MicroRNA-645, up-regulované v ľudskom adencarcinoma žalúdočnej pažeráka križovatky, inhibuje apoptózu zameraním nádorového supresor IFIT2

MicroRNA-645, up-regulované v ľudskom adencarcinoma žalúdočnej pažeráka križovatky, inhibuje apoptózu zameraním tumor supresorové IFIT2
abstraktné
pozadia
Rastúce množstvo dôkazov naznačuje, že miRNA zohrávajú zásadnú úlohu v karcinogenézy a rakoviny progresie; Avšak, role miRNA v tumorigenezi o adencarcinoma žalúdočné pažeráka križovatky (AGEJ) zostáva z veľkej časti nejasný.
Metódy
SGC7901 a boli použité BGC-823 karcinómu žalúdka bunkové línie. Vyjadrenie Mir-645 a IFIT2 (interferón-indukovaná proteín tetratricopeptide opakuje 2) boli skúmané pomocou QRT-PCR, sú výrazy IFIT2 bola skúmaná metódou Western blotting a imunohistochemického testu. Bunková apoptóza bola stanovená pomocou FACS. Mir-645 inhibítor, napodobňuje a plazmid-IFIT2 transfekcia boli vykonané na štúdium bezstratové a zisk-funkcie. Kaspázy-3/7 aktivita bola skúmaná testom kaspázy-3/7.
Výsledky
V tejto štúdii sme sa uvádzajú zvýšenej expresie MIR-645 vo AGEJ klinických vzoriek v porovnaní s párovými non-rakovinové tkanivá. Tiež sme zaznamenali značný MIR-645 up-regulácia v dvoch rakovina žalúdka (GC) bunkových línií, SGC7901 a BGC-823, ktoré boli použité ako bunkových modeloch, pretože došlo k dispozícii žiadne AGEJ bunkové línie zavedené k dnešnému dňu. Zistili sme, že inhibícia MIR-645 by mohla citlivosť dramaticky SGC7901 a BGC-823 buniek ako v sére starvation- a chemoterapiou apoptózy vyvolané lieky od up-reguláciu IFIT2, ako sprostredkovateľ apoptózy cez mitochondriálnu dráhy, s potenciálnym väzbovým miestom pre mier -645 vo svojej mRNA v 3 'UTR. Ďalšie šetrenie vykazoval že IFIT2 výraz v SGC7901 a BGC-823 buniek a tkanív AGEJ klesá. IFIT2
ektopická expresia vedie k podpore bunkovej apoptózy, čo znamená, že môže fungovať ako IFIT2 supresor vo vývoji AGEJ. Okrem toho, inhibícia MIR-645 indukuje up-regulácia IFIT2 a zvýšená aktivita kaspázy-3/7 v porovnaní s kontrolnými skupinami.
Závery
Naše dáta naznačujú, že mier-645 funguje ako onkogén v ľudskom AGEJ strany, na aspoň čiastočne cez zameraný IFIT2
.
Kľúčové
adencarcinoma žalúdočné pažeráka križovatka mikroRNA-645 IFIT2 apoptózy pozadí
Nedávne štúdie ukázali, že adencarcinoma žalúdočné pažeráka križovatky (AGEJ) je odlišný od distálny žalúdok, s rôznymi rizikovými faktormi, nádorové charakteristiky a biologické správanie [1-4]. Okrem toho výskyt AGEJ rastie v priebehu posledných 30 rokov, a to najmä v Spojených štátoch a severnej Číne [5-9].
MicroRNA (miRNA) sú skupinou endogénne exprimovaný, nekódujúca malých RNA, 20- 25 nukleotidov, ktoré sú známe, že negatívne regulovať génovú expresiu potlačenie translácie alebo zníženie stability mRNA priamo väzbou na 3'-nepřekládané oblasti (3'-UTR) cieľových mRNA [10, 11]. Hromadia sa dôkazy naznačujú, že miRNA zohrávajú významnú úlohu pri regulácii fyziologických a patologických procesov, vrátane vývoja [12], metabolizmus [13], proliferácie buniek [14], diferenciácie [15] a apoptózy [16]. Okrem toho, aberantne post-transkripčný regulácia mRNA pomocou miRNA je spojená s tumorogenézy [17, 18]. Abnormálne expresné profily miRNA boli hlásené byť zistený v rôznych typov ľudských nádorov, vrátane pľúc [19], prsníka [20], prostaty [21], pečene [18], hrubého čreva [22] a rakoviny žalúdka [23]. Okrem toho môžu niektoré miRNA pôsobiť ako onkogény [24-26] alebo nádorových supresor [27, 28] tým, že reguluje expresiu svojich cieľových génov, ktoré hrajú významnú úlohu v niektorých kľúčových dráhach zapojených do bunkového cyklu progresie, apoptózy či proliferácia. miRNA down-regulovaná v nádorových vzorkách, ako je MIR-22 [29, 30], mier-101 [31, 32], a mier-7 [33, 34], zvyčajne fungujú ako potlačovacie miRNA, zatiaľ čo miRNA up-regulované v nádorových vzorkách, ako sú MIR-17 [35, 36], a mier-21 [37, 38], zvyčajne vyvinúť onkogénne role. Tieto štúdie naznačujú, že regulačné poruchy miRNA sa často podieľajú na karcinogenéze a progresiu rakoviny.
