MicroRNA-645, iki reguliuojama žmogaus adencarcinoma skrandžio stemplės jungties, slopina apoptozę nukreipiant auglio slopinamojo IFIT2

MicroRNA-645, iki reguliuojama žmogaus adencarcinoma skrandžio stemplės jungties, slopina apoptozę nukreipiant auglio slopinamojo IFIT2
tezės
Background pervežimas vis organo duomenys rodo, kad miRNAs turi lemiamą vaidmenį kancerogenezės ir vėžio progresavimo; Tačiau miRNAs į adencarcinoma skrandžio stemplės jungties (AGEJ) Tumorigenesis vaidmuo išlieka labai neaiški.
metodai
SGC7901 ir buvo naudojami BGC-823 skrandžio vėžio ląstelių linijos. Į PPN-645 ir IFIT2 posakiai (interferonas sukeltas baltymų su tetratricopeptide pakartoja 2) išnagrinėjo KRL-PGR, iš IFIT2 posakiai išnagrinėjo Imunoblotingo ir imunohistocheminis tyrimu. Ląstelių apoptozę buvo nustatomas pagal FACS. MIR-645 inhibitoriaus, imituoja ir plazmidės-IFIT2 transfekcija buvo atlikta studijuoti nuostolinga ir įgyti FUNKCINIŲ. Kaspazės-3/7 Aktyvumas išnagrinėjo kaspazės-3/7 tyrimu.
Rezultatai
Šiame tyrime mes pranešė padidintą išraišką PPN-645 į AGEJ klinikinių mėginių, palyginti su suporuotas nevėžinės audiniuose. Mes taip pat pastebėjo reikšmingą MIR-645 up-reglamento dviem skrandžio vėžys (GC) ląstelių linijas, SGC7901 ir BGC-823, kurie buvo naudojami kaip mobilieji modelių, nes nebuvo laisvų AGEJ ląstelių linijos nustatytos datos. Mes nustatėme, kad slopinimas miR-645 gali įjautrinti dramatiškai SGC7901 ir bgc-823 ląstelių tiek serumo starvation- ir chemoterapinių vaistų sukeltos apoptozės iki reguliavimo IFIT2, yra apoptozės tarpininką per mitochondrijų keliu, su potencialiu privalomą svetainėje Mir -645 į jo iRNR anketa 3'UTR srities. Tolesnis tyrimas eksponuojami kad IFIT2 išraiška mažėja SGC7901 ir BGC-823 ląstelių ir AGEJ audiniuose. IFIT2
negimdinis išraiška sukelia skatinimo ląstelių apoptozę, nurodant, kad IFIT2 gali veikti kaip iš AGEJ plėtros slopintuvas. Be to, slopinimas miR-645 skatinantys iki-reguliavimo IFIT2 ir padidėjo kaspazės-3/7 Aktyvumas lyginant su kontrolinės grupės.
Išvados
Mūsų duomenys rodo, kad Pasaulis-645 funkcijas kaip žmonijos AGEJ onkogeno kurį, tuo bent iš dalies per, orientacija IFIT2
.
Raktiniai žodžiai
adencarcinoma skrandžio stemplės jungties MicroRNA-645 IFIT2 apoptozę Background
Naujausi tyrimai parodė, kad adencarcinoma skrandžio stemplės jungties (AGEJ) yra skiriasi nuo distalinės skrandžio, su skirtingais rizikos veiksnių, vėžinių savybių, ir biologinio elgesio [1-4]. Be to, AGEJ dažnis didėjo per pastaruosius 30 metų, ypač JAV ir šiaurės Kinijoje [5-9].
Mikro RNR (miRNAs) yra organizme grupė išreiškė, ne kodavimo mažų RNR, 20- 25 nukleotidų ilgio, kurie yra žinomi neigiamai reguliuoti genų ekspresiją per sulaiko vertimą arba sumažinant mRNR stabilumą tiesiogiai prisijungdamas prie 3'-neišverstas regione (3'-UTR) tikslinių mRNR [10, 11]. Daugėja įrodymų rodo, kad miRNAs svarbius vaidmenis reguliuojant fiziologinius ir patologinius procesus, įskaitant plėtros [12], metabolizmas [13], ląstelių proliferacija [14], diferenciacija [15] ir apoptozės [16]. Be to, netipinė po transkripcijos reguliacija mRNR iki miRNAs yra susijęs su Tumorigenesis [17, 18]. buvo pranešta, kad aptiktas įvairių tipų žmogaus navikų, įskaitant plaučių [19], krūties [20], prostatos [21], kepenų [18], storosios žarnos [22] ir skrandžio vėžio [23] nenormalūs ekspresijos profilius miRNAs. Be to, kai miRNAs gali veikti kaip onkogenų [24-26] arba naviko Supressors [27, 28], reguliuojant jų tikslinių genų svarbius vaidmenis kurių pagrindinių kelių dalyvaujančių ląstelių ciklo progresavimo, apoptozės ar platinimu išraiška. miRNAs žemyn reguliuojama naviko pavyzdžių, pavyzdžiui, miR-22 [29, 30], ir miR-101 [31, 32], ir miR-7 [33, 34] paprastai veikti kaip Slopinamoji miRNAs, o miRNAs aktyvinama naviko pavyzdžių, tokių kaip ir miR-17 [35, 36], ir miR-21 [37, 38] paprastai daryti onkogeninių vaidmenį. Šie tyrimai rodo, kad reguliacijos sutrikimas ir miRNAs dažnai dalyvauja kancerogenezėje ir vėžio progresavimą.
