El microARN-645, hasta reguladas en adencarcinoma humano de la unión esófago gástrica, inhibe la apoptosis por la orientación supresor tumoral IFIT2

El microARN-645, hasta reguladas en adencarcinoma humano de la unión esófago gástrica, inhibe la apoptosis por la orientación supresor de tumores IFIT2
Resumen Antecedentes

Un creciente cuerpo de evidencia indica que los miRNAs tienen un papel crítico en la carcinogénesis y la progresión del cáncer; Sin embargo, el papel de los miRNAs en la tumorigénesis de adencarcinoma de la unión esófago gástrica (AGEJ) sigue siendo en gran medida poco clara.
Métodos comentario El SGC7901 y se utilizaron BGC-823 líneas celulares de cáncer gástrico. Las expresiones de miR-645 y IFIT2 (proteína inducida por interferón con tetratricopeptide repite 2) fueron examinados por QRT-PCR, las expresiones de IFIT2 fue examinado por Western Blot y ensayo de inmunohistoquímica. La apoptosis de las células se determinó mediante FACS. MiR-645 inhibidor, imita y transfecciones plásmido-IFIT2 se realizaron para estudiar la deficitaria y ganancia de función. la actividad de caspasa-3/7 se examinó mediante ensayo de caspasa-3/7.
: Resultados de la En el presente estudio, hemos informado de un aumento de la expresión de miR-645 en muestras clínicas AGEJ en comparación con los tejidos no cancerosos pareadas. También se observó una significativa miR-645 sobre regulación en dos líneas celulares de cáncer gástrico (CG), SGC7901 y BGC-823, que se utilizaron como modelos celulares porque no había líneas celulares disponibles AGEJ establecido hasta la fecha. Se encontró que la inhibición de miR-645 podría sensibilizar drásticamente SGC7901 y BGC-823 células tanto starvation- quimioterapéutico suero y la apoptosis inducida por el fármaco por hasta la regulación de IFIT2, un mediador de la apoptosis a través de una vía mitocondrial, con un potencial sitio de unión para MIR -645 en 3'UTR de su ARNm. Más investigación mostró que la expresión IFIT2 disminuye en SGC7901 y células BGC-823 y tejidos AGEJ. IFIT2
expresión ectópica conduce a la promoción de la apoptosis de las células, lo que indica que IFIT2 puede funcionar como un supresor en el desarrollo de AGEJ. Además, la inhibición de miR-645 induce sobre regulación de IFIT2 y el aumento de la actividad de caspasa-3/7 en comparación con los grupos control.
Conclusiones
Nuestros datos sugieren que el miR-645 funciona como un oncogén en AGEJ humana por, al menos parcialmente, a través, de orientación IFIT2
.
Palabras clave
adencarcinoma de gástrica unión esofágica Antecedentes microARN-645 IFIT2 apoptosis
estudios recientes han sugerido que adencarcinoma de la unión esófago gástrica (AGEJ) es distinta de la de distal estómago, con diferentes factores de riesgo, las características del tumor, y el comportamiento biológico [1-4]. Por otra parte, la incidencia de AGEJ ha ido en aumento durante los últimos 30 años, especialmente en Estados Unidos y el norte de China [5-9].
MicroRNAs (miRNAs) son un grupo de endógenamente expresado, no codificante ARN pequeños, 20- 25 nucleótidos de longitud, que son conocidos para regular negativamente la expresión génica a través de la supresión de la traducción o la disminución de la estabilidad de los ARNm mediante la unión directamente a la región 3 'no traducida (3'-UTR) del ARNm diana [10, 11]. La acumulación de pruebas indica que miRNAs tienen papeles importantes en la regulación de procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo el desarrollo [12], el metabolismo de [13], la proliferación celular [14], la diferenciación [15] y la apoptosis [16]. Además, la regulación post-transcripcional aberrante de ARNm por miRNAs está relacionado con la tumorigénesis [17, 18]. Se han notificado los perfiles de expresión anormales de miRNAs para ser detectado en diversos tipos de tumores humanos incluyendo cáncer de pulmón [19], de mama [20], de próstata [21], el hígado [18], colon [22] y el cáncer gástrico [23]. Por otra parte, algunos miRNAs pueden actuar como oncogenes [24-26] o supresores tumorales [27, 28] mediante la regulación de la expresión de sus genes diana que tienen papeles importantes en algunas vías clave involucrados en la progresión del ciclo celular, la apoptosis o la proliferación. miRNAs las reguladas en muestras de tumores tales como el miR-22 [29, 30], miR-101 [31, 32], y miR-7 [33, 34] por lo general funcionan como miRNAs supresores, mientras que los miRNAs upregulated en muestras de tumores tales como miR-17 [35, 36], y miR-21 [37, 38] por lo general ejercen funciones oncogénicas. Estos estudios sugieren que la desregulación de miRNAs participa con frecuencia en la carcinogénesis y la progresión del cáncer.