Nedávna štúdia ukázala, že mier-645 môže pôsobiť rolu tumor supresorové pri pokročilom serózna rakoviny vaječníkov pre mier-645 je negatívne spojené s celkovým prežitím to [39]. V tejto štúdii sme zistili, že mier-645 expresia bola významne zvýšená v AGEJ klinických vzoriek v porovnaní s párovými non-rakovinové tkanivá pomocou microRNA čipy. Avšak úloha Mir-645 v tumorigenezi z AGEJ nebola doteraz študovaná. Ďalšie štúdie ukázali, že mier-645 bola tiež významne up-regulovaná v dvoch rakovina žalúdka (GC) bunkových línií, SGC7901 a BGC-823, ktoré boli použité ako alternatívne bunkové modely v tejto štúdii. Inhibícia Mir-645 v SGC7901 a BGC-823 buniek, výrazne potláča apoptózu SGC7901 a BGC-823 buniek v podmienkach sérového hladovania alebo chemoterapeutickým liečivá prostredníctvom up-reguláciu IFIT2, ako sprostredkovateľ apoptózy, s potenciálnym väzbovým miestom pre mier -645 vo svojej mRNA v 3 'UTR. Expresného profilu Mir-645 a IFIT2 v AGEJ klinických vzoriek boli v negatívnej korelácii, čo ďalej naznačuje, že IFIT2
je cieľový gén MIR-645. Okrem toho, inhibícia MIR-645 má za následok zvýšenie kaspázy-3/7 činnosti, ktorý je aktivovaný IFIT2. V tejto štúdii sme skúmali, či MIR-645 je up-regulovaný v ľudskom žalúdku adencarcinoma pažeráka križovatky a inhibuje apoptózu zameraním tumor supresorové IFIT2.
Metódy
etickú výpisu
Pri vzorkách tkanív, písomný informovaný súhlas bol získané od pacientov. Postupy použité v tejto štúdii boli schválené Institutional Review rady Henan University of Science and Technology a bol prispôsobený Helsinskej deklarácie, a s platnými právnymi predpismi.
Bunkové línie a kultivačné podmienky
rakovinou žalúdka bunkových línií SGC -7901, BGC-823 a zvečnil normálne žalúdočnej epiteliálne bunkové línie, GES-1 boli láskavo prepožičal prof Daiming Fan. Všetky bunkové línie boli udržiavané v našom ústave podľa odporúčaných protokolov. Bunky boli kultivované v médiu RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) doplneného sérom 10% fetálne bovinné (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) pri teplote 37 ° C v inkubátore s 5% CO2.
ľudské vzorky
Všetky experimentálne postupy boli schválené Institutional Review rady Henan University of Science and Technology. Písomný informovaný súhlas bol získaný u všetkých vzoriek pacientov. Vzorky ľudskej AGEJ (n = 43) a pacientov spárované non-rakovinové vzorky boli získané od pacientov na prvej sesterské nemocnice, Henan University of Science and Technology, s informovaným súhlasom od každého pacienta. Čistenie
RNA, cDNA syntéza a kvantitatívne PCR v reálnom čase (QRT-PCR)
Celková RNA z kultivovaných buniek sa extrahuje TRIzolu činidlá (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) podľa protokolu a RNA výrobcu boli skladované pri -80 ° C a potom QRT-PCR analýzou , Zrelé MIR-645 expresia bola detekovaná pomocou Mirvana TM QRT-PCR miRNA Detection Kit (Ambion Inc. Austin, Texas), s U6 ako vnútorná kontrola. IFIT2 expresia bola detekovaná s primermi F: 5'AGCGAAGGTGTGCTTTGAGA 3 ', R: 5'GAGGGTCAATGGCGTTCTGA3' (dĺžka výrobku: 125 bp, Tm: 60 ° C; GC%: F-50%, R-55%; start-koniec: 643 až 748 bp) a GAPDH bola použitá ako vnútorná kontrola. PCR produkty boli oddelené na etídiumbromidu postriekané 1,5% agarózovom géle a vizualizované UV žiareniu.
