miR-449 inibisce la proliferazione delle cellule ed è down-regolato in cancro gastrico

miR-449 inibisce la proliferazione delle cellule ed è down-regolato nel carcinoma gastrico
Abstract
sfondo
cancro gastrico è il quarto cancro più comune al mondo e la seconda causa più comune di morte per cancro correlato. Lo sviluppo del cancro gastrico è principalmente associato da H. pylori
infezione porta ad una messa a fuoco in studi di patologia da fattori batterici e ambientali, e in misura minore per lo sviluppo meccanicistica del tumore. I microRNA sono piccole molecole di RNA non codificanti coinvolte nella regolazione genica post-trascrizionale. Si trovano a regolare i geni coinvolti in diversi funzioni biologiche e alterazioni nell'espressione microRNA sono stati collegati alla patogenesi di molte neoplasie. L'attuale studio è focalizzato sull'identificazione microRNA coinvolti nella carcinogenesi gastrica e di esplorare la loro rilevanza meccanicistico caratterizzando i loro obiettivi.
Risultati
microarray Invitrogen NCode miRNA identificati miR-449 per essere diminuita in 1-year-old Gastrin
topi KO e in H. Pylori
tessuti gastrici infetti rispetto ai tessuti provenienti da animali wild-type. Tasso di crescita delle linee di cellule gastriche over-esprimono miR-449 è stata inibita del 60% rispetto ai controlli. FACS analisi del ciclo cellulare di miR-449 sovraesprimono cellule ha mostrato un significativo aumento del sub-G 1 frazione indicativo di apoptosi. ß-gal analisi hanno indicato un fenotipo senescente di linee di cellule gastriche over-esprimono miR-449. array 133v2 Affymetrix identificati GMNN
, MET, CCNE2, SIRT1
e CDK6
come miR-449 bersagli. saggi di luciferasi sono stati usati per confermare la GMNN
, MET
, CCNE2
e SIRT1
obiettivi come diretti. Mostriamo anche che miR-449 sovra-espressione attiva p53 e la sua valle p21 bersaglio così come il CASP3 marcatori di apoptosi spaccati e PARP. È importante sottolineare che, qPCR analisi ha mostrato una perdita di miR-449 espressione nei tumori gastrici clinici umani rispetto ai tessuti normali
. Conclusioni
In questo studio, documentiamo un'espressione diminuita di miR-449 in Gastrin
topi KO e ulteriormente confermato la sua perdita di tumori gastrici umani. Abbiamo studiato la funzione di miR-449, identificando i suoi obiettivi diretti. Inoltre abbiamo dimostrato che miR-449 induce senescenza e apoptosi attivando la via p53.
Sfondo
cancro gastrico è tra i cinque tumori più comuni nel mondo e la seconda causa più comune di decessi correlati al cancro [1] . È principalmente, ma non esclusivamente, causata da H. Pylori
infezione [2] non tutti H. Pylori
persone infettate sviluppano tumori [3]. Altri fattori coinvolti nello sviluppo del cancro gastrico includono il grado e il tipo di risposta infiammatoria [2], nonché i livelli della gastrina
ormonale [4, 5]. Diversi studi hanno dimostrato che sia ipergastrinemia [6, 7] e la mancanza di gastrina [5] contribuiscono alla patogenesi del cancro gastrico. Achlorhydria è una caratteristica comune di modelli murini inclini a metaplasia in via di sviluppo e il cancro [6, 8, 9]. Gastrina
topi knockout sono achlorhydric [10], favorendo una proliferazione batterica gastrica [11, 12], e le infezioni gastriche batteriche croniche portano alla metaplasia gastrica che può progredire in cancro gastrico [6, 12].
Fin dalla loro scoperta microRNA, sono stati trovati implicati in una vasta gamma di processi normali e patologici [13]. I microRNA esercitano le loro funzioni di regolamentazione posttranscriptionally legandosi a parte sequenza complementare motifs prevalentemente nel 3 'UTR del mRNA bersaglio con conseguente mRNA destabilizzazione e la repressione traslazionale [14]. Da un punto di vista biologico, microRNA sono difficili oggetti per studiare come si regolano coorti di geni bersaglio, che non sono facilmente identificati. Da un punto di vista terapeutico, microRNA sono molto interessante in quanto diversi studi hanno dimostrato il potere dei microRNA come biomarcatori e studi preclinici iniziali hanno stabilito che i microRNA possono essere terapeuticamente mirati in vivo [15].
