MicroRNA-645, up-regolati in adencarcinoma umana di gastrico giunzione esofageo, inibisce l'apoptosi di mira soppressore del tumore IFIT2

MicroRNA-645, up-regolato in adencarcinoma umana di gastrico giunzione esofageo, inibisce l'apoptosi di mira soppressore del tumore IFIT2
Abstract
Sfondo
un numero crescente di evidenze indica che miRNA hanno un ruolo critico nella cancerogenesi e progressione del cancro; Tuttavia, il ruolo dei miRNA nella tumorigenesi del adencarcinoma di giunzione gastrico esofageo (AGEJ) rimane in gran parte poco chiara.
Metodi
Il SGC7901 e BGC-823 linee di cellule di cancro gastrico sono stati utilizzati. Le espressioni di miR-645 e IFIT2 (proteina interferone-indotta con tetratricopeptide ripete 2) sono stati esaminati da qRT-PCR, le espressioni di IFIT2 è stata esaminata mediante western blotting e test di immunoistochimica. L'apoptosi è stata determinata mediante FACS. Mir-645 inibitore, imita e trasfezioni plasmide-IFIT2 sono stati eseguiti per studiare la in perdita e il guadagno funzione. attività di caspasi-3/7 è stata esaminata mediante saggio di caspasi-3/7.
risultati
In questo studio, abbiamo riportato una aumentata espressione di miR-645 in campioni clinici AGEJ rispetto ai tessuti non tumorali appaiati. Abbiamo anche osservato una significativa miR-645 up-regulation in due linee cellulari di cancro gastrico (GC), SGC7901 e BGC-823, che sono stati utilizzati come modelli cellulari perché non c'erano linee cellulari AGEJ disponibili su cui fino ad oggi. Abbiamo scoperto che l'inibizione di miR-645 potrebbe sensibilizzare notevolmente SGC7901 e BGC-823 cellule sia starvation- siero e chemioterapici apoptosi indotta da farmaci da up-regolazione IFIT2, un mediatore dell'apoptosi mitocondriale attraverso un sentiero, con un potenziale sito di legame per miR -645 nel 3'UTR del suo mRNA. Ulteriori indagini esposto che l'espressione IFIT2 diminuisce in SGC7901 e BGC-823 cellule e dei tessuti AGEJ. IFIT2
espressione ectopica conduce alla promozione dell'apoptosi cellulare, indicando che IFIT2 può funzionare come un soppressore nello sviluppo di AGEJ. Inoltre, l'inibizione di miR-645 induce up-regolazione di IFIT2 e una maggiore attività della caspasi-3/7 rispetto ai gruppi di controllo.
Conclusioni
nostri dati suggeriscono che miR-645 funziona come un oncogene in AGEJ umana, a almeno in parte attraverso, il targeting IFIT2
.
Parole
Adencarcinoma di gastrico giunzione esofago microRNA-645 IFIT2 apoptosi Sfondo
recenti studi hanno suggerito che adencarcinoma di giunzione gastrico esofageo (AGEJ) è distinta da quella di distale stomaco, con diversi fattori di rischio, le caratteristiche del tumore, e comportamento biologico [1-4]. Inoltre, l'incidenza di AGEJ è andata aumentando nel corso degli ultimi 30 anni, soprattutto in Stati Uniti e Cina del nord [5-9].
MicroRNA (miRNA) sono un gruppo di endogeno espresso, non codificante piccoli RNA, 20- 25 nucleotidi di lunghezza, che sono noti per regolare negativamente l'espressione genica attraverso la soppressione di traduzione o diminuendo la stabilità di mRNA da direttamente vincolanti per la regione 3'-non tradotta (3'-UTR) del mRNA bersaglio [10, 11]. Accumulando prove indicano che i miRNA hanno un ruolo importante nella regolazione dei processi fisiologici e patologici, tra cui lo sviluppo [12], il metabolismo [13], la proliferazione cellulare [14], la differenziazione [15] e l'apoptosi [16]. Inoltre, aberranti regolazione post-trascrizionale di mRNA da miRNA è correlata con tumorigenesi [17, 18]. I profili di espressione anormale di miRNA sono stati segnalati per essere rilevato in vari tipi di tumori umani tra cui polmone [19], della mammella [20], della prostata [21], il fegato [18], del colon [22] e cancro gastrico [23]. Inoltre, alcune miRNA possono agire come oncogeni [24-26] o supressors tumorali [27, 28] regolando l'espressione dei loro geni bersaglio che hanno ruoli importanti in alcuni percorsi chiave coinvolti nella progressione del ciclo cellulare, apoptosi o proliferazione. miRNA down-regolato nei campioni tumorali, come miR-22 [29, 30], miR-101 [31, 32], e miR-7 [33, 34] di solito funzionano come miRNA soppressivi, mentre miRNA upregulated in campioni di tumore, come miR-17 [35, 36], e miR-21 [37, 38] di solito esercitano ruoli oncogenici. Questi studi suggeriscono che la disregolazione dei miRNA è spesso coinvolto nella carcinogenesi e nella progressione del cancro.