Prenos buniek
ľudskej MIR-645 duplexné agomir (400 nm), antagomir (400 nM) a negatívna kontrola boli navrhnuté a poskytnuté Ribobio (Guangzhou, Guangdong, Čína). Plasmid-IFIT2 a negatívne kontrolné plamid boli zakúpené od Ribobio Inc (Guangzhou, Guangdong, Čína)
miRNA cieľ predikcie
nájsť potenciálnych miRNA cieľových génov, webové stránky TargetScanHuman (http :. //Www. Targetscan. org /) bol použitý, voľné väzobné energie bola vypočítaná a vyčkáva miest boli analyzované pomocou http: .... //bibiserv techfak Uni-Bielefeld de /rnahybrid webové stránky
vektorové konštrukty a luciferázy reportér test
Pre konštrukciu plazmidu IFIT2-3'UTR, divokého typu 3'-UTR fragment ľudského IFIT2 mRNA (1226-1233 nt, GenBank č. NM_001547.4), obsahujúci domnelú väzobnú sekvenciu MIR-645 bola amplifikovaná RT-PCR a klonovanie do miesta medzi Xho i a Not i po prúde od luciferázového reportérového génu vektora psiCHECK ™ (Promega, USA). Mutant jednotného MIR-645 väzobné miesto (5'AGCCTAG -3 'na 5'-TCGGATC -3 ") v 3'-UTR IFIT2 bol zahrnutý pomocou lokálne riadenou mutagénnych Kit (SBS Genetech, Beijing, Čína ). Divoké a mutantný typy pmirGLO-IFIT2-UTR vektorov boli overené sekvenovaním DNA
nukleotidových sekvencií primerov pre IFIT2-3'UTR (WT) klon :.
IFIT2XhoIF2 :. 5'CCGCTCGAG AGAATAGAGATGTGGTGCCCACTAGGCTACTGCTG 3 '
IFIT2NotIR2: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TTAAAATGGAATCAGTGACTTTTATTTCTCATAACAGAG 3 '
nukleotidovej sekvencie primérov pre IFIT2-3'UTR (MT) klon :.
mutIFIT2F2: 5'TTCTAGGTAGATGCTGAATTCGGATCACATCAAAGTTGGTGTGAAC 3'.
mutIFIT2R2: 5'GTTCACACCAACTTTGATGTGATCCGAATTCAAGEJTCTACCTAGAA 3 ' .
Bunky boli transfekovány s Mir-645 napodobenín, NC a pmirGLO plazmidu v 24 jamkami s použitím Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) podľa inštrukcií. 48 hodín neskôr boli bunky izolované a analyzované na aktivitu luciferázy pomocou Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA) a detekovaný detekčným systémom GloMaxTM 20/20 (E5331, Promega).
Kaspasy 3/7 test
aktivita kaspázy-3 a kaspázy-7 bol zistený vo formáte 96-jamkové (2 x 10 3 buniek /jamku) s použitím testu kaspasy-Glo 3/7 (Promega) podľa inštrukcií. 100 ul Caspase-Glo reagent 3/7 boli doplnené do každej jamky a inkubované pri izbovej teplote po dobu 1 h follwong luminiscencie bola detekovaná s použitím mikrotitračnej doštičky M200 fluorescenčné čítačky (Tecan). Pozadie luminiscencie spojené s bunkovou kultúrou a testovacieho činidla (prázdny reakcia) bola odpočítaná od experimentálne hodnoty.
MTT test
bunky boli transfekovány 100 nM MIR-645 (inhibítor Genepharma, Shanghai, Čína), napodobňuje (Ribobio Inc ., Guangzhou, Guangdong, Čína), alebo 100 nM plamid-IFIT2 (Ribobio Inc., Čína). Dvadsaťštyri neskôr, bunky boli schovať v 96-jamkových doštičiek (2 x 10 3 /jamku). Životaschopnosť buniek bola skúmaná pomocou MTT (3-2, 5-difenyl tetrazolium bromidu) testu (Sigma, USA) podľa inštrukcií v určenom čase.
