MicroRNA-645, uppreglerat i mänsklig adencarcinoma av mag esofagus korsning, hämmar apoptos genom att rikta tumörsuppressor IFIT2

MicroRNA-645, uppreglerat i mänsklig adencarcinoma av mag esofagus korsning, hämmar apoptos genom att rikta tumörsuppressor IFIT2 Bild Sammanfattning
bakgrund Review, en ökande mängd bevis tyder på att miRNAs har en avgörande roll i cancer och cancerutveckling; dock fortfarande roll miRNA i tumörbildning av adencarcinoma av mag esofagus korsning (AGEJ) till stor del oklar.
metoder
SGC7901 och BGC-823 gastric cancercellinjer användes. Uttrycken för MIR-645 och IFIT2 (Interferon-inducerad protein med tetratricopeptide upprepar 2) undersöktes av QRT-PCR, var uttryck för IFIT2 granskas av western blotting och immunohistokemi analys. Cellen apoptos bestämdes med FACS. MIR-645-hämmare, härmar och plasmid-IFIT2 transfektioner utfördes för att studera förlust- och förstärkningsfunktion. Kaspas-3/7-aktivitet undersöktes av kaspas-3/7 analysen.
Resultat
I den aktuella studien har vi rapporterat ett ökat uttryck av MIR-645 i AGEJ kliniska prover jämfört med parade icke-cancervävnader. Vi observerade också en betydande MIR-645 uppreglering i två ventrikelcancer (GC) cellinjer, SGC7901 och BGC-823, som användes som cellmodeller eftersom det inte fanns några tillgängliga AGEJ cellinjer etablerade hittills. Vi fann att hämning av MIR-645 kunde sensibilisera dramatiskt SGC7901 och BGC-823 celler till både serum starvation- och kemoterapeutiska läkemedel apoptos genom uppreglering IFIT2, en förmedlare av apoptos via en mitokondriell väg, med en potentiell bindningsställe för miR -645 i dess mRNA s 3'UTR. Ytterligare undersökning uppvisade att IFIT2 uttryck minskar i SGC7901 och BGC-823 celler och AGEJ vävnader. IFIT2
ektopiskt uttryck leder till främjande av cellapoptos, vilket indikerar att IFIT2 kan fungera som en suppressor i utvecklingen av AGEJ. Vidare inducerar hämning av MIR-645 uppreglering av IFIT2 och ökad caspas-3/7-aktivitet jämfört med kontrollgrupper.
Slutsatser
Våra data antyder att miR-645 fungerar som en onkogen i human AGEJ genom att vid stone delvis genom, med inriktning på IFIT2
.
Nyckelord
Adencarcinoma av mag esofagus korsning mikroRNA-645 IFIT2 Apoptos bakgrund Nybyggt studier har antytt att adencarcinoma av mag esofagus korsning (AGEJ) skiljer sig från den distala mage, med olika riskfaktorer, tumöregenskaper och biologiskt beteende [1-4]. Dessutom har förekomsten av AGEJ ökat under de senaste 30 åren, särskilt i USA och norra Kina [5-9].