Un recente studio ha indicato che miR-645 può esercitare il ruolo soppressore tumorale nel carcinoma ovarico in stadio avanzato sierose per miR-645 è negativamente associata con la sopravvivenza globale di essa [39]. Nel presente studio, abbiamo scoperto che l'espressione di miR-645 è risultato significativamente aumentato nei campioni clinici AGEJ rispetto ai tessuti non tumorali appaiati utilizzando chip microRNA. Tuttavia, il ruolo di miR-645 nella tumorigenesi di AGEJ non è stato ancora studiato. Ulteriori studi hanno dimostrato che miR-645 è stato anche significativamente up-regolati in due linee cellulari di cancro gastrico (GC), SGC7901 e BGC-823, che sono stati utilizzati come modelli cellulari alternative nel presente studio. L'inibizione del miR-645 in SGC7901 e BGC-823 cellule significativamente soppressa l'apoptosi delle SGC7901 e BGC-823 cellule in condizione di fame siero o farmaco chemioterapico con up-regolazione IFIT2, un mediatore di apoptosi, con un potenziale sito di legame per miR -645 nel 3'UTR del suo mRNA. Il pattern di espressione di miR-645 e IFIT2 in campioni clinici AGEJ erano correlati negativamente, inoltre suggerendo che IFIT2
è un gene bersaglio di miR-645. Inoltre, l'inibizione di miR-645 risultati in aumento caspasi-3/7 attività, che viene attivato da IFIT2. In questo studio, abbiamo studiato se miR-645 è up-regolato in adencarcinoma umana di giunzione gastrico esofagea e inibisce l'apoptosi di mira soppressore tumorale IFIT2.
Metodi
etica dichiarazione
Per campioni di tessuto, il consenso informato scritto è stato ottenuti da pazienti. Le procedure utilizzate in questo studio sono stati approvati dal Institutional Review Board dell'Università di Henan della scienza e della tecnologia ed è stato conformi alla Dichiarazione di Helsinki e alla legislazione locale. Linee
cellulari e condizioni di coltura
linee di cellule di cancro gastrico SGC -7901, BGC-823 e immortalata normale linea di cellule epiteliali gastriche, GES-1 sono stati gentilmente conferito dal Prof. Daiming Fan. Tutte le linee cellulari sono state mantenute in nostro istituto secondo i protocolli consigliati. Le cellule sono state coltivate in RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a 37 ° C in un incubatore di CO2 del 5%.
campioni umani in tutte le nazioni procedure sperimentali sono state approvate dal Institutional Review Board dell'Università di Henan della Scienza e della Tecnologia. consenso informato scritto è stato ottenuto per tutti i campioni dei pazienti. esemplari AGEJ umani (n = 43) e pazienti abbinato campioni non cancerose sono stati ottenuti da pazienti al primo ospedale affiliato, Henan Università della Scienza e della Tecnologia, con il consenso informato da ciascun paziente. purificazione
di RNA, la sintesi del DNA, e quantitativa real-time PCR (qRT-PCR)
RNA totale di cellule in coltura è stato estratto con il reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) secondo il protocollo del produttore e RNA sono stati conservati a -80 ° C prima di qRT-PCR . espressione matura miR-645 è stato rilevato utilizzando un TM qRT-PCR miRNA Detection Kit Mirvana (Ambion Inc. Austin, Texas), con U6 come controllo interno. espressione IFIT2 è stato rilevato con primer F: 5'AGCGAAGGTGTGCTTTGAGA 3 ', R: 5'GAGGGTCAATGGCGTTCTGA3' (lunghezza del prodotto: 125 bp; Tm: 60 ° C; GC%: F-50%, R-55%; start-end: 643-748 bp) e GAPDH è stato utilizzato come controllo interno. I prodotti di PCR sono stati separati su un gel di agarosio 1,5% bromuro-macchiato etidio e visualizzati con UV.
