MicroRNA-645, up-gereguleerd in het menselijk adencarcinoma van maag-slokdarm overgang, remt apoptose door zich te richten tumor suppressor IFIT2

MicroRNA-645, up-gereguleerd in het menselijk adencarcinoma van maag-slokdarm overgang, remt apoptose door zich te richten tumor suppressor IFIT2
Abstract
Achtergrond
een toenemende hoeveelheid bewijsmateriaal wijst erop dat miRNAs hebben een cruciale rol in het ontstaan ​​van kanker en de progressie van kanker; De rol van miRNAs bij de tumorigenese van adencarcinoma van gastrische slokdarm overgang (AGEJ) grotendeels onduidelijk.
Methods Ondernemingen De SGC7901 en BGC-823 maagkanker cellijnen werden gebruikt. De uitingen van miR-645 en IFIT2 (interferon-geïnduceerde eiwit met tetratricopeptide herhaalt 2) werden onderzocht door qRT-PCR, werd de uitingen van IFIT2 onderzocht door western blotting en immunohistochemie assay. De cel apoptose werd bepaald met FACS. MiR-645 remmer, en bootst plasmide-IFIT2 transfecties werden uitgevoerd om de verlies- en gain-functie te bestuderen. Caspase-3/7-activiteit werd onderzocht door caspase-3/7 assay.
Resultaten
In de onderhavige studie hebben we een verhoogde expressie van miR-645 in AGEJ klinische monsters vergeleken met gekoppelde niet-carcinomateuze weefsels gerapporteerd. Ook waargenomen significante miR-645 up-regulatie in twee maagkanker (GC) cellijnen, SGC7901 en BGC-823, die werden gebruikt als celmodellen omdat er geen beschikbare AGEJ cellijnen die tot dusver. We vonden dat remming van miR-645 drastisch SGC7901 en BGC-823 cellen kunnen sensibiliseren voor zowel serum starvation- en chemotherapeutische geneesmiddelen geïnduceerde apoptose door up-reguleren IFIT2, een mediator van apoptose via een mitochondriële route, met een potentiële bindingsplaats voor miR -645 in de mRNA's 3'UTR. Nader onderzoek tentoongesteld dat IFIT2 expressie afneemt in SGC7901 en BGC-823 cellen en weefsels AGEJ. IFIT2
ectopische expressie leidt tot bevordering van apoptose, wat aangeeft dat IFIT2 kan functioneren als een onderdrukker in de ontwikkeling van AGEJ. Bovendien remming van miR-645 induceert up-regulatie van IFIT2 en verhoogde caspase-3/7-activiteit vergeleken met controlegroepen.
Conclusies Home Onze gegevens suggereren dat miR-645 functioneert als een oncogen in menselijke AGEJ door ten ten dele door middel, gericht IFIT2
.
Trefwoorden
adencarcinoma van maag-slokdarm overgang microRNA-645 IFIT2 apoptose Achtergrond
Recente studies hebben gesuggereerd dat adencarcinoma van maag-slokdarm overgang (AGEJ) is verschillend van die van de distale maag, met verschillende risicofactoren, tumor kenmerken, en biologisch gedrag [1-4]. Bovendien is de incidentie van AGEJ is toegenomen in de afgelopen 30 jaar, met name in de Verenigde Staten en Noord-China [5-9].
MicroRNAs (miRNAs) zijn een groep van endogeen tot expressie, niet-coderende RNA's kleine, 20- 25 nucleotiden, waarvan bekend is dat negatief reguleren van genexpressie door middel van het onderdrukken van translatie of verlaging van de stabiliteit van mRNA door direct te binden aan het 3'-ongetranslateerde gebied (3'-UTR) van doelwit mRNA [10, 11]. Accumulerende aanwijzingen dat miRNAs een belangrijke rol bij het reguleren van fysiologische en pathologische processen, waaronder ontwikkeling [12], metabolisme [13], celproliferatie [14], differentiatie [15] en apoptose [16]. Bovendien wordt afwijkende post-transcriptionele regulatie van mRNA van miRNAs in verband met tumorigenese [17, 18]. De abnormale expressieprofielen van miRNAs gerapporteerd in verschillende soorten van humane tumoren te detecteren waaronder long [19], borst [20], prostate [21], lever [18], colon [22] en maagkanker [23]. Bovendien kunnen sommige miRNAs optreden als oncogenen [24-26] of tumor supressors [27, 28] door het reguleren van de expressie van hun doelgroep genen die een belangrijke rol in een aantal belangrijke routes betrokken bij de celcyclus, apoptose of proliferatie te hebben. miRNAs down-gereguleerd in tumor specimens zoals miR-22 [29, 30], miR-101 [31, 32], en miR-7 [33, 34] meestal functioneren als onderdrukkende miRNAs, terwijl miRNAs opgereguleerd in tumor specimens, zoals miR-17 [35, 36] en miR-21 [37, 38] meestal uitoefenen oncogene rollen. Deze studies suggereren dat ontregeling van miRNAs vaak is betrokken bij het ontstaan ​​van kanker en de progressie van kanker.