MikroRNA (miRNA) är en grupp av endogent uttryckt, icke-kodande små RNA, 20- 25 nukleotider i längd, som är kända för att negativt reglera genuttrycket genom att undertrycka translation eller minska stabiliteten hos mRNA genom att direkt binda till den 3'-otranslaterade regionen (3'-UTR) av mål-mRNA: n [10, 11]. Ackumulerande bevis tyder på att miRNAs har viktiga roller i regleringen fysiologiska och patologiska processer, inklusive utveckling [12], metabolism [13], celltillväxt [14], differentiering [15] och apoptos [16]. Dessutom är avvikande post-transkriptionell reglering av mRNA från miRNA relaterade till tumorigenes [17, 18]. De onormala uttrycksprofiler av miRNA har rapporterats detekteras i olika typer av humana tumörer inklusive lunga [19], bröst [20], prostata [21], lever [18], kolon [22] och magcancer [23]. Dessutom kan vissa miRNA fungera som onkogener [24-26] eller tumör supressors [27, 28] genom att reglera uttrycket av sina målgener som har viktiga roller i några viktiga vägar som är involverade i cellcykelprogression, apoptos eller spridning. miRNAs nedregleras i tumörprover som MIR-22 [29, 30], MIR-101 [31, 32], och MIR-7 [33, 34] brukar fungera som undertryckande miRNA, medan miRNAs uppregleras i tumörprover som mIR-17 [35, 36], och mIR-21 [37, 38] brukar utöva onkogena roller. Dessa studier tyder på att dysreglering av miRNA ofta är inblandade i cancer och cancer progression. Review En färsk studie har visat att MIR-645 kan utöva tumörundertryck roll i avancerad serös äggstockscancer för MIR-645 är negativt associerad med total överlevnad av det [39]. I den aktuella studien fann vi att MIR-645 uttryck ökade signifikant i AGEJ kliniska prover jämfört med parade godartade vävnader med hjälp av mikroRNA chips. Men rollen av MIR-645 i tumörbildning av AGEJ har inte ännu studerats. Ytterligare studier visade att MIR-645 var också signifikant upp-regleras i två ventrikelcancer (GC) cellinjer, SGC7901 och BGC-823, som har använts som alternativa cellmodeller i den aktuella studien. Hämning av MIR-645 i SGC7901 och BGC-823-celler undertryckte signifikant apoptos av SGC7901 och BGC-823 celler i skick serumsvält eller kemoterapeutiska läkemedel genom uppreglering IFIT2, en förmedlare av apoptos, med en potentiell bindningsställe för miR -645 i dess mRNA s 3'UTR. Uttrycksmönstret för MIR-645 och IFIT2 i AGEJ kliniska prover negativt korrelerade, vilket ytterligare tyder på att IFIT2
är en målgen av MIR-645. Dessutom hämning av MIR-645 resulterar i ökad kaspas-3/7-aktivitet, som aktiveras av IFIT2. I denna studie undersökte vi om MIR-645 uppregleras i human adencarcinoma av gastric matstrupen korsningen och hämmar apoptos genom att rikta tumörsuppressor IFIT2.
Metoder
etik uttalande Hus Till vävnadsprover, var skriftligt informerat samtycke erhölls från patienter. De metoder som används i denna studie har godkänts av Institutional Review Board i Henan University of Science and Technology och överensstämde med Helsingforsdeklarationen, och lokal lagstiftning.
Cellinjer och odlingsbetingelser
magcancer cellinjer SGC -7901, BGC-823 och odödlig normal gastrisk epitelceller linje, GES-1 var vänlig skänkt av professor Daiming fläkt. Alla cellinjerna upprätthölls i vårt institut enligt rekommenderade protokoll. Celler odlades i RPMI-1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
prover från människa
Alla experimentella förfaranden godkändes av Institutional Review Board i Henan University of Science and Technology. Skriftligt informerat samtycke erhölls för alla patientprover. Mänskliga AGEJ prover (n = 43) och patient parade godartade prover erhölls från patienter vid den första anslutna sjukhus, Henan University of Science and Technology, med informerat samtycke från varje patient.
RNA rening, cDNA-syntes, och kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) Review Total RNA från odlade celler extraherades med TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) enligt tillverkarens protokoll och RNA lagrades vid -80 ° C innan QRT-PCR-analys . Mogna miR-645 uttryck detekterades med användning av en Mirvana TM QRT-PCR miRNA Detection Kit (Ambion Inc. Austin, Texas), med U6 som en intern kontroll. IFIT2 uttryck detekterades med primrarna F: 5'AGCGAAGGTGTGCTTTGAGA 3 ', R: 5'GAGGGTCAATGGCGTTCTGA3' (produktlängd: 125 bp; Tm: 60 ° C; GC%: F-50%, R-55%; start-end: 643-748 bp) och GAPDH användes som en intern kontroll. PCR-produkterna separerades på en etidiumbromid-färgade 1,5% agarosgel och visualiserades med UV.