Cellulare trasfezione
L'uomo miR-645 duplex Agomir (400 Nm), antagomir (400 Nm) e il controllo negativo sono stati progettati e fornito da Ribobio (Guangzhou, Guangdong, Cina). Plasmidi-IFIT2 e le plamid controllo negativo sono stati acquistati da Ribobio Inc (Guangzhou, Guangdong, Cina): miRNA bersaglio previsione
Per trovare potenziali geni bersaglio miRNA, sito TargetScanHuman (http:.. //Www TargetScan. org /) è stata utilizzata, l'energia libera di legame è stato calcolato e siti biding sono stati analizzati utilizzando http:.... //bibiserv techfak uni-Bielefeld de /sito web rnahybrid
costrutti vettoriali e reporter luciferasi saggio
Per costruire IFIT2-3'UTR plasmide, un wild-type 3'-UTR frammento di umana IFIT2 mRNA (1226-1233 nt, GenBank adesione n. NM_001547.4) contenente il putativa sequenza di legame miR-645 è stato amplificato mediante RT-PCR e clonato nel sito tra Xho I e Not I a valle del gene reporter luciferasi del vettore psiCHECK ™ (Promega, USA). Un mutante del singolo miR-645 sito di legame (5'-AGCCTAG -3 'a 5'-TCGGATC -3') nel 3'-UTR di IFIT2 è stato incluso dalla mutagenesi sito-diretta kit (SBS Genetech, Pechino, Cina ). tipi selvatici e mutanti di vettori pmirGLO-IFIT2-UTR sono stati convalidati dal sequenziamento del DNA
Le sequenze nucleotidiche di primer per IFIT2-3'UTR (WT) clone:.
IFIT2XhoIF2:. 5'CCGCTCGAG AGAATAGAGATGTGGTGCCCACTAGGCTACTGCTG 3 '
IFIT2NotIR2: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TTAAAATGGAATCAGTGACTTTTATTTCTCATAACAGAG 3 '
Le sequenze nucleotidiche di primer per IFIT2-3'UTR (MT) clone:.
mutIFIT2F2: 5'TTCTAGGTAGATGCTGAATTCGGATCACATCAAAGTTGGTGTGAAC 3'.
mutIFIT2R2: 5'GTTCACACCAACTTTGATGTGATCCGAATTCAAGEJTCTACCTAGAA 3 ' .
cellule sono state trasfettate con i miR-645 imita, NC e pmirGLO plasmide in piastre da 24 pozzetti utilizzando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) secondo le istruzioni. 48 ore più tardi, le cellule sono state raccolte e analizzate per l'attività della luciferasi utilizzando il Dual-reporter luciferasi sistema di analisi (Promega, USA) e rilevati dal sistema di rilevazione GloMaxTM 20/20 (E5331, Promega).
Caspasi-3/7 test
l'attività della caspasi-3 e caspasi-7 è stato rilevato in formato a 96 pozzetti (2 × 10 3 cellule /pozzetto) utilizzando la caspasi-Glo 3/7 Assay (Promega) secondo le istruzioni. 100 l Caspase-Glo 3/7 reagente sono state integrate in tutti i pozzetti e quindi incubate a temperatura ambiente per 1 h follwong la luminescenza è stato rilevato utilizzando il lettore di micropiastre a fluorescenza M200 (Tecan). La luminescenza fondo associati a coltura cellulare e il dosaggio dei reagenti (reazione vuoto) è stato sottratto dal valore sperimentale.
Saggio MTT
cellule sono state trasfettate con 100 nM miR-645 inibitore (Genepharma, Shanghai, Cina), imita (Ribobio Inc ., Guangzhou, Guangdong, Cina) o 100 nM plamid-IFIT2 (Ribobio Inc., Cina). Ventiquattro dopo, le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti (2 × 10 3 /pozzetto). La vitalità delle cellule è stato esaminato da MTT (3-2, 5-difenil tetrazolio bromuro) test (Sigma, USA) secondo le istruzioni al momento designato.