Neseniai atliktas tyrimas parodė, kad Pasaulis-645, gali daryti su auglio slopinamojo vaidmenį Išplėstinė serozinis kiaušidžių vėžio MIR-645 yra neigiamai susijęs su bendra išlikimo jis [39]. Šioje studijoje, mes nustatėme, kad Pasaulis-645 išraiška buvo gerokai padidėjo AGEJ klinikinių mėginių, palyginti su suporuotas nevėžinės audinių naudojant MicroRNA lustai. Tačiau, miR-645 vaidmuo AGEJ tumorigenezei netirta dar. Daugiau tyrimas parodė, kad Pasaulis-645 taip pat buvo reikšmingai iki reguliuojama dviem skrandžio vėžys (GC) ląstelių linijas, SGC7901 ir bgc-823, kurie buvo naudojami kaip alternatyvūs ląstelių modelių Šio tyrimo. Slopinimas miR-645 į SGC7901 ir BGC-823 ląstelių reikšmingai slopino apie SGC7901 ir bgc-823 ląstelių apoptozę serumo bado ar chemoterapinio vaisto iki reguliavimo IFIT2, yra apoptozės tarpininką, su potencialiu privalomą svetainėje Mir būklės -645 į jo iRNR anketa 3'UTR srities. Sąvoka modelis miR-645 ir IFIT2 į AGEJ klinikinių mėginių buvo neigiamai koreliuoja, toliau rodo, kad IFIT2
yra tikslinio geno miR-645. Be to, slopinimas miR-645 rezultatų padidėjo kaspazė-3/7 veiklos, kuri yra aktyvuojamas IFIT2. Šiame tyrime mes ištirti, ar Pasaulis-645 yra iki reguliuojama žmogaus adencarcinoma skrandžio stemplės jungties ir slopina apoptozę nukreipiant auglio slopinamojo IFIT2.
Metodai
etikos taisyklės
audinių pavyzdžių, parašyta informuotas sutikimas buvo gauti iš pacientų. Naudojami šiame tyrime procedūros buvo patvirtintos pagal institucinius peržiūros valdybos Henan universiteto mokslo ir technologijų srityje ir buvo atitiko Helsinkio deklaraciją, ir vietos įstatymus.
Mobilaus ryšio linijų ir auginimo sąlygos
skrandžio vėžio ląstelių linijų SGC -7901, BGC-823 ir įamžino normalų skrandžio epitelio ląstelių linijos, GES-1 buvo maloniai suteikė prof Daiming gerbėjas. Visi ląstelių linijos išliko mūsų institute pagal rekomenduojamus protokolus. Ląstelės buvo auginamos RPMI-1640 terpėje (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), papildytoje su 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), esant 37 ° C temperatūroje, 5% CO2 inkubatoriuje.
žmogaus pavyzdžiai
institucinių peržiūros valdybos Henan universiteto mokslo ir technologijų Visi eksperimentiniai procedūros buvo patvirtintas. Parašė informuotas sutikimas buvo gautas visų pacientų mėginių. Žmogaus AGEJ pavyzdžiai (n = 43) ir pacientų suporuotas ne vėžiniai egzemplioriai buvo gauti iš ligonių iš pirmo susijusi ligoninėje, Henan universiteto mokslo ir technologijų, informuoto sutikimo kiekvienam pacientui.
RNR gryninimas, kDNR sintezės ir kiekybinis realaus laiko PGR (KRL-PGR)
viso RNR auginamų ląstelių ekstrahuojamas TRIzol reagento (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV) pagal gamintojo protokolą ir RNR buvo laikomi -80 ° C iki KRL-PGR analizės , Brandaus Pasaulis-645 išraiška buvo aptiktas naudojant mirVana TM KRL-PCR Mirna aptikimo rinkinį (Ambion Inc Ostinas, Teksasas), su U6 kaip vidaus kontrolė. IFIT2 išraiška buvo aptiktas su gruntais F: 5'AGCGAAGGTGTGCTTTGAGA 3 ", R: 5'GAGGGTCAATGGCGTTCTGA3" (gaminio ilgis: 125 bp; Tm: 60 ° C temperatūroje; GC%: F-50%, R-55%; pradėti-end: 643-748 bp) ir GAPDH buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. PGR produktai buvo atskirtos dėl etidžio bromido tamsintas 1,5% agarozės gelyje ir vizualizuoti su UV.