Cell transfektion
humana miR-645 duplex agomir (400 nM), antagomir (400 nM) och negativ kontroll utformades och från Ribobio (Guangzhou, Guangdong, Kina). Plasmid-IFIT2 och de negativa kontroll plamid köptes från Ribobio Inc (Guangzhou, Guangdong, Kina) Review miRNA mål förutsägelse
att hitta potentiella miRNA målgener, TargetScanHuman webbplats (http:.. //Www targetscan. org /) användes, bindningsfria energin beräknades och bidar ställen analyserades med användning http:.... //bibiserv techfak uni-bielefeld de /rnahybrid webbplats
vektorkonstrukt och luciferas reporter assay
för att konstruera IFIT2-3'UTR plasmiden, en vildtyp 3'-UTR-fragment av humant IFIT2 mRNA (1226-1233 nt, Genbank åtkomstnr. NM_001547.4) innehållande den förmodade miR-645 bindningssekvensen amplifieras genom RT-PCR och klonades in i stället mellan Xho i och Not i nedströms luciferasrapportörgenen av psiCHECK ™ vektorn (Promega, USA). En mutant av den inre miR-645 bindningsställe (5'AGCCTAG -3 "att 5'TCGGATC -3) i 3'-UTR av IFIT2 ingick av riktad mutagenes Kit (SBS Genetech, Beijing, Kina ). Vilda och mutanta typer av pmirGLO-IFIT2-UTR-vektorer validerades genom DNA-sekvense
Nukleotidsekvenserna hos primrarna för IFIT2-3'UTR (WT) klon:.
IFIT2XhoIF2:. 5'CCGCTCGAG AGAATAGAGATGTGGTGCCCACTAGGCTACTGCTG 3 '
IFIT2NotIR2: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TTAAAATGGAATCAGTGACTTTTATTTCTCATAACAGAG 3 '
nukleotidsekvenserna hos primrarna för IFIT2-3'UTR (MT) klon:.
mutIFIT2F2: 5'TTCTAGGTAGATGCTGAATTCGGATCACATCAAAGTTGGTGTGAAC 3' mutIFIT2R2
:. 5'GTTCACACCAACTTTGATGTGATCCGAATTCAAGEJTCTACCTAGAA 3 ' . sälja Cellerna transfekterades med Mir-645 härmar, NC och pmirGLO plasmid i 24-brunnsplattor med hjälp av Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) enligt instruktionerna. 48 h senare skördades cellerna och analyserades för luciferasaktivitet med användning av Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA) och detekteras av GloMaxTM 20/20 detekteringssystem (E5331, Promega).
Caspas-3/7-analysen
aktiviteten av kaspas-3 och kaspas-7 detekterades i 96-brunnsformat (2 x 10 3 celler /brunn) med användning av kaspas-Glo 3/7 Assay (Promega) enligt instruktionerna. 100 mikroliter Caspase-Glo 3/7 reagens kompletterades i varje brunn och inkuberades därefter vid rumstemperatur under 1 h follwong luminiscensen detekterades med användning av M200 mikroplattfluorescensläsare (Tecan). Bakgrunden luminiscens i samband med cellodling och analysreagens (blank reaktion) subtraherades från experimentella värde.
MTT-analys
Celler transfekterades med 100 nM miR-645-hämmare (Genepharma, Shanghai, Kina), härmar (Ribobio Inc ., Guangzhou, Guangdong, Kina) eller 100 nM plamid-IFIT2 (Ribobio Inc., Kina). Tjugofyra senare såddes celler i 96-brunnsplattor (2 x 10 3 /brunn). Viabiliteten hos cellerna undersöktes genom MTT (3-2, 5-difenyltetrazoliumbromid) analys (Sigma, USA) i enlighet med instruktioner på angiven tid.
