МикроРНК-645, повышающей регуляции в человеческом adencarcinoma желудочного пищеводного перехода, ингибирует апоптоз путем пристреливать супрессоров опухолей IFIT2

микроРНК-645, повышающей регуляции в человеческом adencarcinoma желудочного пищеводного перехода, ингибирует апоптоз путем пристреливать подавителя опухоли IFIT2
Аннотация <бр> Фон
увеличивается объем фактических данных указывает на то, что микроРНК играют важную роль в канцерогенезе и прогрессии рака; Тем не менее, роль микроРНК в онкогенеза из adencarcinoma желудочного пищеводного перехода (AGEJ) остается в значительной степени неясным.
методы
The SGC7901 и использовались BGC-823 линии рака желудка клеток. Выражения микроРНК-645 и IFIT2 (интерферон-индуцированный белок с tetratricopeptide повторяет 2) были рассмотрены QRT-PCR, Выражения IFIT2 исследовали с помощью Вестерн-блоттинга и иммуногистохимии анализа. Апоптоз клеток определяли с помощью FACS. MIR-645 ингибитора, подражает и плазмиды IFIT2 трансфекцию проводили для изучения убыт- и усиления функции. Каспазы-3/7 активность была рассмотрена каспазы-3/7 анализа.
Результаты
В настоящем исследовании мы сообщали об увеличении экспрессии микроРНК-645 в AGEJ клинических образцах по сравнению с парными нераковых тканей. Мы также наблюдали значительное MIR-645 повышающей регуляции в двух клеточных линий рака желудка (GC), SGC7901 и BGC-823, которые использовались в качестве клеточных моделей, поскольку не было никаких доступных линий AGEJ клеток, установленные на сегодняшний день. Мы обнаружили, что ингибирование микроРНК-645 может повышать чувствительность и драматически SGC7901 BGC-823 клеток в сыворотке starvation- и химиотерапевтическое лекарственное средство-индуцированного апоптоза путем повышающей регуляции IFIT2, медиатором апоптоза через митохондриальный путь, с потенциальным сайтом связывания для Mir -645 в 3'UTR его мРНК в. Дальнейшие исследования выставлялись, что экспрессия IFIT2 уменьшается в SGC7901 и клетках BGC-823 и тканей AGEJ. IFIT2
эктопической экспрессии приводит к продвижению апоптоза клеток, что свидетельствует о том, что IFIT2 может функционировать в качестве супрессора в развитии AGEJ. Кроме того, ингибирование микроРНК-645 индуцирует повышающую регуляцию IFIT2 и увеличение каспазы-3/7 активностью по сравнению с контрольными группами.
Выводы
Наши данные позволяют предположить, что функции микроРНК-645 как онкоген в человеческом AGEJ путем, в крайней мере, частично через, ориентации IFIT2
.
Ключевые слова
Adencarcinoma желудочного пищеводного перехода микроРНК-645 IFIT2 Апоптоз Справочная информация
Недавние исследования показали, что adencarcinoma желудочного пищеводного перехода (AGEJ) отличается от дистального желудка, с различными факторами риска, характеристик опухоли и биологического поведения [1-4]. Кроме того, заболеваемость AGEJ растет в течение последних 30 лет, особенно в Соединенных Штатах и ​​на севере Китая [5-9].
МикроРНК (миРНК) представляют собой группу эндогенной экспрессии некодирующих малых РНК, 20- 25 нуклеотидов в длину, которые, как известно, негативно регулирует экспрессию гена через подавляя перевод или уменьшая стабильность мРНК за счет непосредственного связывания с 3'-нетранслируемую область (3'-UTR) целевых мРНК [10, 11]. Накопленные данные показывают, что микроРНК играют важную роль в регуляции физиологических и патологических процессах, включая развитие [12], метаболизм [13], пролиферации клеток [14], дифференциация [15] и апоптоза [16]. Кроме того, аберрантное пост-транскрипционной регуляции мРНК с помощью микроРНК связан с онкогенеза [17, 18]. Аномальные профили экспрессии микроРНК, как сообщается, будут обнаружены в различных типах опухолей человека в том числе легких [19], молочной железы [20], простаты [21], печени [18], толстой кишки [22] и рака желудка [23]. Кроме того, некоторые микроРНК могут выступать в качестве онкогенов [24-26] или опухолевых супрессоров [27, 28], регулируя экспрессию их генов-мишеней, которые играют важную роль в некоторых ключевых путей, участвующих в клеточном цикле прогрессии, апоптоза или пролиферации. микроРНК вниз регулируется в опухолевых образцах, таких как микроРНК-22 [29, 30], микроРНК-101 [31, 32], и микроРНК-7 [33, 34], как правило, функционируют как подавляющих микроРНК, в то время как микроРНК повышающей регуляции в опухолевых образцах, таких как микроРНК-17 [35, 36], и микроРНК-21 [37, 38], как правило, оказывают онкогенные роли. Эти исследования показывают, что дерегуляция микроРНК часто участвует в канцерогенезе и прогрессии рака.