Profiling studi hanno evidenziato microRNA deregolamentazione un ampio spettro di malattie, tra cui tutti i principali tipi di cancro [16]. I microRNA probabilmente influenzano i processi oncogeni a due livelli. In primo luogo, diversi studi hanno stabilito i ruoli pro-oncogeni o tumore soppressiva dei singoli microRNA fermamente che collegano questi per l'eziologia del cancro come esemplificato da miR-155, miR-10b e miR-21 [17-19]. In secondo luogo, il sistema di regolamentazione microRNA per sé sembra avere funzioni di tumore soppressiva come l'ablazione genetica di fattori microRNA biogenesi chiave, come Dicer, fortemente aumentare la suscettibilità al cancro [20] e la perdita di funzione mutazioni sono state identificate in microRNA importanti fattori di trasformazione in tumori umani [21-23].
in questo studio, abbiamo affronta l'importanza dei microRNA nel carcinoma gastrico approfittando della gastrina
modello di topo knockout e H. pylori
infezione di topi wild-type. Identifichiamo miR-449 come significativamente down-regolato o perso in modelli murini di cancro gastrico, così come nei tumori gastrici umani primari. Identificazione di bersagli mRNA rivela che questo microRNA probabilmente esercita funzioni di tumore soppressiva attraverso la regolazione concertata di una coorte di regolatori del ciclo cellulare del cancro-associata, tra cui il TEM, GMNN, CCNE2, SIRT1, e HDAC1.
Metodi
Mice
sono stati utilizzati tre diversi gruppi di età (12-16 settimane, 1 anno o 1 ½ anni) di wild type (WT) o di gastrina
knockout mice (KO). Tutti i topi erano su un misto 129 /SVJ, C57BL /6J sfondo, reincrociata almeno quattro volte per C57BL /6J [12]. I topi sono stati tenuti sotto specifiche condizioni esenti da organismi patogeni e monitorati secondo la Federazione di raccomandazione laboratorio europeo animali Associazioni Scienza [24] con 12 ore di luce e 12 ore cicli scuri.
H. pylori
infezione
C57BL6 /J topi (n = 10) sono stati inoculati con un clone non-mouse adattata di H. Pylori
ceppo 67:21, originariamente isolato da un biopsia antrale ottenuto da una femmina svedese con ulcera gastrica. Il ceppo è VacA + e contiene l'intera isola di patogenicità Cag (PAI) con la stabilità genetica nel Cag PAI [25]. I topi sono stati inoculati ogni secondo giorno (tre volte) durante un periodo di 5 giorni. DNA è stato estratto ed analizzato per la presenza di specie di Helicobacter utilizzando un test gel elettroforesi gradiente semi-nested polymerase chain reaction-denaturazione, specifico per l'Helicobacter genere, come precedentemente descritto [26]. Un gruppo abbinato di non infetti topi C57BL6 /J sono stati utilizzati come controlli.
Stomaco di tutti i topi sono stati sezionati in fondo e antro prima dell'estrazione di RNA. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato danese Animal Welfare (2005 /562-40) e la Foresta danese e Nature Agency (20010077355/6). Sezioni antro
Mice
topi sono stati sacrificati per dislocazione cervicale. L'antro è stato rimosso, lavato delicatamente in PBS freddo, congelato in azoto liquido e conservati a -80 ° C fino estrazione di RNA.
Campioni clinici analisi
biopsie di cancro gastrico ed i tessuti normali adiacenti sono stati ottenuti da pazienti sottoposti a chirurgia per cancro gastrico presso il Dipartimento di chirurgia gastrointestinale, Rigshospitalet. L'inserimento è avvenuto nel mese di luglio a dicembre 2008 e di tutti i pazienti di cui ha firmato, il consenso informato (approvazione del comitato etico H-B-2008-049) e Agenzia per la protezione dei dati danese (2008-41-2138). Le biopsie sono stati collocati in RNAlater (Ambion) in sala operatoria e successivamente congelati a -80 ° C fino estrazione di RNA. Estrazione
RNA e qPCR analisi
RNA è stato estratto utilizzando TRIzol (Invitrogen) secondo il fornitore. miRNA profilo di espressione è stata valutata utilizzando saggi Taqman miRNA (Applied Biosystems) per HSA /MMU-miR-449a e B, HSA /MMU-miR-34a, B e C e rnu44 o HSA /MMU-miR-191. sequenze primer per Affymetrix obiettivi convalida sono elencati nel file aggiuntivo 1, tabella S1.
