MicroRNA-645, hochreguliert in menschlichen adencarcinoma von Magen-Ösophagus-Kreuzung, hemmt die Apoptose von Tumor-Suppressor-IFIT2 Targeting

MicroRNA-645, hochreguliert in menschlichen adencarcinoma von Magen-Ösophagus-Kreuzung, die Apoptose hemmt durch Tumor-Suppressor-IFIT2
Zusammenfassung
Hintergrund
An immer mehr Beweise Targeting zeigt an, dass miRNAs eine wichtige Rolle bei der Krebsentstehung und Progression von Krebs haben; jedoch die Rolle von miRNAs in der Tumorentstehung von adencarcinoma von Magen-Ösophagus-Kreuzung (AGEJ) bleibt weitgehend unklar.
Methoden
Die SGC7901 und BGC-823 Magenkrebs-Zelllinien verwendet wurden. Die Ausdrücke von miR-645 und IFIT2 (Interferon-induzierte Protein mit tetratricopeptide wiederholt 2) durch qRT-PCR untersucht wurden, sind die Ausdrücke nach IFIT2 wurde durch Western Blotting und Immunhistochemie-Test untersucht. Die Zell-Apoptose wurde durch FACS bestimmt. MiR-645-Inhibitor, imitiert und Plasmid-IFIT2 Transfektionen wurden durchgeführt, die Verlust- und Gewinn-Funktion zu untersuchen. Caspase-3/7 Aktivität untersucht wurde durch Caspase-3/7-Test.
Ergebnisse
In der vorliegenden Studie haben wir eine erhöhte Expression von miR-645 in AGEJ klinischen Proben verglichen mit gepaart nicht kanzerösen Gewebe berichtet. Wir beobachteten auch einen bedeutenden miR-645 Hochregulierung in zwei Magenkrebs (GC) Zelllinien, SGC7901 und BGC-823, die als Zellmodelle verwendet wurden, weil es keine verfügbaren AGEJ Zelllinien bis heute etabliert war. Wir fanden, dass die Hemmung der miR-645 SGC7901 dramatisch sensibilisieren könnte und BGC-823-Zellen sowohl Serum starvation- und chemotherapeutischen Medikamenten-induzierten Apoptose durch Hochregulation IFIT2, einen Mediator der Apoptose über eine mitochondriale Weg, mit einem potentiellen Bindungsstelle für miR -645 in seiner mRNAs 3'UTR. Weitere Untersuchungen zeigten, dass IFIT2 Ausdruck nimmt in SGC7901 und BGC-823-Zellen und AGEJ Gewebe. IFIT2
ektopische Expression führt zur Förderung von Zell-Apoptose, was darauf hinweist, dass IFIT2 als ein Suppressor in der Entwicklung von AGEJ funktionieren. Weiterhin Hemmung von miR-645 induziert Hochregulierung von IFIT2 und erhöhte Caspase-3/7-Aktivität im Vergleich zu Kontrollgruppen.
Schlussfolgerungen
Unsere Daten legen nahe, dass miR-645 funktioniert als ein Onkogen in menschlichen AGEJ durch zumin dest teilweise durch Targeting IFIT2
.
Schlüsselwörter adencarcinoma von Magen-Ösophagus-Kreuzung microRNA-645 IFIT2 Apoptosis hintergrund und Neuere Studien haben vorgeschlagen, dass adencarcinoma von Magen-Ösophagus-Kreuzung (AGEJ) von der distalen unterscheidet Magen, mit verschiedenen Risikofaktoren, Tumoreigenschaften und biologische Verhalten [1-4]. Darüber hinaus hat die Inzidenz von AGEJ wurden in den vergangenen 30 Jahren zugenommen, vor allem in USA und Nordchina [5-9].