Недавнее исследование показало, что микроРНК-645 может оказывать роль подавителя опухоли в области передовых серозного рака яичников для MIR-645 отрицательно связана с общей выживаемости он [39]. В настоящем исследовании мы обнаружили, что экспрессия микроРНК-645 была значительно увеличена у AGEJ клинических образцов по сравнению с парными нераковых тканей с использованием микроРНК чипов. Тем не менее, роль микроРНК-645 в онкогенеза из AGEJ еще не изучены. Дальнейшее исследование показало, что микроРНК-645 был также значительно повышающей регуляции в двух клеточных линий рака желудка (GC), SGC7901 и BGC-823, которые были использованы в качестве альтернативных моделей клеток в настоящем исследовании. Ингибирование микроРНК-645 в SGC7901 и клетках BGC-823 значительно подавляли апоптоз SGC7901 и клеток BGC-823 в условиях сывороточного голодания или химиотерапевтического препарата путем повышающей регуляции IFIT2, медиатор апоптоза, с потенциальным сайтом связывания для Mir -645 в 3'UTR его мРНК в. Паттерн экспрессии микроРНК-645 и IFIT2 в AGEJ клинических образцах отрицательно коррелировали, далее предполагая, что IFIT2
является целевой ген микроРНК-645. Кроме того, ингибирование микроРНК-645 приводит к увеличению каспазы-3/7 активности, который активируется IFIT2. В данном исследовании мы исследовали, является ли микроРНК-645 повышающей регуляции в человеческом adencarcinoma желудочного перехода пищевода и ингибирует апоптоз путем пристреливать супрессор опухолей IFIT2.
Методы
этике Заявление
Для образцов тканей, письменное информированное согласие было полученные от пациентов. Процедуры, используемые в данном исследовании, были одобрены Советом по институциональному обзору Хэнань университета науки и техники и соответствовали Хельсинской декларации, а также местному законодательству.
Клеточные линии и условия культивирования
желудочной линий раковых клеток SGC -7901, КУП-823 и увековечил нормальную эпители желудка клеточную линию, GES-1 были любезно пожаловал профессор Daiming Вентилятор. Все клеточные линии поддерживали в нашем институте в соответствии с рекомендованными протоколами. Клетки культивировали в среде RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, США) при 37 ° С в инкубаторе с 5% СО2.
Человеческие особи
Все экспериментальные процедуры были одобрены Советом по институциональному обзору Хэнань университета науки и техники. Письменное информированное согласие было получено для всех образцов. Образцы человека AGEJ (п = 43) и пациент в паре незлокачественные образцы были получены от пациентов в первой филиал больницы, Хэнань университета науки и техники, с информированного согласия от каждого пациента. очистки
РНК, синтез кДНК, и количественный ПЦР в реальном времени (QRT-ПЦР)
Суммарную РНК из культивируемых клеток экстрагировали реагентом TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с протоколом и РНК изготовителя хранили при -80 ° с перед анализом QRT-PCR , Выражение Зрелые микроРНК-645 был обнаружен с помощью Mirvana TM QRT-PCR микроРНК Detection Kit (Амбион Inc. Остин, штат Техас), с U6 в качестве внутреннего контроля. экспрессия IFIT2 была обнаружена с помощью праймеров F: 5'AGCGAAGGTGTGCTTTGAGA 3 ', R: 5'GAGGGTCAATGGCGTTCTGA3' (длина продукта: 125 пар оснований; Tm: 60 ° C; GC%: F-50%, R-55%, время начала и окончания: 643-748 пар оснований) и GAPDH был использован в качестве внутреннего контроля. Продукты ПЦР разделяли на бромидом окрашивали 1,5% -ном агарозном геле этидия и визуализировали с помощью УФ-излучения.