cellulare cultura
SNU638 e MKN74 sono state coltivate in RPMI-1640 (Gibco) con il 10% FBS (Hyclone), 100 U /ml di penicillina e 100 ug /ml di streptomicina (Invitrogen) e incubate a 37 ° C in 5% CO 2. cellule HCT116 (wt e p53 - /- sono stati coltivati ​​in 5A di McCoy (Gibco) con 10% FBS (Hyclone), e 100U /ml di penicillina e 100 ug /ml di streptomicina (Invitrogen) e incubate a 37 ° C in 5% CO <. sub> 2 HEK293 e cellule MEF (wt e p53 - /-) sono state coltivate in DMEM (Gibco) con 10% FBS (Hyclone), 100 U /ml di penicillina e 100 ug /ml di streptomicina (Invitrogen) e incubate a 37 ° C con il 5% di CO 2.
precursori di miRNA e siRNA
precursori di miRNA sono stati acquistati da Ambion, HSA-miR-449a (PM11521), HSA-miR-449b (PM11127) e HSA-miR-34a ( PM11030). analizza
crescita cellulare
cellule SNU638 sono state seminate in piastre da 24 pozzetti e trasfettate il giorno seguente con 50nm miRNA duplex o siRNA usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). le cellule sono state fissate in momenti indicati in paraformaldeide al 4% , macchiato in una soluzione di cristallo viola allo 0,1%, e risospeso in acido acetico 10%. assorbanza del campione è stata misurata a 620 nm.
ciclo cellulare FACS analisi
cellule SNU638 e MKN74 sono state seminate a 2 × 10 6 cellule per 10 centimetri piatto e trasfettate con 50nm miRNA duplex (Ambion) utilizzando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Le cellule sono state raccolte 48 e 72 ore dopo la trasfezione, tinto per contenuto di DNA utilizzando ioduro di propidio (PI) e analizzati su un flusso FACS Calibur citometro (Becton-Dickinson). In breve, le cellule sono state raccolte da tripsinizzazione e lavati una volta con PBS prima di fissare per tutta la notte nel 70% EtOH. Per macchiare il DNA, le cellule sono state pellettato, risospese in 100 microlitri EtOH e colorate per 1 ora con 300 microlitri soluzione PI (0,05 mg /ml PI, 20 ug /ml RNasi A in 0,1% BSA) analizza
. Senescenza cellule
SNU638 sono state seminate a 400.000 cellule per 6-ben piatto e trasfettate con 50 nm miRNA duplex (Ambion) utilizzando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Quattro giorni dopo la trasfezione, le cellule sono state lavate in PBS e fissate per 5 minuti a temperatura ambiente in 2% formaldeide /0,2% glutaraldeide. Le cellule sono state lavate due volte in PBS pH6.0 prima di essere tinto con β-Gal soluzione senescenza fresca associata macchia (1mg /ml 5-bromo-4-cloro-3-indolil-βD-galattoside (X-Gal), 0.12mm K 3Fe [CN] 6, 0.12mm K 4Fe [CN] 6, 1mM MgCl 2 in PBS pH6.0) durante la notte a 37 ° C senza CO 2 alimentazione . Le cellule sono state lavate una volta in PBS (pH6.0) e osservati al microscopio.
Anticorpi e Western Blot analisi
SNU638 sono state seminate a 2 × 10 6 celle per 10 cm Piatto, transfettate due volte su due successive giorni con duplex 50nm miRNA utilizzando Lipofectamine 2000 secondo produttore (Invitrogen). Le cellule sono state raccolte da tripsinizzazione, lavate una volta con PBS e lisate in RIPA tampone (150mm di NaCl, 0,5% di sodio Desossicolato, 0.1% SDS, 1% Igepal, 50mM Tris-HCl pH 8, 2mM EDTA) integrato con 1mM DTT, 1mM Pefabloc, 1mM nav3, 10mm NaF e 1X completa i mini cocktail di inibitori della proteasi compresse. 25 mg di proteine ​​/corsia sono stati risolti sul 4-20% gel NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen) e trasferiti su una membrana di nitrocellulosa. Gli anticorpi primari utilizzati sono state soddisfatte (Cell Signal 4560), MYC (Cell Signal 9402), GMNN (Santa Cruz Sc-53923), VCL (Sigma V9131), TP53 (Santa Cruz Sc-126), CDKN1A (Santa Cruz Sc-6246) , CDK6 (Santa Cruz Sc-177), HDAC1 (Santa Cruz Sc-7872), CCNE2 (Cell Signal 4132), TUBB (Abcam ab11304), PARP (Cell Signal 9542) e Cleaved CASP3 (Cell Signal 9661).