Western blotting
proteina totale da cellule in coltura sono stati lisati da Lysis Buffer contenente PMSF sul ghiaccio. Poi proteine ​​erano elettroforesi a 12% gel di SDS poliacrilammide e sono stati poi trasferiti su una membrana PVDF (Millipore). Le membrane sono state bloccate con 5% non grasso di latte in polvere a temperatura ambiente per 1 h ed incubate overnight con anticorpi primari. Le membrane sono state incubate con anticorpi secondari marcati con HRP per 1 ora a temperatura ambiente dopo tre 10 min lavaggi in TBS-T (soluzione salina triethanolaminebuffered con Tween). Infine, i segnali sono stati rilevati utilizzando il kit ECL (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) e le membrane sono stati digitalizzati e analizzati utilizzando un sistema di imaging + Bio-Rad ChemiDoc XRS con software di imaging (quantità versione 1). L'espressione della proteina è stata normalizzata ad un riferimento endogena (tubulina) e rispetto al controllo. Il multicolore scala proteina vasta gamma Spectra (Fermentas) è stato utilizzato come marcatore molecolare. Tutti gli anticorpi utilizzati nel test western blot sono elencati nel file aggiuntive 1: Tabella S1
immunoistochimica e immunoistochimica per segnare
sezioni in paraffina, 4 micron di spessore, sono stati cotti per 2 ore a 65 ° C e deparaffinate.. Antigen recupero è stata effettuata utilizzando tampone sodio citrato (pH 7,2) a 95 ° C per 15 minuti e poi vetrini sono stati raffreddati a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo il trattamento con perossido di idrogeno al 3% per 15 minuti per bloccare la perossidasi endogena, le sezioni sono state trattate con siero normale di capra liquido confinamento per 30 minuti per ridurre il legame e quindi policlonale di coniglio anti-IFIT2 (1 non specifico: 500, HPA003408, Sigma-Aldrich. Shanghai, Cina) è stato incubato sezioni per 12 ore a 4 ° C. Dopo il riscaldamento per 1 ora e lavaggio per 5 volte, le sezioni sono state incubate con anticorpo secondario per 30 minuti a temperatura ambiente. Diaminobenzidina (DAB) è stato utilizzato per le reazioni di colore. La successiva colorazione immunoistochimica è stato segnato come descritto in precedenza L'analisi statistica dei dati
[40].
Sono stati espressi come media ± SD di tre esperimenti indipendenti. Per i test statistici, SPSS pacchetto software statistico, version17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) è stato utilizzato. t di Student
-test, il senso unico ANOVA e due vie di test ANOVA sono stati eseguiti per la densità di banda relativa del western blotting e valori di MTT OD. La correlazione tra miR-645 e IFIT2 è stata analizzata con la correlazione di Spearman. P valori. ≪ 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi
Risultati
Espressioni di miR-645 sono up-regolati in campioni clinici AGEJ
per valutare il ruolo di miR-645 nella tumorigenesi del AGEJ, in primo luogo abbiamo usato qRT - PCR per misurare miR-645 espressione di 43 tessuti clinici AGEJ umani, e ha scoperto che miR-645 è risultato significativamente up-regolata nei tessuti clinici AGEJ rispetto ai tessuti del paziente abbinato gastrici cardiaci non-cancerose (Figura 1A). Per ottenere ulteriori approfondimenti l'osservazione di cui sopra, abbiamo esaminato la relazione tra l'espressione di miR-645 e pazienti parametri clinici. L'analisi ha dimostrato che l'espressione di miR-645 era irrilevante con l'età, il sesso, la differenziazione del tumore, linfonodi metastasi e stadio TNM (Tabella 1: La relazione tra i parametri clinici e miR-645 espressione primaria adenocarcinoma cardias), ma era in una correlazione positiva con la dimensione del tumore, vale a dire, le dimensioni del tumore maggiore o uguale al gruppo 5 cm mostrato una significativa maggiore espressione di miR-645 rispetto alle dimensioni del tumore inferiore a 5 cm di gruppo (Figura 1B & Tabella 1, t-test
, * p
= 0,045). Figura 1 Espressioni di miR-645 sono up-regolati in campioni clinici AGEJ. A. espressione di miR-645 in campioni clinici 43 AGEJ umana relativi ai tessuti adiacenti accoppiati normali umani gastrici cardiaci non cancerose, è stato misurato mediante RT-PCR (I valori indicano la media ± SEM, n = 3, t
-test, * p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001). confronto B. di espressione relativa di miR-645 in campioni clinici AGEJ umano di dimensioni del tumore diverso. (A due code t
-test, * p < 0,05).