MicroRNAs (miRNAs) sind eine Gruppe von endogen exprimiert, nicht-kodierende kleine RNAs, 20- 25 Nukleotiden in der Länge, die bekannt sind, negativ die Genexpression durch Unterdrückung Übersetzung oder Verringern der Stabilität der mRNAs durch direkte Bindung an die 3'-untranslatierte Region (3'-UTR) von Ziel-mRNAs [10, 11] steuern. Beweise Ansammeln zeigt an, dass miRNAs wichtige Rollen bei der Regulierung der physiologischen und pathologischen Prozessen haben, die Entwicklung, einschließlich [12], Metabolismus [13], die Zellproliferation [14], Differenzierung [15] und Apoptose [16]. Zusätzlich wird aberrant post-transkriptionelle Regulation von mRNAs von miRNAs mit tumorigenesis bezogen [17, 18]. Die anomalen Expressionsprofile von miRNAs berichtet wurden in verschiedenen Arten von menschlichen Tumoren wie Lungen- [19], Brust [20], der Prostata [21], der Leber [18], Kolon [22] und Magenkrebs [23] nachgewiesen werden. Darüber hinaus können einige miRNAs als Onkogene wirken [24-26] oder Tumor-Suppressoren [27, 28] durch die Expression ihrer Zielgene regulieren, die in den Zellzyklus, der Apoptose oder die Proliferation beteiligt wichtige Rollen in einigen Schlüsselwege haben. miRNAs herunterreguliert in Tumorproben wie miR-22 [29, 30], miR-101 [31, 32] und miR-7 [33, 34] in der Regel fungieren als suppressive miRNAs, während miRNAs in Tumorproben hochreguliert wie miR-17 [35, 36], und miR-21 [37, 38] in der Regel onkogenen Rollen ausüben. Diese Studien legen nahe, dass eine Fehlregulation der miRNAs häufig in der Karzinogenese und Tumorprogression beteiligt ist.
Eine aktuelle Studie hat gezeigt, dass miR-645 kann den Tumor-Suppressor-Rolle in fortgeschrittenen serösen Ovarialkarzinom für miR-645 ausüben negativ assoziiert mit Gesamtüberleben von es [39]. In der vorliegenden Studie haben wir festgestellt, dass miR-645 Expression in AGEJ klinischen Proben erhöht wurde signifikant im Vergleich mit paarigen nicht kanzerösen Gewebe unter Verwendung von microRNA-Chips. Allerdings hat die Rolle von miR-645 in der Tumorgenese von AGEJ noch nicht untersucht worden. Weitere Studie zeigte, dass miR-645 wurde ebenfalls signifikant hochreguliert in zwei Magenkrebs (GC) Zelllinien, und SGC7901 BGC-823, die als alternative Zellmodelle in der vorliegenden Studie verwendet wurden. Inhibition von miR-645 in SGC7901 und BGC-823-Zellen unterdrückt signifikant die Apoptose von SGC7901 und BGC-823-Zellen in dem Zustand des Serumentzug oder chemotherapeutisches Arzneimittel durch Hochregulieren IFIT2, einen Mediator der Apoptose, mit einem potentiellen Bindungsstelle für miR -645 in seiner mRNAs 3'UTR. Das Expressionsmuster von miR-645 und IFIT2 in AGEJ klinischen Proben wurden negativ korreliert, das weiterhin darauf hindeutet, dass IFIT2
ist ein Zielgen von miR-645. Außerdem Hemmung von miR-645 führt zu einer erhöhten Caspase 3/7-Aktivität, die durch IFIT2 aktiviert wird. In dieser Studie haben wir untersucht, ob miR-645 in der menschlichen adencarcinoma von Magen-Ösophagus-Kreuzung hochreguliert ist und Apoptose hemmt durch Tumorsuppressor IFIT2 Targeting.
Methoden
Ethik Aussage
Für Gewebeproben wurde eine schriftliche Einverständniserklärung von Patienten erhalten. Die Verfahren in dieser Studie verwendet wurden von der Institutional Review Board der Henan University of Science and Technology genehmigt und wurde in der Erklärung von Helsinki und der lokalen Gesetzgebung angepasst.
Zelllinien und Kulturbedingungen
SGC Magenkrebszelllinien -7901, BGC-823 und normale Magen-epithelialen Zell-Linie verewigt, GES-1 wurden freundlicherweise verliehen durch Prof. Daiming Fan. Alle Zelllinien wurden in unserem Institut gehalten gemäß den empfohlenen Protokolle. Zellen kultiviert wurden in RPMI-1640-Medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator.
Humanproben
Alle experimentellen Verfahren, die von der Institutional Review Board der Henan University of Science and Technology genehmigt. Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde für alle Patientenproben erhalten. Menschliche AGEJ Proben (n = 43) und Patienten gepaart Nicht-Krebs-Proben wurden von Patienten in der ersten verbundenen Krankenhaus, Henan University of Science and Technology, mit Einverständniserklärung von jedem Patienten.