Un estudio reciente ha indicado que el miR-645 puede ejercer el papel supresor tumoral en el cáncer de ovario seroso avanzada para el miR-645 está asociado negativamente con la supervivencia global de que [39]. En el presente estudio, se encontró que la expresión de miR-645 fue significativamente mayor en las muestras clínicas AGEJ en comparación con emparejados tejidos no cancerosos que utilizan chips de microARN. Sin embargo, el papel de miR-645 en la tumorigénesis de AGEJ no se ha estudiado todavía. Estudios posteriores mostraron que el miR-645 también fue significativamente hasta reguladas en dos líneas celulares de cáncer gástrico (CG), SGC7901 y BGC-823, que se utilizaron como modelos celulares alternativos en el presente estudio. La inhibición de miR-645 en SGC7901 y células BGC-823 suprimió de forma significativa la apoptosis de SGC7901 y células BGC-823 en la condición de la privación de suero o fármaco quimioterapéutico por hasta la regulación de IFIT2, un mediador de la apoptosis, con un sitio de unión potencial para MIR -645 en 3'UTR de su ARNm. El patrón de expresión de miR-645 y IFIT2 en muestras clínicas AGEJ se correlacionaron negativamente, lo que sugiere, además, que IFIT2
es un gen diana de miR-645. Por otra parte, la inhibición de miR-645 resultados en el aumento de la actividad de caspasa-3/7, que se activa por IFIT2. En este estudio, se investigó si el miR-645 es regulado en adencarcinoma humano de la unión esófago gástrica e inhibe la apoptosis mediante la focalización supresor de tumores IFIT2.
Métodos
Ética declaración Opiniones de muestras de tejido, era consentimiento informado por escrito obtenido a partir de pacientes. Los procedimientos utilizados en este estudio fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Henan de Ciencia y Tecnología y se ajustaban a la Declaración de Helsinki, y con la legislación local.
Líneas celulares y condiciones de Cultura y líneas celulares de cáncer gástrico SGC -7901, BGC-823 y la línea celular inmortalizada epitelial gástrica normal, GES-1 fueron amablemente concedido por el Prof. Daiming ventilador. Todas las líneas celulares se mantuvieron en nuestro instituto de acuerdo con los protocolos recomendados. Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%.
especímenes humanos MyBestPlay Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Henan de Ciencia y Tecnología. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito para todas las muestras de los pacientes. especímenes AGEJ humanos (n = 43) y pacientes emparejado muestras no cancerosas se obtuvieron de los pacientes en el primer hospital afiliado, Henan Universidad de Ciencia y Tecnología, con el consentimiento informado de cada paciente.
purificación de ARN, síntesis de ADNc, y cuantitativa PCR en tiempo real (QRT-PCR)
ARN total de las células cultivadas se extrajo con reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante y ARN se almacenaron a -80 ° C antes de QRT-PCR análisis . expresión maduro miR-645 se detectó usando un qRT-PCR Kit mirVana TM miRNA detección (Ambion Inc. Austin, Texas), con U6 como control interno. expresión IFIT2 se detectó con los cebadores F: 5'AGCGAAGGTGTGCTTTGAGA 3 ', R: 5'GAGGGTCAATGGCGTTCTGA3' (longitud del producto: 125 pb; Tm: 60 ° C; GC%: F-50%, R-55%; empezar-end: 643-748 pb) y GAPDH se utilizó como control interno. Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa 1,5% teñido con bromuro de etidio y se visualizaron con UV.