Een recente studie heeft aangetoond dat miR-645 de tumor suppressor rol in geavanceerde sereuze eierstokkanker voor miR-645 kunnen uitoefenen wordt negatief geassocieerd met de algemene overleving van Het [39]. In de huidige studie, vonden we dat miR-645 expressie aanzienlijk AGEJ klinische monsters werd verhoogd in vergelijking met gepaarde niet-kwaadaardige weefsels met behulp van microRNA chips. Echter, de rol van miR-645 in het ontstaan ​​van tumoren van AGEJ is nog niet onderzocht. Nader onderzoek toonde aan dat miR-645 was ook significant up-gereguleerd in twee maagkanker (GC) cellijnen, SGC7901 en BGC-823, die werden gebruikt als alternatief cel modellen in de huidige studie. Remming van miR-645 in SGC7901 en BGC-823 cellen significant onderdrukt de apoptose van SGC7901 en BGC-823 cellen in de toestand van serumuithongering of chemotherapeutisch geneesmiddel door opreguleren IFIT2, een mediator van apoptose, met een mogelijke bindingsplaats voor miR -645 in de mRNA's 3'UTR. Het expressiepatroon van miR-645 en IFIT2 AGEJ in klinische monsters waren negatief gecorreleerd, verder suggereert dat IFIT2
een doelgen van miR-645. Bovendien remming van miR-645 resulteert in verhoogde caspase-3/7-activiteit, die wordt geactiveerd door IFIT2. In deze studie hebben we onderzocht of miR-645 is up-gereguleerd in het menselijk adencarcinoma van maag-slokdarm overgang en remt apoptose door zich te richten tumor suppressor IFIT2.
Methods
Ethics statement
Voor weefselmonsters, schriftelijk toestemming was verkregen van patiënten. De in deze studie procedures werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Henan Universiteit voor Wetenschap en Technologie en is in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki, en om de lokale wetgeving.
Cellijnen en kweekomstandigheden
Maagkanker cellijnen SGC -7901, BGC-823 en vereeuwigd normale maag epitheel cellijn, werden GES-1 vriendelijk geschonken door Prof. Daiming Fan. Alle cellijnen werden in ons instituut onderhouden volgens de aanbevolen protocollen. Cellen werden gekweekt in RPMI-1640 medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
menselijke specimens
Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Institutional review Board van de Henan Universiteit voor Wetenschap en Technologie. Schriftelijke informed consent werd verkregen voor alle monsters van patiënten. Human AGEJ exemplaren (n = 43) en de patiënt gepaarde niet-kwaadaardige monsters werden verkregen van patiënten bij de eerste aangesloten ziekenhuis, Henan Universiteit voor Wetenschap en Technologie, met informed consent van elke patiënt.
RNA zuivering, cDNA synthese, en kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) Totaal RNA
gekweekte cellen werd geëxtraheerd met TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) volgens de fabrikant protocol en RNA's werden bewaard bij -80 ° C voor qRT-PCR analyse . Rijpe miR-645 expressie werd gedetecteerd met een Mirvana TM qRT-PCR miRNA Detection Kit (Ambion Inc. Austin, Texas) met U6 als een interne controle. IFIT2 expressie werd gedetecteerd met primers F: 5'AGCGAAGGTGTGCTTTGAGA 3 ', R: 5'GAGGGTCAATGGCGTTCTGA3' (product lengte: 125 bp; Tm: 60 ° C; GC%: F-50%, R-55%; start-end: 643-748 bp) en GAPDH werd gebruikt als een interne controle. PCR producten werden gescheiden op een met ethidiumbromide gekleurde 1,5% agarosegel en zichtbaar gemaakt met UV.
