MIR-449 inhibuje proliferáciu buniek a je down-regulovaná v žalúdku cancer

Mir-449 inhibuje proliferáciu buniek a je down-regulovaný u rakoviny žalúdka
abstraktné
pozadia
rakovina žalúdka je štvrtým najbežnejším typom rakoviny na svete a druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu súvisiace. Rozvoj rakoviny žalúdka je spojený predovšetkým s H. pylori
infekcie vedúce k zameraniu v patologických štúdiách na bakteriálnych a environmentálnych faktorov, a v menšej miere na mechanický vývoj nádoru. MikroRNA sú malé nekódujúca RNA molekuly podieľajú na regulácii post-transkripčný génov. Ak zistí, že regulujú gény zapojené do rôznych biologických funkcií a zmeny v expresii mikroRNA boli spojené k patogenéze mnohých malignít. Súčasná štúdia sa zameriava na identifikáciu mikroRNA zapojené do žalúdočnej karcinogenéze a preskúmať ich Mechanistický význam tým, že charakterizuje ich cieľov.
Výsledky
Invitrogen nCode miRNA microarrays identifikovaných MIR-449 sa znížil na 1-ročné gastrín
KO myší a v H. pylori
nakazené žalúdočné tkaniva v porovnaní s tkanivom typu zvierat voľne žijúcich. Tempo rastu žalúdočného bunkových línií s nadmernou expresiou Mir-449 bola inhibovaná o 60% v porovnaní s kontrolami. FACS analýza bunkového cyklu MIR-449 s nadmernou expresiou bunky vykazovali významné zvýšenie sub-G 1 frakcie orientačné apoptózy. SS-Gal testy ukázali zostárnutých fenotyp žalúdočných bunkových línií s nadmernou expresiou MIR-449. Affymetrix 133v2 pole identifikované GMNN
trhového hospodárstva, CCNE2, SIRT1 stroje a CDK6
as MIR-449 ciele. Luciferázové testy boli použité na potvrdenie GMNN
, sa stretol
CCNE2 stroje a SIRT1
ako priame ciele. Tiež ukazujú, že mier-449 nadmernej expresie aktivovanej p53 a jeho následného cieľovej p21 rovnako ako apoptóza markerov štiepené PARP a CASP3. Dôležité je, že qPCR analýzy ukázali, stratu MIR-449 expresie v klinických nádorov žalúdka v porovnaní s normálnymi tkanivami.
Závery
V tejto štúdii sme dokumentovať zníženú expresiu MIR-449 gastrínu
KO myší a ďalej potvrdila svoju stratu na ľudských nádorov žalúdka. Skúmali sme funkcie MIR-449 stanovením jej priame ciele. Ďalej ukážeme, že mier-449 indukuje starnutia a apoptózu aktiváciou p53 dráhy.
Pozadie
Karcinóm žalúdka je jedným z piatich najčastejších nádorových ochorení na svete a druhou najrozšírenejšou príčinu úmrtí súvisiacich s rakovinou [1] , Jedná sa predovšetkým, ale nie výlučne, v dôsledku infekcie H. pylori
[2], pretože nie všetky H. pylori
infikovaných osôb k vývoju tumorov [3]. Ďalšie faktory podieľajúce sa na vzniku rakoviny žalúdka zahŕňajú stupeň a typ zápalovej reakcie [2], ako aj hladiny gastrínu
hormónu [4, 5]. Niekoľko štúdií ukázalo, že ako hypergastrinémie [6, 7] a nedostatok gastrínu [5] prispievajú k patogenéze rakoviny žalúdka. Achlórhydrie je spoločným rysom myších modeloch sklon k metaplázia a rakoviny [6, 8, 9]. Gastrín
knockout myši sú achlorhydric [10], že zvýhodňuje bakteriálne žalúdočné prerastania [11, 12] a chronické bakteriálnou infekciou žalúdka viesť k žalúdočným metaplázia, ktoré môže viesť až k rakovine žalúdka [6, 12].
Od ich objavenia microRNA, boli nájdené zapojené vo veľmi širokom rozsahu normálnych a patologických procesov [13]. MikroRNA prejavujú svoje regulačné funkcie posttranscriptionally väzbou na čiastočne komplementárne sekvencie motívy prevažne v 3 'UTR cieľových mRNA, čo vedie mRNA destabilizácii a transláciu [14]. Z biologického hľadiska, microRNA sú náročné objekty, aby čo upravujú kohorty cieľových génov, ktoré nie sú ľahko identifikovať. Z terapeutického hľadiska, microRNA sú veľmi zaujímavé, pretože niekoľko štúdií preukázalo, silu mikroRNA ako biomarkerov a počiatočných predklinických štúdiách sa zistilo, že microRNA môžu byť terapeuticky cielené in vivo [15].
