MikroRNS-645, akár szabályozott humán adencarcinoma a gyomor nyelőcső találkozásánál, gátolja az apoptózist célzott tumor szupresszor IFIT2

mikroRNS-645, akár szabályozott humán adencarcinoma a gyomor nyelőcső találkozásánál, gátolja az apoptózist célzott tumor szupresszor IFIT2 katalógusa Abstract
Háttér
egyre több bizonyíték utal arra, hogy a miRNS-ek döntő szerepük van a karcinogenitási és daganatos progresszió; Azonban a szerepe a miRNS-ek a tumorigenezisben a adencarcinoma a gyomor nyelőcső csomópont (AGEJ) jobbára továbbra is tisztázatlan.
Módszerek
A SGC7901 és BGC-823 gyomorrák sejtvonalakat használtunk. A kifejezések a miR-645 és IFIT2 (interferon-indukálta fehérje tetratricopeptide ismétli 2) vizsgáltunk qRT-PCR, kifejezései IFIT2 vizsgáltuk Western-blot és immunhisztokémiai vizsgálattal. A sejt apoptózis határoztuk meg FACS. MiR-645 inhibitor, utánozza, és a plazmid-IFIT2 transzfekciókra végeztünk, hogy tanulmányozza a veszteséges és a nyereség-funkciót. Kaszpáz-07/03 aktivitását vizsgáltuk a kaszpáz-07/03 vizsgálattal. Katalógusa Eredmények
A jelen tanulmányban azt emelkedéséről számoltak be kifejezése miR-645 AGEJ klinikai mintákból képest páros nem rákos szövetekben. Azt is megfigyelték, jelentős miR-645 up-szabályozás két gyomorrák (GC) sejtvonalak, SGC7901 és BGC-823, amelyek alapján a sejt modell, mert nem volt elérhető AGEJ sejtvonalak a mai napig. Azt találtuk, hogy gátolja a miR-645 is érzékennyé drámaian SGC7901 és BGC-823 sejtek mind a szérum starvation- és a kemoterápiás gyógyszer-indukált apoptózis akár szabályozó IFIT2, a közvetítő az apoptózis keresztül mitokondriális út, a potenciális kötőhelyet miR -645 annak mRNS-3'UTR. A további vizsgálat mutatott, hogy IFIT2 kifejezés csökken SGC7901 és BGC-823 sejtek és szövetek AGEJ. IFIT2
ektopikus expressziója vezet előmozdítása sejt apoptózis, jelezve, hogy IFIT2 működhet, mint egy szuppresszor a fejlesztés a AGEJ. Továbbá gátlása miR-645 indukál up-regulációja IFIT2 és növekedett kaszpáz-07/03 tevékenység, mint a kontroll csoportban. Katalógusa Következtetések katalógusa Adataink arra utalnak, hogy a miR-645 funkcionál onkogén humán AGEJ által, a legalább részben át, célzás IFIT2 katalógusa.
kulcsszavak katalógusa adencarcinoma gyomor- nyelőcső találkozásánál mikroRNS-645 IFIT2 apoptózis Háttér katalógusa a legújabb vizsgálatok arra utaltak, hogy a gyomor-nyelőcső adencarcinoma csomópont (AGEJ) eltér a distalis gyomor, a különböző kockázati tényezők, tumor jellemzők és biológiai viselkedést [1-4]. Sőt, az előfordulási AGEJ nőtt az elmúlt 30 évben, különösen az Egyesült Államok és Észak-Kína [5-9]. Katalógusa mikroRNS (miRNS) egy csoportja az endogén kifejezve, nem kódoló RNS-ek kis, 20- 25 nukleotid hosszúságú, amelyekről ismert, hogy negatívan szabályozzák a génexpressziót keresztül elnyomja fordítás vagy csökkentésével stabilitását mRNS-ek által közvetlenül kötelezőek a 3'-nem transzlatált régió (3'-UTR) a megcélzott mRNS-ek [10, 11]. Egyre több bizonyíték utal, hogy a miRNS-ek fontos szerepet töltenek szabályozásában fiziológiás és patológiás folyamatokban, mint például a fejlesztés [12], az anyagcsere [13], sejtburjánzást [14], a differenciálás [15] és az apoptózis. [16] Ezen túlmenően, az aberráns poszt-transzkripciós szabályozása mRNS-ek által miRNS összefügg tumorigenezis [17, 18]. Az abnormális expressziója profilok miRNS leírták, hogy kimutatható különböző humán tumorok, beleértve a tüdő [19], emlő [20], a prosztatában [21], a májban [18], a vastagbél [22] és a gyomorrák [23]. Sőt, egyes miRNS működhet onkogének [24-26] vagy tumor supressors [27, 28] által expresszióját szabályozó a cél gének, amelyek fontos szerepet néhány kulcsfontosságú utak részt a sejtciklus előrehaladását, az apoptózis vagy proliferáció. miRNS alulszabályozott tumor minták, mint például a miR-22 [29, 30], miR-101 [31, 32], és a miR-7 [33, 34] általában működnek szuppresszív miRNS, míg miRNS felülszabályozott tumorminták, mint a miR-17 [35, 36], és a miR-21 [37, 38] általában fejtik onkogén szerepeket. Ezek a vizsgálatok arra utalnak, hogy zavara miRNS gyakran részt vesz a carcinogenezisben és daganatos progresszió.