Celtransfectie
menselijke miR-645 duplex agomir (400 nM), antagomir (400 nM) en negatieve controle werden ontworpen en door Ribobio (Guangzhou, Guangdong, China). Plasmide-IFIT2 en de negatieve controle plamid werden gekocht van Ribobio Inc (Guangzhou, Guangdong, China)
miRNA doelwit voorspelling Belgique Om potentiële miRNA target genen, TargetScanHuman website (http:.. //Www targetscan. org /) werd gebruikt, de binding vrije energie werd berekend en afwachtend sites werden geanalyseerd met behulp van http:.... //bibiserv techfak uni-Bielefeld de /rnahybrid website
Vector bouwt en luciferase reporter assay Belgique Om IFIT2-3'UTR plasmideconstruct, een wildtype 3'-UTR fragment van humaan IFIT2 mRNA (nt 1226-1233, Genbank toegangsnummer. NM_001547.4) met de vermeende miR-645-bindende sequentie werd geamplificeerd door RT-PCR en gekloneerd in de plaats tussen de XhoI en NotI stroomafwaarts van het luciferase reportergen van de psiCHECK ™ vector (Promega, USA). Een mutant van de enkele miR-645 bindingsplaats (5'AGCCTAG -3 'to 5'TCGGATC -3') in de 3'-UTR van IFIT2 werd opgenomen door Site mutagenese Kit (SBS gentech, Beijing, China ). Wilde en mutante vormen van pmirGLO-IFIT2-UTR vectoren werden bevestigd door DNA sequentiebepaling Ondernemingen De nucleotidesequenties van de primers voor IFIT2-3'UTR (WT) kloon.
IFIT2XhoIF2. 5'CCGCTCGAG AGAATAGAGATGTGGTGCCCACTAGGCTACTGCTG 3 '
IFIT2NotIR2: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TTAAAATGGAATCAGTGACTTTTATTTCTCATAACAGAG 3 'Ondernemingen De nucleotide sequenties van primers voor IFIT2-3'UTR (MT) kloon:.
mutIFIT2F2: 5'TTCTAGGTAGATGCTGAATTCGGATCACATCAAAGTTGGTGTGAAC 3'.
mutIFIT2R2: 5'GTTCACACCAACTTTGATGTGATCCGAATTCAAGEJTCTACCTAGAA 3 ' .
Cellen werden getransfecteerd met de miR-645 bootst, NC en pmirGLO plasmide 24 putjes met gebruik van Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) volgens de instructies. 48 h later werden de cellen geoogst en geanalyseerd voor luciferase activiteit met het Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA) en gedetecteerd door de GloMaxTM 20/20 detectiesysteem (E5331, Promega).
Caspase-3/7 assay Ondernemingen de activiteit van caspase-3 en caspase-7 werd gedetecteerd in 96 putjes (2 x 10 3 cellen /putje) met de caspase-Glo 3/7 Assay (Promega) volgens de instructies. 100 pl Caspase-Glo 3/7 reagens werden aangevuld in elk putje en vervolgens geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 1 h follwong de luminescentie werd gedetecteerd met de M200 microplaat fluorescentielezer (Tecan). De achtergrond luminescentie geassocieerd met celkweek en assay reagens (blanco reactie) werd afgetrokken van de experimentele waarde.
MTT-test
cellen werden met 100 nM miR-645 remmer (Genepharma, Shanghai, China), bootst (Ribobio Inc ., Guangzhou, Guangdong, China) of 100 nM plamid-IFIT2 (Ribobio Inc., China). Vierentwintig later werden cellen gezaaid in 96-well platen (2 x 10 3 /putje). De levensvatbaarheid van cellen werd onderzocht door MTT (3-2, 5-difenyl tetrazolium bromide) test (Sigma, USA) volgens de instructies aangegeven duur.