Mobilusis transfekcijq
žmogaus Pasaulis-645 dvipusio agomir (400 Nm), antagomir (400 nm) ir neigiamos kontrolės, buvo suprojektuota ir teikia Ribobio (Guangzhou, Guangdong, Kinija). Plazmidės IFIT2 ir neigiamos kontrolės plazmidės buvo įsigytas iš Ribobio Inc (Guangzhou, Guangdong, Kinija)
Mirna tikslas prognozavimas
rasti potencialių Mirna tikslines genus, TargetScanHuman svetainėje (http:.. //Www targetscan. org /) buvo naudojamas, įrišimo laisva energija buvo apskaičiuojamas ir Ofiarowana kaina aukcionuose vietos buvo analizuojami naudojant "http:.... //techfak bibiserv uni-Bielefeld dE /rnahybrid svetainė
Vector konstruktai ir liuciferazės reporteris tyrimas
statyti IFIT2-3'UTR plazmidės, laukinio tipo 3'-UTR fragmentas žmogaus IFIT2 mRNR (1226-1233 NT, GENBANK prisijungimas Nr. NM_001547.4), kuriame yra spėjamą Pasaulis-645 privalomą seka buvo papildyta RT-PGR ir klonuotas į tarp Xho I vieta, o ne aš pasroviui nuo liuciferazės reporterio geno psiCHECK ™ vektoriaus (Promega, JAV). Iš vieno Pasaulis-645 privalomą svetainėje mutantas (5'-AGCCTAG -3 "į 5'-TCGGATC -3) į 3'-UTR ir IFIT2 buvo įtraukta sait-mutagenezes Kit (SBS GENETECH, Pekinas, Kinija ). Laukiniai ir mutantas tipų pmirGLO-IFIT2-UTR vektoriai buvo patvirtinti DNR sekos
nukleotidų sekas gruntai IFIT2-3'UTR (WT) klonas.
IFIT2XhoIF2. 5'CCGCTCGAG AGAATAGAGATGTGGTGCCCACTAGGCTACTGCTG 3 "
IFIT2NotIR2: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TTAAAATGGAATCAGTGACTTTTATTTCTCATAACAGAG 3 "
nukleotidų sekas gruntai IFIT2-3'UTR (MT) klonas.
mutIFIT2F2: 5'TTCTAGGTAGATGCTGAATTCGGATCACATCAAAGTTGGTGTGAAC 3".
mutIFIT2R2: 5'GTTCACACCAACTTTGATGTGATCCGAATTCAAGEJTCTACCTAGAA 3 ' .
Ląstelės buvo pernešta su mir-645 imituoja, NC ir pmirGLO plazmidžių 24-duobučių lėkštelėse, naudojant lipofectamine ™ 2000 (INVITROGEN) pagal instrukcijas. 48 h vėliau, Ląstelės buvo surinktos ir analizuojami liuciferazės veiklos tyrimą, naudodamas Dual-liuciferazės reporterio testą sistema (PROMEGA, JAV) ir aptinka GloMaxTM 20/20 aptikimo sistema (E5331, Promega).
Kaspazė-07/03 tyrimas
kaspazės-3 ir veiklą kaspazė-7 buvo aptikta 96 šulinėlių formatu (2 × 10 3 ląstelių /gerai), naudojant kaspaze Glo 3/7 tyrimas (PROMEGA) pagal instrukcijas. 100 pL kaspazė-Glo 3/7 reagentas buvo papildytos į kiekvieną šulinėlį, ir inkubuojami kambario temperatūroje 1 valandą, o follwong liuminescencija buvo nustatytas taikant M200 mikroplokšteles fluorescencijos skaitytuvas (TECAN). Fonas liuminescencijos susijęs su ląstelių kultūros ir tyrimo reagento (tuščias reakcijos) buvo atimama iš eksperimentinės vertės.
MTT
ląstelės buvo pernešta su 100 nM Pasaulis-645 inhibitoriaus (Genepharma, Šanchajus, Kinija), imituoja (Ribobio Inc ., Guangdžou, Guangdong, Kinija), arba 100 nm plazmidės-IFIT2 (Ribobio Inc, Kinija). Dvidešimt keturios vėliau ląstelės buvo pasėjamos 96 duobučių lėkštelėse (2 × 10 3 /gerai). Ląstelių gyvybingumas išnagrinėjo MTT (3-2, 5-difenilo tetrazolio bromido) Analizės (Sigma, JAV) pagal instrukcijas nustatytu laiku.