Egy nemrégiben készült tanulmány azt mutatta, hogy a miR-645 fejthet tumorszupresszorral szerepet előrehaladott savós petefészekrák a miR-645 negatívan kapcsolódó teljes túlélése hogy [39]. A jelen tanulmányban azt találták, hogy a miR-645 expressziója szignifikánsan emelkedett volt AGEJ klinikai mintákból képest páros nem rákos szöveteket mikroRNS chipek. Azonban a szerepe a miR-645 tumorigenezis a AGEJ nem vizsgálták még. A további vizsgálatok azt mutatták, hogy a miR-645 szintén szignifikánsan felülszabályozott két gyomorrák (GC) sejtvonalak, SGC7901 és BGC-823, amelyeket használunk alternatív sejt modellek a jelen tanulmányban. Gátlása miR-645 SGC7901 és BGC-823 sejtek szignifikánsan gátolni apoptózist SGC7901 és BGC-823 sejtek állapotának szérum éhezés vagy kemoterápiás gyógyszer akár szabályozó IFIT2, a közvetítő az apoptózis, a potenciális kötõhelyet miR -645 annak mRNS-3'UTR. Az expressziós mintázata a miR-645 és IFIT2 a AGEJ klinikai mintákat negatívan korrelált, továbbá arra utal, hogy IFIT2 katalógusa célpontja gén a miR-645. Továbbá gátlása miR-645 megnövekszik a kaszpáz-3/7-aktivitására, amely aktiválja a IFIT2. Ebben a tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy a miR-645 akár szabályozott humán adencarcinoma gyomor- nyelőcső csomópont és gátolja az apoptózist célzott tumor szupresszor IFIT2. Katalógusa módszerek katalógusa Etikai nyilatkozat katalógusa A szövetminták, írásos beleegyezését adta betegektől nyert. Eljárások ebben a tanulmányban alkalmazott jóváhagyta az Institutional Review Board a Henan University of Science and Technology, és megfelelt a Helsinki Nyilatkozat, és a helyi előírásoknak megfelelően. Katalógusa Sejtvonalak és tenyésztési körülmények
Gyomorrák sejtvonalak SGC -7901, BGC-823 és halhatatlanná normál gyomornyálkahártya sejtvonal GES-1-et kedves adományozta Prof. Daiming Fan. Az összes sejtvonalat fenn intézet szerint ajánlott protokollokat. A sejteket RPMI-1640 tápközegben (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), kiegészítve 10% magzati borjúszérummal (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 37 ° C-on, 5% CO 2 inkubátorban.
emberi mintákban
Minden vizsgálati eljárást jóváhagyta az Institutional Review Board a Henan University of Science and Technology. Írásos beleegyezését adta az összes beteg minták. Emberi AGEJ példányok (n = 43) és a beteg páros nem rákos mintákat betegektől nyert az első kapcsolt kórház, Henan University of Science and Technology, a beleegyező nyilatkozatot minden beteg. Katalógusa RNS tisztítása, cDNS szintézis és kvantitatív valós idejű PCR (qRT-PCR)
teljes RNS tenyésztett sejtek extraháljuk TRIzol reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) alkalmazásával a gyártó protokollja és RNS-eket -80 ° C-on, mielőtt qRT-PCR elemzés . Érett miR-645 expressziós detektáltuk Mirvana TM QRT-PCR miRNS Detection Kit (Ambion Inc. Austin, Texas), a U6 belső kontrollként. IFIT2 expressziót detektáltunk primerekkel F: 5'AGCGAAGGTGTGCTTTGAGA 3 ', R: 5'GAGGGTCAATGGCGTTCTGA3' (termék hossza: 125 bp; Tm: 60 ° C; GC%: F-50%, az R-55%; start-end: 643-748 bp), és GAPDH használtuk belső kontrollként. A PCR-termékeket elkülönítettük egy etídium-bromiddal festett 1,5% -os agaróz gélen, és UV-vel.