Western blotting
Total protein från odlade celler lyserades genom Lysis Buffer innehållande PMSF på is. Sedan protein elektroforesbehandlades genom 12% SDS-polyakrylamidgeler och överfördes sedan till ett PVDF-membran (Millipore). Membranen blockerades med 5% fettfri mjölkpulver vid rumstemperatur under 1 h och inkuberades över natt med primära antikroppar. Membran inkuberades med sekundära antikroppar märkta med HRP under 1 h vid rumstemperatur efter tre 10 min tvättar i TBS-T (triethanolaminebuffered saltlösning med Tween). Slutligen var de signaler detekterades med användning av ECL-kit (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) och membranen scannades och analyserades med användning av en Bio-Rad ChemiDoc XRS + avbildningssystem med bildbehandlingsprogram (version kvantitet 1). Proteinexpressionsnormaliserades till en endogen referens (tubulin) och i förhållande till kontrollen. Spectra multi brett sortiment protein stege (Fermentas) användes som molekylär markör. Alla antikroppar som används i Western blot-analysen är listade i kompletterande fil 1: Tabell S1
Immunhistokemi och immunohistokemisk scoring
Paraffinsnitt, 4-um i tjocklek, bakades under 2 timmar vid 65 ° C och avparaffinerades.. Antigenåtervinning utfördes med användning av citrat natrium-buffert (pH 7,2) vid 95 ° C under 15 minuter och sedan Glasen kyldes vid rumstemperatur under 30 minuter. Efter att ha behandlats med 3% väteperoxid i 15 minuter för att blockera endogent peroxidas, var sektionerna behandlades med normalt getserum innestängande vätska under 30 minuter för att reducera icke-specifik bindning och sedan kanin polyklonal anti-IFIT2 (1: 500, HPA003408, Sigma-Aldrich. Shanghai, Kina) inkuberades sektionerna under 12 h vid 4 ° C. Efter återuppvärmning under 1 timme och tvättning under 5 gånger, var sektioner inkuberades med sekundär antikropp under 30 minuter vid rumstemperatur. Diaminobensidin (DAB) användes för färgreaktioner. Efterföljande immunhistokemisk färgning poängsattes såsom beskrivits tidigare [40]
. Statistisk analys
Data uttrycktes som medelvärden ± SD för tre oberoende experiment. För statistiska test, SPSS statistiskt programpaket, version17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) användes. Studentens t
-test, den envägs ANOVA och tvåvägs ANOVA-test utfördes för relativ band densitet av western blotting och MTT OD-värden. Korrelationen mellan MIR-645 och IFIT2 analyserades med Spearman rank korrelation. P-värden. ≪ 0,05 ansågs statistiskt signifikant
Resultat
uttryck av MIR-645 är upp-regleras i AGEJ kliniska prover
att bedöma betydelsen av MIR-645 i tumörbildning i AGEJ, vi först användes QRT - PCR-metoden för att mäta mIR-645 uttryck av 43 humana AGEJ kliniska vävnader, och fann att mIR-645 var betydligt uppreglerat i AGEJ kliniska vävnader jämfört med patient parade gastric hjärt icke-cancervävnader (Figur 1A). För att få ytterligare insikt i observationen som nämns ovan har vi granskat förhållandet mellan MIR-645 uttryck och patienter kliniska parametrar. Analys visade att MIR-645 uttryck var irrelevant med ålder, kön, tumördifferentiering, Lymfknuta metastaser och TNM stadium (Tabell 1: Förhållandet mellan kliniska parametrar och MIR-645 uttryck i primär gastric cardia adenocarcinom), men var i en positiv korrelation med tumörstorleken, nämligen tumörstorlek som är större än eller lika med 5 cm gruppen visade signifikant ökad miR-645 expression jämfört med tumörstorlek mindre än 5 cm gruppen (Figur 1B & Tabell 1, t
-test, * P
= 0,045). Figur 1 Uttryck av MIR-645 är upp-regleras i AGEJ kliniska prover. A. uttryck av MIR-645 i 43 humant AGEJ kliniska prover i förhållande till de angränsande parade normala humana gastriska hjärt icke-cancervävnader, mättes med kvantitativ RT-PCR (Värdena anger medelvärde ± SEM, n = 3, t
-testet, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001). B. jämförelse av relativ uttryck av MIR-645 i humant AGEJ kliniska prover av olika tumörstorlek. (Tvåsidiga t
-test, * p < 0,05).