Western blotting
Totaal eiwit uit gekweekte cellen werden gelyseerd door Lysis Buffer met PMSF op ijs. Daarna werden eiwitten geëlektroforeerd over 12% SDS-polyacrylamidegelen en werden vervolgens overgebracht naar een PVDF-membraan (Millipore). Membranen werden geblokkeerd met 5% magere melkpoeder bij kamertemperatuur gedurende 1 uur en overnacht geïncubeerd met primaire antilichamen. Membranen werden geïncubeerd met secundaire antilichamen gemerkt met HRP gedurende 1 uur bij kamertemperatuur na drie 10 min wassingen in TBS-T (triethanolaminebuffered zoutoplossing met Tween). Tenslotte werden de signalen gedetecteerd met ECL-kit (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) en de membranen werden gescand en geanalyseerd met behulp van een Bio-Rad ChemiDoc XRS + beeldvormingssysteem met beeldverwerkingssoftware (versie Afname 1). De eiwitexpressie werd genormaliseerd op een endogene referentie (tubuline) en opzichte van de controle. De Spectra multicolor brede range eiwit ladder (Fermentas) werd gebruikt als moleculaire marker. Alle bij de Western blot assay antilichamen zijn vermeld in aanvullende bestandsinformatie 1: Tabel S1
immunohistochemie en immunohistochemische scoring
Paraffinesecties, 4-urn dik, werden gebakken gedurende 2 uur bij 65 ° C en van paraffine ontdaan.. Antigeenterugtrekking werd uitgevoerd met natrium citraat buffer (pH 7,2) bij 95 ° C gedurende 15 minuten en daarna werden objectglaasjes bij kamertemperatuur gekoeld gedurende 30 minuten. Na behandeling met 3% waterstofperoxide gedurende 15 minuten om endogeen peroxidase te blokkeren, werden de coupes behandeld met normaal geitenserum beperken vloeistof 30 minuten bindende en konijn polyklonaal anti-IFIT2 (1 verlagen aspecifieke: 500, HPA003408, Sigma-Aldrich. Shanghai, China) werd geïncubeerd secties gedurende 12 uur bij 4 ° C. Na opwarmen gedurende 1 uur en wassen voor 5 tijden werden secties geïncubeerd met secundair antilichaam gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Diaminobenzidine (DAB) werd gebruikt voor kleurreacties. Daaropvolgende immunohistochemische kleuring werd gescoord als eerder beschreven Statistische analyse
Data [40].
Werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke experimenten. Voor statistische testen, SPSS statistisch softwarepakket version17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) werd gebruikt. De student t
-test, de one-way ANOVA en twee-weg ANOVA-test werd uitgevoerd voor relatieve band dichtheid van western blotting en MTT OD-waarden. De correlatie tussen miR-645 en IFIT2 werd geanalyseerd met Spearman rank correlatie. P-waarden. ≪ 0,05 werden beschouwd als statistisch significant
Resultaten
Uitingen van miR-645 zijn up-gereguleerd in AGEJ klinische monsters Belgique Om de rol van miR-645 in het ontstaan ​​van tumoren van AGEJ beoordelen we voor het eerst gebruikt qRT - PCR-methode voor het meten van miR-645 expressie van 43 menselijke AGEJ klinische weefsels, en vond dat miR-645 was aanzienlijk up-gereguleerd in AGEJ klinische weefsels in vergelijking met de patiënt gekoppeld gastric cardiale niet-kwaadaardige weefsels (figuur 1A). Om meer inzicht te krijgen in de bovengenoemde observatie, onderzochten we de relatie tussen miR-645 expressie en patiënten klinische parameters. Analyse toonde aan dat miR-645 expressie irrelevant leeftijd, geslacht, tumordifferentiatie, ganglionaire metastase en TNM (Tabel 1: Het verband tussen klinische parameters en miR-645 expressie in primaire gastrische cardia adenocarcinoom), maar was een positieve correlatie met de tumorgrootte, namelijk tumorgrootte groter dan of gelijk aan 5 cm groep toonde significant verhoogde miR-645 expressie tegen tumor kleiner dan 5 cm groep (Figuur 1B & Tabel 1, t
-test, * p
= 0,045). Figuur 1 Uitingen van miR-645 zijn up-gereguleerd in AGEJ klinische monsters. A. expressie van miR-645 in 43 menselijke AGEJ klinische monsters ten opzichte van de aangrenzende gepaarde normale menselijke maag cardiale niet-kankerachtige weefsels werd gemeten met kwantitatieve RT-PCR (De waarden geven het gemiddelde ± SEM, n = 3, t
-test, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001). B. vergelijking van de relatieve expressie van miR-645 in de menselijke AGEJ klinische monsters van verschillende grootte van de tumor. (Tweezijdige t
-test, * p < 0,05).