Tabella 1 La relazione tra i parametri clinici e l'espressione di miR-645 in primaria adenocarcinoma cardias
parametri clinici
N (%)
Parenti espressione (media ± SEM)
p-value
Età (anni)
≥ 60
15 (50)
2,1286 ± 0,59,201 mila
0,568
< 60
15 (50)
1,9571 ± 0,52,402 mila
genere
Maschio
18 (60)
2,1111 ± 0,42,783 mila
0.462
femminile
12 (40)
2,3333 ± 0,65,328 mila
Dimensioni
≥5
13 (43,3)
2,7385 ± 100128
0,004 *
< 5
17 (56,7)
1,8235 ± 1,52,214 mila
istologica differenziazione
Well (W)
15 (50)
2.138 ± 0,1866 0,9427

scarsamente (P)
15 (50)
2.198 ± 0,1903
linfatico metastasi
Si
12 (40)
2,4583 ± 0,77,864 mila
< 0,001 **
No
18 (60)
1,4944 ± 1,36,273 mila
stadio TNM
fase I /II
16 (53,3)
2,9125 ± 1,33,66 mila
< 0,001 **
stadio III /IV
14 (46,7)
1,4857 ± 0,73,991 mila
(* p <
0,05; ** P. ≪
0.001)
Depletion di miR-645 promuove l'apoptosi delle cellule di cancro gastrico
per studiare il ruolo di miR-645 nelle caratteristiche fenotipiche della progressione AGEJ, abbiamo utilizzato due cancro gastrico ( linee cellulari GC), SGC7901 e BGC-823 come modelli cellulari. risultati qRT-PCR hanno dimostrato che miR-645 espressione era significativamente up-regolata rispetto a linea di cellule GC immortalato, GES-1 (sui file 2: Figura S1, P
< 0,001).
SGC7901 e BGC-823 le cellule sono state trasfettate con miR-645 imita, inibitore, finto transfettate, o miR-NC. Come mostrato nella Figura 2A e D, risultati quantitativi RT-PCR dimostrano che l'espressione di retrovisori 645 imita o inibitori significativamente up-regolare o down-regolare rispettivamente il livello di espressione di miR-645, in SGC7901 e BGC-823 cellule dal primo al quinto posto giorno trasfezione (Figura 2A, P
< 0,001; figura 2D, P
< 0,001) rispetto ai controlli NC e finte. Figura 2 L'esaurimento delle miR-645 promuove l'apoptosi delle cellule del cancro gastrico (GC). A & D. Il livello di miR-645 è stata misurata mediante PCR quantitativa in tempo designato (One-way analisi ANOVA, i valori indicano la media ± SD, figura 2A, F = 426,588, P < 0,001; figura 2D, F = 685,026, P <0,001). B & E. cellule GC trasfettate con miR-645 imita e inibitore sottoposti a test MTT al giorno per 6 giorni (a due vie di analisi ANOVA, Figura 2b, F = 52.602, p < 0,001; figura 2E, F = 42,847, p < 0,001). C & F. cellule cellule GC trasfettate con miR-645 imita e inibitori sono stati raccolti per l'analisi FACS dopo 72 h (I valori indicano la media ± DS, n = 3, a una via di analisi ANOVA, Figura 2C-a, F = 121,600, p < 0.001; Figura 2C-B, F = 250,400, p < 0,001; Figura Fa, F = 194,815, p < 0,001; Figura 2F-B, F = 412,741, p < 0,001)
SGC7901 e BGC-. 823 cellule trasfettate con miR-645 inibitori e imita mostravano livelli significativamente inferiori e superiori di proliferazione cellulare, rispettivamente confronto con NC o gruppi finti in presenza di ADR (0,2 mcg /ml), come determinato mediante saggio MTT (Figura 2B, P
< 0,001; figura 2E, P
< 0,001)
saggio Anniex Vapoptosis esposto significativo aumento e diminuzione i tassi di apoptosi delle miR-645 esaurimento e gruppi di espressione ectopica rispetto ai gruppi di controllo numerico nel siero-libero. condizione o in presenza di farmaco antitumorale, adriamicina (ADR) (Figura 2C ab, P
< 0,001; Figura 2 F ab, P
< 0,001)
. IFIT2 è un bersaglio di miR-645
dati precedenti suggeriscono che miR-645 potrebbe essere un oncogene del carcinoma ovarico avanzato sierose. Così abbiamo cercato ulteriormente per i potenziali bersagli di miR-645 per l'algoritmo di Target Scan umana. Tra questi, IFIT2, un soppressore del tumore, è stato trovato per avere putativo miR-645 siti di legame nel suo 3'UTR (Figura 3A). Poi abbiamo eseguito saggio giornalista luciferasi utilizzando cellule SGC7901 e BGC-823 per verificare se IFIT2 era un bersaglio diretto di miR-645. Wild-type e mutante IFIT2-3'UTR che contiene il sito di legame putativo di miR-645 sono stati clonati in psiCHECK-2 vettore a valle gene della luciferasi (sui file 3: Figura S2). Introduzione del miR-645 ha ridotto l'attività lucirferase dal giornalista vettore IFIT2 3'UTR in modo significativo (Figura 3B, P