Tabell 1 Förhållandet mellan kliniska parametrar och MIR-645 uttryck i primär gastric cardia adenocarcinom
kliniska parametrar
N (%)
släktingar uttryck (Medelvärde ± SEM)
p-värde
Ålder (år) katalog ≥ 60
15 (50) Review 2,1286 ± 0,59201
0,568 Hotel < 60
15 (50) Review 1,9571 ± 0,52402
Kön
Man
18 (60) Review 2,1111 ± 0,42783
0,462
Kvinna
12 (40) Review 2,3333 ± 0,65328
Storlek
≥5
13 (43,3) Review 2,7385 ± 100128
0,004 * Hotel < 5
17 (56,7) Review 1,8235 ± 1,52214
Histologisk differentiering
Well (W) Review 15 (50) Review 2,138 ± 0,1866
0,9427
Dåligt (P)
15 (50) Review 2,198 ± 0,1903
lymfatiska metastasering
Ja
12 (40) Review 2,4583 ± 0,77864 Hotel < 0,001 **
Ingen
18 (60) Review 1,4944 ± 1,36273
TNM stadium
fas I /II
16 (53,3) Review 2,9125 ± 1,33660 Hotel < 0,001 **
Steg III /IV
14 (46,7) Review 1,4857 ± 0,73991
(* p <
0,05; ** P <.
0,001) katalog Förbrukning av MIR-645 främjar apoptos av gastric cancerceller
För att undersöka rollen av MIR-645 i fenotypiska egenskaper AGEJ progression, använde vi två magcancer ( GC) cellinjer, SGC7901 och BGC-823 som cellmodeller. QRT-PCR-resultat visade att MIR-645 uttryck var betydligt uppreglerad jämfört med immortaliserad GC cellinje, GES-1 (Ytterligare fil 2: Figur S1, P Hotel < 0,001).
SGC7901 och BGC-823 cellerna transfekterades med mogna mIR-645 härmar, inhibitor, mock-transfekterade eller mIR-NC. Såsom visas i fig 2A och D, kvantitativa RT-PCR-resultaten visar att uttryck av MIR-645 härmar eller hämmare signifikant uppreglera eller nedreglera uttrycksnivån för MIR-645, respektive, i SGC7901 och BGC-823-celler från första till femte dagen efter transfektion (Figur 2A, P
< 0,001; figur 2D, P
< 0,001) jämfört med NC och mock-kontroller. Figur 2 Utarmning av MIR-645 främjar apoptos av magcancer (GC) celler. A & D. Nivån på MIR-645 mättes genom kvantitativ PCR vid angiven tid (One-way ANOVA analys värdena anger medelvärdet ± SD, figur 2A, F = 426,588, P < 0,001; figur 2D, F = 685,026, P < 0,001). B & E. GC-celler transfekterade med MIR-645 härmar och inhibitor utsattes för MTT-analysen dagligen under 6 dagar (Tvåvägs ANOVA analys, figur 2B, F = 52.602, p < 0,001; figur 2E, F = 42,847, p < 0,001). C & F. GC celler celler transfekterade med MIR-645 härmar och inhibitor samlades för FACS-analys efter 72 h (Värdena anger medelvärde ± SD, n = 3, One-way ANOVA analys, figur 2C-a, F = 121,600, p < 0,001; figur 2C-B, F = 250,400, p < 0,001; figur Fa, F = 194,815, p < 0,001; figur 2F-b, F = 412,741, p < 0,001) Review SGC7901 och BGC-. 823-celler transfekterade med mIR-645-hämmare och härmar visade signifikant lägre och högre nivåer av cellproliferation, respektive, jämförelse med NC eller mock-grupper i närvaro av ADR (0,2 | ig /ml) såsom bestämts genom MTT-analys (figur 2B, P Hotel < 0,001; figur 2E, P Hotel < 0,001) katalog Anniex Vapoptosis analys uppvisade signifikant ökad och minskad apoptos andelen miR-645 utarmning och ektopiskt uttryck grupper jämfört med NC grupper i serumfritt. tillstånd eller i närvaro av läkemedel mot cancer, adriamycin (ADR) (Figur 2C ab, P Hotel < 0,001; figur 2 F ab, P Hotel < IFIT2 0,001) Review. Är ett mål för MIR-645