Cell transzfekció
Az emberi miR-645 duplex agomir (400 nm), antagomir (400 nm) és a negatív kontroll volt a célja, és által biztosított Ribobio (Guangzhou, Guangdong, Kína). A plazmid-IFIT2 és a negatív kontroll plamid vásároltunk Ribobio Inc (Guangzhou, Guangdong, Kína).
MiRNS target predikciós katalógusa hogy megtalálják a potenciális miRNS target gének, TargetScanHuman honlapján (http: //www. Targetscan. org /) használunk, a kötési energia szabad kiszámítottuk, és biding oldalak segítségével elemeztük a http: //bibiserv. techfak. uni-Bielefeld. de /rnahybrid honlapján. katalógusa vektor konstrukciókat és luciferáz assay
a konstrukció IFIT2-3'UTR plazmid, egy vad típusú 3'-UTR-fragmens a humán IFIT2 mRNS (1226-1233 nt, GenBank hozzáférési szám. NM_001547.4), amely a feltételezett miR-645 kötő szekvenciát amplifikáltuk RT-PCR és beklónoztuk a helyszínen között Xho I és Not I downstream a luciferáz riporter gént a psiCHECK ™ vektorba (Promega, USA). A mutáns az egységes miR-645 kötőhely (5'AGCCTAG -3 'to 5'TCGGATC -3) a 3'-UTR IFIT2 szerepelt helyspecifikus mutagenezis készlet (SBS Genetech, Peking, Kína ). Vad és mutáns típusú pmirGLO-IFIT2-UTR vektorok által hitelesített DNS-szekvenálással.
A nukleotidszekvenciák láncindítók IFIT2-3'UTR (WT) Klón:
IFIT2XhoIF2: 5'CCGCTCGAG AGAATAGAGATGTGGTGCCCACTAGGCTACTGCTG 3 '.
IFIT2NotIR2: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TTAAAATGGAATCAGTGACTTTTATTTCTCATAACAGAG 3 '.
A nukleotidszekvenciák láncindítók IFIT2-3'UTR (MT) klón:
mutIFIT2F2: 5'TTCTAGGTAGATGCTGAATTCGGATCACATCAAAGTTGGTGTGAAC 3'.
mutIFIT2R2: 5'GTTCACACCAACTTTGATGTGATCCGAATTCAAGEJTCTACCTAGAA 3 ' .
sejteket transzfektáltunk a miR-645 utánozza, NC és pmirGLO plazmid 24-lyukú lemezeken Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) utasításai szerint. 48 óra múlva a sejteket összegyűjtöttük és analizáltuk luciferázaktivitást a Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA), és detektáltuk a GloMaxTM 20/20 érzékelő rendszer (E5331, Promega).
Kaszpáz-3/7 assay
aktivitása kaszpáz-3 és kaszpáz-7-et detektáltunk 96 mérőhelyes formátumban (2 × 10 3 sejt /mérőhely) a kaszpáz-Glo 3/7 Assay (Promega) utasításai szerint. 100 ul Caspase-Glo 3/7 reagens kiegészítettük az egyes lyukakba, majd szobahőmérsékleten inkubáljuk 1 órán follwong a lumineszcencia alkalmazásával mutattuk M200 mikrolemez fluoreszcencia leolvasó (Tecan). A háttér lumineszcencia összefüggő sejt kultúra és vizsgálati reagenst (üres reakció) levonjuk a kísérleti értéket. Katalógusa MTT assay katalógusa sejteket 100 nM miR-645 inhibitor (Genepharma, Shanghai, Kína), utánozza (Ribobio Inc ., Guangzhou, Guangdong, Kína), vagy 100 nM plamid-IFIT2 (Ribobio Inc., Kína). Huszonnégy később a sejteket szélesztettünk 96 mérőhelyes lemezeken (2 × 10 3 /lyuk). A sejtek életképességét úgy vizsgáltuk MTT-t (3-2, 5-difenil-tetrazólium-bromid) vizsgálattal (Sigma, USA) utasításai szerint a kijelölt időben.
Western blot
származó összes fehérje tenyésztett sejteket lizáltuk Lysis Buffer tartalmazó PMSF jégen. Ezután fehérje elektroforézisnek vetettünk 12% -os SDS poliakrilamid gélen és átvisszük PVDF membránra (Millipore). A membránokat blokkoltuk 5% zsírmentes tejpor szobahőmérsékleten 1 órán és éjszakán át inkubáltuk primer antitestekkel. A membránokat ezután a másodlagos antitestekkel jelzett HRP 1 óra után szobahőmérsékleten három 10 perc mosás TBS-T (triethanolaminebuffered sóoldat Tween). Végül a jelek alkalmazásával detektáltuk ECL kit (Pierce, Biotech., Rockford, IL, USA), és a membránokat beolvasott és elemeztük egy Bio-Rad ChemiDoc XRS + képalkotó rendszer képalkotó szoftver (verzió mennyiség 1). A fehérje expresszióját normalizáltuk egy endogén referencia (tubulin), és a kontrollhoz viszonyítva. A Spectra többszínű széles spektrumú protein létra (Fermentas) használtunk molekuláris marker. Minden alkalmazott antitestek Western blot assay felsorolt ​​kiegészítő fájl 1: Táblázat S1.