< 0,001; Figura 3C, P
< 0,001), ma non ha influenzato l'attività lucirferase da il mutante IFIT2 3'UTR giornalista vettore, sostenendo l'interazione diretta del miR-645 con IFIT2. Questi risultati suggeriscono inoltre che miR-645 può sopprimere l'espressione IFIT2 di mira il 3'-UTR di IFIT2 mRNA. Figura 3 Convalida i siti di legame previsti tra miR-645 e IFIT2. A. Lo schema mostra il costrutto di Luc-IFIT2 3'UTR e Luc-IFIT2 3'Mut UTR. Entrambi Luc-IFIT2 3'UTR e Luc-IFIT2 3'Mut UTR sono stati clonati in un plasmide pmirGLO a valle della luciferasi di lucciola regione codificante tra i siti PMEI e XbaI. B & C. SGC7901 cellule (B) o BGC-823 cellule (C) sono state co-trasfettate con i psiCHECK-2 costrutti contenenti sia IFIT2 3'UTR o IFIT2 3'Mut UTR e sia l'inibitore di miR-645 o il miR-645 imita per 48 h. I valori indicano l'attività della luciferasi relativa dopo la normalizzazione all'attività luciferasi Renilla (I valori indicano la media ± DS, n = 3, a una via di analisi ANOVA, figura 3B, F = 283,244, Figura 3C, F = 143,313. *** P <. 0,001)
espressione di miR-645 e IFIT2 sono negativamente correlata in campioni clinici AGEJ
Per valutare ulteriormente la relazione tra miR-645 e IFIT2, abbiamo esaminato l'espressione IFIT2 in campioni clinici 43 AGEJ tramite qRT-PCR . E 'stato trovato tessuti AGEJ ha avuto un notevole livello di espressione inferiore IFIT2 rispetto ai tessuti non-cancerose appaiati (Figura 4A), e l'espressione IFIT2 era inversamente correlato con la dimensione del tumore (Figura 4B, p = 0,0304
). Vale a dire, le dimensioni del tumore maggiore o uguale a 5 cm gruppo ha mostrato una significativa down-regolato espressione IFIT2 rispetto alle dimensioni del tumore inferiore a 5 cm di gruppo. Per convalidare i dati, abbiamo poi misurato l'espressione della proteina di IFIT2 utilizzando western blotting (Figura 4C A-B), ed i risultati hanno mostrato un andamento simile alle osservazioni trovate da qRT-PCR. analisi immunoistochimica mostrato una significativa diminuzione espressione di IFIT2 nei tessuti accoppiati AGEJ tessuti non-cancerose (Figura 4D A-B, P <
0,001). Poi abbiamo analizzato la relazione tra miR-645 e IFIT2 espressione e ha scoperto che il livello di espressione IFIT2 era correlata negativamente con quello di miR-645 (Figura 4E, P <
0,01). Inoltre, le cellule SGC7901 (Figura 4F a) e BGC-823 (Figura 4F b) trasfettate con miR-645 inibitore hanno notevolmente aumentato l'espressione IFIT2 in proteine ​​e livelli di mRNA rispetto alle finte e NC gruppi (Figura 4F ab, P <
0.01). I nostri risultati indicano che miR-645 può disciplinare direttamente l'espressione di IFIT2. Figura 4 L'espressione di miR-645 e IFIT2 correla negativamente in campioni clinici AGEJ e IFIT2 è stato down-regolato nei tessuti AGEJ rispetto ai tessuti non tumorali appaiati. A. L'espressione di IFIT2
e miR-645 in campioni clinici AGEJ sono stati analizzati mediante PCR quantitativa. B. confronto di espressione relativa di IFIT2
in campioni clinici AGEJ umani delle dimensioni del tumore diverso. (T-test
, * p < 0,05). C. L'espressione di IFIT2 esaminato dal western blotting (a, b: i valori indicano la media ± SD, normalizzato alla tubulina, n = 3, t-test
, *** p
< 0,001) D. un. Immagini rappresentative mostrate sono colorazione immunoistochimica positiva del IFIT2 in campioni AGEJ umani e abbinati tessuti sani adiacenti (ingrandimento 200 ×). b. Colorazione decine di IFIT2 (t