RNA-Reinigung, cDNA-Synthese erhalten und quantitative real-time PCR (qRT-PCR)
Gesamt-RNA von kultivierten Zellen wurde mit Trizolreagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) extrahiert und nach dem Protokoll und RNAs des Herstellers wurden vor qRT-PCR-Analyse bei -80 ° C gelagert . Ältere miR-645-Expression wurde unter Verwendung eines Mirvana TM qRT-PCR miRNA Detection Kit (Ambion Inc. Austin, Texas), mit U6 als interne Kontrolle festgestellt. 5'AGCGAAGGTGTGCTTTGAGA 3 ', R: 5'GAGGGTCAATGGCGTTCTGA3' (Produktlänge: IFIT2-Expression wurde mit Primer F detektiert 125 bp; Tm: 60 ° C; GC%: F-50%, R-55%; Start-Ende: 643-748 bp) und GAPDH wurde als interne Kontrolle verwendet. PCR-Produkte auf einem ethidiumbromidgefärbten 1,5% Agarose-Gel und visualisiert mit UV getrennt wurden.
Zelltransfektion
Der menschliche miR-645 Duplex Agomir (400 nM), antagomir (400 nM) und negative Kontrolle wurden entworfen und zur Verfügung gestellt von Ribobio (Guangzhou, Guangdong, China). Plasmid-IFIT2 und die negative Kontrolle plamid wurden von Ribobio Inc (Guangzhou, Guangdong, China) gekauft
miRNA Ziel Vorhersage
Potential miRNA Zielgene zu finden, TargetScanHuman Website (http:. //Www. Targetscan. org /) verwendet wurde, wurde die freie Bindungsenergie berechnet und abwartend Websites wurden mit http analysiert:.... //bibiserv TechFak uni-bielefeld de /rnahybrid Webseite
Vektor-Konstrukte und Luciferase-Reporter Assay
Zum IFIT2-3'UTR Plasmid, ein Wildtyp-3'-UTR-Fragment des menschlichen IFIT2 mRNA (1226-1233 nt, Genbank-Nr. NM_001547.4), der das mutmaßliche miR-645-Bindungssequenz Konstrukt wurde amplifiziert durch RT-PCR und in die Stelle zwischen Xho I kloniert und Not I stromabwärts des Luciferase-Reportergens des psiCHECK ™ Vektor (Promega, USA). Eine Mutante des einzelnen miR-645-Bindungsstelle (5 'AGCCTAG -3' bis 5 'TCGGATC -3') in der 3'-UTR von IFIT2 durch zielgerichtete Mutagenese-Kit (SBS Genetech, Beijing, China aufgenommen wurde ). Wilde und mutierten Arten von pmirGLO-IFIT2-UTR-Vektoren durch DNA-Sequenzierung validiert wurden, Die Nukleotid-Sequenzen der Primer für IFIT2-3'UTR (WT) Klon:.
IFIT2XhoIF2. 5'CCGCTCGAG AGAATAGAGATGTGGTGCCCACTAGGCTACTGCTG 3 '
IFIT2NotIR2: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TTAAAATGGAATCAGTGACTTTTATTTCTCATAACAGAG 3 'Die Nukleotid-Sequenzen von Primern für IFIT2-3'UTR (MT) Klon: Artikel.
mutIFIT2F2: 5'TTCTAGGTAGATGCTGAATTCGGATCACATCAAAGTTGGTGTGAAC 3'.
mutIFIT2R2: 5'GTTCACACCAACTTTGATGTGATCCGAATTCAAGEJTCTACCTAGAA 3 ' .
die Zellen wurden mit den miR-645 imitiert, NC und pmirGLO Plasmid in 24-Well-Platten unter Verwendung von Lipofectamin ™ 2000 (Invitrogen) gemäß den Anweisungen transfiziert. 48 h später wurden die Zellen geerntet und auf Luciferase-Aktivität untersucht unter Verwendung des Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA) und detektiert durch den GloMaxTM 20/20 Erfassungssystem (E5331, Promega).