Profilovanie štúdie svedčia microRNA deregulácie široké spektrum chorôb, vrátane všetkých hlavných druhov rakoviny [16]. MikroRNA pravdepodobne ovplyvňovať vznik nádorov procesy na dvoch úrovniach. Po prvé, niekoľko štúdií stanovené pre-onkogénne alebo nádorovo supresívnej role jednotlivých mikroRNA pevne prepájanie s rakovinou etiológie, čo sa dokladá MIR-155, mier-10b a mier-21 [17-19]. Po druhé, zobrazí sa microRNA regulačný systém sám o sebe, aby sa nádor supresívnej funkcie ako genetický ablácia kľúčových microRNA biogeneze faktorov, ako je Dicer, silne zvýši rakovina náchylnosť [20] a stratu mutácií funkčných boli identifikované v dôležitých mikroRNA spracovania faktorov v ľudských nádoroch [21 až 23].
v tejto štúdii sa zaoberáme význam mikroRNA v rakoviny žalúdka využívať gastrínu
modelu knockout myši a H. pylori
infekcie u myší divokého typu. Identifikujeme MIR-449, ako významne down-regulované alebo stratené v myšiach modeloch rakoviny žalúdka, rovnako ako v primárnych ľudských nádorov žalúdka. Identifikácia cieľov mRNA ukazuje, že táto microRNA pravdepodobne pôsobí tumor supresívnej funkcie prostredníctvom vzájomnej regulácie kohorty regulátorov s rakovinou spojené bunkového cyklu, vrátane trhového zaobchádzanie, GMNN, CCNE2, SIRT1 a HDAC1.
Metódy
Myši
boli použité tri rôzne vekové skupiny (12-16 týždne, 1 rok alebo 1 ½ rokov) divokého typu (wT) alebo gastrín
knockout myší (KO). Všetky myši boli na zmiešané 129 /SVJ, C57BL /6J pozadí, backcrossed najmenej štyrikrát do C57BL /6J [12]. Myši boli udržiavané pri špecifických podmienkach bez patogénov a monitorované podľa Federácie odporúčania Európske laboratórium Animal Science zväzov [24] s 12 h svetla a 12 h temná cyklov.
H. pylori
infekcie
C57BL6 /J myší (n = 10) boli vrúbľovať s non-myšou-upravený klonu H. pylori kmeňa
67:21, pôvodne izolovaný z antrálnej biopsiu získané zo švédskej ženy s žalúdočný vred. Kmeň je Vaca + a obsahuje celý CAG patogenity ostrov (PAI), s genetickou stabilitu v CAG PAI [25]. Myši boli vrúbľovať každý druhý deň (trikrát) počas 5 dní. DNA bola extrahovaná a analyzovaná na prítomnosť Helicobacter druhov za použitia gradientu gélovej elektroforézy testu semi-nested PCR, denaturácia, špecifickú pre rod Helicobacter, ako bolo opísané skôr [26]. Úspešná skupina neinfikovaných myší C57BL6 /J boli použité ako kontroly.
Žalúdky všetkých myší boli rozdelené na očnom pozadí a antra pred extrakciou RNA. Všetky pokusy na zvieratách boli schválené sociálneho výboru dánskeho zvierat (2005 /562-40) a dánsky lesa a prírody agentúry (20010077355/6).
Myši dutine úsekov
Myši boli usmrtené zlomením väzu. Antra bola odstránená, vyperie v ľadovo chladnom PBS, zmrazí v kvapalnom dusíku a skladované pri teplote -80 ° C až do extrakcie RNA.
Klinické vzorky analýzy
biopsie z karcinómu žalúdka a priľahlé normálneho tkaniva boli získané od pacientov podstúpi operáciu rakoviny žalúdka u Oddelenie gastrointestinálne operácií, Rigshospitalet. Zahrnutie sa konal v júli do decembra 2008 a všetci pacienti za predpokladu, podpísaný informovaný súhlas (Ethical schválenie výbor H-B-2008-049) a Dánska agentúra pre ochranu údajov (2008-41-2138). Biopsie boli umiestnené do RNAlater (Ambion) na operačnom sále a následne sa zmrazí pri -80 ° C až do extrakcie RNA. Extrakcia RNA a
qPCR analýzy
RNA bola extrahovaná za použitia TRIzolu (Invitrogen) podľa výrobcu. miRNA profil expresie bola hodnotená pomocou TaqMan miRNA testy (Applied Biosystems) za HSA /MMU-MIR-449a a B HSA /MMU-MIR-34a, b a c a rnu44 alebo HSA /MMU-MIR-191. Sekvencia primérov pre validáciu Affymetrix ciele sú uvedené v ďalšej súbor 1, tabuľka S1.