-test, p *** Hotel < 0,001). trame E. Scatter che mostrano la correlazione lineare negativa tra l'espressione di mRNA di IFIT2
e quello di miR-645 in campioni clinici 43 AGEJ. espressione F. IFIT2 e IFIT2
misurata mediante western blotting in SGC7901 (a) e BGC-823 cellule (b). (I valori indicano la media ± DS, n = 3, a una via di analisi ANOVA, p *** Hotel < 0,001)
IFIT2 media la funzione del miR-645 attraverso la promozione SGC7901 e BGC-823 cellule. apoptosi
Per confermare che l'induzione di apoptosi delle cellule in SGC7901 e BGC-823 cellule per miR-645 è stata mediata di mira IFIT2
, abbiamo eseguito IFIT2
plasmide trasfezione in SGC7901 (Figura 5A) e BGC-823 (Figura 5B) celle a up-regolare l'espressione di IFIT2. Western Blotting e PCR quantitativa hanno dimostrato che up-regolazione di IFIT2 da IFIT2
trasfezione plasmide può essere diminuito significativamente da miR-645 imita. saggio MTT ha dimostrato che le cellule transfettate con plasmide-IFIT2 proliferazione è stata soppressa, però, le cellule trasfettate con miR-645 imita la proliferazione aumentata significativamente confrontati con plasmide-controllo e plasmide-IFIT2 + miR-645 gruppi (Figura 5C ab, P <
0,001). Inoltre, l'introduzione di IFIT2 promosso apoptosi SGC7901 e BGC-823 cellule e miR-645 imita ridotta apoptosi delle cellule indotte da IFIT2 up-regolazione rispetto al gruppo NC in presenza di ADR (Figura 5E-F, P <
0,001). I nostri risultati hanno suggerito che IFIT2 mediato la funzione di miR-645 nell'inibire SGC7901 e BGC-823 cellule proliferazione e induce l'apoptosi cellulare. Figura 5 IFIT2 media la funzione del miR-645 attraverso la promozione di apoptosi delle cellule GC. A & B. L'espressione di IFIT2 esaminato dal western blotting (A:. SGC7901, B, BGC-823 a, normalizzato alla tubulina, i valori indicano la media ± DS, analisi One-Way ANOVA, per SGC7901, F = 189,307, per BGC-823, F = 85,374; b, I valori indicano la media ± SD, One-Way ANOVA analisi, per SGC7901, F = 85,374, per BGC-823, F = 219,921; *** p
< 0,001). C. SGC7901 (a) e BGC-823 (b) le cellule sottoposte a saggio MTT giorno per 6 giorni (i valori indicano la media ± SD, due vie ANOVA, per SGC7901, F = 13,768, per BGC-823, F = 16,409, p *** Hotel < 0,001). D & E. SGC7901 (D) e BGC-823 (E) le cellule sono state raccolte per l'analisi FACS dopo 72 h in presenza di ADR (0,05 mg /mL) (i valori indicano la media ± SD, n = 3, unidirezionale analisi ANOVA; per SGC7901, F = 361,749, per BGC-823, F = 229,952; *** p
. < 0,001)
Depletion e up-regolazione di miR-645 alterato l'attività della caspasi-3/7
IFIT2 è stato segnalato per essere un soppressore del tumore tramite mediare l'apoptosi delle cellule attraverso l'attivazione di attività di caspasi-3/7. Caspase-Glo 3/7 test ha dimostrato che miR-645 esaurimento significativamente up-regolato, mentre miR-645 sovraespressione il basso regolata l'attività della caspasi-3/7 rispetto ai gruppi di finte e NC in presenza di ADR (0,2 mg /ml) (Figura 6A e B, P <
0.001) o la condizione di siero di inedia (Figura 6C e D, P <
0,001). Questi risultati combinati con le osservazioni di cui sopra suggeriscono che miR-645, up-regolata nei tessuti AGEJ umani, l'apoptosi delle cellule inibito e promuove tumorigenicità mediante la soppressione della caspasi-3/7 attività di mira IFIT2. Figura 6 caspasi-3/7 attività. capacità anti-apoptotica delle cellule e SGC7901 BGC-823 cellule dopo l'esposizione ad ADR (0,2 mg /ml) o mancanza di siero è stata valutata mediante attività di caspasi-3/7. A & C, SGC7901 cellule; B & D, BGC-823 cellule. (I valori indicano la media ± DS, n = 3, One-Way ANOVA analisi, per A, F = 183,930, per B, F = 1093,797; per C, F = 1861,50, per D, F = 1483,604, *** p
