos (arquivo adicionais 1, figura S4C).
MiR-449 regula vários controladores de ciclo celular
Os perfis de expressão foram usadas para identificar os transcritos expressos diferencialmente em células transfectadas com o miR-449b ou os controlos (de arquivo adicionais 1, tabela S2). Uma análise de activação da via com base nos transcritos diferencialmente regulados demonstra que o miR-449 controla principalmente transcritos que codificam para proteínas envolvidas nas respostas de dano celular, controlo do ciclo celular, inflamação e vias de cancro (Figura 3A). Concentrando-se em um conjunto de genes alvo putativos com papéis bem estabelecidos em tumorigénese, que confirmou a regulação negativa por miR-449 de oncogene proto satisfeitas (MET
), ciclina quinase dependente 6 (CDK6)
, geminin (GMNN )
, mielocitomatose viral oncogenes homólogo (MYC)
, sirtuína 1 (SIRT1
) e histona deacetilase 1 (HDAC1)
no nível de transcrição (Figura 3B). A análise Western blot confirmou a capacidade de miR-449 para regular negativamente a TEM, GMNN, MYC, SIRT1, ciclina E2 (CCNE2) e HDAC1 ao nível da proteína a um nível semelhante ao obtido por re-introdução de miR-34a (figura 3c). Para um subconjunto de genes-alvo, incluindo MET
, GMNN, CCNE2
, SIRT1 Comprar e HDAC1
, confirmamos a interação direta de miR-449 com o gene alvo 3 'UTR usando ensaio de luciferase (Figura 3D ). Figura 3 o miR-449 tem como alvo os genes de controlador de ciclo celular. A - A capacidade Pathway Analysis (IPA) de genes desregulados sobre o miR-449 re-introdução em células que apresentam SNU638 enriquecimento para as vias categorias de genes do cancro, morte celular e do ciclo celular, entre outros. B - validação qPCR de matrizes Affymetrix mostrando a regulação negativa do TEM
, CDK6
, GMNN
, MYC Comprar e HDAC1
sobre miR-449 re-introdução comparação com os controlos de ARN mexidos. C - validação de Western blot de genes regulados por baixo em cima de miR-449 re-introdução na SNU638 células em comparação com controles de RNA mexidos. Vinculin (VCL) e tubulina beta (TUBB) foram utilizados como controle de carga D - verificação do alvo direto e funcional de ligação usando construções de luciferase segurando 3'UTRs tipo selvagem e mutantes 3'UTRs (duas mutações no miR-449 sítio de ligação), * indica significância estatística na expressão de luciferase entre 3'UTRs tipo selvagem transfectadas com miR449a /b em relação ao RNA mexidos controle, # indica diferença estatística na expressão de luciferase entre 3'UTRs tipo selvagem em comparação com 3'UTRs mutantes transfectadas com miR-449a e miR- 449b. "Ns" não significativo valor >p; 0,05, "*" ou "#" significativa 0,01 < valor <p; 0,05, "**" ou "##" muito significativa 0,01 < valor <p; 0.001, "***" ou "###" extremamente significativo valor de p < 0,001
Assim, o miR-449 tem como alvo directamente genes reguladores do ciclo celular, consistente com uma função supressora de tumor e com a paragem do ciclo celular observada sobre o miR-449 re-introdução em linhas celulares de cancro.