Western blotting
celkové množstvo bielkovín z kultivovaných buniek boli lyžovanie lyzačním pufra obsahujúce PMSF na ľade. Potom proteín boli podrobené elektroforéze cez 12% SDS polyakrylamidovom gélu a potom boli prenesené na PVDF membránu (Millipore). Membrány boli blokované 5% netučného sušeného mlieka pri teplote miestnosti po dobu 1 h a inkubované cez noc s primárnymi protilátkami. Membrány boli inkubované s protilátkami značenými sekundárnymi HRP po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti a po 10 minútach troch premytí v TBS-T (triethanolaminebuffered soľný roztok s Tween). Napokon, signály boli detekované použitím ECL kitu (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) a membrány boli skenované a analyzované za použitia Bio-Rad ChemiDoc XRS + zobrazovací systém sa zobrazovacie softvér (verzia 1) množstvo. Expresia proteínu bola normalizovaná na endogénne referencie (tubulín) a vzhľadom na kontrolu. Spectra viacfarebný široká škála proteín rebrík (Fermentas) bol použitý ako molekulárne marker. Všetky protilátky použité v teste Western blot, sú uvedené v ďalšej oblasti 1: Tabuľka S1
Imunohistochemické vyšetrenie a imunohistochemické scoring
parafínové rezy, 4-um hrúbky, sa pečie po dobu 2 hodín pri teplote 65 ° C a zbavené parafínu .. Antigén vyhľadávania bola vykonaná za použitia citrátu sodný (pH 7,2) pri teplote 95 ° C počas 15 minút a potom sa sklíčka sa ochladí na teplotu miestnosti po dobu 30 minút. Potom, čo bol spracovaný 3% peroxidu vodíka po dobu 15 minút k zablokovaniu endogénnej peroxidázy, rezy boli ošetrené zvažujúcemu kvapalinou normálnym kozím sére počas 30 minút k zníženiu nešpecifické väzby a králičie polyklonálne anti-IFIT2 (1: 500, HPA003408, sigma-Aldrich, Shanghai, Čína) bol inkubuje sa s ním v častiach po dobu 12 hodín pri teplote 4 ° C. Po rewarming po dobu 1 hodiny a umývanie na 5 krát, boli rezy inkubované s sekundárnou protilátkou počas 30 minút pri teplote miestnosti. Diaminobenzidine (DAB) bol použitý pre farebné reakcie. Následné imunohistochemické farbenie bola hodnotená ako je popísané skôr [40].
Štatistická analýza
dáta bola vyjadrená ako priemer ± SD z troch nezávislých experimentov. Pre štatistické testy, SPSS štatistického softvérového balíka, version17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) bol použitý. Študenta t-test
, jednosmerná ANOVA a dvojcestná ANOVA testy boli vykonané na relatívnu hustotu pásmom westernovým prenosom a hodnoty MTT OD. Korelácia medzi Mir-645 a IFIT2 bola analyzovaná pomocou Spearmanova poradové korelácia. Hodnoty p. ≪ 0,05 boli považované za štatisticky významné
Výsledky
prejavov zo MIR-645 sú up-regulované v AGEJ klinických vzoriek
Aby bolo možné posúdiť úlohu MIR-645 pri vzniku nádorov z AGEJ sme najprv použitý QRT - metóda PCR pre meranie MIR-645 expresie 43 ľudských klinických AGEJ tkanív, a zistili, že mier-645 bol významne up-regulovaný v AGEJ klinických tkanivách v porovnaní s pacientmi spárované žalúdočnej srdcové non-rakovinové tkanivá (obrázok 1a). Ak chcete získať ďalšie vhľad do pozorovania vyššie uvedeného sme skúmali vzťah medzi MIR-645 prejavu a pacientov klinických parametrov. Analýza ukázala, že mier-645 výraz bol irelevantné s vekom, pohlavím, diferenciácie nádoru, lymfatické uzliny metastázy a TNM fáze (Tabuľka 1: Vzťah medzi klinickými parametrami a mier-645 expresie v primárnom kardia adenokarcinóm), ale bol v pozitívnej korelácii s veľkosť nádoru, a to, veľkosť nádoru väčšia než alebo rovná 5 cm skupinu ukázali významné zvýšenie expresie MIR-645 v porovnaní s veľkosťou nádoru menšou ako 5 cm skupina (obr 1B &Co. tabuľke 1, t-test
, * P
= 0,045). Obrázok 1 Prejavy MIR-645 sú up-regulované v AGEJ klinických vzoriek. A. expresie Mir-645 v 43 človek AGEJ klinických vzoriek vzhľadom k susednej spárovaných normálnej ľudskej žalúdočnej srdcový nerakovinových tkanív, bola meraná pomocou kvantitatívnej RT-PCR (Tieto hodnoty označujú priemer ± SEM, n = 3, t
-test, * p menšie ako 0,05, ** p < 0,01, *** p 0,001). B. nákupný relatívnej expresie Mir-645 v ľudských AGEJ klinických vzoriek rôzne veľkosti nádoru. (Dvojstranný t-test
, * p menšie ako 0,05).