Imunoblotingo
bendro baltymų iš išaugintų ląstelių buvo lizuoti lizės buferiniame tirpale kurių sudėtyje yra PMSF ant ledo. Tada baltymas buvo atliekama elektroforezė per 12% SDS poliakrilamido gelyje ir tada buvo perkeltas į PVDF membrana (Millipore). Membranos buvo užblokuotas su 5% lieso pieno miltelių kambario temperatūroje 1 valandą, o ir inkubuojami per naktį su pirminių antikūnų. Membranos buvo inkubuojami su antrinių antikūnų, ant kurių HRP 1 valandą, o kambario temperatūroje po tris 10 min plauna į TBS-T (triethanolaminebuffered fiziologinis tirpalas su Tween). Galiausiai signalai buvo aptikti naudojant ECL rinkinį (Pierce Biotech., Rockford, IL, JAV) ir membranos buvo nuskaitomi ir analizuojami naudojant Bio-Rad ChemiDoc XRS + vaizdo gavimo sistema su vaizdo programinę įrangą (versija Kiekis 1). Baltymų išraiška buvo normalizuojamas endogeninio nuoroda (tubulino) ir, lyginant su kontroliniu. Spectra daugiaspalvis plataus diapazono baltymų kopėčios ( "Fermentas") buvo naudojama kaip molekulinės persekiotoją. Visi antikūnai naudojami Vakarų dėmė tyrimo išvardyti papildomame faile 1: Lentelė S1
imunohistocheminis ir imunohistocheminis atsakomają
Parafino skyriai, 4-mkm storio, buvo kepama 2 h 65 ° C ir deparaffinized.. Antigenas paieška buvo atlikta naudojant citrato natrio buferio (pH 7.2), esant 95 ° C temperatūroje 15 minučių ir tada skaidres buvo atšaldytas iki kambario temperatūroje 30 minučių. Po to, kai gydomas su 3% vandenilio peroksido 15 minučių, kad blokuoti endogeninę peroksidaze, sekcijos buvo gydomi gebančiais skysčio normalus ožkos serumo 30 minučių, kad sumažinti nespecifinį ir tada triušis polikloninis anti-IFIT2 (1: 500, HPA003408, sigma-Aldrich. Šanchajus, Kinija) buvo inkubavome skyrius 12 valandų, esant 4 ° C temperatūroje. Po to, kai rewarming 1 h ir plovimo 5 kartus, dalys buvo inkubuotos su antriniais antikūnais 30 minučių kambario temperatūroje. Diaminobenzidinas (DAB) buvo naudojamas spalvų reakcijų. Po imunohistocheminį dažymo pelnytas, kaip aprašyta anksčiau [40].
Statistinė analizė
duomenys buvo pateikti kaip vidurkis ± SD trijų nepriklausomų eksperimentų. Dėl statistinių testų, SPSS statistiniu programinės įrangos paketas, version17.0 (SPSS, Čikaga, IL, JAV) buvo naudojamas. Studento T
-test, vienas ANOVA ir du ANOVA testas buvo atliekamas santykinio juostos tankis Imunoblotingo ir MTT optinio tankio vertės. Tarp miR-645 ir IFIT2 koreliacija analizuojami Spearman koreliacijos. P vertes. ≪ 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas
rezultatai
raiškos PPN-645 yra up-reguliuojami AGEJ klinikinių mėginių
Siekiant įvertinti PPN-645 vaidmenį AGEJ Tumorigenesis, mes pirmą kartą panaudotas KRL - PGR metodu išmatuoti Pasaulis-645 išraišką 43 žmogaus AGEJ klinikinių audinių ir nustatė, kad Pasaulis-645 buvo gerokai iki-reguliuojami AGEJ klinikinių audinių, lyginant su pacientų suporuotas skrandžio širdies nevėžinės audinių (1a pav.) Norėdami gauti daugiau įžvalgų į pirmiau minėtą stebėjimo, mes išnagrinėjo tarp Pasaulis-645 saviraiškos ir klinikinius parametrus pacientų santykius. Analizė parodė, kad Pasaulis-645 išraiška buvo nereikšmingas su amžiumi, lytimi, naviko diferenciacijos, limfmazgis metastazių ir TNM etape (1 lentelė: tarp klinikinius parametrus ir Pasaulis-645 raiškos pradinio skrandžio CARDIA adenokarcinoma santykius), bet buvo teigiama koreliacija su navikas dydis, būtent, auglio ilgis yra didesnis nei arba lygus 5 cm grupės parodė daug didesnio miR-645 išraiška, palyginti su naviko dydis yra mažesnis nei 5 cm grupė (1B pav & 1 lentelėje, t
-test, * P
= 0,045). 1 paveikslas Išraiškos PPN-645 yra up-reguliuojami AGEJ klinikinius mėginius. A. išraiška miR-645 į 43 žmonių AGEJ klinikinių mėginių, palyginti su gretimų suporuotas įprastų žmogaus skrandžio širdies nevėžinės audiniuose, buvo matuojamas kiekybinio RT-PCR (vertybės nurodyti vidurkis ± SEM, n = 3, T
-test, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001). B. palyginimas santykinio išraiškos PPN-645 žmogaus AGEJ klinikinių mėginių įvairaus naviko dydžio. (Du-tailed T
-test, * p < 0,05).