Immunhisztokémia és immunhisztokémiai pontozási
paraffin metszeteket, 4-um vastagságú, sütöttek 2 órán át 65 ° C-on és a paraffint. Antigén-visszanyerés alkalmazásával végeztük citrát nátrium-pufferrel (pH = 7,2) 95 ° C-on 15 percig, majd tárgylemezeket lehűtjük szobahőmérsékleten 30 percig. Miután kezeltük 3% -os hidrogén-peroxid 15 percig, hogy blokkolja az endogén peroxidáz, a metszeteket kezelt normál kecske szérummal határoló folyékony 30 percig, hogy csökkentsék a nem-specifikus kötődés, majd nyúl poliklonális anti-IFIT2 (1: 500, HPA003408, Sigma-Aldrich. Shanghai, Kína) inkubáltuk a metszeteket 12 órán át 4 ° C-on. Miután felmelegítés 1 órán és mosás 5-ször, metszeteket szekunder antitesttel 30 percig, szobahőmérsékleten. Diaminobenzidinnel (DAB) használtunk szín reakciókat. Későbbi immunhisztokémiai festést pontoztuk a korábban leírt [40].
Statisztikai analízis
Az adatokat átlag ± SD három független kísérlet során. A statisztikai tesztek, az SPSS statisztikai szoftvercsomag, version17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) használtunk. A hallgató t katalógusa próba, az egyirányú ANOVA és két utas ANOVA tesztet végeztünk relatív sáv sűrűségét western blot és MTT OD értékeket. A korreláció miR-645 és IFIT2 elemeztük Spearman rank korreláció. P értékek < 0,05 tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Katalógusa eredményei katalógusa kifejezések a miR-645 is fel-szabályozott AGEJ klinikai mintákban
szerepének értékeléséhez miR-645 tumorigenezis a AGEJ, először használt qRT - PCR módszerrel határozza meg a miR-645 expressziója 43 emberi AGEJ klinikai szöveteket, és megállapította, hogy a miR-645 szignifikánsan up-szabályozott AGEJ klinikai szövetekben, mint a beteg párosított gyomor szív nem rákos szövetekben (1A). Ahhoz, hogy további betekintést nyerjenek a megfigyelés említettük, megvizsgáltuk a kapcsolatát miR-645 expresszió és a betegek klinikai paramétereit. Az elemzés azt mutatta, hogy a miR-645 expressziója nem volt jelentősége az életkor, a nem, a tumor differenciálás, nyirokcsomó-metasztázis és TNM (1. táblázat: A kapcsolat a klinikai paraméterek és a miR-645 expressziója primer cardia adenocarcinoma), de a pozitív korrelációt a tumor méretét, nevezetesen a tumor mérete nagyobb, vagy egyenlő, mint 5 cm-csoport mutatott szignifikáns fokozott miR-645 expressziós összehasonlítva tumor mérete kisebb, mint 5 cm-csoport (1B & 1. táblázat, T
-próba, * P
= 0,045). 1. ábra kifejezések a miR-645 is fel-szabályozott AGEJ klinikai mintákban. A. expressziójának miR-645 43 humán AGEJ klinikai mintákban képest a szomszédos párosított normál emberi gyomor szív nem rákos szöveteket, mértük kvantitatív RT-PCR (Az értékek azt mutatják, az átlag ± SEM, n = 3, t
-próba, * p 0,05, ** p < 0,01; *** p < 0,001). B. összehasonlítása relatív expresszióját miR-645 humán AGEJ klinikai minták különböző tumor méretét. (Kétmintás t próba katalógusa, * p < 0,05). 1. táblázat katalógusa kapcsolata a klinikai paraméterek és a miR-645 expressziója primer cardia adenocarcinoma katalógusa klinikai paraméterek