Tabuľka 1 Vzťah medzi klinických parametrov a mier-645 expresie v primárnom kardio adenokarcinómu
klinických parametrov
N (%)
Príbuzní výraz (priemer ± SEM)
hodnotu p
vek (roky)
≥ 60
15 (50)
2,1286 ± 0,59201
0,568 Hotel < 60
15 (50)
1,9571 ± 0,52402
rodovej rovnosti
Muž
18 (60)
2,1111 ± 0.42783
0,462
Žena
12 (40)
2,3333 ± 0,65328
Veľkosť
≥5
13 (43,3)
2,7385 ± 100.128
0,004 * Hotel < 5
17 (56,7)
1,8235 ± 1,52214
histologické diferenciácie
Well (W)
15 (50)
2,138 ± 0,1866 0,9427
Zle (P)
15 (50)
2,198 ± 0,1903
Lymfatická metastázy
Áno
12 (40)
2.4583 ± 0.77864 Hotel &0,001 **
Nie
18 (60)
1,4944 ± 1,36273
TNM štádium
fázy I /II
16 (53,3)
2.9125 ± 1.33660 Hotel &0,001 **
Stage III /IV
14 (46,7)
1.4857 ± 0,73991
(* p <
0,05; ** P. ≪
0,001)
Vyčerpanie MIR-645 podporuje apoptózu buniek karcinómu žalúdka
Ak chcete skúmať úlohu Mir-645 v fenotypových znakov AGEJ progresie, sme použili dve rakovinu žalúdka ( GC) bunkové línie, SGC7901 a BGC-823 sú mobilné modely. Výsledky QRT-PCR ukázala, že mier-645 expresia bola významne up-regulovaná v porovnaní s imortalizovanou bunkovou líniou GC, GES-1 (Ďalší súbor 2: Obrázok S1, P Hotel &0,001).
SGC7901 a BGC-823 bunky boli prechodne transfekovány zrelé MIR-645 napodobenín, inhibítora, mock transfekovány alebo MIR-NC. Ako je ukázané na obrázku 2A a D, kvantitatívne výsledky RT-PCR ukazujú, že expresia spätných 645 napodobňuje alebo inhibítory významne up-reguláciu alebo down-reguláciu hladiny expresie MIR-645, v tomto poradí, v SGC7901 a BGC-823 buniek z prvý až piaty deň po transfekciu (obrázok 2A, P Hotel &0,001, obr 2D, P Hotel &0,001) v porovnaní s NC a falošné kontroly. Obrázok 2 Vyčerpanie MIR-645 podporuje apoptózu buniek karcinómu žalúdka (GC) buniek. A & D. Hladina MIR-645 bola meraná pomocou kvantitatívnej PCR v určenom čase (One-way ANOVA analýzy hodnoty označujú priemer ± SD, obrázok 2A, F = 426,588, P 0,001, obr 2D, F = 685,026, P <0,001). B & E. GC bunky transfekovány s Mir-645 napodobenín a inhibítor podrobia MTT testom denne po dobu 6 dní (Two-way ANOVA analýzy, 2B, F = 52.602, p 0,001, obr 2E, f = 42.847, p 0,001). C & F. GC buniek Bunky transfekované MIR-645 napodobňuje a inhibítor boli zbierané pre analýzu FACS po 72 hodinách (Hodnoty označujú priemer ± SD, n = 3, One-way ANOVA analýzy, 2C-a, F = 121,600, p < 0,001, obr 2C-b, F = 250,400, p 0,001, obr Fa, F = 194,815, p 0,001, obr 2F-b, F = 412,741, p 0,001)
SGC7901 a BGC-. 823 buniek transfekciou s Mir-645 inhibítory a napodobňuje ukázal podstatne nižšie a vyššie hladiny bunkovej proliferácie, v danom poradí, komparáciu s NC alebo mock skupín v prítomnosti ADR (0,2 ug /ml), ako bolo stanovené testom MTT (obrázok 2B, P Hotel < 0,001, obr 2E, P Hotel < 0,001)
test Anniex Vapoptosis vykazovali významné zvýšenie a zníženie apoptózu sadzby MIR-645 vyčerpania a ektopická expresia skupín v porovnaní s NC skupinami v sére-free. stave alebo v prítomnosti protirakovinový liek, adriamycín (ADR) (obrázok 2C ab, P Hotel &0,001; obrázok 2 F ab, P Hotel <
0,001). IFIT2 je cieľom MIR-645