1 lentelė Ryšys tarp klinikinius parametrus ir Pasaulis-645 raiškos pradinio skrandžio CARDIA adenokarcinoma
Klinikinė parametrai
N (%)

Giminės išraiška (vidurkis ± SEM)

p-reikšmė
Amžius (metai)
≥ 60
15 (50) 2,1286 ± 0,59201
0,568
< 60
15 (50)
1,9571 0,52402
± Lytis
Vyras
18 (60)
2,1111 ± 0.42783 0.462
Moteris
12 (40)
2,3333 0,65328
± Dydis
≥5
13 (43,3)
2,7385 ± 100.128
0,004 *
< 5
17 (56,7)
1,8235 ± 1,52214
histologinio diferenciacija
Na (W),
15 (50)
2,138 ± 0,1866
0,9427
Prastai (P),
15 (50)
2,198 ±
limfinės metastazės
Taip
12 (40)
2.4583 0.77864
± <0,1903; 0,001 **
Nėra
18 (60)
1,4944 1,36273
± TNM stadija
I etapas /II
16 (53,3)
2.9125 1.33660
± < 0,001 **
III etapas /IV
14 (46,7)
1.4857 ± 0,73991
(* p <
0,05; ** P. ≪
0,001)
išeikvojimas miR-645 skatina apoptozę skrandžio vėžio ląstelių
Ištirti PPN-645 vaidmenį fenotipo savybes AGEJ progresavimo, mes panaudojome du skrandžio vėžiu ( GC) ląstelių linijas, SGC7901 ir BGC-823 kaip ląstelių modelius. KRL-PGR rezultatai parodė, kad Pasaulis-645 išraiška buvo gerokai iki reguliuojama palyginti su įamžinta GC ląstelių linijos, GES-1 (Papildoma failą 2: Pav S1 P
< 0,001).
SGC7901 ir BGC-823 ląstelės buvo laikinai perkeltų su brandaus Pasaulis-645 imituoja, inhibitorius, maketas perkeltų arba miR-NC. Kaip parodyta 2A ir D pav kiekybiniai RT-PGR rezultatai rodo, kad išraiška miR- 645 imituoja arba inhibitorių gerokai iki reguliuoti arba žemyn reguliuoti atitinkamai raiškos lygį PPN-645, iš SGC7901 ir bgc-823 ląstelių iš pirma-penkta diena po transfekciją (2A pav P
< 0,001; 2D pav P
< 0,001), palyginti su NC ir juoktis kontrolės. 2 pav išeikvojimas miR-645 skatina apoptozę skrandžio vėžio (GC) ląsteles. "A & D. Iš miR-645 lygis buvo matuojamas kiekybine PGR nustatytu laiku (ANOVA analizę, vertės rodo, vidurkis ± SD, 2a pav F = 426,588, p < 0,001; 2D pav F = 685,026, p < 0,001). B & El. GC ląstelės transfekuotos Pasaulis-645 imituoja ir inhibitorius, atliekamas MTT parą 6 dienas (du ANOVA analizės, 2b pav F = 52.602, p < 0,001; 2E paveiksle, f = 42.847, p < 0,001). K & F. GC ląsteles, perkeltų su Pasaulis-645 imituoja ir inhibitorius buvo renkami FACS analizė po 72 h (vertybės nurodyti vidurkis ± SD, n = 3, ANOVA analizė, 2C-figūra, M = 121,600, p < 0,001; pav 2C-b, f = 250,400, p < 0,001; Fa pav, F = 194,815, p < 0,001; pav 2F-b, f = 412,741, p < 0,001)
SGC7901 ir BGC-. 823 ląstelių transfektuotose Pasaulis-645 inhibitorių ir imituoja parodė žymiai mažesnis ir aukštesnio lygio ląstelių proliferaciją, atitinkamai, palyginimui su NC ar juoktis grupių ADR akivaizdoje (0,2 mikrogramų /ml), kaip nustatyta MTT (2b pav, P
< 0,001; 2E pav P
< 0,001)
Anniex Vapoptosis tyrimas eksponuojama didelė padidėjo ir sumažėjo apoptozę kainos PPN-645 išeikvojimo ir negimdinio raiškos grupes, palyginti su NC grupių laisvas serumo. sąlyga arba priešvėžinės narkotikų, adriamicino (ADR) (pav 2C ab, P
<buvimą; 0,001; 2 pav F ab, P
< 0,001).