MiR-449 induz a expressão de p53, mas não é regulado por p53
Como miR-34a foi encontrado anteriormente para funcionar a jusante da p53 [30-33], analisou-se também miR-449a /b estavam ligados à p53. Este foi, além disso, estimulado pela presença de um sítio de ligação putativo de p53 de 10 kb a montante de humano miR-449 (dados não apresentados). Nós, portanto, induzida p53 por danos no DNA usando UV ou 5-fluorouracil (5-FU) em quatro diferentes sistemas, HCT116 e células MEF tipo selvagem e knockout p53 (arquivo adicionais 1, figura S5A). No entanto, nenhuma mudança significativa na expressão de miR-449 foi detectada após a activação da via p53 (arquivo adicionais 1, figura S5b). Em conclusão, não encontramos nenhuma evidência de que o miR-449 é um alvo transcricional de p53. Por outro lado, verificou-se que o miR-449a /b é capaz de induzir a activação de p53, a activação dos genes de resposta p53 tais como o p21 e a indução de apoptose tal como evidenciado pela clivagem de caspase 3 (CASP3) e poli (ADP-ribose ) 1 polimerase (PARP) (figura 4). Para a compreensão do mecanismo pelo qual o miR-449 faz isso examinámos o efeito de miR-449 em SIRT1 e HDAC1. SIRT1 e HDAC1 são desacetilases que inibem, entre outros, a activação de p53 e miR-34 foi mostrado para reprimir SIRT1 [34]. Nós validou a ligação específica de miR-449 para SIRT1 e HDAC1 usando ensaios de luciferase 3'UTR (figura 3d). Figura 4 o miR-449 activa a via de p53. A análise Western blot mostrando um aumento de proteína p53 após o miR-449 e o controlo positivo de miR-34a re-introdução em SNU638 células em comparação com o ARN codificado de controlo, bem como uma activação dos jusante marcadores p21 alvo e apoptose p53 CASP3 e PARP clivada. Vinculina (VCL) e tubulina beta (TUBB) foram utilizados como controlos de carga.
Assim, especula-se que o miR-449 induz a apoptose através da inibição da desacetilase de histona e HDAC1 SIRT1 que conduz à activação da via de p53, assim, a indução de marcadores de apoptose clivado CASP3 e PARP.
miR-449 é regulada em cancros gástricos humanos
Para avaliar a importância de miR-449 em tumores humanos, próxima examinaram a expressão de miR-449 em 10 biópsias de câncer gástrico. Importante, encontramos tanto miR-449a e b ser significativamente regulada para baixo ou ausente em 8 dos 10 cânceres gástricos primários. Além disso, a expressão de miR-449a e b parecem ser co-regulados (Figura 5A). Nós não encontrou qualquer correlação entre a redução na expressão de miR-449 e características clínicas de câncer (Figura 5B). Análises do ADN genómico a partir dos tumores encontrada nenhuma evidência de perda ou hiper-metilação dos miR-449 loci através da análise de curva de fusão específicos de metilação (MS-MCA) indicando transcricional infra-regulação da expressão (dados não mostrados). Assim, de acordo com dados de dois modelos de ratos com inflamação gástrica e hiperplasia, a expressão de miR-449 é regulada em cancros gástricos humanos. Figura 5 miR-449 é regulada negativamente em cancros gástricos humanos. análise qPCR (painel superior) que mostra a infra-regulação da expressão de miR-449 em 8 tecidos de cancro gástrico em comparação com o miR-449 expressão em controlos com a mesma amostra (linha pontilhada). U44 foi utilizado como controlo endógeno. Tabela mostrando informações clínicas dos pacientes (painel inferior). "Ns" não significativo valor >p; 0,05, "*" significativa 0,01 < valor <p; 0,05, "**" muito significativa 0,01 < valor <p; 0.001, "***" extremamente significativo valor de p < 0,001
Discussão
O câncer gástrico é um tumor maligno altamente letal com mais de 21.500 novos casos por ano nos Estados Unidos sozinhos [35]. A doença é geralmente detectada tarde e a taxa de sobrevida em 5 anos é, portanto, abaixo de 20% [36]. É, portanto, importante compreender as fases etiologia e progressão da doença. A importância dos fatores de risco genético de bactérias, ambientais e de acolhimento na carcinogênese gástrica foram estudados, porém pouco se sabe sobre a progressão molecular da doença [37, 38]. Entre outros, a inactivação via p53 é relatada em 30-60% dos cancros gástricos [39, 40] e estudos recentes sugerem H. pylori
modulação direta do gene p53 ou de seus alvos a jusante [41]. Outra alteração comum em cancro gástrico é a perturbação do controlo do ciclo celular através da expressão ao longo da ciclina E1, que está associado com a agressividade do tumor e metástase ganglionar [42, 43].

• A influência de N-acetil-L-cisteína de infusão em níveis de citocina e o pH gástrico intramucosal durante grave sepsis
• Benigna fístula gastro-cólicas em uma mulher que apresenta com perda de peso e vômitos intermitentes: um caso report