microarray analisi
piccoli RNA (< 200 nt) sono stati isolati con Kit Invitrogen PureLink miRNA isolamento dal tessuto fundica e antrale da 1) topi Gastrin
KO ed età e topi di controllo C57BL6 /J sesso abbinati, e 2) C57BL6 /topi J infettati da H. pylori
e l'età e il sesso non infetto abbinati topi di controllo C57BL6 /J, (n = 4 per ciascun gruppo). La qualità di isolati piccoli RNA è stato determinato utilizzando il piccolo RNA test su un Agilent Bioanalyzer. 500 ng di piccoli RNA è stato etichettato con Kit Genisphere FlashTag e ibridato a Invitrogen NCode multi-specie miRNA Microarray V2 in una stazione di ibridazione Maui. diapositive trasformati sono stati digitalizzati in un scanner per microarray Agilent DNA. immagini risultanti sono stati analizzati e rapporto tra mediana normalizzati utilizzando GenePix Pro 6.0. Quattro repliche biologiche sono stati usati per ogni confronto. I campioni sono stati ibridati a quattro array in un colorante Scambio colore microarray disegno sperimentale doppio. ArrayTools BRB sono stati utilizzati per il cambiamento piega e calcoli statistici. dati miRNA selezionati dalla analisi serie sono stati convalidati usando real-time PCR TaqMan miRNA. I dati saranno depositati presso ArrayExpress previa accettazione
. Array di mRNA
SNU638 sono state trasfettate con 50 Nm di miR-34a e miR-449b duplex con Siglo siRNA utilizzati come controllo negativo. RNA totale è stato estratto 24 ore dopo la trasfezione usando TRIzol reagente. analisi di microarray Affymetrix (HG-U133 Plus 2.0 umana) è stata eseguita presso il Centro per microarray, Rigshospitalet, Copenhagen University Hospital. Gli esperimenti sono stati eseguiti sia in triplicato o quadruplicates. I dati saranno depositati presso ArrayExpress previa accettazione
. Vettori di costruzione e giornalista saggi
I 3'UTRs di HDAC1
, SIRT1
, MET
, GMNN
e CCNE2
detenzione miR-449 siti di legame sono stati clonati a valle del reporter luciferasi nel sistema di vettore PMIR-REPORT (Ambion). Quickchange sito-diretta kit di mutagenesi (Stratagene) è stato utilizzato per indurre due mutazioni puntiformi nella regione seme. primer mutagenesi sequenze sono elencati nel file aggiuntive 1, tabella S1.
HEK293 cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti e trasfettate con 20nm miRNA precursore o strapazzate controllo siRNA, 20-50ng di luciferasi vettore (PMIR-relazione) e 5 ng di renilla vettore (pRL-TK) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Le cellule sono state raccolte 24 ore dopo la trasfezione e l'attività della luciferasi è stata misurata utilizzando Dual-Glo saggio luciferasi (Promega).
Analisi microarray
dati di espressione microarray è stato elaborato con il pacchetto 'Affy' in BioConductor [27]. Set di sonde intensità sono stati riassunti e quantile normalizzati utilizzando i pacchetti BioConductor RMA e VSN. espressione differenziale è stato determinato per probeset utilizzando un t-test. set di sonde sono stati mappati trascrizioni Ensembl (versione 49) utilizzando mappature fornite a BioMart. Probesets che associati a due diversi geni Ensembl sono state scartate.
Valutare down-regulation globale di microRNA geni bersaglio Aziende Il 3'UTRs, 5'UTRs e sequenze codificanti delle trascrizioni sono stati analizzati per corrispondenza 6mer, 7mer e 8MER miRNA siti di semi (complementari alla posizione 2-7, 2-8, e 2-9 del miRNA). Analisi globale del target miRNA down-regolazione è stata valutata utilizzando la sequenza più lunga 3'UTR per gene per evitare distorsioni introdotte dai geni con molte isoforme di trascrizione. Abbiamo scartato trascrizioni con sequenze 3'UTR più corte di 50 nt. Per globalmente valutare se miRNA geni bersaglio sono stati down-regolati dopo miRNA trasfezione, abbiamo testato l'ipotesi nulla che la distribuzione cambiamento espressione di obiettivi miRNA (che hanno un sito di destinazione 7mer) era pari alla distribuzione di tutti i geni espressi senza siti di destinazione previsti utilizzando il non parametrica rank-sum test di Wilcoxon. Un approccio simile è stato utilizzato per valutare down-regolazione dei geni con siti bersaglio miRNA nelle regioni codificanti e 5'UTRs di mRNA.