IFIT2 yra miR-645 tikslas
Ankstesnės duomenys rodo, kad Pasaulis-645 gali būti pažangių serozinis kiaušidžių vėžio onkogeno. Taigi mes ir toliau ieškoma potencialių taikinių PPN-645 iki algoritmas Target Scan žmogus. Tarp jų, IFIT2, navikas slopintuvas, buvo nustatyta, kad spėjamas Pasaulis-645 privalomus svetaines per savo 3'UTR srities (3a pav.) Tada mes atliekame liuciferazės reporterio testą, naudojant SGC7901 ir BGC-823 ląstelių patikrinti, ar IFIT2 buvo tiesioginė tikslinė miR-645. Laukinio tipo ir mutantas IFIT2-3'UTR kuriame spėjamą prijungimo vietą PPN-645 buvo klonuotas į psiCHECK-2 vektoriaus pasroviui nuo liuciferazės geno (Papildoma failų 3: S2 pav). Įvadas miR-645 sumažino lucirferase veikla iš IFIT2 3'UTR reporteris vektoriaus žymiai (3b pav P
< 0,001; Fig.3C, p pervežimas < 0,001), tačiau neturėjo įtakos lucirferase veiklą nuo mutantas IFIT2 3'UTR reporteris vektorius, remti tiesioginę sąveiką PPN-645 su IFIT2. Šie rezultatai rodo, kad toliau Pasaulis-645, gali slopinti IFIT2 išraišką nukreipiant 3'-UTR iš IFIT2 mRNR. 3 pav Validating prognozuojamas privalomus svetainių tarp miR-645 ir IFIT2. A. schema rodo Luc-IFIT2 3'UTR srities ir Luc IFIT2 3'Mut UTR konstruktą. Tiek Luc IFIT2 3'UTR ir Luc IFIT2 3'Mut UTR buvo klonuotas į pmirGLO plazmidžių pasroviui Firefly liuciferazės kodavimo regioną tarp PmeI ir Xbal svetainėse. B & C. SGC7901 ląstelės (B) arba bgc-823 ląstelių (C) buvo bendrai, į kurias psiCHECK-2 konstruoja, kurių sudėtyje yra arba IFIT2 3'UTR arba IFIT2 3'Mut UTR ir arba Mir-645 inhibitoriaus arba MIR-645 imituoja 48 val. Vertės rodo santykinį liuciferazės veikla sunormalėja į Renilla liuciferazės veikla (vertybės nurodyti vidurkis ± SD, n = 3, ANOVA analizė, pav 3B, F = 283,244, Fig.3C F = 143,313. *** P <,. 0,001)
išraiška miR-645 ir IFIT2 yra neigiamai susijęs ir AGEJ klinikinių mėginių
toliau vertinti tarp miR-645 ir IFIT2 santykį, mes išnagrinėjo IFIT2 išraišką 43 AGEJ klinikinių mėginių, naudojant KRL PGR , Buvo nustatyta, AGEJ audiniai turėjo nepaprastą mažesnę raišką lygį IFIT2 nei suporuotas nevėžinės audinių (4a paveikslas) ir IFIT2 išraiška buvo atvirkščiai koreliuoja su naviko dydis (4b paveikslas, p = 0,0304
). Būtent, auglio ilgis yra didesnis nei arba lygi 5 cm grupės parodė reikšmingas žemyn reguliuojama IFIT2 išraiška, palyginti su naviko dydis yra mažesnis nei 5 cm grupės. Patvirtinti duomenis, mes vėliau matuojamas baltymo ekspresiją iš IFIT2 Imunoblotingo metodu (4c paveikslas a-b), ir rezultatai parodė, modelį, panašų į stebėjimų rasti KRL-PGR. Imunohistocheminis tyrimas eksponuojama didelė sumažėjo išraiška IFIT2 į AGEJ audinių suporuotas ne vėžiniai audiniai (4d pav a-b, P <
0,001). Tada mes analizavo tarp miR-645 ir IFIT2 santykius išraiška ir nustatė, kad IFIT2 išraiška lygis neigiamai koreliuoja su tuo miR-645 (4E figūra, P <
0,01). Be to, SGC7901 (pav 4F a) ir BGC-823 (pav 4F b) ląstelės transfekuotos su miR-645 inhibitoriaus žymiai padidėjo IFIT2 išraiška tuo baltymų ir iRNR lygio, palyginti su natūralaus modelio ir NC grupių (pav 4F ab, P <
0,01). Mūsų išvados rodo, kad Pasaulis-645, gali tiesiogiai reguliuoti IFIT2 išraiška. 4 pav išraiška miR-645 ir IFIT2 neigiamai koreliuoja į AGEJ klinikinius mėginius ir IFIT2 buvo žemyn reguliuojama AGEJ audinių palyginti su suporuotas nevėžinės audiniuose. A. išraiška IFIT2
ir miR-645 į AGEJ klinikinių mėginių buvo analizuojami kiekybinio PGR. B. palyginimas santykinio išraiška IFIT2
žmogaus AGEJ klinikinių mėginių įvairaus naviko dydžio. (T