Tabel 1 De relatie tussen klinische parameters en miR-645-expressie in primaire maag cardia adenocarcinoom
klinische parameters
N (%)
Verwanten expressie (gemiddelde ± SEM)
p-waarde
Leeftijd (jaar)
≥ 60
15 (50)
2,1286 ± 0,59201
0,568 Restaurant < 60
15 (50)
1,9571 ± 0,52402
Geslacht
Man
18 (60)
2,1111 ± 0,42783
0,462
Vrouw
12 (40)
2,3333 ± 0,65328
Maat
≥5
13 (43,3)
2,7385 ± 100.128
0,004 * Restaurant < 5
17 (56,7)
1,8235 ± 1,52214
histologische differentiatie
Well (w)
15 (50)
2,138 ± 0,1866
0,9427
Slecht (P)
15 (50)
2,198 ± 0,1903
Lymfatische metastase
Ja
12 (40)
2,4583 ± 0,77864 Restaurant < 0,001 ** verhuur No
18 (60)
1,4944 ± 1,36273
TNM stadium
fase I /II
16 (53,3)
2,9125 ± 1,33660 Restaurant < 0,001 **
fase III /IV
14 (46,7)
1,4857 ± 0,73991
(* p <
0,05; ** P <.
0.001)
Uitputting van miR-645 bevordert apoptose van maagkanker cellen
Om de rol van miR-645 in de fenotypische kenmerken van AGEJ progressie te onderzoeken, gebruikten we twee maagkanker ( GC) cellijnen, SGC7901 en BGC-823 als cell modellen. qRT-PCR resultaten toonden aan dat miR-645 expressie was significant up-gereguleerd in vergelijking met onsterfelijk gemaakte GC cellijn, GES-1 (Extra file 2: Figuur S1, P Restaurant < 0,001).
SGC7901 en BGC-823 cellen werden tijdelijk met volwassen miR-645 bootst, inhibitor, mock getransfecteerd, of miR-NC. Zoals getoond in figuur 2A en D, kwantitatieve RT-PCR resultaten tonen dat expressie van buitenspiegels 645 nabootst of remmers significant up-reguleren of neerwaarts reguleren van de expressie van miR-645 in respectievelijk SGC7901 en BGC-823 cellen van de eerste tot vijfde dag na de transfectie (Figuur 2A, P Restaurant < 0,001; figuur 2D, P Restaurant < 0,001) in vergelijking met NC en mock controles. Figuur 2 Uitputting van miR-645 bevordert apoptose van maagkanker (GC) cellen. A &D. Het niveau van miR-645 werd bepaald door kwantitatieve PCR op ingestelde tijd (One-way ANOVA analyse, de waarden geven het gemiddelde ± SD, Figuur 2A, F = 426,588, P < 0,001 Figuur 2D, F = 685,026, P <0,001). B & E. GC-cellen die met miR-645 bootst en remmer onderworpen aan een MTT-test per dag gedurende 6 dagen (Two-way ANOVA analyse, Figuur 2B, F = 52,602, p < 0,001; figuur 2E, F = 42,847, p < 0,001). C & F. GC cellen cellen die met miR-645 bootst en remmer werden verzameld voor FACS analyse na 72 uur (De waarden geven het gemiddelde ± SD, n = 3, One-way ANOVA analyse, figuur 2C-a, F = 121,600, p < 0,001; figuur 2C-B, F = 250,400, p < 0,001; figuur Fa, F = 194,815, p < 0,001; figuur 2F-b, F = 412,741, p < 0,001)
SGC7901 en BGC-. 823 cellen getransfecteerd met miR-645-remmers en bootst vertoonden significant lagere en hogere niveaus van celproliferatie, respectievelijk vergelijking met de NC of mock groepen in aanwezigheid van ADR (0,2 ug /ml) zoals bepaald door MTT-bepaling (Figuur 2B, P Restaurant < 0,001; figuur 2E, P Restaurant < 0,001)
AnnieX Vapoptosis assay vertoonden significant verhoogde en verlaagde apoptose tarieven van miR-645 uitputting en ectopische expressie groepen in vergelijking met NC-groepen in het serum-vrij. conditie of in de aanwezigheid van anti-drug, adriamycine (ADR) (figuur 2C ab, P Restaurant < 0,001; Figuur 2 F ab, P Restaurant < 0.001).
