MicroRNA-645, säädellään ylöspäin ihmisen adencarcinoma mahalaukun ruokatorven risteyksessä, estää apoptoosin kohdentamalla tuumorisuppressoriproteiinia IFIT2

MicroRNA-645, säädellään ylöspäin ihmisen adencarcinoma mahalaukun ruokatorven risteyksessä, estää apoptoosin kohdentamalla tuumorisuppressoriproteiinia IFIT2
Abstract
Taustaa
yhä useammat todisteet osoittavat, että miRNA on ratkaiseva rooli syövän synnyssä ja syövän etenemisen; kuitenkin, rooli miRNA että kasvainten synnyssä on adencarcinoma mahalaukun ruokatorven risteyksessä (AGEJ) on paljolti epäselvä. Tool Menetelmät
SGC7901 ja BGC-823 mahasyövän solulinjoja käytettiin. Ilmaukset miR-645 ja IFIT2 (interferoni aiheuttama proteiinin tetratricopeptide toistuu 2) tutkittiin qRT-PCR, ilmaukset IFIT2 tutkittiin western blottauksella ja immunohistokemia määritys. Solun apoptoosi määritettiin FACS: llä. MiR-645 estäjä, jäljittelee ja plasmidi-IFIT2 transfektiot suoritettiin tutkimaan tappiota ja voitto-toiminto. Kaspaasi 3/7 aktiivisuus tutkittiin kaspaasi-3/7 määrityksessä.
Tulokset
Tässä tutkimuksessa olemme raportoitu lisääntyneen ekspression miR-645 AGEJ kliinisissä näytteissä verrattuna pariksi ei-syöpä kudoksiin. Havaitsimme myös merkittävä miR-645 ylössäätöä kahdessa mahasyövässä (GC) solulinjat, SGC7901 ja BGC-823, jota käytettiin solumalleja koska ei ollut saatavilla AGEJ solulinjat perustettiin tasalla. Huomasimme, että esto miR-645 voi herkistää dramaattisesti SGC7901 ja BGC-823 solujen sekä seerumin starvation- ja kemoterapeuttisen lääkkeen aiheuttama apoptoosin jopa säätelevä IFIT2, välittäjänä apoptoosin kautta mitokondrion koulutusjakson, joilla on mahdollisesti sitoutumiskohdan miR -645 sen mRNA: n 3'UTR. Lisätutkimuksissa näytteillä että IFIT2 ilmaisu laskee SGC7901 ja BGC-823 soluja ja AGEJ kudoksia. IFIT2
ektooppinen ekspressoituminen johtaa edistämiseen solujen apoptoosia, mikä osoittaa, että IFIT2 voi toimia vaimentimen kehittämisessä AGEJ. Lisäksi esto miR-645 indusoi säätely ylöspäin IFIT2 ja lisääntynyt kaspaasi-3/7-aktiivisuus verrattuna kontrolliryhmiin.
Johtopäätökset
Tuloksemme viittaavat siihen, että miR-645 toimii onkogeenin ihmisen AGEJ by kello ainakin osittain läpi, kohdistaminen IFIT2
.
avainsanat
adencarcinoma maha- ruokatorven risteyksessä microRNA-645 IFIT2 Apoptosis tausta
Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että adencarcinoma mahalaukun ruokatorven risteykseen (AGEJ) on erillään distaalista vatsa, joilla on erilaiset riskitekijät, kasvainten ominaisuuksiin, ja biologista käyttäytymistä [1-4]. Lisäksi esiintyvyys AGEJ on kasvanut 30 viime vuoden aikana erityisesti Yhdysvalloissa ja Pohjois-Kiinassa [5-9].
MikroRNA (miRNA) ovat ryhmä endogeenisesti ilmaistu, ei-koodaavan pieni RNA: t, 20- 25 nukleotidin pituisia, joiden tiedetään säädellä negatiivisesti geeniekspression vaimentamiseksi kääntämisen tai vähentämällä vakautta mRNA: iden suoraan sitovia 3'-transloimaton alue (3'-UTR) ja kohde-mRNA: iden [10, 11]. Kertyvät todisteet osoittavat, että miRNA on tärkeä rooli säätelyssä fysiologisia ja patologisia prosesseja, mukaan lukien kehittäminen [12], aineenvaihdunta [13], solujen lisääntymistä [14], erilaistumiseen [15] ja apoptoosin [16]. Lisäksi poikkeava posttranskriptionaalisen sääntely mRNA: iden miRNA liittyy tuumorigeneesiin [17, 18]. Epänormaali ilmentyminen profiilit miRNA on raportoitu havaita eri ihmisen kasvaimissa, kuten keuhko- [19], rintojen [20], eturauhassyöpä [21], maksan [18], paksusuolen [22] ja mahasyövän [23]. Lisäksi jotkut miRNA voi toimia onkogeenien [24-26] tai kasvain supressors [27, 28] säätelemällä mielipiteenilmaisun kohdegeenien joilla on tärkeitä rooleja joitakin keskeisiä reittejä mukana solusyklin etenemisen, apoptoosin tai lisääntymistä. miRNA alas-säädellä tuumorin näytteiden, kuten miR-22 [29, 30], miR-101 [31, 32], ja miR-7 [33, 34], toimivat yleensä niin tukahduttava miRNA, kun taas miRNA yläreguloituja Tuumorinäytteet kuten miR-17 [35, 36], ja miR-21 [37, 38] on yleensä käyttää onkogeenisia rooleja. Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että häiriöstä miRNA on usein osallisena syövän synnyn ja syövän etenemistä.