Transfección de células
El humano miR-645 agomir duplex (400 nM), antagomir (400 nM) y control negativo fueron diseñados y proporcionada por Ribobio (Guangzhou, Guangdong, china). Plásmido-IFIT2 y los plamid de control negativo fueron adquiridos de Ribobio Inc (Guangzhou, Guangdong, China): perfil del miARN objetivo de predicción
Para encontrar posibles genes miARN, TargetScanHuman página web (http:.. //Www TargetScan. org /) fue utilizado, la energía libre de unión se calculó y sitios Biding se analizaron mediante http:.... //bibiserv techfak uni-Bielefeld de /sitio web RNAhybrid
reportero construcciones de vector y la luciferasa
ensayo para construir el plásmido IFIT2-3'UTR, una de tipo salvaje fragmento de ARNm IFIT2 humana 3'-UTR (1226-1233 nt, GenBank adhesión no. NM_001547.4) que contiene la secuencia de unión de miR-645 putativo se amplificó por RT-PCR y se clonó en el sitio entre Xho I y Not I aguas abajo del gen indicador de luciferasa del vector psiCHECK ™ (Promega, EE.UU.). Un mutante del único sitio de unión de miR-645 (5'-AGCCTAG 3 'a 5' TCGGATC -3 ') en la 3'-UTR de IFIT2 fue incluida por mutagénesis dirigida Kit (SBS Genetech, Beijing, China ). tipos salvajes y mutantes de vectores pmirGLO-IFIT2-UTR se validaron mediante secuenciación de ADN México La secuencias de nucleótidos de cebadores para IFIT2-3'UTR clon (WT):.
IFIT2XhoIF2:. 5'CCGCTCGAG AGAATAGAGATGTGGTGCCCACTAGGCTACTGCTG 3 '
IFIT2NotIR2: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TTAAAATGGAATCAGTGACTTTTATTTCTCATAACAGAG 3 'Empresas El secuencias de nucleótidos de cebadores para IFIT2-3'UTR clon (MT):.
mutIFIT2F2: 5'TTCTAGGTAGATGCTGAATTCGGATCACATCAAAGTTGGTGTGAAC 3'.
mutIFIT2R2: 5'GTTCACACCAACTTTGATGTGATCCGAATTCAAGEJTCTACCTAGAA 3 ' .
células fueron transfectadas con los imitadores de miR-645, CN y pmirGLO plásmido en placas de 24 pocillos utilizando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones. 48 h más tarde, se recogieron las células y se analizaron para la actividad de luciferasa utilizando el Sistema Dual-Luciferase reportero de ensayo (Promega, EE.UU.) y se detectaron por el sistema de detección GloMaxTM 20/20 (E5331, Promega). Caspasa-3/7 ensayo
México la actividad de la caspasa-3 y caspasa-7 se detectó en formato de 96 pocillos (2 × 10 3 células /pocillo) usando el ensayo de la caspasa-Glo 3/7 (Promega) de acuerdo con las instrucciones. 100 l de la caspasa-Glo 3/7 reactivo se complementaron en cada pocillo y después se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h follwong la luminiscencia se detectó usando el lector de fluorescencia de microplacas M200 (Tecan). La luminiscencia de fondo asociado con el cultivo celular y reactivo de ensayo (reacción en blanco) se restó del valor experimental. Ensayo MTT
Las células fueron transfectadas con 100 nM de miR-645 inhibidor (Genepharma, Shanghai, China), imita (Ribobio Inc ., Guangzhou, Guangdong, china) o 100 nM plamid-IFIT2 (Ribobio Inc., china). Veinticuatro más tarde, las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos (2 × 10 3 /pocillo). La viabilidad de las células se examinó mediante MTT (3-2, 5-difenil tetrazolio bromuro) ensayo (Sigma, EE.UU.) según las instrucciones en el momento designado.