Bunková kultúra
SNU638 a MKN74 boli pestované v RPMI-1640 (Gibco) s 10% FBS (Hyclone), 100 U /ml penicilínu a 100 ug /ml streptomycínu (Invitrogen) a inkubovaná pri teplote 37 ° C v 5% CO 2. Bunky HCT116 (wt a p53 - /- boli pestované v McCoy 5A (Gibco) s 10% FBS (Hyclone) a 100 U /ml penicilínu a 100 ug /ml streptomycínu (Invitrogen) a inkubované pri 37 ° C v 5% CO <. sub> 2 HEK293 a MEF bunky (hmôt a p53 - /-) boli pestované v DMEM (Gibco) s 10% FBS (Hyclone), 100 u /ml penicilínu a 100 ug /ml streptomycínu (Invitrogen) a inkubovaná pri teplote 37 ° C 5% CO 2.
miRNA prekurzorov a siRNA
prekurzory miRNA boli kúpené od firmy Ambion, HSA-MIR-449a (PM11521), HSA-MIR-449b (PM11127) a HSA-MIR-34a ( PM11030).
rast buniek analýzy
SNU638 bunky boli nasadené na 24jamkové doštičky a transfekovány nasledujúci deň s 50 nM miRNA duplexu siRNA alebo za použitia Lipofectamine 2000 (Invitrogen). bunky boli fixované v uvedených časových bodoch v 4% paraformaldehydu , morenie v 0,1% roztoku kryštálovej violete, a resuspendované v 10% kyseline octovej. Vzorka absorbancie bola meraná pri 620 nm.
bunkového cyklu pomocou FACS analýzy
SNU638 a MKN74 bunky boli nasadené v množstve 2 x 10 6 buniek na 10cm doštičky a transfekovány 50 nm miRNA duplex (Ambion) s použitím Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Bunky boli zozbierané 48 a 72 hodín po transfekciu, zafarbené na obsah DNA s použitím propidium jodidu (PI) a analyzované na prietokovom cytometri FACS Calibur (Becton-Dickinson). V stručnosti, bunky boli zozbierané trypsinizací a premyjú raz PBS, ako ktorým sa cez noc v 70% etanolu. Na škvrny na DNA, bunky boli peletovanie, resuspendované v 100 ul EtOH a farbené po dobu 1 hodiny sa 300 ul roztoku PI (0,05 mg /ml PI, 20 ug /ml RNázy A v 0,1% BSA).
Starnutie analýz
SNU638 bunky boli vrúbľovať v množstve 400.000 buniek na 6-jamkové doštičky a transfekovány 50 nm miRNA duplex (Ambion) s použitím Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Štyri dni po transfekciu boli bunky premyté PBS a fixované po dobu 5 minút pri teplote miestnosti v 2% formaldehydu /0,2% glutaraldehydu. Bunky boli dvakrát premyté v PBS pred tým, než pH6.0 zafarbené čerstvým Senescence spojené beta-Gal roztokom škvŕn (1 mg /ml 5-bróm-4-chlór-3-indolyl-βD-galaktosidov (X-gal), 0.12mM K 3Fe [CN] 6, 0.12mM K 4Fe [CN] 6, 1 mM MgCl 2 v PBS pH6.0) cez noc pri teplote 37 ° C bez CO 2 dodávka , Bunky boli premyté raz v PBS (pH6.0) a pozorovali pod mikroskopom.
Protilátky a western blot analýzy
SNU638 boli nasadené v množstve 2 x 10 6 buniek na 10 cm dosku, transfekované dvakrát na dvoch po sebe idúcich dní s 50 nM miRNA duplexy s použitím Lipofectamine 2000 podľa výrobcu (Invitrogen). Bunky boli zozbierané trypsinizací, premyté raz PBS a lyžovanie v RIPA pufri (150 mM NaCl, 0,5% deoxycholát sodný, 0,1% SDS, 1% Igepal, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM EDTA) doplnenom 1 mM DTT, 1 mM Pefabloc, 1 mM NaV3, 10 mM NaF a 1X kompletné mini inhibítora proteázy tablety kokteilu. 25 ug proteínu /dráha boli rozdelené na 4 až 20% NuPAGE Bis-Tris gélov (Invitrogen) a prenesené na nitrocelulózové membránu. Primárne protilátky použité boli splnené (Cell Signal 4560), MYC (Cell Signal 9402), GMNN (Santa Cruz Sc-53923), VCL (Sigma V9131), TP53 (Santa Cruz Sc-126), CDKN1A (Santa Cruz Sc-6246) , CDK6 (Santa Cruz Sc-177), HDAC1 (Santa Cruz Sc-7872), CCNE2 (Cell Signal 4132), Tubb (abca ab11304), PARP (Cell Signal 9542) a odštiepi CASP3 (Cell Signal 9661).