Predchádzajúce údaje naznačujú, že mier-645 môže byť onkogén pokročilého serózna rakoviny vaječníkov. Tak my ďalej hľadal potenciálnych cieľov MIR-645 algoritmom Target Scan Human. Medzi nimi, IFIT2, je nádorový supresor, bolo zistené, že putativní MIR-645 väzobné miesta na svojom 3 'UTR (obrázok 3A). Potom sme vykonali luciferázového reporterového testu pomocou SGC7901 a BGC-823 bunky overiť, či IFIT2 bolo priamym cieľom MIR-645. Divokého typu a mutantný IFIT2-3'UTR obsahujúce domnelú väzobné miesto MIR-645 boli klonované do psiCHECK-2 vektora po smere od génu luciferázy (ďalší súbor 3: Obrázok S2). Zavedenie MIR-645 znižuje aktivitu lucirferase z IFIT2 3 'UTR reportérového vektora významne (obrázok 3B, P Hotel &0,001; obrázku 3C, P Hotel &0,001), ale nemá vplyv na aktivitu lucirferase z mutantný IFIT2 3'UTR reportér vektora, čo podporuje priamu interakciu s Mir-645 sa IFIT2. Tieto výsledky ďalej ukazujú, že mier-645 sa môže potlačiť expresiu IFIT2 zacielenie na 3'-UTR IFIT2 mRNA. Obrázok 3 Overenie predpokladaných väzbové miesta medzi Mir-645 a IFIT2. A. schematické znázornenie ukazuje konštrukt Luc-IFIT2 3'UTR a Luc-IFIT2 3'Mut UTR. Ako Luc-IFIT2 3'UTR a Luc-IFIT2 3'Mut UTR boli klonované do plazmidu pmirGLO po prúde od luciferázy svetlušky kódujúce oblasti medzi miestami Xbal a PmeI. B & C. SGC7901 bunky (B), alebo BGC-823 buniek (C) boli ko-transfekovány konštrukty psiCHECK-2, ktoré obsahujú buď 3 'UTR, alebo IFIT2 IFIT2 3'Mut UTR a buď inhibítor Mir-645 alebo MIR-645 napodobňuje pre 48 h. Hodnoty ukazujú relatívnej aktivity luciferázy po normalizácii na Renilla luciferázy (Tieto hodnoty znamenajú priemer ± SD, n = 3, One-way ANOVA analýzy, 3B, F = 283,244, 3C, F = 143,313. *** P < 0,001).
expresie Mir-645 a IFIT2 sú negatívny vzťah v AGEJ klinických vzoriek
Ak chcete ďalej posudzuje vzťah medzi Mir-645 a IFIT2 sme skúmali expresiu IFIT2 v 43 AGEJ klinických vzoriek pomocou QRT-PCR , Bolo zistené, AGEJ tkaniva mal významný nižšiu úroveň expresie IFIT2 než spárovaných non-rakovinové tkanivá (obrázok 4A), a IFIT2 expresia bola nepriamo úmerná veľkosti nádoru (obrázok 4B, P = 0,0304
). Menovite, veľkosť nádoru väčšia než alebo rovná 5 cm skupinu ukázali významné down-regulované IFIT2 expresie v porovnaní s veľkosťou nádoru menšou ako 5 cm skupiny. Ak chcete overiť dáta sme následne merať expresiu proteínu IFIT2 pomocou western blotting (pozri obrázok 4C a-b), a výsledky ukázali podobný vzor na pripomienky zistených QRT-PCR. Imunohistochemické stanovenia vykazovali významné zníženie expresie IFIT2 v AGEJ tkanivách párových non-rakovinové tkanivá (obr 4D a-b, P <
0,001). Potom sme analyzovali vzťah medzi Mir-645 a IFIT2 výraz a zistil, že IFIT2 hladina expresie bola v negatívnej korelácii s tým Mir-645 (obr 4E, P <
0,01). Okrem toho SGC7901 (obr 4F a) a BGC-823 (obr 4F b) bunky transfekovány MIR-645 inhibítor výrazne zvýšili IFIT2 expresiu v proteínu a mRNA v porovnaní s modelovými a NC skupín (obr 4F ab, P <
0,01). Naše výsledky ukazujú, že mier-645 sa môže priamo regulujú expresiu IFIT2. Obrázok 4 Expresia Mir-645 a IFIT2 negatívne koreluje v AGEJ klinických vzorkách a IFIT2 bola down-regulované v AGEJ tkanivách v porovnaní s párovými non-rakovinové tkanivá. A. Expresia IFIT2 stroje a Mir-645 v AGEJ klinických vzoriek boli analyzované metódou kvantitatívnej PCR. B. Porovnanie relatívnej expresie IFIT2
v ľudských AGEJ klinických vzorkách rôznej veľkosti nádoru. (T-test
, * p menšie ako 0,05). C. Expresia IFIT2 skúmaná metódou Western blot (a, b: Hodnoty ukazujú, priemer ± SD, normovaná na tubulín, n = 3, t-test
, *** p Hotel &0,001) D. a. Reprezentatívne obrazy zobrazené sú pozitívne imunohistochemické farbenie IFIT2 vo vzorkách ľudských AGEJ a uzavreté susedných normálnych tkanivách (zväčšenie 200 x). b. Farbenie skóre IFIT2 (t