трансфекции клеток
Человеческий микроРНК-645 дуплексного agomir (400 нМ), antagomir (400 нм) и отрицательный контроль, были разработаны и обеспечивается Ribobio (Гуанчжоу, провинция Гуандун, Китай). Плазмидную-IFIT2 и отрицательные plamid управления были приобретены у Ribobio Inc (Гуанчжоу, провинция Гуандун, Китай)
микроРНК цель прогнозирования
Чтобы найти потенциальных целевых микроРНК генов, сайт TargetScanHuman (HTTP:.. //WWW TargetScan. орг /) был использован, рассчитывали связывание свободной энергии и выжидать сайты были проанализированы с использованием HTTP:.... //bibiserv techfak Uni-Билефельд де /rnahybrid сайт
векторные конструкции и люциферазы репортер анализ
Для построения IFIT2-3'UTR плазмиды, дикого типа, 3'-UTR фрагмент мРНК человеческого IFIT2 (1226-1233 нуклеотида, GenBank, нет. NM_001547.4) содержащие мнимые микроРНК-645 связывающую последовательность амплифицировали с помощью оТ-ПЦР и клонировали в сайт между Xho I и Not I ниже по потоку от гена-репортера люциферазы вектора psiCHECK ™ (Promega, США). Мутант из одного сайта микроРНК-645 связывания (5'- AGCCTAG -3 'до 5'- TCGGATC -3') в 3'-UTR из IFIT2 включен сайт-направленного мутагенеза Kit (SBS Genetech, Пекин, Китай ). Дикие и мутантные типы векторов pmirGLO-IFIT2-UTR были подтверждены секвенирования ДНК
нуклеотидные последовательности праймеров для IFIT2-3'UTR (WT) клона:.
IFIT2XhoIF2:. 5'CCGCTCGAG AGAATAGAGATGTGGTGCCCACTAGGCTACTGCTG 3 '<бр> IFIT2NotIR2: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TTAAAATGGAATCAGTGACTTTTATTTCTCATAACAGAG 3 '
нуклеотидные последовательности праймеров для IFIT2-3'UTR (MT) клона:.
mutIFIT2F2: 5'TTCTAGGTAGATGCTGAATTCGGATCACATCAAAGTTGGTGTGAAC 3'.
mutIFIT2R2: 5'GTTCACACCAACTTTGATGTGATCCGAATTCAAGEJTCTACCTAGAA 3 ' .
Клетки трансфицировали с микроРНК-645 мимика, NC и pmirGLO плазмиды в 24-луночные планшеты с использованием липофектамина ™ 2000 (Invitrogen) в соответствии с инструкциями. 48 ч спустя клетки собирали и анализировали на активность люциферазы с использованием двойного люциферазы репортерной системы анализа (Promega, США) и определяется системой обнаружения GloMaxTM 20/20 (E5331, Promega).
Каспазы-3/7 Анализ
активность каспазы-3 и каспазы-7 был обнаружен в формате 96-луночного (2 × 10 3 клеток /лунку) с использованием каспазы-Glo 3/7 анализа (Promega) в соответствии с инструкциями. 100 мкл каспазы-Glo 3/7 реагента были дополнены в каждую лунку и затем инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч follwong люминесценция была обнаружена с помощью М200 микропланшет Флюориметры (Tecan). Фоне люминесценции, связанная с культурой клеток и анализа реагента (пустой реакции) вычитали из экспериментального значения.
МТТ
Клетки трансфицировали 100 нМ ингибитора микроРНК-645 (Genepharma, Шанхай, Китай), мимике (Ribobio Inc ., Гуанчжоу, провинция Гуандун, Китай) или 100 нМ plamid-IFIT2 (Ribobio Inc., Китай). Двадцать четыре спустя, клетки высевали в 96-луночные планшеты (2 × 10 3 /лунку). Жизнеспособность клеток исследовали с помощью МТТ (3-2, 5-дифенил тетразолия бромид) для анализа (Sigma, США) в соответствии с инструкциями в назначенное время.