IFIT2 is een doelwit van miR-645
Vorige gegevens suggereren dat miR-645 een oncogen van geavanceerde sereuze eierstokkanker zou kunnen zijn. Dus we verder gezocht naar de mogelijke doelwitten van miR-645 door algoritme van Target Scan van de mens. Onder hen, IFIT2, een tumor suppressor, bleek vermeende miR-645 bindingsplaatsen binnen de 3'UTR (figuur 3A) te hebben. Vervolgens voerden we luciferase reporter assay met behulp van SGC7901 en BGC-823 cellen na te gaan of IFIT2 was een direct doelwit van miR-645. Wild-type en mutant IFIT2-3'UTR daarin de vermoedelijke bindingsplaats van miR-645 werden gekloond in psiCHECK-2 vector stroomafwaarts van luciferasegen (Extra file 3: Figuur S2). Introductie van miR-645 verminderde de lucirferase activiteit vanuit IFIT2 3'UTR reporter vector significant (Figuur 3B, P Restaurant < 0,001; figuur 3C, P Restaurant < 0,001), maar had geen invloed op de activiteit van lucirferase de mutant IFIT2 3'UTR reporter vector, het ondersteunen van de directe interactie van miR-645 met IFIT2. Deze resultaten suggereren verder dat miR-645 de IFIT2 expressie kan onderdrukken door zich te richten het 3'-UTR van IFIT2 mRNA. Figuur 3 valideren de voorspelde bindingsplaatsen tussen miR-645 en IFIT2. A. Het schema toont het construct van Luc-IFIT2 3'UTR en Luc-IFIT2 3'Mut UTR. Zowel Luc-IFIT2 3'UTR en Luc-IFIT2 3'Mut UTR werd gekloond in een plasmide pmirGLO stroomafwaarts van de vuurvlieg luciferase coderend gebied tussen de Pmel en Xbal plaatsen. B & C. SGC7901 cellen (B) of BGC-823 cellen (C) werden gecotransfecteerd met de psiCHECK 2-constructen die ofwel IFIT2 3'UTR of IFIT2 3'Mut UTR en hetzij de miR-645 remmer of miR-645 signaalpeptidase 48 h. Waarden geven de relatieve luciferaseactiviteit na normalisatie naar Renilla luciferaseactiviteit (De waarden geven het gemiddelde ± SD, n = 3, One-way ANOVA analyse, figuur 3B, F = 283,244, figuur 3C, F = 143,313. *** P <. 0,001)
expressie van miR-645 en IFIT2 zijn negatief gerelateerd in AGEJ klinische monsters Belgique Om de relatie tussen miR-645 en IFIT2 verder te beoordelen, onderzochten we de IFIT2 expressie in 43 AGEJ klinische monsters met behulp van qRT-PCR . Het bleek AGEJ weefsels hadden een opmerkelijk lagere expressie niveau van IFIT2 dan de gepaarde niet-kwaadaardige weefsels (Figuur 4A), en IFIT2 expressie werd omgekeerd gecorreleerd met de grootte van de tumor (figuur 4B, P =
0,0304). Namelijk tumorgrootte groter dan of gelijk aan 5 cm groep toonde significant neerwaarts gereguleerd IFIT2 expressie tegen tumor kleiner dan 5 cm groep. De gegevens te valideren we vervolgens gemeten eiwitexpressie van IFIT2 met behulp van western blotting (Figuur 4C a-b), en de resultaten toonden een soortgelijk patroon als de opmerkingen gevonden qRT-PCR. Immunohistochemie assay vertoonden een significant verlaagde expressie van IFIT2 in AGEJ weefsels gepaarde niet-kwaadaardige weefsels (figuur 4D a-b, P <
0,001). Vervolgens analyseerden we de relatie tussen miR-645 en IFIT2 meningsuiting en vond dat IFIT2 expressie negatief gecorreleerd was met die van miR-645 (Figuur 4E, P <
0,01). Bovendien SGC7901 (figuur 4F a) en BGC-823 (Figuur 4F b) cellen die met miR-645-remmer zijn aanzienlijk gestegen IFIT2 expressie aan het eiwit en mRNA-niveaus in vergelijking met mock en NC groepen (Figuur 4F ab, P <
0,01). Onze bevindingen wijzen erop dat miR-645 direct de expressie van IFIT2 kan reguleren. Figuur 4 Expressie van miR-645 en IFIT2 negatief correleren in AGEJ klinische monsters en IFIT2 werd down-gereguleerd in AGEJ weefsels in vergelijking met gepaarde non-kankerweefsel. A. Expressie van IFIT2 Kopen en miR-645 in AGEJ klinische monsters werden geanalyseerd met behulp van kwantitatieve PCR. B. vergelijking van de relatieve expressie van IFIT2