-test, p *** Hotel <0,001). E. Rozptyľovacie grafy ukazujúce negatívne lineárnu koreláciu medzi expresiou mRNA IFIT2 stroje a že mier-645 v 43 AGEJ klinických vzoriek. F. IFIT2 a IFIT2
expresie meria western blotting v SGC7901 (a) a BGC-823 buniek (b). (Uvedené hodnoty označujú priemer ± SD, n = 3, One-way ANOVA analýza, *** p Hotel <0,001)
IFIT2 sprostredkováva funkciu MIR-645 podporou SGC7901 a BGC-823 buniek. apoptóza
K potvrdeniu, že indukcia apoptózy buniek v SGC7901 a BGC-823 buniek pomocou MIR-645 bol sprostredkovaný zacielením IFIT2
sme vykonali IFIT2
plazmidmi transfekciu v SGC7901 (obrázok 5A) a BGC-823 (Obrázok 5B) bunky, aby sa-regulujú expresiu IFIT2. Western blotting a kvantitatívne PCR ukázala, že up-regulácia IFIT2 podľa IFIT2
plazmidmi transfekciu by mohla byť výrazne znížil o MIR-645 napodobňuje. MTT test ukázal, že bunky transfekované plazmidom IFIT2 proliferácie bolo potlačené, avšak bunky prenesené s proliferáciou Mir-645 simuluje výrazne zvýšili v porovnaní s plazmidom-riadenie a plazmid-IFIT2 + MIR-645 skupín (obrázok 5C AB, P <
0,001). Okrem toho zavedenie IFIT2 podporovaná apoptóza SGC7901 a BGC-823 buniek a mier-645 má rovnakú funkciu ako zníženú apoptózu buniek indukovanú IFIT2 up-regulácia v porovnaní s NC skupinou v prítomnosti ADR (obr 5E-F, P <
0,001). Naše zistenia naznačujú, že IFIT2 sprostredkované funkcie MIR-645 pri inhibícii SGC7901 a BGC-823 buniek proliferáciu a indukovať apoptózu buniek. Obrázok 5 IFIT2 sprostredkováva funkciu MIR-645 tým, že podporuje GC apoptózu buniek. A & B. Expresia IFIT2 skúmaná metódou Western blot (A :. SGC7901, B, BGC-823 a, normalizované na tubulín, hodnoty označujú strednú hodnotu ± SD, jednosmerný ANOVA analýzy, pre SGC7901, F = 189.307, pre BGC-823, F = 85,374; b, hodnoty označujú priemer ± SD, One-Way ANOVA analýza, pre SGC7901, F = 85,374, pre BGC-823, F = 219,921; *** p Hotel <0,001). C. SGC7901 (a) a BGC-823 (b) bunky vystavené MTT testom denne po dobu 6 dní (hodnoty označujú priemer ± SD, Obojsmerná ANOVA analýzy pre SGC7901, F = 13,768, pre BGC-823, F = 16,409, p *** Hotel <0,001). D & E. SGC7901 (D) a BGC-823 (E), bunky boli zbierané pre analýzu FACS po 72 h v prítomnosti ADR (0,05 ug /ml) (hodnoty označujú priemer ± SD, n = 3, jednosmerný ANOVA analýzy; pre SGC7901, F = 361.749, pre BGC-823, F = 229.952; *** p
. <
0,001), vyčerpanie a up-regulácia MIR-645 zmenila aktivitu kaspasy-3/7
IFIT2 bolo hlásené, že je nádorový supresor cez sprostredkujúcu apoptózu buniek prostredníctvom aktivácie aktivity kaspasy-3/7. Kaspázy-Glo 3/7 test ukázal, že mier-645 deplécie významne up-regulované, zatiaľ čo nadmerná expresia MIR-645 downregulovány aktivitu kaspasy-3/7 v porovnaní s modelovými a NC skupín v prítomnosti ADR (0,2 ug /ml) (obrázok 6A a B, P <
0,001), alebo stav sérum hladovania (obrázok 6C a D, P <
0,001). Tieto výsledky v kombinácii s pozorovaním uvedených vyššie naznačujú, že mier-645, up-regulované v ľudských tkanivách, AGEJ inhibuje apoptózu buniek a podporuje tumorigeničnosti prostredníctvom potlačenie kaspázy-3/7 aktivitu zacielenia IFIT2. Obrázok 6 kaspasy 3/7 aktivitu. Anti-apoptotické schopnosť SGC7901 buniek a BGC-823 buniek po expozícii ADR (0,2 ug /ml) alebo sérového hladovania bola hodnotená kaspázy-3/7 činnosti. Dvojica A a C, SGC7901 bunky; B & D, BGC-823 buniek. (Hodnoty označujú priemer ± SD, n = 3, jednosmerná ANOVA analýzy, pre A, F = 183.930, za b, f = 1093.797, lebo C, F = 1861,50, pre D, F = 1483.604, *** p
. < 0,001)
Diskusia a závery