Вестерн-блоттинга
Общее содержание белка из культивируемых клеток лизируют лизирующего буфера содержащий PMSF на льду. Затем белок подвергали электрофорезу через 12% полиакриламидном геле, а затем переносили на PVDF мембрану (Millipore). Мембраны блокировали 5% обезжиренным сухим молоком при комнатной температуре в течение 1 ч и инкубировали в течение ночи с первичными антителами. Мембраны инкубировали с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена в течение 1 ч при комнатной температуре, после того, как три 10-минутных промывок в TBS-T (triethanolaminebuffered солевой раствор с Tween). И, наконец, сигналы были обнаружены с использованием ECL набора (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) и мембраны были просмотрены и проанализированы с использованием системы визуализации + Bio-Rad ChemiDoc XRS с программным обеспечением обработки изображений (версия 1) количество. Экспрессии белка нормализовалось к эндогенному ссылки (тубулине) и по сравнению с контролем. Spectra многоцветной широкого диапазона белка лестницы (Ферментас) был использован в качестве молекулярного маркера. Все антитела, используемые в западном блот перечислены в дополнительный файл 1: Таблица S1
иммуногистохимии и иммуногистохимическое скоринг
парафиновых срезах, 4-мкм в толщину, обжигали в течение 2 ч при 65 ° С и депарафинировали.. Антиген поиска проводили с использованием цитратного буфера натрия (рН 7,2) при 95 ° С в течение 15 минут, а затем Срезы охлаждают при комнатной температуре в течение 30 минут. После обработки 3% раствором перекиси водорода в течение 15 минут, чтобы блокировать эндогенной пероксидазы срезы обрабатывали нормальной козьей сыворотки удерживающего жидкость в течение 30 минут, чтобы уменьшить неспецифическое связывание и затем кроличьи поликлональные анти-IFIT2 (1: 500, HPA003408, Sigma-Aldrich. Шанхай, Китай) инкубировали секции в течение 12 ч при температуре 4 ° с. После согревания в течение 1 ч и промывки в течение 5 раз, срезы инкубировали с вторичными антителами в течение 30 минут при комнатной температуре. Диаминобензидин (ДАБ) использовали для цветных реакций. Последующее иммуногистохимическое окрашивание оценивали, как описано ранее [40].
Статистический анализ
Данные были выражены как среднее ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. Для статистических тестов, SPSS статистического программного обеспечения пакета, version17.0 (SPSS, Чикаго, Иллинойс, США) был использован. Студенческий т
-test, односторонний ANOVA и двухсторонняя тест ANOVA были выполнены для относительной плотности зонной вестерн-блоттинга и значений МТТ ОП. Корреляция между микроРНК-645 и IFIT2 анализировали с Спирмена ранговой корреляции. Значения Р &ЛТ; 0,05. Считались статистически значимыми
Результаты
Выражения MIR-645 являются повышающей регуляции в AGEJ клинических образцах
Для оценки роли микроРНК-645 в онкогенеза из AGEJ, мы впервые использовали QRT - метод ПЦР для измерения микроРНК-645 экспрессию 43 AGEJ клинических тканей человека, и обнаружили, что микроРНК-645 был значительно повышающей регуляции в AGEJ клинических тканей по сравнению с пациентами в паре желудочного сердца нераковых тканей (Рис. 1А) Чтобы получить более полное представление о наблюдении, упомянутой выше, мы исследовали связь между экспрессией микроРНК-645 и пациентов клиническими параметрами. Анализ показал, что экспрессия микроРНК-645 не имеет никакого отношения с возрастом, полом, дифференцировки опухоли, лимфатический узел метастазов и стадии TNM (Таблица 1: Взаимосвязь между клиническими параметрами и микроРНК-645 экспрессии в первичной кардии аденокарциномы), но был в положительной корреляции с размер опухоли, а именно, размер опухоли больше или равна 5 см группе показал значительное повышение экспрессии микроРНК-645 по сравнению с размером опухоли менее 5 см группа (рисунок 1В &Amp; Таблица 1, т
-test, * Р
= 0,045). Рисунок 1 Выражения MIR-645 являются повышающей регуляции в AGEJ клинических образцах. А. экспрессия микроРНК-645 в 43 человек AGEJ клинических образцов по отношению к соседним спаренных нормальных желудочных сердца нераковых тканей человека, измеряли с помощью количественного RT-PCR (значения указывают на среднее значение ± SEM, п = 3, т <бр> -test, * р &л; 0,05, ** р &л; 0,01, *** р &л; 0,001). B. Сравнение относительной экспрессии микроРНК-645 в человеческих AGEJ клинических образцов различного размера опухоли. (Стьюдента
-test, * р &л; 0,05).