N (%) Matton hozzátartozók kifejezés (átlag ± SEM) Matton p-érték Matton Életkor (év) hotelben ≥ 60 katalógusa 15 (50) hotelben 2,1286 ± 0,59201 katalógusa 0,568 katalógusa < 60 katalógusa 15 (50) hotelben 1,9571 ± 0,52402 katalógusa Gender katalógusa Férfi katalógusa 18 (60) hotelben 2,1111 ± 0,42783 katalógusa 0,462 fiatal női katalógusa 12 (40) hotelben 2,3333 ± 0,65328 katalógusa Méret katalógusa ≥5 katalógusa 13 (43,3) hotelben 2,7385 ± 100128 katalógusa 0,004 * katalógusa < 5 katalógusa 17 (56,7) hotelben 1,8235 ± 1,52214 katalógusa szövettani differenciálás katalógusa Well (W) hotelben 15 (50) hotelben 2,138 ± 0,1866 0,9427 katalógusa katalógusa rosszul (P) katalógusa 15 (50) hotelben 2,198 ± 0,1903 katalógusa nyirokrendszer áttét katalógusa Igen
12 (40) hotelben 2,4583 ± 0,77864 katalógusa < 0,001 ** katalógusa No katalógusa 18 (60) hotelben 1,4944 ± 1,36273 katalógusa TNM katalógusa Stage I /II
16 (53,3) hotelben 2,9125 ± 1,33660 katalógusa < 0,001 ** katalógusa Stage III /IV katalógusa 14 (46,7) hotelben 1,4857 ± 0,73991 katalógusa (* p < katalógusa 0,05; ** P < katalógusa 0,001). Katalógusa kiürülése a miR-645 elősegíti az apoptózist gyomorrák sejtek
szerepének vizsgálata a miR-645 a fenotípusos jellemzőiben AGEJ progresszió, szoktuk két gyomorrák ( GC) sejtvonalak, SGC7901 és BGC-823, mint sejt modellek. QRT-PCR eredmények azt mutatták, hogy a miR-645 expresszió szignifikánsan felülszabályozott összehasonlítva immortalizált GC sejtvonal, GES-1 (Plusz fájl 2: ábra S1, p
< 0,001).
SGC7901 és BGC-823 sejteket átmenetileg transzfektált érett miR-645-utánzatok, inhibitor, makett transzfektált vagy miR-NC. Amint azt a 2A ábra és a D, kvantitatív RT-PCR-eredmények azt mutatják, hogy az expresszió a miR 645 utánozza vagy inhibitorok jelentősen felfelé szabályozzák vagy lefelé szabályozza expressziós szintjének miR-645, illetve a SGC7901 és BGC-823 sejteket a első-ötödik napon a transzfekció után (2A ábra, p
<0,001; ábra a 2D, p
< 0,001), összehasonlítva a NC és mock ellenőrzéseket. 2. ábra kiürülése miR-645 elősegíti az apoptózist gyomorrák (GC) sejtek. A & D. A szint miR-645 mértük kvantitatív PCR, a kijelölt idő (one-way ANOVA analízis, az értékek azt jelzik, az átlag ± SD, 2A ábra, F = 426,588, a P <0,001; ábra a 2D, F = 685,026, a P <0,001). B &E. GC transzfektált sejtek miR-645 utánozza és inhibitor vetjük alá MTT assay napi 6 napon (kétutas ANOVA analízis, a 2B ábra, F = 52,602, p 0,001; ábra 2E, F = 42,847, p < 0,001). C & F. GC-sejtek transzfektált sejtek miR-645 utánozza és inhibitor gyűjtöttük FACS analízissel 72 óra után (Az értékek azt mutatják, az átlag ± SD, n = 3, Egyutas ANOVA analízis, ábra 2C-A, F = 121,600, p < 0,001; ábra 2C-b, F = 250,400, p 0,001; ábra Fa, F = 194,815, p 0,001; ábra 2F-b, F = 412,741, p < 0,001).