Valutazione statistica tassativo delle parole correlate con down-regulation
Abbiamo usato un non-parametrica precedentemente pubblicati rango a base statistica per valutare in modo esaustivo la correlazione di eventi di parola in 3'UTRs e il cambiamento di espressione genica dopo miRNA trasfezione [28, 29]. I geni sono stati ordinati dal cambiamento espressione indotta da trasfezione di miR-34a e miR-449b, e la correlazione con down-regulation è stato testato per tutte le parole di lunghezza 5-7 (n = 21 504). I test statistici

t-test gli studenti con la correzione di Welch.
Risultati
miR-449b è giù regolati nel antro di entrambi i topi Gastrin
KO e H. pylori
infettato topi
gastrina
topi knockout sono achlorhydric con una tendenza per sviluppare iperplasia antrale e adenomi gastrica nel tempo (figura 1) [6, 12]. Al fine di identificare microRNA liberalizzati durante lo sviluppo del cancro gastrico, abbiamo esaminato miRNA profili di espressione in neoplasie gastriche da gastrina topi knockout
utilizzando microarray miRNA. Come indicato nella tabella 1, 20 microRNA erano significativamente liberalizzati nei topi knockout rispetto ai controlli selvatici tipo littermate, con tre miRNA diversi più di due volte, miR-7 di essere up-regolata e miR-709 e miR-449b essere down-regolato nel antro di gastrina
topi knockout rispetto ai tipi selvatici. Ad ulteriore conferma miR-449 deregolamentazione durante lo sviluppo del cancro gastrico, abbiamo esaminato la sua espressione nei tessuti antro mouse tipo selvatici infettati da H. pylori
. È interessante notare che gli array miRNA hanno dimostrato una specifica down-regolazione di miR-449b in H. Pylori
infettato topi (tabella 2 e sui file 1, figura S1). Figura 1 Old Gastrin knockout topi sviluppano adenomi gastrici. sezioni antro isolati da 12-16 settimane di età topi (pannello di sinistra), 12 a 18 mesi di età i topi (pannello centrale) e di età superiore a 18 mesi i topi (pannello di destra), da wild type (pannello superiore) e gastrina
topi knockout (pannello inferiore). Le sezioni mostrano lo sviluppo adenoma nei tessuti antro nei gastrina
fori rispetto ai tipi selvatici.
Tabella 1 miRNA deregolamentati di gastrina
topi knockout
miRNA Nome
log2 volte
p-value
miRNA Name

Log2-fold

p-value

mmu-miR-709
-1.73
7.0E-06
mmu-miR-422b
0.44
4.6E-02
mmu-miR-449b
-1.37
1.6E-03
mmu-miR-199a*
0.50
7.7E-03
mmu-miR-805
-1.01
7.5E-03
mmu-miR-25
0.51
1.6E-02
mmu-miR-706
-0.98
3.1E-03
mmu-miR-27b
0.56
5.1E-03
mmu-miR-467a
-0.88
2.8E-02
mmu-miR-182
0.56
1.8E-02
mmu-miR-696
-0.83
7.1E-03
mmu-miR-30a-3p
0.59
2.2E-02
mmu-miR-667
-0.66
2.3E-02
mmu-miR-10a
0.70
7.1E-03
mmu-miR-690
-0.28
1.7E-02
mmu-miR-152
0.70
2.3E-02
mmu-miR-18
0.29
3.7E-02
mmu-miR-1
0.77
7.1E-03
mmu-miR-143
0.34
2.3E-02
mmu-miR-7
1.06
4.9E-03
Elenco dei miRNA significativamente liberalizzati a neoplasie gastriche da gastrina
topi knockout rispetto ai tipi di bosco.
Tabella 2 miRNA deregolamentati in H. pylori
tessuti infetti
name miRNA

Fold change

p-value

mmu-miR-122a
-3.247
0.000788
mmu-miR-449b
-0.879
0.045214
Elenco dei miRNA significativamente liberalizzati a selvaggio topi di tipo antro infettati da H. pylori
rispetto al antro non infetta.