Таблица 1 Взаимосвязь между клиническими параметрами и экспрессии микроРНК-645 в первичном кардии аденокарциномы
клинических параметров

N (%) завод
Родственникам выражение (среднее значение ± SEM) завод
р-значение

Возраст (лет)
≥ 60
15 (50)
2,1286 ± 0,59201
0,568
&л; 60
15 (50)
1,9571 ± 0,52402

ГЕНДЕРНЫЙ Муж
18 (60)
2,1111 ± 0.42783
0,462
Female
12 (40)
2,3333 ± 0,65328
Размер
≥5
13 (43,3)
2,7385 ± 100128
0,004 *
&л; 5
17 (56,7)
1,8235 ± 1,52214
Гистологическое дифференцировка
Ну (W)
15 (50)
2,138 ± 0,1866 0,9427

Плохо (P)
15 (50)
2,198 ± 0,1903
лимфатической метастаз
Да
12 (40)
2.4583 ± 0.77864
&лт; 0,001 **
Нет
18 (60)
1,4944 ± 1,36273
TNM стадия
этап I /II
16 (53,3)
2.9125 ± 1.33660
&лт; 0,001 **
стадия III /IV
14 (46,7)
1.4857 ± 0,73991
(* р &лт;
0,05; ** Р &Лт;
. 0.001)
Истощение микроРНК-645 способствует апоптоз клеток рака желудка
Чтобы исследовать роль микроРНК-645 в фенотипическими характеристиками AGEJ прогрессии, мы использовали два рака желудка ( GC) клеточные линии, SGC7901 и КУП-823 в качестве клеточных моделей. Результаты QRT-PCR показали, что микроРНК-645 экспрессия была значительно повышающей регуляции по сравнению с иммортализованных клеточной линии GC, GES-1 (Дополнительный файл 2: Рисунок S1, P
&л; 0,001).
SGC7901 и КУП-823 клетки трансфицированы с зрелой микроРНК-645 мимика, ингибитор, насмехайся трансфицируют или MIR-NC. Как показано на фигуре 2А и D, количественные результаты ОТ-ПЦР показывают, что экспрессия зер- 645 мимике или ингибиторов значительно повышающего регулировать или понижающей регуляции уровня экспрессии микроРНК-645, соответственно, в SGC7901 и BGC-823 клеток из с первого по пятый день после трансфекции (рис 2A, P
&л; 0,001; рис 2D, P
&л; 0,001) по сравнению с NC и напускной управления. Рисунок 2 Истощение микроРНК-645 способствует апоптозу рака желудка (GC) клеток. &Amp; D. Уровень MIR-645 измеряли с помощью количественной ПЦР в назначенное время (односторонний анализ ANOVA, значения указывают на среднее ± стандартное отклонение, рис 2А, F = 426,588, P &л; 0,001; рис 2D, F = 685,026, P &л; 0,001). B &Amp; E. GC клетки трансфицировали микроРНК-645 мимике и ингибитор подвергают МТТ ежедневно в течение 6 дней (Двусторонний ANOVA анализа, рис 2B, F = 52.602, р &ЛТ; 0,001; фигура 2E, F = 42.847, р &л; 0,001). C &Amp; F. GC клетки клетки трансфицировали микроРНК-645 мимике и ингибитора были собраны для анализа FACS после 72 ч (значения указывают на среднее ± стандартное отклонение, n = 3, Односторонний ANOVA анализ, рис 2С-а, F = 121,600, р &л; 0,001; рис 2C-B, F = 250,400, р &л; 0,001; рис Fa, F = 194,815, р &л; 0,001; рис 2F-B, F = 412,741, р &л; 0,001)
SGC7901 и BGC-. 823 клетки, трансфицированные с ингибиторами микроРНК-645 и мимике показали значительно более низкие и более высокие уровни пролиферации клеток, соответственно, Comparision с ЧПУ или имитационной группами в присутствии АДР (0,2 мкг /мл), как это определено с помощью МТТ-анализа (рис 2B, P
&л; 0,001; рис 2E, P &
л; 0,001)
Anniex Vapoptosis анализ выставлялись значимо возрастал и снижение цены апоптоз микроРНК-645 истощению и эктопической экспрессии групп по сравнению с NC группами в свободной от сыворотки. состояние или в присутствии противоопухолевого препарата, адриамицин (ADR) (рис 2С AB, P
&ЛТ; 0,001; рис 2 F AB, P
≪ 0,001).