Hoci nahromadili dôkazy ukázali, že miRNA deregulácia je spojené s nádorom karcinogenézy, progresie, migrácia a invázia [41], metastáz [42, 43] a mnohopočetné liekovej rezistencie [44-46]. Málo je známe o rolách miRNA vo vývoji adencarcinoma žalúdočné pažeráka križovatky (AGEJ). Tu sme ukázali, že mier-645 expresia bola významne zvýšená v AGEJ klinických vzoriek v porovnaní s párovými non-rakovinové tkanivá a bola významne up-regulované v dvoch rakovina žalúdka (GC), bunkové línie, SGC7901 a BGC-823, ktoré boli použité alternatívne bunkové modely pretože nie je k dispozícii bunkové línie AGEJ boli stanovené k dnešnému dňu. Inhibícia Mir-645 v SGC7901 a BGC-823 buniek významne indukovanú apoptózu SGC7901 a BGC-823 buniek v podmienkach sérového hladovania alebo chemoterapeutickým liečivá prostredníctvom up-reguláciu IFIT2,
mediátor apoptózy, s potenciálnym väzbovým miestom pre mier-645 vo svojom mRNA v 3 'UTR. Expresného profilu Mir-645 a IFIT2 v SGC7901 a BGC-823 buniek a klinických vzoriek boli v negatívnej korelácii, čo ďalej naznačuje, že IFIT2
je cieľový gén MIR-645. Okrem toho, inhibícia MIR-645 má za následok zvýšenie kaspázy-3/7 činnosti, ktorý je aktivovaný IFIT2. Všetky tieto nálezy ukazujú zásadnú úlohu Mir-645 v karcinogenéze, a to najmä pri vývoji AGEJ.
Príliš málo apoptózy je rozhodujúcou príčinou karcinogenézy, pretože malígne bunky smrť sa znižujú výrazne [47, 48], čo vedie k malígnej transformácii postihnutých buniek, nádorových metastáz a multidrug rezistencie rakovinových buniek. Z tohto dôvodu, apoptóza má veľký význam v liečbe rakoviny a je obľúbeným cieľom mnohých liečebných stratégií. V tejto štúdii sme ukázali, že mier-645 postihnutých rakovinové bunky na sérový deprivácie indukovanú apoptózu, zatiaľ čo vyčerpania MIR-645 antagonizovaný tento účinok MIR-645, čo naznačuje, že mier-645, môže hrať kľúčovú úlohu v úprave rakoviny bunky nízkemu výživy. Stále viac miRNA boli zapojené do nádorových buniek apoptózu. Na jednej strane, microRNA môže pôsobiť ako nádorový supresor prostredníctvom indukcie apoptózy, tj. MIR-421, ktorý indukuje bunkovú proliferáciu a odolnosť apoptózu v ľudskej nazofaryngálne karcinóm cez down-reguláciu FOXO4 [49]; MIR-149, ktorý indukuje apoptózu inhibíciou AKT1 a E2F1 v ľudských rakovinových bunkách [50] a miRNA-31, ktorý vyvoláva apoptózu ľudských neuroblastomových buniek [51]. Na druhej strane, microRNA môže pôsobiť ako onkogény potlačením apoptózy, tj. MIR-24, ktorý inhibuje apoptózu a potláča BIM v myšiach kardiomyocytov [52]; MIR-886-5p, ktorý inhibuje apoptózu down-reguláciu expresie v Bax bunky ľudského cervikálneho karcinómu [53], a mier-183, ktorý inhibuje TGF-D1-indukovanú apoptózu downregulace PDCD4 v bunkách ľudského hepatocelulárneho karcinómu buniek [54] .
ISGS, IFN stimulované gény, pozri génov, ktoré sú tanscribed podľa IFN indukciu. Medzi nimi, 4 môžu hrať významnú úlohu, ktoré ovplyvňujú tak inhibíciu vírusovej replikácie a inhibíciu bunkovej proliferácie [55, 56]. Tieto gény môžu inhibovať replikáciu vírusu tým, že obetuje bunku prostredníctvom podpory apoptózu a brzdiť priebeh rakoviny prostredníctvom inhibície zhubne transformovanej bunkovej prežitie v prospech hostiteľa [57]. Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• Proteome analýza ľudského kardio adenokarcinómu laserom capture microdissection
• Terapeutický potenciál PRL-3 zacielenie a klinický význam PRL-3 genomické zosilnenie v žalúdku cancer