MiR-449 inibisce la progressione del ciclo cellulare e induce senescenza
Dopo aver dimostrato down-regolazione di miR-449 espressione in tumori gastrici abbiamo voluto esaminare l'effetto di ri-esprimere miR-449 in linee cellulari di cancro gastrico. È interessante notare che nessuna espressione evidente della famiglia miR-449 è stato rilevato attraverso un pannello di linee cellulari gastrici tra cui SNU638, SNU5, SNU216, SNU601 e MKN74 sostenere la nozione di miR-449 con funzioni tumore soppressiva (dati non riportati). La famiglia di miR-449 è costituito da miR-449a e B negli esseri umani e miR-449a, B e C nei topi. È interessante notare che condividono la stessa sequenza di semi come la famiglia miR-34 e sono quindi tenuti a regolare coorti sovrapposti di geni bersaglio (Figura 2a). Per valutare la funzione di miR-449 in linee cellulari gastrici abbiamo reintrodotto miR-449b nelle cellule SNU638 e MKN74. Rispetto ai microRNA di controllo negativo, la reintroduzione di miR-449b influenzato fortemente la proliferazione di SNU638 cellule (figura 2b) e ispezione visiva delle cellule induzione di apoptosi e senescenza cellulare (figura 2c, e sui file 1, figura S2) indicate. analisi dei flussi di citometria di cellule ioduro macchiato di propidio trasfettate con miR-449b ha mostrato un G 1 accumulo 48 ore dopo la trasfezione, seguiti a 72 ore dopo la trasfezione da un accumulo di cellule nel sub G 1 frazione suggestivo di cellule morte (figura 2d). L'induzione di senescenza cellulare è stata confermata da acido beta gal colorazione con miR-34a come controllo positivo microRNA (figura 2e). Per escludere effetti specifiche della linea di cellule, le conseguenze funzionali di miR-449 reintroduzione in termini di arresto del ciclo cellulare sono stati verificati in MKN74 cellule (file aggiuntivo 1, figura S3). Così, la reintroduzione di miR-449 influisce negativamente la proliferazione delle linee cellulari di cancro gastrico concomitanti con l'induzione di senescenza e apoptosi in accordo con miR-449 con tumore funzioni soppressive. Figura 2 miR-449 è parte della famiglia miR-34 e inibisce la proliferazione cellulare. A - miR-449 fa parte della famiglia di miR-34 ed è evolutivamente conservata. B - miR-449 reintroduzione in linee di cellule gastriche umane (SNU638) inibisce la proliferazione delle cellule (linea rossa) rispetto ad un controllo criptato (linea blu) e il controllo miR-146 (linea nera). Le barre di errore rappresentano S.D. C - Controllo visivo di inibizione della proliferazione cellulare e fenotipo simile alla senescenza su miR-449 reintroduzione nella SNU638 cellule (pannello inferiore) rispetto al controllo trasfezione strapazzate (pannello superiore). D - FACS analisi del ciclo cellulare che mostra l'accumulo di sub-G1 di SNU638 celle 72 ore seguenti miR-449 re-introduzione (istogramma a destra) rispetto ad un controllo trasfezione criptato (istogramma a sinistra) La tabella mostra l'accumulo di cellule nella frazione G1 su miR-449 re -introduzione rispetto al controllo RNA codificato a 48 ore dopo la trasfezione, seguito da uno spostamento alla frazione sub-G1 a 72 ore dopo la trasfezione indicativo di morte cellulare. E - fenotipo senescente di SNU638 cellule su di miR-449 e miR-34a controllo positivo reintroduzione dimostrato mediante test di β-gal acida rispetto al controllo strapazzate RNA
La sequenza seme congiunta di miR-449b e miR-34a indurre altamente. espressione correlato cambia
per caratterizzare le trascrizioni controllati da miR-449 e per vedere se miR-449 regola trascrizioni diverse rispetto miR-34a, SNU638 cellule profili di espressione sono stati esaminati 24 ore dopo la trasfezione di miR-449b o miR-34a e differenziale trascritti espressi identificati. Abbiamo scoperto che mRNA con i siti previsti miRNA bersaglio (7 MER sito seme) nel 3'UTR erano significativamente down-regolato rispetto al mRNA senza siti di destinazione previsti dopo trasfezione di miR-449b (p < 1.2e-70, due coda test di Wilcoxon rank-sum), (sui file 1, figura S4a). mRNA aver previsto miRNA siti bersaglio di semi in regioni codificanti sono stati anche trovati ad essere significativamente down-regolato (p < 9.9E-25), mentre mRNA con siti in 5'UTRs sono stati solo marginalmente down-regolato (p < 5.3e- 2). I cambiamenti di espressione indotte dalla trasfezione di maturo miR-449b e miR-34a sono stati altamente correlati, nonostante la divergenza delle sequenze maturi di fuori della regione di semi (coefficiente di correlazione R di Pearson = 0.94, p = 0), (file aggiuntivo 1, figura 4J). Abbiamo valutato in modo esauriente tutti gli oligonucleotidi (parole) di lunghezza 5-7 per la correlazione con il down-regulation dopo miR-449b e miR-34a trasfezione (vedi metodi). Coerentemente con molti studi precedenti, questa analisi ha rivelato l'/sito seme 449b condiviso miR-34a, come la parola 3'UTR più correlato con down-regolazione nei due esperimenti (sui file 1, figura S4C).