microarray analýzy
malé RNA (menej ako 200 nT) boli izolované s Invitrogen PureLink miRNA Isolation Kit z fundusu a antrálnej tkaniva z 1) gastrín
KO myší a podľa veku a pohlavia uzavreté C57BL6 /J kontrolných myší a 2) C57BL6 /J myší infikovaných H. pylori stroje a neinfikovaných veku a pohlavia zodpovedajúci kontrolný myší C57BL6 /J, (n = 4 pre každú skupinu). Kvalita izolovaných malých RNA bola stanovená použitím testu na malej RNA na Agilent Bioanalyzer. 500ng malých RNA bola označená Genisphere FlashTag Kit a hybridizována Invitrogen nCode vícedruhovému miRNA Microarray V2 v hybridizačním stanici Maui. Spracovaná sklíčka boli naskenované v microarray skener Agilent DNA. Výsledný obraz bol analyzovaný a pomer mediánu normalizované pomocou GenePix Pro 6.0. Štyri biologickej repliky sú pre každé porovnanie. Vzorky boli hybridizovány štyroch polí v duálnom farebné farbivá odkladacie mikročipu experimentálneho designu. BRB ArrayTools boli použité pre násobné zmeny a štatistické výpočty. Vybrané údaje z analýzy miRNA poľa bola potvrdená použitím TaqMan PCR v reálnom čase miRNA testy. Dáta budú uložené u ArrayExpress po prijatí.
MRNA polí
SNU638 boli prenesené s 50 nM Mir-34a a mier-449b duplex siRNA s siglo použité ako negatívna kontrola. Celková RNA bola extrahovaná 24 hodín po transfekciu za použitia TRIzolu činidla. Analýza Affymetrix microarray (HG-U133 Plus 2.0 človeka) bola vykonaná na Microarray Center, Rigshospitalet, Copenhagen University Hospital. Experimenty boli vykonané buď v triplikátech alebo quadruplicates. Dáta budú uložené u ArrayExpress po prijatí.
Vectors konštrukciu a reportér testy
3'UTRs z HDAC1
SIRT1
, sa stretol
GMNN stroje a CCNE2
hospodárstva MIR-449 väzbové miesta klonom po prúde luciferázové reportér vo vektorovom systéme pMIR-Report (Ambion). QuickChange lokálne cielená mutagenéza kit (Stratagene) bola použitá na vyvolanie dvoch bodových mutácií do oblasti osiva. Primery pre mutagenéza sekvencie sú uvedené v ďalšej súbor 1, tabuľka S1.
HEK293 bunky boli nasadené na 96jamkové doštičky a transfekovány 20 nM miRNA prekurzor alebo miešaná siRNA riadenie, 20-50ng luciferázy vektora (pMIR-správa) a 5 ng z Renilla vektor (PRL-TK) za použitia Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Bunky boli zozbierané 24 hodín po transfekciu a aktivita luciferázy bola meraná s použitím Dual-Glo Luciferase Assay (Promega). Analýza bola spracovaná
Microarray
Microarray expresie dát pomocou "AFFY" balíček Bioconductor [27]. Probe set intenzity boli zhrnuté a kvantilová normalizované pomocou balíčkov Bioconductor RMA a VSN. Diferenciálnej expresie bola stanovená za probeset za použitia t-testu. Sondy sety boli mapované do Ensemble prepisov (verzia 49) s využitím mapovanie poskytovaných na BioMart. Probesets, ktoré mapujú na dvoch rôznych ensemble gény boli vyradené.
Vyhodnocovanie globálne down-reguláciu microRNA cieľové gény
3'UTRs, 5'UTRs a kódujúce sekvencií transkriptov boli skenované na zodpovedajúci 6mer, 7mer a 8mer miRNA semeno miesta (doplňujúce pozíciu 2-7, 2-8 a 2-9 miRNA). Globálna analýza miRNA ciele down-regulácia bola hodnotená pomocou najdlhšia 3 'UTR sekvenciu génu per sa predišlo skresleniu zavedené gény s mnohými prepis izoforiem. My sme tu zavrhli prepisy s 3 'UTR sekvencie kratšej ako 50 nt. Ak chcete celkovo posúdiť, či Mirna cieľové gény boli down-regulované po miRNA transfekciu sme testovali hypotézu, null, že distribúcia zmena expresie miRNA cieľov (ktoré majú 7mer cieľové miesto) sa rovná distribúciu všetkých vyjadrených génov bez predpokladaných cieľových miestach pomocou formulára neparametrické Wilcoxonův rank súčtu test. Podobný prístup bol použitý pre vyhodnotenie down-regulácia génov s cieľovými miestami miRNA v kódujúcich oblastí a 5'UTRs mRNA.