in menselijke AGEJ klinische monsters van verschillende grootte van de tumor. (T
-test, * p < 0,05). C. Expressie van IFIT2 onderzocht door western blotting (a, b: de waarden geven het gemiddelde ± SD, genormaliseerd op tubuline, n = 3, t-test
, *** p
< 0,001) D. een. Representatieve beelden getoond zijn positieve immunohistochemische kleuring van IFIT2 in menselijke specimens AGEJ en afgestemd aangrenzende normale weefsels (vergroting 200 ×). b. Kleuring scores van IFIT2 (t
-test, *** p Restaurant < 0,001). E. Scatter plots met de negatieve lineaire correlatie tussen de mRNA expressie van IFIT2
en die van miR-645 in 43 AGEJ klinische monsters. F. IFIT2 en IFIT2
expressie gemeten door western blotting in SGC7901 (a) en BGC-823 cellen (b). (De waarden geven het gemiddelde ± SD, n = 3, One-way ANOVA analyse, *** p Restaurant < 0,001)
IFIT2 bemiddelt de functie van miR-645 door het bevorderen van SGC7901 en BGC-823 cellen. apoptose
Om te bevestigen dat de inductie van cel apoptose in SGC7901 en BGC-823 cellen door miR-645 werd bemiddeld door zich te richten IFIT2
, voerden we IFIT2
plasmide transfectie in SGC7901 (figuur 5A) en BGC-823 (Figuur 5B) cellen te reguleren de expressie van IFIT2. Western blotting en kwantitatieve PCR toonde aan dat up-regulatie van IFIT2 door IFIT2
plasmide transfectie significant door miR-645 bootst kon worden verlaagd. MTT assay toonde dat cellen die met plasmide-IFIT2 proliferatie onderdrukt echter cellen die met miR-645 bootst proliferatie aanzienlijk gestegen vergeleken met plasmide-controle en plasmide-IFIT2 + miR-645 groepen (Figuur 5C ab, P <
0,001). Bovendien invoering van IFIT2 bevorderde apoptose van SGC7901 en BGC-cellen 823 en miR-645 bootst verminderde apoptose van cellen geïnduceerd door IFIT2 opregulatie tegenover NC, in aanwezigheid van ADR (figuur 5E-F, P <
0,001). Onze bevindingen gesuggereerd dat IFIT2 bemiddelde de functie van miR-645 in het remmen SGC7901 en BGC-823 cellen proliferatie en het induceren van apoptose. Figuur 5 IFIT2 bemiddelt de functie van miR-645 door het bevorderen van GC cel apoptose. A & B. Expressie van IFIT2 onderzocht door western blotting (A:. SGC7901; B, BGC-823 a, genormaliseerd naar tubuline, de waarden geven het gemiddelde ± SD, One-Way ANOVA analyse, voor SGC7901, F = 189,307, voor BGC-823, F = 85,374; b, de waarden geven het gemiddelde ± SD, One-Way ANOVA analyse, voor SGC7901, F = 85,374, voor BGC-823, F = 219,921; *** p Restaurant < 0,001). C. SGC7901 (a) en BGC-823 (b) cellen blootgesteld aan MTT-bepaling per dag gedurende 6 dagen (de waarden geven het gemiddelde ± SD, twee-weg ANOVA analyse voor SGC7901, F = 13,768, voor BGC-823, F = 16,409, *** p Restaurant < 0,001). D &E. SGC7901 (D) en BGC-823 (E) cellen werden verzameld voor FACS analyse na 72 uur in aanwezigheid van ADR (0,05 ug /ml) (de waarden geven het gemiddelde ± SD, n = 3, One-Way ANOVA analyse; voor SGC7901, F = 361,749, voor BGC-823, F = 229,952; *** p
. < 0,001)
Uitputting en up-regulatie van miR-645 veranderde de caspase-3/7-activiteit
IFIT2 is gerapporteerd een tumor suppressor via bemiddelen apoptose door middel van activerende caspase-3/7-activiteit. Caspase-Glo 3/7 assay toonde dat miR-645 depletie aanzienlijk opgereguleerd, terwijl miR-645 overexpressie down- gereguleerd de caspase-3/7-activiteit vergeleken met mock en NC-groepen in aanwezigheid van ADR (0,2 ug /ml) (Figuur 6A en B, P <
0,001) of het serum honger conditie (figuur 6C en D, P <