MiR-449 Regola numerosi regolatori del ciclo cellulare
I profili di espressione sono stati usati per identificare trascritti differenzialmente espressi in cellule trasfettate con miR-449b o controlli (sui file 1, tabella S2). Un'analisi attivazione della via sulla base delle trascrizioni differenziale regolamentati dimostra che miR-449 controlla principalmente trascritti che codificano per proteine ​​coinvolte nella risposta danni delle cellule, controllo del ciclo cellulare, l'infiammazione e le vie di cancro (Figura 3a). Concentrandosi su un set di geni bersaglio putativi con ruoli ben definiti in tumorigenesi, abbiamo confermato down-regulation con miR-449 di met oncogene Proto (MET
), ciclina dipendente chinasi 6 (CDK6)
, Geminin (GMNN )
, myelocytomatosis oncogeni virali omologo (MYC)
, SIRT1 (SIRT1
) e istone deacetilasi 1 (HDAC1)
a livello di trascrizione (figura 3b). Western Blot analisi ha confermato la capacità di miR-449 a down-regolare MET, GMNN, MYC, SIRT1, ciclina E2 (CCNE2) e HDAC1 a livello proteico in una misura simile a quello ottenuto con la reintroduzione di miR-34a (figura 3c). Per un sottoinsieme di geni bersaglio, tra cui il TEM
, GMNN, CCNE2
, SIRT1
e HDAC1
, abbiamo confermato l'interazione diretta del miR-449 con il gene bersaglio 3 'UTR mediante saggio di luciferasi (figura 3d ). Figura 3 miR-449 si rivolge a geni del regolatore del ciclo cellulare. A - Ingenuity Pathway Analysis (IPA) di geni deregolati su miR-449 reintroduzione nella SNU638 cellule che mostrano un arricchimento per il tumore categorie gene, morte cellulare e del ciclo cellulare percorsi tra gli altri. B - convalida qPCR di array Affymetrix che mostra down-regolazione del MET
, CDK6
, GMNN
, MYC
e HDAC1
su miR-449 re-introduzione rispetto ai controlli RNA strapazzate. C - convalida Western Blot dei geni down-regolato su miR-449 reintroduzione in SNU638 cellule rispetto ai controlli RNA strapazzate. Vinculin (VCL) e tubulina beta (TUBB) sono stati utilizzati come controlli di carico D - verifica del bersaglio diretto e funzionale vincolante utilizzando costrutti luciferasi in possesso 3'UTRs wild type e mutati 3'UTRs (due mutazioni in miR-449 sito di legame), * indica la significatività statistica di espressione luciferasi tra 3'UTRs wild-type trasfettate con miR449a /b rispetto ad RNA strapazzate controllo, # indica differenza statistica nella espressione della luciferasi tra 3'UTRs wild-type rispetto al 3'UTRs mutanti trasfettate con miR-449a e retrovisori 449b. "Ns" non significativo valore p > 0,05, "*" o "#" significativo 0,01 < valore <p; 0.05, "**" o "##" molto significativo 0,01 < valore <p; 0.001, "***" o "###" estremamente significativo valore p < 0.001
Quindi, miR-449 si rivolge direttamente del ciclo cellulare geni regolatori coerenti con una funzione di soppressore del tumore e con l'arresto del ciclo cellulare osservata in seguito miR-449 reintroduzione in linee cellulari di cancro.