. < 0,001)
Discussione e conclusioni
Anche se l'accumulo di prove hanno dimostrato che la deregolamentazione miRNA è coinvolto con la carcinogenesi del tumore, la progressione, la migrazione e l'invasione [41], metastasi [42, 43] e multidrug resistance [44-46]. Poco si sa circa il ruolo dei miRNA nello sviluppo di adencarcinoma di giunzione esofago gastrico (AGEJ). Qui, abbiamo dimostrato che l'espressione di miR-645 è risultato significativamente aumentato nei campioni clinici AGEJ rispetto ai tessuti non-cancerose appaiati ed era un'alternativa significativamente up-regolati in due linee cellulari di cancro gastrico (GC), SGC7901 e BGC-823, che sono stati utilizzati modelli cellulari perché nessun linee cellulari AGEJ a disposizione sono stati stabiliti fino ad oggi. L'inibizione del miR-645 in SGC7901 e BGC-823 cellule in modo significativo indotto apoptosi delle SGC7901 e BGC-823 cellule in condizione di fame siero o farmaco chemioterapico con up-regolazione IFIT2,
un mediatore dell'apoptosi, con un potenziale sito di legame per miR-645 nel 3'UTR del suo mRNA. Il pattern di espressione di miR-645 e IFIT2 in SGC7901 e BGC-823 cellule e campioni clinici sono stati negativamente correlata, inoltre suggerisce che IFIT2
è un gene bersaglio di miR-645. Inoltre, l'inibizione di miR-645 risultati in aumento caspasi-3/7 attività, che viene attivato da IFIT2. Tutti questi risultati suggeriscono un ruolo fondamentale di miR-645 nella carcinogenesi, soprattutto nello sviluppo di AGEJ.
Troppo poco apoptosi è una causa cruciale della carcinogenesi perché le cellule maligne morte si riducono notevolmente [47, 48], con conseguente trasformazione maligna delle cellule colpite, tumore metastasi e resistenza multidrug delle cellule tumorali. Quindi, l'apoptosi è di grande importanza nel trattamento del cancro ed è un obiettivo popolare di molte strategie di trattamento. In questo studio, abbiamo dimostrato che miR-645 cellule tumorali con problemi al siero apoptosi privazione-indotto, mentre la deplezione di miR-645 antagonizzata questo effetto di miR-645, suggerendo che miR-645 può giocare un ruolo cruciale nell'adattamento del cancro celle a basso nutrizione. Un numero crescente di miRNA sono stati implicati nella apoptosi delle cellule tumorali. Da un lato, i microRNA potrebbero funzionare come soppressore del tumore tramite indurre apoptosi, cioè miR-421, che induce la proliferazione cellulare e la resistenza all'apoptosi nel carcinoma nasofaringeo umano tramite down-regulation di FOXO4 [49]; miR-149, che induce l'apoptosi inibendo Akt1 e E2F1 nelle cellule tumorali umane [50] e miRNA-31, che induce apoptosi nelle cellule di neuroblastoma umano [51]. D'altra parte, i microRNA potrebbe funzionare come oncogeni sopprimendo l'apoptosi, cioè miR-24, che inibisce l'apoptosi e reprime Bim in cardiomiociti di topo [52]; miR-886-5p, che inibisce l'apoptosi da espressione Bax down-regolazione nelle cellule di carcinoma della cervice umani [53], e miR-183, che inibisce l'apoptosi TGF-β1-indotta da down-regulation dell'espressione PDCD4 nelle cellule di carcinoma epatocellulare umano [54] .
ISGS, IFN stimolati geni, fare riferimento a geni che sono tanscribed da IFNs induzione. Tra questi, 4 possono svolgere ruoli importanti che influenzano sia l'inibizione della replicazione virale e l'inibizione della proliferazione cellulare [55, 56]. Questi geni possono inibire la replicazione virale sacrificando la cellula attraverso la promozione apoptosi e sopprimere la progressione del cancro tramite inibendo la sopravvivenza delle cellule malignamente trasformato per il bene del paese ospitante [57]. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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