SGC7901 és BGC- 823 transzfektált sejtek miR-645 inhibitorok és utánozza szignifikánsan alacsonyabb és magasabb szintű sejtproliferáció, illetve összehasonlítás az NC, vagy ál csoportok jelenlétében ADR (0,2 ng /ml) által meghatározott MTT assay (2B, P
< 0,001 ábra 2E, P katalógusa < 0,001). katalógusa Anniex Vapoptosis vizsgálatban mutatott jelentős növelését és csökkentését apoptózis aránya a miR-645 kimerülése és a méhen kívüli kifejezés csoportok képest NC csoportok a szérum-mentes feltétel vagy jelenlétében rákellenes gyógyszer, adriamicin (ADR) (2C ábra AB, p
<0,001; 2. ábra F AB, p
< 0,001). Katalógusa IFIT2 célpontja a miR-645 katalógusa Korábbi adatok arra utalnak, hogy a miR-645 lehet egy onkogén fejlett savós petefészekrák. Így tovább keresi a potenciális célpontjai a miR-645 algoritmussal Target Scan emberi. Közülük, IFIT2, egy tumor szupresszor, azt találtuk, hogy a feltételezett miR-645 kötőhelyeket belül 3'UTR (3A ábra). Aztán végre luciferáz riporter esszével SGC7901 és BGC-823 sejteket ellenőrizni, hogy IFIT2 volt közvetlen célpontja a miR-645. A vad típusú és mutáns IFIT2-3'UTR tartalmazó feltételezett kötőhely miR-645 klónoztuk psiCHECK-2 vektor downstream luciferáz gént (Plusz fájl 3: ábra S2). Bevezetés a miR-645 csökkentette a lucirferase tevékenységet a IFIT2 3'UTR riporter vektor jelentősen (3B, P &katalógusa 0,001; 3C, ábra, P katalógusa < 0,001), de nem befolyásolja a lucirferase tevékenység a mutáns IFIT2 3'UTR riporter vektor, amely támogatja a közvetlen kapcsolat a miR-645 és IFIT2. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a további miR-645 elnyomhatja a IFIT2 kifejezés megcélozva 3'-UTR IFIT2 mRNS. 3. ábra érvényesítése megjósolt kötőhelyek között miR-645 és IFIT2. A. A sematikus ábra mutatja a konstrukció Luc-IFIT2 3'UTR és Luc-IFIT2 3'Mut UTR. Mindkét Luc-IFIT2 3'UTR és Luc-IFIT2 3'Mut UTR klónoztuk egy pmirGLO plazmid áramlásirányban a szentjánosbogár luciferázt kódoló régiót közötti Pmel és Xbal helyek. B &C. SGC7901 sejtek (B) vagy BGC-823 sejteket (C) együtt transzfektáltuk a psiCHECK-2 konstrukciót tartalmazó vagy IFIT2 3'UTR vagy IFIT2 3'Mut UTR és vagy a miR-645 inhibitor vagy a miR-645 utánozza 48 h. Értékek jelzik a relatív luciferáz aktivitást normalizálás után Renilla luciferáz aktivitást (Az értékek azt mutatják, az átlag ± SD, n = 3, Egyutas ANOVA analízis, ábra a 3B, F = 283,244, 3C, ábra, F = 143,313. *** P <0,001). katalógusa Expression miR-645 és IFIT2 negatív kapcsolatban a AGEJ klinikai mintákban
további értékelése viszonyának miR-645 és IFIT2 megvizsgáltuk a IFIT2 kifejezés 43 AGEJ klinikai mintákból qRT-PCR . Azt találtuk, AGEJ szövetekben volt egy figyelemre méltó alacsonyabb expressziós szintjét IFIT2, mint a páros nem rákos szöveteknél (4a ábra), és IFIT2 expresszió fordított korrelációban van a tumor mérete (4b ábra, P =
0,0304). Nevezetesen, a tumor mérete nagyobb, vagy egyenlő, mint 5 cm-csoport mutatott szignifikáns alulszabályozott IFIT2 expressziója összehasonlítva a tumor mérete kisebb, mint 5 cm-csoport. Hogy érvényesítse a adatok, akkor a későbbiekben mért fehérje expresszióját IFIT2 felhasználásával Western blottal (4C A-B), és az eredmények azt mutatták, hasonló mintát a megfigyelések által talált QRT-PCR. Immunhisztokémia assay mutatott szignifikáns csökkent expressziója IFIT2 a AGEJ szövetekben párosított nem rákos szövetekben (4D A-B, P <
0,001). Aztán viszonyát elemezte miR-645 és IFIT2 kifejezés, és megállapította, hogy IFIT2 expressziós szint negatívan korrelál a miR-645 (ábra 4E, P < katalógusa 0,01). Sőt, SGC7901 (4F) és BGC-823 (4F b) transzfektált sejtek miR-645 inhibitor jelentősen növelte IFIT2 kifejezés a fehérje és mRNS szinten, mint a vak és NC csoportok (4F ab, P <