IFIT2 является объектом MIR-645
Предыдущие данные свидетельствуют о том, что микроРНК-645 может быть онкоген передовых серозного рака яичников. Таким образом, мы также искали потенциальных мишеней микроРНК-645 с помощью алгоритма Target сканирования человека. Среди них, IFIT2, супрессор опухоли, было установлено, что мнимый микроРНК-645 сайтов связывания в пределах его 3'-UTR (фиг.3А). Затем мы провели люциферазы репортера с использованием SGC7901 и КУП-823 клетки, чтобы проверить, был ли IFIT2 непосредственной мишенью микроРНК-645. Дикого типа и мутанта IFIT2-3'UTR содержащие мнимые сайт связывания микроРНК-645, были клонированы в psiCHECK-2 вектора вниз по течению от гена люциферазы (дополнительный файл 3: Рисунок S2). Введение MIR-645 уменьшил lucirferase активность репортера вектора IFIT2 3'UTR значительно (рис 3B, P
&л; 0,001; фиг.3С, P &
ЛТ; 0,001), но не влияет на активность lucirferase от мутант репортер вектор IFIT2 3'UTR, поддерживая непосредственное взаимодействие MIR-645 с IFIT2. Эти результаты позволяют предположить, что микроРНК-645 может подавлять экспрессию IFIT2 путем ориентации 3'-UTR мРНК IFIT2. Рисунок 3 Проверка предсказанных сайтов связывания между микроРНК-645 и IFIT2. А. Принципиальная схема показывает конструкцию Luc-IFIT2 3'UTR и Люк-IFIT2 3'Mut УТР. И Люк-IFIT2 3'UTR и Люк-IFIT2 3'Mut UTR клонировали в плазмиду pmirGLO ниже по потоку от люциферазы светлячка кодирующей области между сайтами PmeI и XbaI. B &Amp; C. SGC7901 клетки (B) или BGC-823 клеток (C) были котрансфицируют в psiCHECK-2 конструкции, содержащие либо IFIT2 3'UTR или IFIT2 3'Mut UTR и либо ингибитор микроРНК-645 или MIR-645 имитаторов 48 час Значения указывают на относительную активность люциферазы после нормализации к активности люциферазы Renilla (Значения показывают среднее ± стандартное отклонение, n = 3, Односторонний ANOVA анализ, Рисунок 3B, F = 283,244, 3С, F = 143,313. *** Р &л;. 0.001)
выражение микроРНК-645 и IFIT2 отрицательно связаны в клинических образцах AGEJ
Для дальнейшей оценки соотношения между микроРНК-645 и IFIT2, мы исследовали экспрессию IFIT2 в 43 AGEJ клинических образцах с использованием QRT-PCR , Было обнаружено ткани AGEJ был замечательный низкий уровень экспрессии IFIT2 чем спаренных нераковых тканей (рис 4а), и экспрессия IFIT2 обратно коррелирует с размером опухоли (рис 4В, P = 0,0304
). А именно, размер опухоли больше или равна 5 см группе показал значительное понижающей регуляции экспрессии IFIT2 по сравнению с размером опухоли менее 5 см группе. Для проверки достоверности данных, мы затем измеряли экспрессию белка IFIT2 с помощью Вестерн-блоттинга (рис 4C а-б), и результаты показали аналогичную картину к наблюдениям найденных QRT-PCR. Иммуногистохимическое анализ наблюдалось значительное снижение экспрессии IFIT2 в тканях AGEJ спаренных незлокачественные ткани (рис 4D A-B, P &л;
0,001). Затем мы проанализировали связь между микроРНК-645 и IFIT2 экспрессии и обнаружили, что уровень экспрессии IFIT2 отрицательно коррелировал с тем из MIR-645 (рис 4E, P <
0,01). Кроме того, SGC7901 (рис 4F а) и КУП-823 (рис 4F б) клетки трансфицируют с ингибитором микроРНК-645 значительно увеличили экспрессию IFIT2 на белок и уровни мРНК по сравнению с фиктивных и NC групп (рис 4F AB, P &л;
0,01). Наши результаты показывают, что микроРНК-645 может непосредственно регулировать экспрессию IFIT2. Рисунок 4 Выражение микроРНК-645 и IFIT2 отрицательно коррелируют в AGEJ клинических образцах и IFIT2 подавлялась в тканях AGEJ по сравнению с парными нераковых тканей. А. Выражение IFIT2
и микроРНК-645 в AGEJ клинических образцах анализировали с помощью количественной ПЦР. B. Сравнение относительной экспрессии IFIT2
в AGEJ клинических образцах человека разного размера опухоли. (Т
-test, * р &л; 0,05). С. Выражение IFIT2 исследовали с помощью Вестерн-блоттинга (а, Ь: значения указывают на среднее ± стандартное отклонение, нормированная на тубулина, п = 3, т
-test, *** р