MiR-449 induce l'espressione di p53, ma non è regolata da p53
Come miR-34a è stato trovato per funzionare valle di p53 [30-33] in precedenza, abbiamo analizzato se anche miR-449a /b sono stati collegati a p53. Questo stato inoltre stimolato dalla presenza di un sito p53 putative di legame 10 kb a monte umana miR-449 (dati non mostrati). Abbiamo quindi indotti p53 dai danni al DNA mediante UV o 5-fluorouracile (5-FU) in quattro diversi sistemi, HCT116 e tipo e p53 knockout cellule MEF selvatici (sui file 1, figura S5A). Tuttavia, nessun cambiamento significativo nella espressione di miR-449 è stato rilevato dopo l'attivazione della via p53 (sui file 1, figura S5B). In conclusione, abbiamo trovato alcuna prova che miR-449 è un obiettivo trascrizionale di p53. D'altra parte, abbiamo scoperto che miR-449a /b è in grado di indurre l'attivazione di p53, l'attivazione della risposta geni p53 come p21 e l'induzione di apoptosi come evidenziato dalla scissione della caspasi 3 (CASP3) e poli (ADP-ribosio ) polimerasi 1 (PARP) (figura 4). Verso la comprensione del meccanismo attraverso il quale miR-449 fa questo abbiamo esaminato l'effetto di miR-449 sulla SIRT1 e HDAC1. SIRT1 e HDAC1 sono deacetilasi che inibiscono, tra l'altro, l'attivazione di p53 e miR-34 ha dimostrato di reprimere SIRT1 [34]. Abbiamo convalidato il legame specifico di miR-449 di SIRT1 e HDAC1 utilizzando saggi di luciferasi 3'UTR (figura 3d). Figura 4 miR-449 attiva il percorso di p53. Analisi Western Blot con un incremento della proteina p53 su miR-449 e il controllo positivo miR-34a reintroduzione nella SNU638 cellule rispetto al RNA strapazzate controllo, nonché l'attivazione delle valle marcatori p21 bersaglio e l'apoptosi p53 CASP3 e PARP spaccati. Vinculin (VCL) e tubulina beta (TUBB) sono stati utilizzati come controlli di carico.
Quindi, ipotizziamo che il miR-449 induce apoptosi inibendo l'istone deacetilasi HDAC1 e SIRT1 che porta alla attivazione di p53 percorso in tal modo l'induzione dei marcatori di apoptosi spaccati CASP3 e PARP.
miR-449 è down-regolato nei tumori gastrici umani
Per valutare l'importanza di miR-449 in tumori umani abbiamo accanto esaminato l'espressione di miR-449 in 10 biopsie di cancro gastrico. È importante sottolineare che abbiamo trovato sia miR-449a e b per essere significativamente down-regolato o assente in 8 su 10 tumori gastrici primari. Inoltre, l'espressione del miR-449a e B sembrano essere co-regolati (figura 5a). Non abbiamo trovato alcuna correlazione tra la riduzione di espressione di miR-449 e le caratteristiche cliniche del cancro (figura 5b). Le analisi del DNA genomico da tumori hanno trovato alcuna prova di perdita o iper-metilazione dei loci miR-449 utilizzando analisi della curva di melting metilazione-specifica (MS-MCA) che indica trascrizionale down-regolazione dell'espressione (dati non riportati). Quindi, in accordo con i dati provenienti da due modelli murini di infiammazione gastrica e iperplasia, l'espressione di miR-449 è down-regolato nei tumori gastrici umani. Figura 5 miR-449 è giù regolata nei tumori gastrici umani. analisi qPCR (pannello superiore) che mostra down-regolazione dell'espressione miR-449 in 8 tessuti di cancro gastrico rispetto al miR-449 espressione in controlli a campione appaiati (linea tratteggiata). U44 è stato utilizzato come controllo endogeno. Tabella che mostra informazioni cliniche dei pazienti (pannello inferiore). "Ns" non significativo valore p > 0,05, "*" significativo 0,01 < valore <p; 0.05, "**" molto significativo 0,01 < valore <p; 0.001, "***" estremamente significativo valore p < 0.001
Discussione
cancro gastrico è un tumore maligno altamente letale, con oltre 21.500 nuovi casi ogni anno solo negli Stati Uniti [35]. La malattia è spesso rilevato in ritardo e il tasso di sopravvivenza a 5 anni è di conseguenza al di sotto del 20% [36]. È quindi importante comprendere le fasi eziologia e la progressione della malattia. L'importanza dei fattori di rischio genetici batterici, ambientali e di ospitare nella carcinogenesi gastrica sono stati studiati, ma meno si sa circa la progressione molecolare della malattia [37, 38]. Tra gli altri, p53 percorso inattivazione è riportato nel 30-60% dei casi di cancro gastrico [39, 40] e studi recenti suggeriscono H. pylori
modulazione diretta del gene p53 o dei suoi bersagli a valle [41]. Un'altra alterazione comune nel cancro gastrico è la perturbazione del controllo del ciclo cellulare tramite l'espressione sopra della ciclina E1, che è associato con aggressività del tumore e metastasi linfonodali [42, 43].

• L'influenza di N-acetil-L-cisteina infusione livelli di citochine e pH gastrico intramucosa durante grave sepsis
• Benigna fistola gastro-coliche in una donna che presenta con la perdita di peso e vomito intermittente: un caso report