0,001). Deze resultaten in combinatie met de opmerkingen hierboven vermeld suggereerden dat miR-645, up-gereguleerd in menselijke AGEJ weefsels, geremd cel apoptose en bevordert tumorigeniciteitscontroles via het onderdrukken van caspase-3/7-activiteit door zich te richten IFIT2. Figuur 6 Caspase-3/7-activiteit. Anti-apoptotische vermogen van SGC7901 cellen en BGC 823-cellen na blootstelling aan ADR (0,2 ug /ml) of serum uithongering werd geëvalueerd door caspases-3/7-activiteit. A & C, SGC7901 cellen; B & D, BGC-823 cellen. (De waarden geven de gemiddelde ± SD, n = 3, One-Way ANOVA analyse, want A, F = 183,930, voor B, F = 1093,797, want C, F = 1.861,50, voor D, F = 1483,604, *** p
. < 0,001)
Discussie en conclusies
Hoewel het verzamelen van bewijzen hebben aangetoond dat miRNAs deregulering is betrokken bij de tumor kanker, progressie, migratie en invasie [41], metastase [42, 43] en multidrug resistance [44-46]. Er is weinig bekend over de rol van miRNAs in de ontwikkeling van adencarcinoma van maag-slokdarm overgang (AGEJ). Hier toonden we aan dat miR-645 expressie aanzienlijk AGEJ klinische monsters werd verhoogd vergeleken met gekoppelde niet-kankerachtige weefsels en was significant opgereguleerd in twee maagkanker (GC) cellijnen, SGC7901 en BGC-823, die gebruikt werden alternatieve cell modellen omdat er geen beschikbaar AGEJ cellijnen werden opgericht tot nu toe. Remming van miR-645 in SGC7901 en BGC-823-cellen geïnduceerde apoptose significant van SGC7901 en BGC-823 cellen in de toestand van serumuithongering of chemotherapeutisch geneesmiddel door opreguleren IFIT2
een mediator van apoptose, met een mogelijke bindingsplaats voor miR-645 in het haar mRNA 3'UTR. Het expressiepatroon van miR-645 en IFIT2 in SGC7901 en BGC-823 cellen en klinische monsters waren negatief gecorreleerd, verder suggereert dat IFIT2
een doelgen van miR-645. Bovendien remming van miR-645 resulteert in verhoogde caspase-3/7-activiteit, die wordt geactiveerd door IFIT2. Al deze bevindingen suggereren een fundamentele rol van miR-645 in carcinogenese, met name bij de ontwikkeling van AGEJ.
Te weinig apoptose een belangrijke oorzaak van kanker omdat maligne cellen dood opvallend verminderd [47, 48], waardoor maligne transformatie van de betrokken cellen, tumormetastase en multidrug resistentie van kankercellen. Daarom apoptose is van groot belang bij de behandeling van kanker en is een populair doelwit van vele behandelingsstrategieën. In deze studie hebben we aangetoond dat miR-645 verminderde kankercellen te ontbering geïnduceerde apoptose serum, terwijl de uitputting van miR-645 dit effect van miR-645 tegengewerkt, wat suggereert dat miR-645 een cruciale rol kunnen spelen in de aanpassing van kanker cellen te lage voeding. Steeds miRNAs zijn betrokken bij de kankercel apoptose. Aan de ene kant kan microRNA functioneren als tumorsuppressor via induceren van apoptose, d.w.z. miR-421, die celproliferatie en apoptose induceert in humane weerstand nasofarynxcarcinoom via downregulatie van FOXO4 [49]; miR-149, dat apoptose induceert door remming Akt1 en E2F1 in menselijke kankercellen [50] en miRNA-31, die apoptose in humane neuroblastoma cellen [51] induceert. Aan de andere kant kan microRNA functioneren als oncogenen door het onderdrukken van apoptose, d.w.z. miR-24, die apoptose remt en onderdrukt Bim in muizen cardiomyocyten [52]; miR-886-5p die apoptose remt beneden reguleren Bax expressie in humane cervicale carcinoomcellen [53] en miR-183, die TGF-β1-geïnduceerde apoptose inhibeert door downregulatie van PDCD4 in humane hepatocellulaire carcinoomcellen [54] .
ISGs, IFN gestimuleerd genen, verwijzen naar genen die tanscribed door IFN inductie. Hiervan kunnen 4 belangrijke rollen die zowel de remming van virale replicatie en remming van cellulaire proliferatie [55, 56] invloed spelen. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• Proteoomanalyse van menselijke maag cardia adenocarcinoom door laser capture microdissectie
• Therapeutisch potentieel van PRL-3 targeting en klinische betekenis van PRL-3 genoomamplificatie bij maagkanker