-test, * p < 0,05). C. išraiška IFIT2 išnagrinėjo Imunoblotingo (A, B: vertybės nurodyti vidurkis ± SD, normalizuojama iki tubulino n = 3, T
-test, *** p
< 0,001), D. a. Reprezentacinės parodyti vaizdai, kurie yra teigiami imunohistocheminis dažymas IFIT2 žmogaus AGEJ egzempliorių ir suderintų gretimuose normaliuose audiniuose (priartinimu 200 ×). b. Dažymo balų IFIT2 (t
-test, *** p
< 0,001). E. Taškinė sklypai, rodantys neigiamą tiesinę koreliaciją tarp iRNR raiška IFIT2
ir kad miR-645 43 AGEJ klinikinius mėginius. F. IFIT2 and IFIT2
išraiška matuojama Imunoblotingo į SGC7901 (A) ir BGC-823 ląstelių (B). (Vertybės nurodyti vidurkis ± SD, n = 3, ANOVA analizė, *** p
< 0,001)
IFIT2 tarpininkauja dėl PPN-645 funkciją skatinant SGC7901 ir bgc-823 ląstelių. apoptozė
Norint patvirtinti, kad ląstelių apoptozės indukcija SGC7901 ir bgc-823 ląstelių miR-645 buvo tarpininkaujant nukreipiant IFIT2
, mes atliekame IFIT2
plazmidžių transfekcijq į SGC7901 (5a pav) ir bgc-823 (5b pav) ląstelės į iki-reguliuoti IFIT2 išraiška. Imunoblotingu ir kiekybinė PGR parodė, kad iki-reguliavimo IFIT2 pagal IFIT2
plazmidžių transfekciją gali būti žymiai sumažėjo Pasaulis-645 imituoja. MTT parodė, kad ląstelės transfekuotos su plazmidės-IFIT2 platinimo buvo nuslopinta, tačiau, ląstelės transfekuotos su miR-645 imituoja platinimo labai padidėjo, palyginti su plazmidės-kontrolės ir plazmidė-IFIT2 + miR-645 grupės (pav 5C ab, P <
0,001). Be to, įvedimas IFIT2 skatinamas apoptozę SGC7901 ir bgc-823 ląstelių ir miR-645 imituoja sumažintą apoptozę ląstelių sukeltų IFIT2 iki reguliavimą, palyginti su NC grupės ADR akivaizdoje (pav 5E-F, P <
0,001). Mūsų išvados rodo, kad IFIT2 tarpininkaujant su PPN-645 funkcijos slopinimas SGC7901 ir BGC-823 ląstelių proliferaciją ir sukelia ląstelių apoptozę. 5 pav IFIT2 tarpininkauja dėl PPN-645 funkciją skatinant GC ląstelių apoptozę. A & B. Išraiška IFIT2 išnagrinėjo Imunoblotingo (A. SGC7901, B, BGC-823 A, normalizuojama iki tubulino, vertybės nurodyti vidurkis ± SD, ANOVA analizė, už SGC7901, f = 189.307, už bgc-823, F = 85,374; b, vertybės nurodyti vidurkis ± SD, ANOVA analizė, už SGC7901 F = 85,374, už bgc-823, M = 219,921; *** p
< 0,001). C. SGC7901 (A) ir BGC-823 (B) ląstelės, pajungtos MTT parą 6 dienas (reikšmės rodo vidurkis ± SD, dvipusis ANOVA analizę, už SGC7901 F = 13,768, už bgc-823, F = 16,409, *** p
< 0,001). D & El. SGC7901 (D) ir BGC-823 (E) ląstelės buvo renkami FACS analizė po 72 h, ADR akivaizdoje (0,05 g /ml) (vertybės nurodyti vidurkis ± SD, n = 3, ANOVA analizė; už SGC7901, f = 361.749, už bgc-823, f = 229.952; *** p
. < 0,001)
išeikvojimas ir up-reguliavimo miR-645 pakeitė kaspaze-3/7 aktyvumas
IFIT2 buvo pranešta, kad navikas slopintuvas per tarpininkauti ląstelių apoptozę per aktyvuoti kaspaze-3/7 aktyvumas. Kaspazės-Glo 3/7 tyrimas parodė, kad Pasaulis-645 išeikvojimas gerokai iki reguliuojama, o Pasaulis-645 raiškos Down reglamentavo kaspaze-3/7 Aktyvumas palyginti su juoktis ir NC grupių ADR akivaizdoje (0,2 g /ml) (6A pav ir B, P <
0,001) arba serumo badas sąlyga (6C pav ir D, čia P <
0,001). Šie rezultatai kartu su pirmiau nurodytų stebėjimų rodo, kad Pasaulis-645, iki reguliuojama žmogaus AGEJ audinių, inhibuoja ląstelių apoptozę ir skatina tumorogeniš- per sulaiko kaspaze-3/7 veiklą nukreipiant IFIT2. 6 pav kaspazės-3/7 Aktyvumas. Anti-aprotoninis gebėjimas SGC7901 ląstelių ir bgc-823 ląstelių po kontakto su ADR (0,2 mikrogramų /ml) arba serumo bado buvo įvertintas kaspazių-3/7 veiklą. A & C, SGC7901 ląstelės; B & D BGC-823 ląstelių. (Vertybės nurodyti vidurkis ± SD, n = 3, One-way ANOVA analizę; A, F = 183.930, B, F = 1093.797, nes, C, F = 1861,50, D, F = 1483.604, *** p