Caspase-3/7 Assay
die Aktivität von Caspase-3 und Caspase-7 in 96-Well-Format erkannt wurde (2 x 10 3 Zellen /Vertiefung) gemäß den Caspase-Glo 3/7 Assay (Promega) mit den Anweisungen. 100 &mgr; l Caspase-Glo 3/7 Reagenz wurden in jede Vertiefung ergänzt und dann 1 h bei Raumtemperatur inkubiert follwong die Lumineszenz nachgewiesen wurde die Mikrotiterplatte M200 Fluoreszenzlesegerät (Tecan) verwendet wird. Der Hintergrund Lumineszenz mit der Zellkultur und Assay-Reagenz (Blindreaktion) assoziiert wurde aus experimentellen Wert abgezogen.
MTT-Test
Zellen wurden mit 100 nM miR-645-Inhibitor (Genepharma, Shanghai, China), ahmt (Ribobio Inc ., Guangzhou, Guangdong, China) oder 100 nM plamid-IFIT2 (Ribobio Inc., China). Vierundzwanzig später wurden die Zellen in 96-well Platten ausgesät (2 x 10 3 /well). Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch MTT untersucht (3-2, 5-diphenyl Tetrazolium Bromid) Assay (Sigma, USA) gemäß den Anweisungen zu bestimmten Zeit.
Western-Blotting
Gesamtprotein aus kultivierten Zellen lysiert wurden durch Lysis Buffer enthält PMSF auf Eis. Dann Protein wurden durch 12% SDS-Polyacrylamidgelen elektrophoretisch aufgetrennt und wurden dann auf eine PVDF-Membran (Millipore) transferiert. Membranen wurden 1 h mit 5% fettfreien Milchpulver bei Raumtemperatur blockiert und über Nacht mit primären Antikörpern inkubiert. Membranen wurden nach drei 10 min Waschen in TBS-T (triethanolaminebuffered Kochsalzlösung mit Tween) mit sekundären Antikörpern markiert mit HRP für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurden die Signale ECL-Kits nachgewiesen unter Verwendung von (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) und die Membranen wurden gescannt und analysiert, um ein Bio-Rad ChemiDoc XRS + Abbildungssystem mit Imaging-Software (Version Menge 1) verwendet wird. Die Protein-Expression wurde an ein endogenes Referenz (Tubulin) normalisiert und relativ zu der Kontrolle. Die Spectra Multicolor-Weitbereichsleiter Protein (Fermentas) wurde als molekulare Marker verwendet. Alle verwendeten Antikörper im Western-Blot-Assays sind in den weiteren Datei aufgelistet 1: Tabelle S1
Immunhistochemie und immunhistochemische scoring
Paraffinschnitte, 4-um Dicke, wurden bei 65 ° C für 2 h gebacken und entparaffiniert.. Antigen Retrieval wurde 15 Minuten bei Verwendung von Citrat-Natriumpuffer (pH 7,2), 95 ° C durchgeführt und dann wurden die Objektträger für 30 Minuten bei Raumtemperatur abgekühlt. Nach 15 Minuten mit 3% Wasserstoffperoxid behandelt wird, um die endogene Peroxidase zu blockieren, wurden die Schnitte für 30 Minuten mit normalem Ziegenserum Sperrflüssigkeit behandelt unspezifische Bindung zu reduzieren und dann polyklonalen Kaninchen-anti-IFIT2 (1: 500, HPA003408, Sigma-Aldrich. Shanghai, China) wurde die Abschnitte für 12 h bei 4 ° C inkubiert. Nach der Wiedererwärmung für 1 h und Waschen für 5 Mal wurden die Schnitte für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit sekundärem Antikörper inkubiert. Diaminobenzidin (DAB) wurde für Farbreaktionen verwendet. Anschließende immunhistochemische Färbung erzielt wurde, wie zuvor beschrieben [40].
Statistical analysis
Die Daten wurden als Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Für statistische Tests, SPSS Statistik-Software-Paket, version17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) verwendet wurde. Der Schüler-t
-test, die Einweg-ANOVA und Zwei-Wege-ANOVA-Test wurden für die relative Banddichte von Western-Blot und MTT OD-Werten durchgeführt. Die Korrelation zwischen miR-645 und IFIT2 wurde mit Spearman Rangkorrelation analysiert. P-Werte. ≪ 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet
Ergebnisse

• Proteomanalyse menschlichen Kardia Adenokarzinom durch Laser Capture microdissection
• Therapeutische Potenzial von PRL-3-Targeting und klinische Bedeutung der PRL-3 genomischen Amplifikation in Magen cancer