Vyčerpávajúce štatistické vyhodnotenie slov koreluje s down-reguláciou
Použili sme predtým publikovaný neparametrického rank na báze štatistika vyčerpávajúco vyhodnotiť vzťah slovných výskytov v 3'UTRs a zmeny génovej expresie po miRNA transfekciu [28, 29]. Gény boli zoradené podľa zmenou expresie indukované transfekcia Mir-34a a mier-449b, a korelácia s down-reguláciou bola testovaná na všetky slová dĺžky 5-7 (N = 21 504).
Štatistické testy
študenti t-test s Welch korekciou.
Výsledky
MIR-449b je dole upravená v dutine oboch gastrín
KO myší a H. pylori
myší infikovaných
gastrín
knockout myší sú achlorhydric so sklonom k ​​rozvoju antrálnej hyperplázie a žalúdočné adenómy v čase (obrázok 1) [6, 12]. Aby bolo možné určiť mikroRNA deregulované pri vývoji rakoviny žalúdka, sme sa zaoberali miRNA profilov expresie v žalúdočných novotvarov z gastrín
knockout myší pomocou miRNA mikročipy. Ako je uvedené v tabuľke 1, 20 microRNA boli významne deregulované u myší s vyradeným génom v porovnaní s kontrolami divokého typu littermate, s tromi miRNA sa líšia viac ako dvojnásobne, MIR-7 sú up-regulované a mier-709 a mier-449b sú down-regulované v dutine gastrínu
knockout myší v porovnaní s divokými typmi. Pre ďalšie potvrdenie MIR-449 deregulácii počas vývoja rakoviny žalúdka, sme sa zaoberali jeho expresiu v divokých typ myší dutine tkanivách infikovaných H. pylori
. Je zaujímavé, že miRNA pole preukázali špecifickú down-reguláciu MIR-449b v H. pylori
infikovaných myší (tabuľka 2 a ďalší súbor 1, obr S1). Obrázok 1 Old gastrín knockout myší rozvíjať žalúdočné adenómov. Antra rezy izolované z 12-16 týždňov staré myši (ľavý panel), 12 až 18 mesiacov staré myši (prostredný panel) a staršie ako 18 mesiacov myši (pravý panel), z divokého typu (horný panel) a gastrín
knockout myší (dolný panel). Sekcia ukazujú vývoj adenóm v dutine tkanív v gastrínu
knockouts v porovnaní s divokými typmi.
Tabuľka 1 miRNA deregulované gastrínu
knockout myší
miRNA Meno
log 2-násobne
p-hodnota
miRNA Name

Log2-fold

p-value

mmu-miR-709
-1.73
7.0E-06
mmu-miR-422b
0.44
4.6E-02
mmu-miR-449b
-1.37
1.6E-03
mmu-miR-199a*
0.50
7.7E-03
mmu-miR-805
-1.01
7.5E-03
mmu-miR-25
0.51
1.6E-02
mmu-miR-706
-0.98
3.1E-03
mmu-miR-27b
0.56
5.1E-03
mmu-miR-467a
-0.88
2.8E-02
mmu-miR-182
0.56
1.8E-02
mmu-miR-696
-0.83
7.1E-03
mmu-miR-30a-3p
0.59
2.2E-02
mmu-miR-667
-0.66
2.3E-02
mmu-miR-10a
0.70
7.1E-03
mmu-miR-690
-0.28
1.7E-02
mmu-miR-152
0.70
2.3E-02
mmu-miR-18
0.29
3.7E-02
mmu-miR-1
0.77
7.1E-03
mmu-miR-143
0.34
2.3E-02
mmu-miR-7
1.06
4.9E-03
Zoznam výrazne deregulovaných miRNA v žalúdočných novotvarov z gastrín
myší Knockout v porovnaní s divokými typmi.
Tabuľka 2 miRNA deregulované v H. pylori
infikovaných tkanív
Názov miRNA
Zložiť change

p-value

mmu-miR-122a
-3.247
0.000788
mmu-miR-449b
-0.879
0.045214
Zoznam výrazne deregulovaných miRNA v divokého typu myší antra infikovaných H. pylori
v porovnaní s non-infikované antra.