Western Blot
proteína total a partir de células cultivadas se lisaron por tampón de lisis que contiene PMSF en hielo. A continuación, la proteína se sometieron a electroforesis a través de 12% en geles de SDS poliacrilamida y luego se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore). Las membranas se bloquearon con 5% de leche sin grasa en polvo a temperatura ambiente durante 1 h y se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios. Las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios marcados con HRP durante 1 h a temperatura ambiente después de tres lavados de 10 min en TBS-T (solución salina triethanolaminebuffered con Tween). Por último, las señales se detectaron utilizando el kit ECL (Pierce Biotech., Rockford, IL, EE.UU.) y las membranas fueron escaneados y analizados mediante un sistema de Bio-Rad ChemiDoc XRS + de imágenes con software de imágenes (versión cantidad 1). La expresión de la proteína se normalizó a una referencia endógena (tubulina) y en relación con el control. La escalera de la proteína de amplio espectro multicolor Spectra (Fermentas) se utilizó como marcador molecular. Todos los anticuerpos utilizados en el ensayo de western blot se enumeran en el archivo adicional 1: Tabla S1
La inmunohistoquímica e inmunohistoquímico de puntuación
secciones de parafina, de 4 m de espesor, se cocieron durante 2 horas a 65 ° C y deparaffinized.. La recuperación del antígeno se llevó a cabo usando tampón de citrato de sodio (pH 7,2) a 95 ° C durante 15 minutos y luego portaobjetos se enfrió a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de ser tratado con peróxido de hidrógeno al 3% durante 15 minutos para bloquear la peroxidasa endógena, las secciones se trataron con líquido confinar suero normal de cabra durante 30 minutos para reducir la unión y luego policlonal de conejo anti-IFIT2 (1 no específica: 500, HPA003408, Sigma-Aldrich. Shanghai, china) se incubaron las secciones durante 12 horas a 4 ° C. Después de recalentamiento para 1 h y lavado 5 veces, las secciones se incubaron con anticuerpo secundario durante 30 minutos a temperatura ambiente. Diaminobencidina (DAB) se utilizó para reacciones de color. tinción inmunohistoquímica subsiguiente se obtuvo tal como se describe anteriormente [40]
. El análisis estadístico
datos se expresaron como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. Para los tests estadísticos, SPSS paquete de software estadístico, version17.0 (SPSS, Chicago, IL, EE.UU.) se utilizó. t de Student
-test, el ANOVA de una vía y de dos vías ANOVA se realizaron para la densidad relativa de la banda de Western Blot y los valores de DO MTT. La correlación entre el miR-645 y se analizó con IFIT2 correlación de Spearman. los valores <P;. 0,05 se consideraron estadísticamente significativos
Resultados
Expresiones de miR-645 están regulados en muestras clínicas AGEJ
Para evaluar el papel de miR-645 en la tumorigénesis de AGEJ, que utilizó por primera QRT - PCR método para medir la expresión de miR-645 de 43 tejidos humanos AGEJ clínicos, y se encontró que el miR-645 fue significativamente hasta reguladas en los tejidos clínicos AGEJ en comparación con los tejidos de pacientes cardíacos emparejado gástricas no cancerosas (Figura 1A). Para obtener un mejor conocimiento de la observación se ha mencionado anteriormente, hemos examinado la relación entre la expresión de miR-645 y los parámetros clínicos pacientes. El análisis mostró que la expresión de miR-645 era irrelevante con la edad, el sexo, la diferenciación tumoral, metástasis de ganglios linfáticos y el estadio TNM (Tabla 1: La relación entre los parámetros clínicos y miR-645 expresión en el adenocarcinoma de cardias gástrico primario), pero estaba en una correlación positiva con el tamaño del tumor, es decir, el tamaño del tumor mayor que o igual a 5 cm grupo mostró significativo aumento de la expresión de miR-645 en comparación con el tamaño del tumor de menos de 5 cm grupo (Figura 1B & Tabla 1, t-test
, * P
= 0,045). Figura 1 Las expresiones de miR-645 están regulados en muestras clínicas AGEJ. A. expresión de miR-645 en muestras clínicas 43 AGEJ humana en relación con los tejidos adyacentes normales emparejados humanos gástricos cardíacos no cancerosas, se midió mediante RT-PCR cuantitativa (Los valores indican la media ± SEM, n = 3, t
-test, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001). B. comparación de la expresión relativa de miR-645 en muestras clínicas AGEJ humana de diferente tamaño del tumor. (Dos colas t-test
, * p < 0,05).