Tidigare uppgifter tyder på att MIR-645 kan vara en onkogen av avancerad serös äggstockscancer. Således har vi sökt vidare till de potentiella målen för MIR-645 genom algoritmen Target Scan Human. Bland dem, IFIT2, en tumörsuppressor, befanns ha förmodade miR-645 bindningsställen inom dess 3'UTR (figur 3A). Sedan vi utförde luciferas reporteranalys med användning SGC7901 och BGC-823 celler för att kontrollera huruvida IFIT2 var ett direkt mål för MIR-645. Vildtyp och mutant IFIT2-3'UTR innehållande den förmodade bindningsstället hos MIR-645 klonades in i psiCHECK-2 vektorn nedströms från luciferasgenen (Ytterligare fil 3: Figur S2). Införande av MIR-645 minskade lucirferase aktivitet från IFIT2 3'UTR reportervektor signifikant (Figur 3B, P Hotel < 0,001; figur 3C, P Hotel < 0,001), men påverkade inte lucirferase aktivitet från mutanten IFIT2 3'UTR reportervektor, stödja direkt interaktion av mIR-645 med IFIT2. Dessa resultat tyder vidare att MIR-645 kan undertrycka IFIT2 uttryck genom att rikta 3'-UTR av IFIT2 mRNA. Figur 3 Validera de förutsagda bindningsställen mellan MIR-645 och IFIT2. A. Schemat visar konstruktionen av Luc-IFIT2 3'UTR och Luc-IFIT2 3'Mut UTR. Både Luc-IFIT2 3'UTR och Luc-IFIT2 3'Mut UTR klonades in i en pmirGLO plasmid nedströms eldflugeluciferas kodande regionen mellan Pmel och Xbal-ställena. B & C. SGC7901 celler (B) eller BGC-823 celler (C) samtransfekterades med psiCHECK-2 konstruktioner som innehåller antingen IFIT2 3'UTR eller IFIT2 3'Mut UTR och antingen Mir-645-hämmare eller MIR-645 härmar för 48 h. Värden anger den relativa luciferasaktiviteten efter normalisering till Renilla luciferasaktivitet (Värdena anger medelvärde ± SD, n = 3, One-way ANOVA analys, figur 3B, F = 283,244, figur 3C, F = 143,313. *** P <,. 0,001) Review expression av mIR-645 och IFIT2 negativt relaterade i AGEJ kliniska prover
för att ytterligare utvärdera sambandet mellan mIR-645 och IFIT2, undersökte vi IFIT2 uttryck i 43 AGEJ kliniska prover med hjälp av QRT-PCR . Det konstaterades AGEJ vävnader hade en anmärkningsvärd lägre expressionsnivå av IFIT2 än de parvisa icke-cancervävnader (Figur 4A), och IFIT2 expression var omvänt korrelerad med tumörstorlek (Figur 4B, P =
0,0304). Nämligen, tumörstorlek som är större än eller lika med 5 cm gruppen visade signifikant nedreglerade IFIT2 expression jämfört med tumörstorlek mindre än 5 cm-grupp. För att validera data, vi värderas därefter proteinuttryck av IFIT2 använder Western blotting (figur 4C a-b), och resultaten visade ett liknande mönster som de yttranden som har hittats av QRT-PCR. Immunohistokemi analys uppvisade en signifikant minskad uttryck av IFIT2 i AGEJ vävnader parade icke-cancervävnader (Figur 4D a-b, P <
0,001). Sedan vi analyserat sambandet mellan MIR-645 och IFIT2 uttryck och fann att IFIT2 uttrycksnivån negativt korrelerad med den för MIR-645 (Figur 4E, P <
0,01). Dessutom SGC7901 (Figur 4F a) och BGC-823 (Figur 4F b) celler transfekterade med MIR-645-hämmare har ökat betydligt IFIT2 uttryck vid proteinet och mRNA-nivåer jämfört med mock och NC-grupper (Figur 4F ab, P <
0,01). Våra resultat tyder på att MIR-645 direkt kan reglera uttrycket av IFIT2. Figur 4 Expression av MIR-645 och IFIT2 korrelerar negativt AGEJ kliniska prover och IFIT2 var nedregleras i AGEJ vävnader jämfört med parade icke-cancervävnader. A. Expression av IFIT2 Mössor och MIR-645 i AGEJ kliniska prover analyserades genom kvantitativ PCR. B. jämförelse av relativ uttryck av IFIT2
i humana AGEJ kliniska prover av olika tumörstorlek. (T
-test, * p < 0,05). C. Expression av IFIT2 undersöktes genom western blotting (a, b: de värden anger medelvärdet ± SD, normaliserad till tubulin, n = 3, t
-test, *** p