&л; 0,001) D. а. Характерные изображения показаны положительные иммуногистохимическое окрашивание IFIT2 в образцах человеческих AGEJ и совпадающим соседних нормальных тканей (увеличение 200 ×). б. Окрашивание десятки IFIT2 (т
-test, *** р
&л; 0,001). E. Точечные графики, показывающие отрицательную линейную корреляцию между экспрессии мРНК IFIT2
и что из MIR-645 в 43 AGEJ клинических образцах. Ф. IFIT2 и IFIT2
выражение измерено Вестерн-блоттинга в SGC7901 (а) и клеток BGC-823 (б). (Значения показывают среднее ± стандартное отклонение, n = 3, Односторонний анализ ANOVA, *** р
&л; 0,001)
IFIT2 опосредует функцию MIR-645 путем содействия SGC7901 и BGC-823 клеток. апоптоз
Чтобы подтвердить, что индукция апоптоза клеток в SGC7901 и КУП-823 клеток с помощью микроРНК-645 был опосредован нацеливание IFIT2
, мы провели IFIT2
плазмиды трансфекции в SGC7901 (рис 5А) и КУП-823 (Рисунок 5В) клетки к вверх-регулируют экспрессию IFIT2. Вестерн-блоттинга и количественный ПЦР показал, что до регуляции IFIT2 по IFIT2
плазмиды трансфекции может быть существенно уменьшено с помощью микроРНК-645 мимике. МТТ Анализ показал, что клетки, трансфицированные пролиферации плазмиды IFIT2 была подавлена, однако, клетки, трансфицированные пролиферации микроРНК-645 имитирует значительно увеличился по сравнению с плазмидой-контроля и плазмиды IFIT2 + микроРНК-645 группы (рис 5C AB, P &ЛТ; <бр> 0,001). Кроме того, введение IFIT2 способствовало апоптозу SGC7901 и BGC-823 клеток и MIR-645 имитирует уменьшенную апоптоз клеток, индуцированных IFIT2 повышающей регуляции по сравнению с группой NC в присутствии АДР (Рис 5E-F, P &ЛТ;
0,001). Наши результаты свидетельствуют о том, что IFIT2 опосредованной функцию микроРНК-645 в подавлении SGC7901 и КУП-823 клеток и пролиферацию индуцировать апоптоз клеток. Рисунок 5 IFIT2 опосредует функцию микроРНК-645 путем поощрения GC апоптоз клеток. &Amp; B. Экспрессия IFIT2 осмотрен Вестерн-блоттинга (A:. SGC7901; B, КУП-823 а, нормированная на тубулина, значения указывают на среднее значение ± SD, анализ однофакторного дисперсионного анализа, для SGC7901, F = 189.307, для КУП-823, F = 85,374; б, значения указывают среднее ± стандартное отклонение, Односторонний ANOVA анализ, для SGC7901, F = 85,374, для КУП-823, F = 219,921; *** р
&л; 0,001). С. SGC7901 (а) и КУП-823 (б) клетки, подвергнутые МТТ ежедневно в течение 6 дней (значения указывают на среднее ± стандартное отклонение, двухстороннее анализа ANOVA, для SGC7901, F = 13,768, для КУП-823, F = 16,409, *** р
&л; 0,001). D &Amp; E. SGC7901 (D), и-823 КУП (E) клетки собирали для анализа FACS после 72 ч в присутствии ADR (0,05 мкг /мл) (значения указывают среднее ± стандартное отклонение, n = 3, однофакторного анализа ANOVA; для SGC7901, F = 361.749, для КУП-823, F = 229.952; *** р
&л;. 0.001)
Истощение и повышающей регуляции MIR-645 изменившей каспазы-3/7 деятельности <бр> IFIT2 сообщалось, что супрессор опухоли через посредническую апоптоз клеток посредством активации каспазы-3/7 активности. Каспазы-Glo 3/7 анализ показал, что микроРНК-645 истощение значительно повышающей регуляции, в то время как микроРНК-645 избыточная экспрессия понижающего регулируется каспазы-3/7 активностью по сравнению с фиктивных и размыкающего группами в присутствии АДР (0,2 мкг /мл) (Рисунок 6A и B, P &л;
0,001) или состояние сывороточного голодания (рис 6C и D, P &л;
0,001). Эти результаты в сочетании с наблюдениями, изложенными выше предположили, что микроРНК-645, повышающей регуляции в тканях человека AGEJ, заторможенной апоптоза клеток и способствует онкогенность с помощью подавления каспазы-3/7 деятельности путем охвата IFIT2. Рисунок 6 каспазы-3/7 активности. Антиапоптической способность SGC7901 клеток и BGC-823 клеток после воздействия ADR (0,2 мкг /мл) или сывороточного голодания оценивали с помощью каспаз-3/7 деятельности. &Amp; C, SGC7901 клетки; B &Amp; D, КУП-823 клетки. (Значения указывают на среднее ± стандартное отклонение, n = 3, одностороннего анализа ANOVA, для A, F = 183.930, для B, F = 1093.797; для C, F = 1861,50, для D, F = 1483.604, *** P
≪ 0,001).