Tabla 1 La relación entre los parámetros clínicos y la expresión de miR-645 en el adenocarcinoma de cardias gástrico primario
parámetros clínicos
N (%) guía empresas familiares expresión (media ± SEM) guía empresas p-valor
Edad (años): perfil ≥ 60
15 (50)
2,1286 ± 0,59201 0,568
Hotel < 60
15 (50)
1,9571 ± 0,52402
Sexo Masculino

18 (60)
2,1111 ± 0,42783
0,462
Mujer página 12 (40)
2.3333 ± 0,65328
Tamaño
≥5 página 13 (43,3)
2,7385 ± 0,004 * 100128
Hotel < 5
17 (56,7)
1,8235 ± 1,52214
diferenciación histológica
Bueno (W)
15 (50)
2,138 ± 0,1866 0,9427

mal (P)
15 (50)
2.198 ± 0.1903
linfático metástasis
Sí página 12 (40)
2,4583 ± 0,77864 Hotel < 0,001 ** No se

18 (60)
1,4944 ± 1,36273
estadio TNM
fase I /II
16 (53,3)
2,9125 ± 1,33660 Hotel < 0,001 **
etapa III /IV página 14 (46,7)
1,4857 ± 0,73991 gratis (* p < 0,05
; ** P <.
0,001)
El agotamiento de miR-645 promueve la apoptosis de las células de cáncer gástrico
Para investigar el papel de miR-645 en las características fenotípicas de la progresión AGEJ, utilizamos dos cáncer gástrico ( líneas celulares GC), SGC7901 y BGC-823 como modelos celulares. QRT-PCR resultados mostraron que el miR-645 expresión fue significativamente hasta reguladas en comparación con la línea celular inmortalizada GC, GES-1 (archivo adicional 2: Figura S1, P Hotel < 0,001).
SGC7901 y BGC-823 Las células fueron transfectadas transitoriamente con madura miR-645 imita, inhibidor, falsamente transfectadas, o miR-NC. Como se muestra en la Figura 2A y D, cuantitativos RT-PCR resultados muestran que la expresión de miR 645 imita o inhibidores significativamente hasta regular o hacia abajo-regular el nivel de expresión de miR-645, respectivamente, en SGC7901 y células BGC-823 de la primero a quinto día después de la transfección (Figura 2A, P
< 0,001; Figura 2D, P
< 0,001) en comparación con NC y los controles simulados. Figura 2 El agotamiento de miR-645 promueve la apoptosis de células de cáncer gástrico (GC). A & D. El nivel de miR-645 se midió por PCR cuantitativa a tiempo designado (análisis ANOVA de una vía, los valores indican la media ± desviación estándar, la figura 2A, M = 426,588, P < 0,001; Figura 2D, M = 685,026, P < 0,001). B & E. células GC transfectadas con el miR-645 imita e inhibidor sometidos a ensayo MTT al día durante 6 días (análisis ANOVA de dos vías, la figura 2B, F = 52.602, P < 0,001; Figura 2E, F = 42,847, p < 0,001). C & F. Células Células GC transfectadas con el miR-645 imita y el inhibidor se recogieron para el análisis FACS después de 72 h (Los valores indican la media ± SD, n = 3, Una forma de análisis de ANOVA, la figura 2C-A, F = 121.600, p < 0,001; Figura 2C-b, F = 250.400, p < 0,001; Figura Fa, F = 194.815, p < 0,001; Figura 2F-b, F = 412.741, p < 0,001)
SGC7901 y BGC-. 823 células transfectadas con miR-645 inhibidores y imita mostraron niveles significativamente más bajos y más altos de la proliferación celular, respectivamente, comparación con el NC o grupos simulados en presencia de ADR (0,2 mg /ml) según se determina mediante el ensayo de MTT (Figura 2B, P Hotel < 0,001; Figura 2E, P Hotel < 0,001)
ensayo Anniex Vapoptosis exhibió significativo aumento y disminución de las tasas de apoptosis de miR-645 y el agotamiento de los grupos de la expresión ectópica en comparación con los grupos de Carolina del Norte en la libre de suero. condición o en presencia de medicamento contra el cáncer, la adriamicina (ADR) (Figura 2C ab, P
< 0,001; Figura 2 F ab, P
< 0,001)
. IFIT2 es un objetivo de miR-645
datos anteriores sugieren que el miR-645 podría ser un oncogén del cáncer de ovario seroso avanzada. Así que más buscaron posibles objetivos de miR-645 por el algoritmo de Objeto de Análisis humana. Entre ellos, IFIT2, un supresor de tumores, se encontró que tienen sitios de unión putativo miR-645 dentro de su 3'UTR (Figura 3A). A continuación, se realizó un ensayo indicador de luciferasa usando células SGC7901 y BGC-823 para verificar si IFIT2 era un objetivo directo de miR-645. De tipo salvaje y mutante IFIT2-3'UTR que contiene el supuesto sitio de unión de miR-645 se clonaron en psiCHECK-2 vector aguas abajo del gen de la luciferasa (archivo adicional 3: Figura S2). Introducción de miR-645 redujo la actividad lucirferase del reportero vector IFIT2 3'UTR significativamente (Figura 3B, P