< 0,001) D. en. Bilderna som visas är positiv immunhistokemisk färgning av IFIT2 i humana AGEJ prover och matchade angränsande normala vävnader (förstoring 200 x). b. Färgning mängder av IFIT2 (t
-test, *** p Hotel < 0,001). E. Spridningsdiagram som visar negativa linjär korrelation mellan mRNA uttryck för IFIT2
och Mir-645 43 AGEJ kliniska prover. F. IFIT2 och IFIT2
expression mättes med western blotting i SGC7901 (a) och BGC-823-celler (b). (Värdena anger medelvärde ± SD, n = 3, One-way ANOVA analys, *** p Hotel < 0,001) IFIT2
förmedlar funktion av MIR-645 genom att främja SGC7901 och BGC-823 celler. apoptos
att bekräfta att induktion av cell apoptos i SGC7901 och BGC-823-celler med mIR-645 förmedlades genom att rikta IFIT2
utförde vi IFIT2
plasmid transfektion i SGC7901 (figur 5A) och BGC-823 (figur 5B) celler till uppreglera uttrycket av IFIT2. Western blotting och kvantitativ PCR visade att uppreglering av IFIT2 av IFIT2
plasmid transfektion skulle kunna minskas avsevärt genom MIR-645 härmar. MTT-analysen visade att celler transfekterade med plasmid-IFIT2 proliferation undertrycktes emellertid celler transfekterade med MIR-645 härmar spridning ökade markant jämfört med plasmid-kontroll och plasmid-IFIT2 + miR-645 grupper (Figur 5C ab, P <
0,001). Vidare införs IFIT2 främjade apoptos hos SGC7901 och BGC-823-celler och MIR-645 härmar reducerad apoptos av celler inducerade av IFIT2 uppreglering jämfört med NC-grupp i närvaro av ADR (Figur 5E-F, P <
0,001). Våra resultat tyder på att IFIT2 medierad funktion miR-645 i hämma SGC7901 och BGC-823 celler proliferation och inducerar cell apoptos. Figur 5 IFIT2 förmedlar funktionen Mir-645 genom att främja GC cell apoptos. A & B. Uttryck av IFIT2 undersöktes med Western blotting (A:. SGC7901; B, BGC-823 a, normaliserad till tubulin, värdena anger medelvärdet ± SD, One-Way ANOVA analys för SGC7901, F = 189,307, för BGC-823, F = 85,374, b, värdena anger medelvärde ± SD, One-Way ANOVA analys för SGC7901, F = 85,374, för BGC-823, F = 219,921; *** p Hotel < 0,001). C. SGC7901 (a) och BGC-823 (b) celler som utsatts för MTT-analys dagligen under 6 dagar (värdena anger medelvärdet ± SD, Tvåvägs ANOVA-analys, för SGC7901, F = 13,768, för BGC-823, F = 16,409, *** p Hotel < 0,001). D & E. SGC7901 (D) och BGC-823 (E) celler samlades för FACS-analys efter 72 timmar i närvaro av ADR (0,05 mikrogram /ml) (värdena anger medelvärdet ± SD, n = 3, One-Way ANOVA analys; för SGC7901, F = 361,749, för BGC-823, F = 229,952; *** p Hotel <. 0,001) Review Depletion och uppreglering av mIR-645 förändrat kaspas-3/7-aktivitet
IFIT2 har rapporterats vara en tumörsuppressor via mediera cellapoptos genom aktivering av caspas-3/7-aktivitet. Kaspas-Glo 3/7-test visade att miR-645 utarmning avsevärt uppreglerat, medan miR-645 överuttryck ned- regleras den caspas-3/7-aktivitet jämfört med mock och NC-grupper i närvaro av ADR (0,2 | j, g /ml) (figur 6A och B, P <
0,001) eller serumsvält tillstånd (Figur 6C och D, P <
0,001). Dessa resultat i kombination med observationer som anges ovan föreslås att MIR-645, uppreglerat i humana AGEJ vävnader, hämmade cell apoptos och främjar tumörbildning genom att undertrycka kaspas-3/7-aktivitet genom att rikta IFIT2. Figur 6 Caspase-3/7-aktivitet. Antiapoptotiska förmågan hos SGC7901 celler och BGC-823-celler efter exponering för ADR (0,2 | j, g /ml) eller serumsvält utvärderades genom caspaser-3/7-aktivitet. A & C, SGC7901 celler; B & D, BGC-823 celler. (Värdena anger medelvärdet ± SD, n = 3, One-Way ANOVA analys, för A, F = 183,930, för B, F = 1093,797, för C, F = 1861,50, för D, F = 1483,604, *** p Hotel <. 0,001) Review Diskussion och slutsatser