MIR-449 inhibuje progresiu bunkového cyklu a vyvoláva starnutie
, ak preukázali, down-regulácia MIR-449 expresie v žalúdočných rakovín sme chceli skúmať účinok re-vyjadrovať MIR-449 v žalúdočnej nádorových bunkových línií. Je zaujímavé bol zistený žiadny badateľný expresie rodiny Mir-449 v rámci panelu bunkových línií, vrátane žalúdočných SNU638, SNU5, SNU216, SNU601 a MKN74 udržanie pojem MIR-449 s funkciou nádorovo supresívnu (dáta nie sú uvedené). Rodina MIR-449 sa skladá z Mir-449a a b u ľudí a mier-449a, b, c u myší. Je zaujímavé, že zdieľajú rovnakú sekvenciu semien ako MIR-34 rodiny a sú teda očakáva regulovať prekrývajúce kohorty cieľových génov (viď obrázok 2A). Pre posúdenie funkcie Mir-449 v žalúdočnej bunkových líniách sme re-predstavený MIR-449b v SNU638 a MKN74 buniek. V porovnaní s negatívnymi kontrolnými mikroRNA, znovuzavedenie MIR-449b výrazne ovplyvnil šírenie SNU638 buniek (obrázok 2b) a vizuálna kontrola buniek indikovaných indukcie apoptózy a bunkového starnutia (obrázok 2c, a ďalší súbor 1, obrázok S2). Prietokovej cytometrie propidium buniek jodidových postriekané transfektovaných MIR-449b ukázala G 1 nahromadenie 48 hodín po transfekciu a následne po 72 hodinách po transfekciu akumuláciou buniek v sub G 1 frakcie pripomínajúce bunky smrť (obr 2d). Indukcia bunkové starnutie bola potvrdená kyslé beta-gal farbenie pomocou MIR-34a ako pozitívna kontrola mikroRNA (obrázok 2e). Ak chcete vylúčiť účinky bunkové línie špecifické funkčné dôsledky MIR-449 znovuzavedenie z hľadiska zastavenie bunkového cyklu boli overené v MKN74 buniek (ďalší súbor 1, postavou S3). Tak, znovuzavedenie MIR-449 negatívne ovplyvňuje proliferáciu žalúdočných nádorových bunkových línií súčasne s indukciou starnutia a apoptózy v zhode s Mir-449 s nádorovým potlačovacie funkcií. Obrázok 2 Mier-449 je súčasťou MIR-34 rodiny a inhibuje proliferáciu buniek. A - Mir-449 je súčasťou MIR-34 rodiny a je evolučne konzervovanú. B - Mir-449 re-úvod do ľudských bunkových línií žalúdočných (SNU638) inhibuje proliferáciu buniek (červená čiara) v porovnaní s rušeným ovládania (modrá čiara) a mier-146 ovládanie (čierna čiara). Chybové úsečky predstavujú smerodajnú odchýlku C - Vizuálna kontrola inhibícia bunkovej proliferácie a Senescence podobný fenotypu po MIR-449 znovuzavedenie do SNU638 buniek (dolný panel) v porovnaní s rušeným kontrole transfekcia (horný panel). D - FACS analýza bunkového cyklu ukazuje akumuláciu sub-G1 SNU638 buniek 72 hodín po MIR-449 znovuzavedenie (vpravo histogramu) v porovnaní s rušeným kontrole transfekcia (vľavo histogramu) Tabuľka ukazuje akumuláciu buniek v G1 frakcii upon MIR-449 re -Úvod v porovnaní s kontrolou kódované RNA po 48 hodinách po transfekciu s následným prechodom na frakcie sub-G1 na 72 hodín po transfekciu zobrazujúceho bunkovej smrti. E - zostárnutých fenotyp SNU638 buniek na Mir-449 a mier-34a pozitívna kontrola znovuzavedenie ukázané v kyslom prostredí β-gal testu v porovnaní s RNA miešaná kontrole
spoločnú sekvenciu očkovacie Mir-449b a mier-34a vyvolať veľmi. korelovaný výraz mení
charakterizovať prepisy riadené Mir-449 a zistiť, či MIR-449 reguluje rôzne prepisy ako MIR-34a, boli skúmané SNU638 bunky expresné profily 24 hodín po transfekciu MIR-449b alebo MIR-34a a diferencovane vyjadrené prepisy identifikovať. Zistili sme, že mRNA s predpokladanými cieľovými miestami miRNA (miesto 7 mer semien) v 3 'UTR boli výrazne down-regulované v porovnaní s mRNA bez predpokladaných cieľových miestach po transfekcia MIR-449b (p < 1.2E-70, dvojstranný Wilcoxonův test rank-súčet), (Ďalšie súbor 1, obrázok S4A). mRNA, čo predpovedal miRNA cieľových miest semien v kódujúcich oblastí sa tiež zistilo, že významne byť down-regulované (p < 9.9e-25), zatiaľ čo mRNA s lokalít v 5'UTRs boli iba okrajovo down-regulované (p < 5.3e- 2). Výraz sa zmení indukované transfekcia zrelého Mir-449b a mier-34a boli vysoko korelované cez divergencia zrelých sekvencií mimo oblasti osiva (Pearsonovho korelačného koeficientu R = 0,94, p = 0), (ďalší súbor 1, obrázok S4B). vyčerpávajúco sme vyhodnotili všetky oligonukleotidy (slov) s dĺžkou 5-7 pre koreláciu s down-reguláciou po MIR-449b a mier-34a transfekcia (pozri metódy). V súlade s mnohými predchádzajúcich štúdií, táto analýza odhalila /449b stránky semien zdieľané MIR-34a ako slová 3'UTR najviac korelovala s down-reguláciou v dvoch pokusov (ďalší súbor 1, obrázok S4C).