< 0,001; Figura 3C, P
< 0,001), pero no afectó a la actividad de lucirferase el vector reportero 3'UTR IFIT2 mutante, el apoyo a la interacción directa de miR-645 con IFIT2. Estos resultados sugieren además que el miR-645 puede suprimir la expresión IFIT2 apuntando a la 3'-UTR del ARNm IFIT2. Figura 3 La validación de los sitios de unión previsto entre el miR-645 y IFIT2. A. El diagrama esquemático que muestra la construcción de Luc-IFIT2 3'UTR y Luc-IFIT2 3'Mut UTR. Tanto Luc-IFIT2 3'UTR y Luc-IFIT2 3'Mut UTR se clonaron en un plásmido pmirGLO aguas abajo de la luciferasa de luciérnaga región de codificación entre los sitios de PmeI y XbaI. B & C. SGC7901 células (B) o BGC-823 células (C) fueron co-transfectadas con los psiCHECK-2 construcciones que contienen ya sea IFIT2 3'UTR o IFIT2 3'Mut UTR y, o bien el inhibidor de miR-645 o el miR-645 imita el 48 marido. Los valores indican la actividad relativa de luciferasa después de la normalización de la actividad de luciferasa de Renilla (Los valores indican la media ± SD, n = 3, Una forma de análisis de ANOVA, la figura 3B, M = 283,244, la figura 3C, M = 143.313. *** P <. 0.001)
expresión de miR-645 y IFIT2 están relacionados negativamente en muestras clínicas AGEJ
a evaluar más a fondo la relación entre el miR-645 y IFIT2, hemos examinado la expresión IFIT2 en 43 AGEJ muestras clínicas mediante qRT-PCR . Se encontró tejidos AGEJ tenían una notable menor nivel de expresión de IFIT2 que los tejidos no cancerosos pareadas (Figura 4A), y la expresión IFIT2 se correlaciona inversamente con el tamaño del tumor (Figura 4B, P = 0,0304
). A saber, el tamaño del tumor mayor que o igual a 5 cm grupo mostró significativa el regulado expresión IFIT2 en comparación con el tamaño del tumor de menos de 5 cm grupo. Para validar los datos, que posteriormente se midió la expresión de la proteína de IFIT2 utilizando el Western Blot (Figura 4C a-b), y los resultados mostraron un patrón similar a las observaciones encontradas por QRT-PCR. ensayo de inmunohistoquímica mostró una significativa disminución de la expresión de IFIT2 en los tejidos AGEJ pareadas tejidos no cancerosos (Figura 4D a-b, P < 0,001)
. A continuación, se analizó la relación entre el miR-645 y IFIT2 expresión y encontramos que el nivel de expresión IFIT2 se correlacionó negativamente con la de miR-645 (Figura 4E, P < 0,01
). Además, las células SGC7901 (Figura 4F a) y BGC-823 (Figura 4F b) transfectadas con inhibidor de miR-645 se han incrementado significativamente la expresión IFIT2 en la proteína y los niveles de ARNm en comparación con los grupos simulados y NC (Figura 4F ab, P <
0,01). Nuestros hallazgos indican que el miR-645 se puede regular directamente la expresión de IFIT2. Figura 4 La expresión de miR-645 y IFIT2 correlaciona negativamente en muestras clínicas y AGEJ IFIT2 se había reducido regulado en los tejidos AGEJ en comparación con los tejidos no cancerosos pareadas. A. Expresión de IFIT2
y miR-645 en muestras clínicas AGEJ se analizaron mediante PCR cuantitativa. B. comparación de la expresión relativa de IFIT2
en muestras clínicas AGEJ humanos de diferente tamaño del tumor. (T-test
, * p < 0,05). C. Expresión de IFIT2 examinado por Western Blot (a, b: los valores indican la media ± desviación estándar, normalizada a la tubulina, n = 3, t-test
, *** p
< 0,001) D. a. Imágenes representativas se muestran en la tinción inmunohistoquímica positiva de IFIT2 en muestras AGEJ humanos y tejidos normales adyacentes emparejados (magnificación × 200). segundo. Tinción decenas de IFIT2 (t-test
, *** p