Trots att ackumulera bevis har visat att miRNAs avreglering är involverad i tumör cancer, progression, migration och invasion [41], metastaser [42, 43] och multiresistens [44-46]. Lite är känt om roller miRNA i utvecklingen av adencarcinoma av mag esofagus korsning (AGEJ). Här visade vi att det miR-645 uttryck ökade signifikant i AGEJ kliniska prover jämfört med parade icke-cancervävnader och var signifikant upp-regleras i två ventrikelcancer (GC) cellinjer, SGC7901 och BGC-823, som användes alternativ cellmodeller eftersom inga tillgängliga AGEJ cellinjer etablerades hittills. Hämning av MIR-645 i SGC7901 och BGC-823 celler signifikant apoptos av SGC7901 och BGC-823 celler i skick serumsvält eller kemoterapeutiska läkemedel genom uppreglering IFIT2,
en förmedlare av apoptos, med en potentiell bindningsställe för mIR-645 i dess mRNA 3'UTR. Uttrycksmönstret för MIR-645 och IFIT2 i SGC7901 och BGC-823-celler och kliniska prover negativt korrelerade, vilket ytterligare tyder på att IFIT2
är en målgen av MIR-645. Dessutom hämning av MIR-645 resulterar i ökad kaspas-3/7-aktivitet, som aktiveras av IFIT2. Alla dessa fynd tyder på en grundläggande roll miR-645 i cancer, speciellt i utvecklingen av AGEJ.
För lite apoptos är en avgörande orsak till cancer eftersom maligna celler död reduceras anmärkningsvärt [47, 48], vilket resulterar i malign transformation av de angripna cellerna, tumörmetastas och multiläkemedelsresistens i cancerceller. Följaktligen är apoptos av stor betydelse vid behandling av cancer och är ett populärt mål för många behandlingsstrategier. I denna studie visade vi att MIR-645 osäkra cancerceller att serumbrist-inducerad apoptos, medan utarmning av MIR-645 motverkas denna effekt av MIR-645, vilket tyder på att MIR-645 kan spela en avgörande roll i anpassningen av cancer celler till låg nutrition. Allt fler miRNAs har varit inblandade i cancercellen apoptos. Å ena sidan kan mikroRNA fungera som tumörsuppressor via induktion av apoptos, dvs miR-421, som inducerar cellproliferation och apoptos resistens inom human nasofaryngeal karcinom via nedreglering av FOXO4 [49]; MIR-149, som framkallar apoptos genom att hämma Akt1 och E2F1 i humana cancerceller [50] och miRNA-31, som inducerar apoptos i humana neuroblastomceller [51]. Å andra sidan kan mikroRNA fungera såsom onkogener genom att undertrycka apoptos, dvs miR-24, som hämmar apoptos och förtränger Bim i mus cardiomyocytes [52]; MIR-886-5p, som hämmar apoptos genom nedreglering Bax expression i humana cervikalkarcinomceller [53], och MIR-183, som inhiberar TGF-β1-inducerad apoptos genom nedreglering av PDCD4 uttryck i humana hepatocellulära karcinomceller [54] .
ISG, IFN stimulerade gener finns gener som tanscribed av IFN induktion. Bland dem, 4 kan spela viktiga roller som påverkar både inhiberingen av viral replikation och hämningen av cellproliferation [55, 56]. Dessa gener kan hämma virusreplikation genom att offra cellen genom att främja apoptos och undertrycka cancer progression via hämma malignt transformerade cellöverlevnad till fördel för värd [57]. Alla författare läst och godkänt den slutliga manuskriptet.

• Proteomanalys av mänsklig gastric cardia adenocarcinom med laser capture microdissection
• Terapeutiska potentialen hos PRL-3 inriktning och kliniska betydelsen av PRL-3 genomisk amplifiering i magcancer