MIR-449 reguluje početné regulátory bunkového cyklu
expresné profily boli použité na identifikáciu odlišne exprimovaných transkriptov v bunkách transfekciou s Mir-449b alebo ovládacích prvkov (ďalší súbor 1, tabuľka S2). Analýza aktivácia dráhy na základe rôzne regulovaných prepisy ukazuje, že mier-449 reguluje predovšetkým prepisy kódujúcich proteíny zúčastňujúce sa odpovede poškodenie buniek, kontrolu bunkového cyklu, zápaly a rakovinou cestami (obrázok 3a). Zameranie na sade domnelých cieľových génov s dobre zavedených rolou vo tumorogenézy sme potvrdili down-reguláciu podľa MIR-449 sa stretol s protokapitalismu onkogénu (MET
), cyklin dependentnej kinázy 6 (CDK6)
geminin (GMNN )
myelocytomatosis vírusové onkogény homológov (MYC)
Sirtuin 1 (SIRT1
) a histondeacetylázy 1 (HDAC1)
na úrovni transkriptov (obrázok 3b). Western blot analýzy potvrdili schopnosť MIR-449 k down-regulácii v trhovom hospodárstve, GMNN, myc, SIRT1, cyklin E2 (CCNE2) a HDAC1 na úrovni proteínu do tej miery, podobnú tej, ktorá dosahuje opätovným zavedením MIR-34a (obr 3c). Pre podskupinu cieľových génov, vrátane trhovohospodársky
GMNN, CCNE2
SIRT1 stroje a HDAC1
, sme potvrdili priamu interakciu s Mir-449 s cieľovým génom 3 'UTR použitím luciferázového testu (obrázok 3d ). Obrázok 3 MIR-449 sa zameriava na gény regulátora bunkového cyklu. A - Vynaliezavosť Pathway Analysis (IPA) z deregulovaných génov upon MIR-449 znovuzavedenie do SNU638 buniek vykazujúcich obohatením rakovinových génov kategórií, bunková smrť a bunkového cyklu ciest medzi ostatnými. B - qPCR validácia Affymetrix polí ukazujúci down-reguláciu Met
CDK6
GMNN
MYC stroje a HDAC1
na Mir-449 znovuzavedenie v porovnaní s miešanými kontrolami RNA. C - Western blot validácia down-regulované gény upon MIR-449 opätovného dovozu do SNU638 buniek v porovnaní s miešanými kontrol RNA. Vinkulin (VCL) a tubulín beta (Tubb) boli použité ako kontroly loading D - overenie priameho a funkčného cieľ väzbu použitím luciferázy konštruktov drží 3'UTRs divokého typu a mutantných 3'UTRs (dve mutácie v-449 MIR väzobné miesto), * označuje štatistickú významnosť v expresie luciferázy medzi 3'UTRs divokého typu transfekciou miR449a /b v porovnaní s RNA kódované kontrolu, # označuje štatisticky významné rozdiely vo expresie luciferázy medzi 3'UTRs divokého typu v porovnaní s mutantný 3'UTRs transfekciou Mir-449a a spätných 449b. "Ns" nie je významná hodnota p > 0.05 "*" alebo "#" významný 0,01 < p hodnota < 0.05 "**" alebo "##" veľmi významné 0,01 < p hodnota < 0,001, "***" alebo "###" mimoriadne významná hodnota p < 0,001
preto, MIR-449 sa priamo cielia gény bunkového cyklu regulátor v súlade s funkciou nádorového supresor a s zástavy bunkového cyklu pozorované pri MIR-449 opätovné zavedenie do nádorových bunkových línií.