< 0,001). E. parcelas de dispersión que muestra la correlación lineal negativa entre la expresión del ARNm de IFIT2
y la de miR-645 en 43 AGEJ muestras clínicas. F. IFIT2 y IFIT2
expresión medido por el Western Blot en SGC7901 (a) y las células BGC-823 (b). (Los valores indican la media ± SD, n = 3, Una forma de análisis de ANOVA, p *** Hotel < 0,001)
IFIT2 media la función de miR-645 mediante la promoción de SGC7901 y células BGC-823. apoptosis
Para confirmar que la inducción de la apoptosis celular en SGC7901 y BGC-823 células por miR-645 fue mediada por la orientación IFIT2
, se realizó IFIT2
plásmido transfección en SGC7901 (Figura 5A) y BGC-823 (Figura 5B) las células a un máximo de regular la expresión de IFIT2. Western Blot y PCR cuantitativa mostraron que la sobre regulación de IFIT2 por IFIT2
plásmido transfección cabe reducir de manera significativa por el miR-645 imita. ensayo de MTT mostró que las células transfectadas con la proliferación plásmido-IFIT2 se suprimió, sin embargo, las células transfectadas con la proliferación miR-645 imita aumentaron significativamente en comparación con el plásmido de control de y el plásmido-IFIT2 + miR-645 grupos (Figura 5C ab, P <
0,001). Por otra parte, la introducción de IFIT2 promueve la apoptosis de las células y SGC7901 BGC-823 y miR-645 imita la reducción de la apoptosis de las células inducidas por IFIT2 regulación en comparación con el grupo NC en presencia de ADR (Figura 5E-F, P <
0,001). Nuestros hallazgos sugieren que IFIT2 mediada la función de miR-645 en la inhibición de las células y SGC7901 BGC-823 proliferación y la inducción de la apoptosis celular. Figura 5 IFIT2 media la función de miR-645 mediante la promoción de la apoptosis celular GC. A & B. La expresión de IFIT2 examinado por Western Blot (A:. SGC7901; B, BGC-823 a, normalizado a la tubulina, los valores indican la media ± desviación estándar, análisis de ANOVA de un factor, por SGC7901, F = 189.307, por BGC-823, F = 85,374; b, los valores indican la media ± desviación estándar, de un solo sentido el análisis ANOVA, para SGC7901, F = 85,374, por BGC-823, M = 219,921; p *** Hotel < 0,001). C. SGC7901 (a) y BGC-823 (b) las células sometidas a ensayo MTT al día durante 6 días (los valores indican la media ± desviación estándar, de dos vías de análisis de ANOVA, para SGC7901, F = 13,768, por BGC-823, F = 16,409, p *** Hotel < 0,001). D & E. SGC7901 (D) y BGC-823 se recogieron las células (E) para el análisis FACS después de 72 h en presencia de ADR (0,05 mg /ml) (los valores indican la media ± SD, n = 3, Una forma de análisis de ANOVA; para SGC7901, F = 361.749, por BGC-823, M = 229,952; *** p
. < 0,001)
el agotamiento y la regulación de miR-645 alterado la actividad de la caspasa-3/7
IFIT2 se ha informado de que un supresor de tumores a través de la mediación de la apoptosis celular a través de la activación de la actividad de caspasa-3/7. Caspasa-Glo 3/7 ensayo mostró que el miR-645 agotamiento significativamente hasta reguladas, mientras que la sobreexpresión de miR-645 abajo regula la actividad de caspasa-3/7 en comparación con los grupos simulados y NC en la presencia de ADR (0,2 mg /ml) (Figura 6A y B, P < 0,001
) o la condición de la privación de suero (Figura 6C y D, P < 0,001
). Estos resultados combinados con las observaciones indicadas anteriormente sugirieron que el miR-645, hasta reguladas en los tejidos humanos, AGEJ inhibe la apoptosis de células y promueve a través de la supresión de la tumorigenicidad caspasa-3 actividad /7 por la orientación IFIT2. Figura 6 la caspasa-3/7 actividad. capacidad anti-apoptótica de las células y SGC7901 BGC-823 células después de la exposición al ADR (0,2 mg /ml) o la privación de suero se evaluó la actividad de las caspasas-3/7. A & C, SGC7901 células; B & D, BGC-823 células. (Los valores indican la media ± SD, n = 3, Una forma de análisis de ANOVA; para A, F = 183.930, para B, F = 1093.797; para C, M = 1861,50, para D, F = 1483.604, *** p
. < 0,001)