Обсуждение и выводы
Несмотря на то, накапливая доказательства показали, что микроРНК дерегулирования связан с опухолью канцерогенеза, прогрессии, миграции и инвазии [41], метастазирование [42, 43] и множественной лекарственной устойчивостью [44-46]. Мало что известно о роли микроРНК в развитии adencarcinoma желудочного пищеводного перехода (AGEJ). Здесь мы показали, что это выражение микроРНК-645 была значительно увеличена в AGEJ клинических образцах по сравнению с парными нераковых тканей и был значительно повышающей регуляции в двух клеточных линий рака желудка (GC), SGC7901 и BGC-823, которые использовались альтернатива модели клеток, поскольку нет доступных клеточных линий AGEJ не были установлены на сегодняшний день. Ингибирование микроРНК-645 в SGC7901 и клетках КУП-823 значительно индуцированный апоптоз клеток SGC7901 и BGC-823 в условиях сывороточного голодания или химиотерапевтического лекарственного средства путем повышающей регуляции IFIT2,
медиатор апоптоза, с потенциальным сайтом связывания для MIR-645 в 3'UTR его мРНК в. Паттерн экспрессии микроРНК-645 и IFIT2 в SGC7901 и клетках BGC-823 и клинических образцов имели отрицательную корреляцию, дополнительно предполагая, что IFIT2
является целевой ген микроРНК-645. Кроме того, ингибирование микроРНК-645 приводит к увеличению каспазы-3/7 активности, который активируется IFIT2. Все эти данные свидетельствуют о фундаментальной роли микроРНК-645 в канцерогенез, особенно в развитии AGEJ.
Слишком мало апоптозу один важный причиной канцерогенеза, потому что смерть злокачественные клетки уменьшаются заметно [47, 48], что приводит к злокачественной трансформации пораженных клеток, метастазы опухоли и множественной лекарственной устойчивости раковых клеток. Следовательно, апоптоз имеет большое значение в лечении онкологических заболеваний и является популярным объектом многих стратегий лечения. В этом исследовании мы показали, что микроРНК-645 обесцененные раковые клетки сыворотки депривации апоптоз, вызванный, в то время как истощение MIR-645 противодействует этот эффект MIR-645, предполагая, что микроРНК-645 может играть решающую роль в адаптации рака клеток к низким питания. Все большее количество микроРНК участвуют в раковых клетках апоптоз. С одной стороны, микроРНК мог бы функционировать в качестве супрессора опухоли посредством индукции апоптоза, т.е. микроРНК-421, который индуцирует пролиферацию клеток и устойчивость к апоптозу карциномы носоглотки человека с помощью понижающей регуляции FOXO4 [49]; микроРНК-149, который индуцирует апоптоз путем ингибирования Akt1 и E2F1 в клетках рака человека [50] и микроРНК-31, который индуцирует апоптоз в клетках нейробластомы человека [51]. С другой стороны, микроРНК мог бы функционировать в качестве онкогенов путем подавления апоптоза, т.е. микроРНК-24, который ингибирует апоптоз и вытесняет Бим в кардиомиоцитах мышей [52]; микроРНК-886-5p, который ингибирует апоптоз за счет понижающего регулирования экспрессии Вах в клетках шейки матки человека карциномы [53], и микроРНК-183, который ингибирует TGF- 1-индуцированное апоптоз путем понижающей регуляции экспрессии Pdcd4 в клетках гепатоцеллюлярной карциномы человека [54] .
ISGs, ИФН стимулировали гены, относятся к генам, которые tanscribed по IFNs индукции. Среди них 4 могут играть важную роль, которые влияют как на подавление вирусной репликации и ингибирование клеточной пролиферации [55, 56]. Эти гены могут ингибировать репликацию вируса, жертвуя клетки путем содействия апоптоз и подавлять прогрессирование рака с помощью ингибирования выживание злокачественно трансформированных клеток в пользу хозяина [57]. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Протеом анализ человеческого желудка кардии аденокарциномы с помощью лазерного захвата микродиссекции
• Терапевтический потенциал ПРЛ-3 адресности и клиническая значимость СПР-3 геномной амплификации при раке жел…