0,01). Eredményeink azt mutatják, hogy a miR-645 közvetlenül expresszióját szabályozzák IFIT2. 4. ábra expressziója miR-645 és IFIT2 negatívan korrelálnak az AGEJ klinikai minták és a IFIT2 volt lefelé szabályozni AGEJ szövetekben összehasonlítva párosított nem rákos szövetekben. A. kifejezése IFIT2 katalógusa és miR-645 AGEJ klinikai mintákat kvantitatív PCR. B. összehasonlítása relatív expresszióját IFIT2
humán AGEJ klinikai minták különböző tumor méretét. (T
-próba, * p < 0,05). C. expressziója IFIT2 vizsgált Western blottal (a, b: az értékek azt jelzik, az átlag ± SD, normalizálva tubulin, n = 3, T
-próba; *** p
< 0,001) D. a. Reprezentatív képek látható pozitív immunhisztokémiai festésével IFIT2 humán AGEJ példányok és kiegyenlített szomszédos normál szövetben (nagyítás 200 ×). b. Festéssel tucat IFIT2 (t katalógusa próba *** p katalógusa < 0,001). E. pontdiagramot mutató negatív lineáris korreláció az mRNS expressziója IFIT2 katalógusa, és hogy a miR-645 43 AGEJ klinikai mintákban. F. IFIT2 és IFIT2
expresszióját mérjük Western blot a SGC7901 (A) és BGC-823 sejtek (B). (Az értékek azt jelzik, az átlag ± SD, n = 3, egyutas ANOVA, p *** katalógusa < 0,001). Katalógusa IFIT2 közvetíti a funkció a miR-645 előmozdításával SGC7901 és BGC-823 sejteket apoptózis
Annak igazolására, hogy az indukció sejt apoptózis SGC7901 és BGC-823 sejtek miR-645-t által közvetített célba IFIT2
végeztünk IFIT2
plazmid transzfekció SGC7901 (5A ábra), és BGC-823 (5B ábra) a sejtek fel-expresszióját szabályozzák IFIT2. Western blot és kvantitatív PCR kimutatta, hogy up-regulációját IFIT2 által IFIT2
plazmid transzfekciót lehet jelentősen csökkent miR-645 utánozza. MTT esszé azt mutatta, hogy a transzfektált sejtek plazmid-IFIT2 proliferáció gátlás alá került, azonban a transzfektált sejtek miR-645 utánozza proliferáció jelentős mértékben megemelkedett plazmiddal-Control és a plazmid-IFIT2 + miR-645 csoportban (5C AB, P <
0,001). Továbbá bevezetése IFIT2 mozdítani apoptózisának SGC7901 és BGC-823 sejteket és a miR-645 utánozza csökkentett sejtek apoptózisát indukálta IFIT2 up-regulációját képest NC-csoport jelenlétében ADR (5E ábra-F, P < katalógusa 0,001). Eredményeink azt javasolta, hogy IFIT2 közvetített funkcióját miR-645 gátolja SGC7901 és BGC-823 sejtek proliferációját és apoptózist indukál. 5. ábra IFIT2 közvetíti a funkció a miR-645 előmozdításával GC apoptózis. A & B. Expression of IFIT2 vizsgált Western blottal (A: SGC7901; B, BGC-823. A, normalizált tubulin, az értékek azt jelzik, az átlag ± SD, egyutas ANOVA analízis, a SGC7901, F = 189,307, a BGC-823, F = 85,374; b, az értékek azt jelzik, az átlag ± SD, egyutas ANOVA analízis, a SGC7901, F = 85,374, a BGC-823, F = 219,921; *** p
< 0,001). C. SGC7901 (A) és BGC-823 (b) a sejteket vetjük alá, MTT assay naponta 6 napig (a értékek jelzik az átlag ± SD, kétutas ANOVA analízis, a SGC7901, F = 13,768, a BGC-823, F- = 16,409, p *** katalógusa < 0,001). D &E. SGC7901 (D) és BGC-823 (E) sejteket összegyűjtöttük FACS elemzés után 72 óra jelenlétében ADR (0,05 ng /ml) (az értékeket jelzik az átlag ± SD, n = 3, one-way ANOVA elemzés; a SGC7901, F = 361,749, a BGC-823, F = 229,952; *** p katalógusa < 0,001). katalógusa kiürülése és up-reguláció a miR-645 megváltoztatta a kaszpáz-07/03 tevékenység
IFIT2 leírták, hogy egy tumorszuppresszor keresztül közvetítésében sejt apoptózis révén aktiváló kaszpáz-3/7-aktivitására. A kaszpáz-Glo 3/7 esszé azt mutatta, hogy a miR-645 kimerülése szignifikánsan felülszabályozott, míg a miR-645 fokozott expressziója lefelé szabályozni a kaszpáz-3/7-aktivitására összehasonlítva mock és NC csoportok jelenlétében ADR (0,2 ng /ml) (6a ábra és B, P <
0,001) vagy szérum éhezés feltétel (ábra 6C és D, P <