MIR-449 indukuje expresia p53, ale nie je regulovaná p53
Ako už bolo skôr zistené, MIR-34a fungovať po prúde p53 [30-33] analyzovali sme chcete tiež MIR-449a /b boli spojené s p53. Toto bolo ďalej urýchlený za prítomnosti domnelého p53 väzbového miesta pre 10 kb upstream od ľudského MIR-449 (dáta nie sú ukázaná). Preto indukovanej p53 poškodenie DNA za použitia UV alebo 5-fluóruracil (5-FU) v štyroch rôznych systémoch, HCT116 a MEF typ a p53 knockout bunkami prirodzeného (dodatočný súbor 1, obrázok S5A). Avšak, bol po p53 dráhy aktiváciou (ďalší súbor 1, obrázok S5B) detekovaná žiadna významná zmena v Mir-449 výrazu. Na záver sme zistili, žiadny dôkaz, že mier-449 je transkripčný terčom p53. Na druhej strane sme zistili, že mier-449a /b je schopný indukovať aktiváciu p53, aktiváciu génov p53 reakcie, ako je napríklad p21 a indukciu apoptózy, ako o tom svedčí štiepenie kaspázy 3 (CASP3) a poly (ADP-ribóza ) polymerázy 1 (PARP) (obrázok 4). K pochopeniu mechanizmu, ktorým MIR-449 Znamená to sme skúmali vplyv Mir-449 na SIRT1 a HDAC1. SIRT1 a HDAC1 sú deacetylázy, ktoré inhibujú, okrem iného, ​​aktivácia p53 a mier-34 bolo preukázané, že potlačiť SIRT1 [34]. overený sme špecifickú väzbu MIR-449 sa SIRT1 a HDAC1 za použitia 3 'UTR luciferázy testov (obrázok 3D). Obrázok 4 MIR-449 aktivuje p53. Western blot analýza ukazuje nárast proteínu p53 po Mir-449 a pozitívna kontrola Mir-34a opätovného dovozu do SNU638 buniek v porovnaní s RNA miešaná kontrolu rovnako ako aktiváciu p53 nadväzujúcich cieľovej p21 a apoptóze markerov odštiepeneckých CASP3 a PARP. Vinkulin (VCL) a tubulín beta (Tubb) boli použité ako kontroly nakladania.
Preto sme sa špekulovať, že mier-449 indukuje apoptózu inhibíciou HDAC1 Histon deacetylázy a SIRT1 čo vedie k aktivácii p53 teda indukciu apoptózy markerov odštiepi CASP3 a PARP.
mier-449 je down-regulovaná v žalúdočných rakovín ľudských
pri posudzovaní významu Mir-449 v ľudských nádorových ochorení Ďalej sme skúmali expresiu Mir-449 v 10 biopsiu s karcinómom žalúdka. Dôležité je, že sme zistili, ako Mir-449a a B, ktoré sa významne down-regulované alebo naopak chýba u 8 z 10 primárnych karcinómov žalúdka. Okrem toho, expresia Mir-449a a b Zdá sa, že čo-regulované (obrázok 5a). Nenašli sme žiadnu koreláciu medzi znížením MIR-449 expresie a klinickými charakteristikami rakoviny (obrázok 5b). Analýza genómovej DNA z nádorov nájdený žiadny dôkaz pre stratu alebo hyper-metyláciou z lokusov MIR-449 za použitia metylácie špecifickej analýzy krivky topenia (MS-MCA) indikujúca transkripčný down-reguláciu expresie (dáta nie sú uvedené). Preto, v súlade s dátami z dvoch myších modeloch zápalu žalúdka a hyperplázia, expresie MIR-449 je down-regulovaná v ľudských karcinómov žalúdku. Obrázok 5 Mier-449 je dole upravený v karcinómov žalúdka človeka. Analýza qPCR (horný panel), zobrazujúci down-reguláciu expresie MIR-449 v 8 žalúdočné rakovinové tkanive v porovnaní s Mir-449 expresie u kontrolných vzoriek zhodou (bodkovaná čiara). U44 bol použitý ako vnútorná kontrola. Tabuľka ukazuje klinické údaje pacientov (dolný panel). "Ns" nie je významná hodnota p > 0.05 "*" významný 0,01 < p hodnota < 0.05 "**" veľmi významné 0,01 < p hodnota < 0,001, "***" mimoriadne významná hodnota p < 0.001
diskusie
rakovina žalúdka je vysoko smrtiace malígne ochorenie s viac ako 21.500 nových prípadov každý rok v Spojených štátoch osamotený [35]. Táto choroba je často zistená neskoro a miera prežitia 5 rokov, je v dôsledku toho nižší ako 20% [36]. Je preto dôležité pochopiť etiológiu a progresie štádiách ochorenia. Význam bakteriálnych, ochrany životného prostredia a hostiteľ genetické rizikových faktorov v žalúdočnej karcinogenéze boli študované, ale menej je známe o molekulárnej progresie ochorenia [37, 38]. Okrem iného p53 dráha inaktivácia je hlásený v 30-60% všetkých karcinómov žalúdka [39, 40] a nedávne štúdie ukazujú, H. pylori
priamu moduláciu génu p53 alebo jeho následné ciele [41].

• Vplyv N-acetyl-L-cysteín infúzie hladiny cytokínov a žalúdka intramucosal pH pri ťažkej sepse
• Benígne gastro-koľkých fistula u ženy prezentujúca pri chudnutí a občasné zvracanie: kazuistika