Discusión y conclusiones
a pesar de la acumulación de pruebas han demostrado que los miRNAs desregulación está involucrado con la carcinogénesis del tumor, progresión, migración y la invasión [41], metástasis [42, 43] y la resistencia a múltiples fármacos [44-46]. Poco se sabe sobre el papel de los miRNAs en el desarrollo de adencarcinoma de la unión esófago gástrica (AGEJ). Aquí, mostramos que esa expresión de miR-645 fue significativamente mayor en las muestras clínicas AGEJ en comparación con los tejidos no cancerosos pareados y era alternativa significativamente hasta reguladas en dos líneas celulares de cáncer gástrico (CG), SGC7901 y BGC-823, los cuales fueron utilizados modelos celulares porque no hay líneas celulares disponibles AGEJ fueron establecidos hasta la fecha. La inhibición de miR-645 en células SGC7901 y BGC-823 indujo significativamente la apoptosis de las células y SGC7901 BGC-823 en el estado de privación de suero o fármaco quimioterapéutico hasta la regulación de IFIT2, España un mediador de la apoptosis, con un potencial sitio de unión de miR-645 en el 3'UTR de su ARNm. El patrón de expresión de miR-645 y IFIT2 en SGC7901 y células BGC-823 y las muestras clínicas se correlacionaron negativamente, lo que sugiere, además, que IFIT2
es un gen diana de miR-645. Por otra parte, la inhibición de miR-645 resultados en el aumento de la actividad de caspasa-3/7, que se activa por IFIT2. Todos estos hallazgos sugieren un papel fundamental de miR-645 en la carcinogénesis, especialmente en el desarrollo de AGEJ.
Demasiado poco apoptosis es una causa fundamental de la carcinogénesis porque las células malignas muerte se reducen notablemente [47, 48], lo que resulta en la transformación maligna de las células afectadas, metástasis tumoral y la resistencia a múltiples fármacos de las células cancerosas. Por lo tanto, la apoptosis es de gran importancia en el tratamiento de cáncer y es un objetivo popular de muchas estrategias de tratamiento. En este estudio, hemos demostrado que el miR-645 células de cáncer con deficiencias al suero de la apoptosis privación inducida, mientras que el agotamiento de miR-645 antagoniza el efecto de miR-645, lo que sugiere que el miR-645 podría desempeñar un papel crucial en la adaptación de cáncer células a baja nutrición. Un número creciente de miRNAs se han implicado en la apoptosis de células de cáncer. Por un lado, microRNAs pueden funcionar como supresor de tumores a través de la inducción de la apoptosis, es decir, miR-421, que induce la proliferación celular y la resistencia a la apoptosis en el carcinoma nasofaríngeo humano a través de la baja regulación de foxo4 [49]; miR-149, que induce la apoptosis mediante la inhibición de Akt1 y E2F1 en células de cáncer humano [50] y los genes miARN-31, que induce la apoptosis en células de neuroblastoma humano [51]. Por otro lado, microRNAs podría funcionar como oncogenes por la supresión de la apoptosis, es decir, miR-24, que inhibe la apoptosis y reprime Bim en cardiomiocitos de ratón [52]; miR-886-5p, que inhibe la apoptosis por la expresión de Bax abajo de la regulación en las células de carcinoma cervical humano [53], y miR-183, que inhibe la apoptosis TGF-β1 inducida por regulación a la baja de la expresión PDCD4 en células de carcinoma hepatocelular humano [54] .
ISGs, IFN estimulan los genes, se refieren a los genes que están tanscribed por IFN inducción. Entre ellos, 4 pueden jugar papeles importantes que afectan tanto a la inhibición de la replicación viral y la inhibición de la proliferación celular [55, 56]. Estos genes pueden inhibir la replicación viral mediante el sacrificio de la célula a través de la promoción de la apoptosis y suprimir la progresión del cáncer a través de la inhibición de la supervivencia de las células malignamente transformadas para el beneficio de la acogida [57]. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

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