0,001). Ezek az eredmények együtt megfigyelések fentebb azt javasolta, hogy a miR-645, akár szabályozott humán AGEJ szövetekben, gátolja a sejt apoptózis és elősegíti tumorgenézisre keresztül elnyomja a kaszpáz-07/03 aktivitást célzó IFIT2. 6. ábra Caspase-3/7-aktivitására. Anti-apoptotikus képességét SGC7901 sejtek és BGC-823 sejtek az expozíció után a ADR (0,2 ng /ml) vagy a szérum-éheztetést értékeltük kaszpázok-3/7-aktivitására. A &C, SGC7901-sejtek; B &D, BGC-823 sejtekben. (Az értékek azt jelzik, az átlag ± SD, n = 3, egyutas ANOVA elemzés; A, F = 183,930, B, F = 1093,797; a C, F = 1861,50, D, F = 1483,604, *** p katalógusa < 0,001). katalógusa Megbeszélés és következtetések katalógusa Bár halmozódó bizonyítékok azt mutatják, hogy a miRNS-ek a dereguláció is részt vesz a daganat karcinogenezissel, progresszió, migrációs és behatolás [41], metasztázis [42, 43] és multidrog rezisztencia [44-46]. Keveset tudunk a szerepek miRNS-ek a fejlesztés adencarcinoma a gyomor nyelőcső csomópont (AGEJ). Itt azt mutatta, hogy ez a miR-645 expressziója szignifikánsan emelkedett volt AGEJ klinikai mintákból képest páros nem rákos szövetek és szignifikánsan up-szabályozásnak két gyomorrák (GC) sejtvonalak, SGC7901 és BGC-823, amelyek alapján az alternatív sejt modell, mivel nem áll rendelkezésre AGEJ sejtvonalak alakultak a mai napig. Gátlása miR-645 SGC7901 és BGC-823 sejtek jelentősen indukált apoptózist SGC7901 és BGC-823 sejtek állapotának szérum éhezés vagy kemoterápiás gyógyszer akár szabályozó IFIT2,
közvetítő az apoptózis, a potenciális kötőhely a miR-645 annak mRNS-3'UTR. Az expressziós mintázata a miR-645 és IFIT2 a SGC7901 és BGC-823 sejtek és klinikai minták korrelált, továbbá arra utal, hogy IFIT2 katalógusa célpontja gén a miR-645. Továbbá gátlása miR-645 megnövekszik a kaszpáz-3/7-aktivitására, amely aktiválja a IFIT2. Mindezek a megállapítások azt sugallják, alapvető szerepet miR-645 a karcinogenezisben, különösen a fejlesztés a AGEJ.
Túl kevés apoptózis az egyik döntő oka a carcinogenesis, mert rosszindulatú sejtek halálát csökken feltűnően [47, 48], ami a malignus transzformáció az érintett sejtek, tumor metasztázis és multidrog rezisztencia rákos sejteket. Ezért, az apoptózis nagy jelentősége van a kezelés a rák, és egy népszerű célpontja számos kezelési stratégiákat. Ebben a tanulmányban azt mutatták, hogy a miR-645 felület a rákos sejtek szérum elvonása által indukált apoptózist, míg a kimerülése miR-645 antagonizálta ezt a hatást a miR-645, ami arra utal, hogy a miR-645 is döntő szerepet játszanak a kiigazítás a rák sejtek alacsony táplálkozás. Egyre több miRNS hozták összefüggésbe a rákos sejtek apoptózisát. Egyrészt, mikroRNS működhetnek mint tumorszuppresszor keresztül apoptózist indukáló, azaz miR-421, amely indukálja a sejtproliferációt és apoptózist rezisztencia emberi orrgarat-karcinóma keresztül, leszabályozza FOXO4 [49]; miR-149, amely apoptózist indukál gátlásával Akt1 és E2F1 humán rákos sejtek [50] és a miRNS-31, amely apoptózist indukál humán neuroblasztóma sejtekben [51]. Másrészt, mikroRNS működhetnek mint onkogének által elnyomja az apoptózis, vagyis a miR-24, amely gátolja az apoptózist és elfojtja Bim egér szívizomsejtek [52]; miR-886-5p, amely gátolja az apoptózist által alulszabályozza Bax expresszió humán méhnyak karcinóma sejtek [53], és a miR-183, amely gátolja a TGF-β1-indukálta apoptózis alulszabályozása PDCD4 expresszió humán hepatocelluláris karcinóma sejtek [54] .
ISGs, IFN stimulált gének, lásd a gének, amelyek tanscribed által IFN indukciós. Ezek közül 4 játszhatnak fontos szerepet, amelyek befolyásolják mind a virális replikációt és a gátlás a celluláris proliferáció [55, 56]. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges kéziratot. Katalógusa

• Proteomikai analízise emberi cardia adenocarcinoma lézeres leválasztás mikrodisszekcióban
• Terápiás potenciálja a PRL-3 célzás és klinikai jelentősége PRL-3 genomi amplifikáció gyomorrák