. < 0,001)
aptarimas ir išvados
Nors kaupti įrodymus parodė, kad miRNAs reguliavimo panaikinimas yra susijęs su naviko Kancerogeninis ir progresavimo, migracijos ir invazijos [41], metastazių [42, 43] ir atsparumas vaistams [44-46]. Mažai žinoma apie miRNAs vaidmenis adencarcinoma skrandžio stemplės jungties (AGEJ) plėtrą. Čia mes parodėme, kad Pasaulis-645 išraiška buvo gerokai padidėjo AGEJ klinikinių mėginių, palyginti su suporuotas nevėžinės audinių ir buvo gerokai iki reguliuojama dviem skrandžio vėžys (GC) ląstelių linijas, SGC7901 ir bgc-823, kuris buvo naudojamas alternatyvus Mobilaus ryšio modeliai, nes nėra laisvų AGEJ ląstelių linijos buvo įkurta iki šiol. Slopinimas miR-645 į SGC7901 ir BGC-823 ląstelių gerokai sukeltos apoptozę SGC7901 ir bgc-823 ląstelių serumo bado ar chemoterapinio vaisto iki reguliavimo IFIT2 būklės,
yra apoptozės tarpininką, su potencialiu privalomą svetainėje mir-645 savo mRNR anketa 3'UTR srities. Sąvoka modelis miR-645 ir IFIT2 į SGC7901 ir BGC-823 ląstelių ir klinikinių mėginių buvo neigiamai koreliuoja, toliau rodo, kad IFIT2
yra tikslinio geno miR-645. Be to, slopinimas miR-645 rezultatų padidėjo kaspazė-3/7 veiklos, kuri yra aktyvuojamas IFIT2. Visi šie faktai rodo, pagrindinį vaidmenį PPN-645 į kancerogenezėje, ypač AGEJ plėtrai.
Per mažai apoptozę yra vienas esminis priežastis kancerogenezėje nes piktybinių ląstelių mirtis yra nepaprastai sumažintas [47, 48], todėl piktybinę transformaciją paveiktų ląstelių navikas metastazės ir rezistencijos vėžinių ląstelių daugiskaitos. Taigi, apoptozės yra labai svarbi vėžio gydymui ir yra populiariausias veiksmo iš daugelio gydymo strategijų. Šiame tyrime mes parodėme, kad Pasaulis-645 negalią turintys vėžio ląstelių serumo atėmimo sukeltos apoptozės, o miR-645 išeikvojimas slopinti šį PPN-645 poveikį, o tai rodo, kad Pasaulis-645, gali vaidinti svarbų vaidmenį vėžio prisitaikymo ląstelės mažo mitybos. Vis daugiau miRNAs buvo susijęs su vėžio ląstelių apoptozę. Viena vertus, mikro RNR gali veikti kaip auglio slopinamojo per apoptozės sužadinimui, t.y. miR-421, kuris skatina ląstelių proliferaciją ir atsparumą apoptozę žmogaus nosiaryklės karcinoma per žemyn reguliavimo FOXO4 [49]; Pasaulis-149, kuri indukuoja apoptozę slopindamas Akt1 ir E2F1 žmogaus vėžinių ląstelių [50] ir Mirna-31, kuri indukuoja apoptozę žmogaus neuroblastoma ląstelių [51]. Kita vertus, mikro RNR gali veikti kaip onkogenų slopina apoptozę, t.y. miR-24, kuris slopina apoptozę ir slopina BIM pelių kardiomiocitų [52]; Pasaulis-886-5p, kuris slopina apoptozę DOWN reguliavimo Bax išraiška žmogaus Gimdos kaklelio vėžys ląstelių [53], ir Pasaulis-183, kuris slopina TGF-β1 sukeltos apoptozės iki downregulation iš PDCD4 išraiška žmogaus kepenų ląstelių karcinoma ląstelių [54] .
ISGs, IFN skatino genų, skaitykite genų, kurie tanscribed iki IFNs indukcija. Tarp jų, 4 gali žaisti svarbius vaidmenis, kurie turi įtakos tiek virusų replikaciją slopinimas ir ląstelių proliferacijos slopinimą [55, 56]. Šie genai gali slopinti viruso replikacija aukojant ląstelių skatinant apoptozės ir slopinti vėžio progresavimą per slopindamas Zjadliwie transformuotą ląstelių išgyvenimą dėl priimančiosios [57] naudai. Visi autoriai skaityti ir patvirtino galutinį rankraštį.

• Proteome analizė žmogaus skrandžio CARDIA adenokarcinoma lazeriniu surinkimo microdissection
• Gydomasis potencialas PRL-3 nukreipimą ir klinikinė reikšmė PRL-3 genomo amplifikacijos skrandžio vėžio