Tuoreessa tutkimuksessa on osoitettu, että miR-645 voidaan käyttää kasvain vaimennin rooli kehittynyt serous munasarjasyövän Mir-645 on negatiivisesti liittyy eloonjäämisaste se [39]. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että miR-645 ilmentyminen oli lisääntynyt AGEJ kliinisissä näytteissä verrattuna pariksi ei-syöpä kudoksiin käyttämällä microRNA pelimerkkejä. Kuitenkin rooli miR-645 on kasvainten synnyssä on AGEJ ei ole tutkittu vielä. Lisäksi tutkimus osoitti, että miR-645 oli myös merkitsevästi säädellään ylöspäin kaksi mahasyövässä (GC) solulinjat, SGC7901 ja BGC-823, jota käytettiin vaihtoehtoisia solumalleja esillä olevassa tutkimuksessa. Esto miR-645 SGC7901 ja BGC-823 solut merkittävästi tukahdutti apoptoosin SGC7901 ja BGC-823 solujen kunnon seerumistarvaatio moterapeuttisista lääkettä jopa säätelevä IFIT2, välittäjänä apoptoosin, joilla on mahdollisesti sitoutumiskohdan miR -645 sen mRNA: n 3'UTR. Ekspressiokuviota miR-645 ja IFIT2 in AGEJ kliinisissä näytteissä oli negatiivinen korrelaatio, lisäksi viittaa siihen, että IFIT2
on kohdegeeni miR-645. Lisäksi esto miR-645 johtaa lisääntyneeseen kaspaasi-3/7 aktiivisuutta, joka aktivoituu IFIT2. Tässä tutkimuksessa tutkimme onko miR-645 on säädelty ihmisen adencarcinoma mahalaukun ruokatorven risteyksessä ja estää apoptoosin kohdentamalla kasvaimia estävä IFIT2. Tool Menetelmät
Ethics selvitys
varten kudosnäytteitä, kirjallinen suostumus oli saatu potilailta. Menettelyt Tässä tutkimuksessa käytetyt hyväksyi Institutional Review Board of Henan yliopiston tiede ja teknologia ja sen sopeutui Helsingin julistuksen ja paikallisen lainsäädännön.
Solulinjat ja viljelyolosuhteet
Mahasyöpää solulinjoissa SGC -7901, BGC-823 ja kuolemattomaksi normaali mahan epiteelisolujen linja, GES-1 oli ystävällisesti lahjoittanut professori Daiming Fan. Kaikki solulinjat pidettiin meidän instituutti mukaan suositellaan protokollia. Soluja viljeltiin RPMI-1640-alustassa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 37 ° C: ssa 5% CO 2-inkubaattorissa.
ihmisen yksilöt
Kaikki koetoimenpiteet hyväksyi Institutional Review Board of Henan yliopiston tiede ja teknologia. Kirjallinen suostumus saatiin kaikkien potilaiden näytteistä. Ihmisen AGEJ yksilöt (n = 43) ja potilaan pariksi ei-syöpä näytteet saatiin potilailta ensimmäisessä sidoksissa sairaalaan, Henan University of Science and Technology, jossa tietoisen suostumuksen kustakin potilaasta.
RNA puhdistus, cDNA-synteesi ja määrällinen real-time PCR (qRT-PCR)
Yhteensä RNA viljellyistä soluista uutettiin TRIzol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan protokollan ja RNA: t säilytettiin -80 ° C: ssa, ennen kuin qRT-PCR-analyysi . Aikuinen miR-645 ekspressiota havaittiin käyttämällä Mirvana TM qRT-PCR miRNA Detection Kit (Ambion Inc. Austin, Texas), jossa U6 sisäisenä kontrollina. IFIT2 ekspressio havaittiin alukkeilla, F: 5'AGCGAAGGTGTGCTTTGAGA 3 ', R: 5'GAGGGTCAATGGCGTTCTGA3 (tuotteen pituus: 125 bp, Tm: 60 ° C; GC%: F-50%, R-55%, alkaa lopussa: 643-748 bp) ja GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. PCR-tuotteet erotettiin etidiumbromidilla värjätty 1,5% agaroosigeelillä ja visualisoitiin UV.
Cell transfektio
Ihmisen miR-645 duplex AGOMIR (400 nM), antagomir (400 nM) ja negatiivinen kontrolli on suunniteltu ja tarjoamat Ribobio (Guangzhou, Guangdong, Kiina). Plasmidi-IFIT2 ja negatiivisen kontrollin plamida ostettiin Ribobio Inc (Guangzhou, Guangdong, Kiina).
MiRNA tavoite ennustus
löytää mahdollisia miRNA kohdegeenien, TargetScanHuman verkkosivuilla (http: //www. Targetscan. org /) käytettiin, sitova vapaa energia on laskettu ja biding sivustot analysoitiin käyttämällä http: //bibiserv. techfak. uni-Bielefeld. de /rnahybrid verkkosivuilla.
kuva konstruktioita ja lusiferaasireportterilla määritys
rakentamiseksi IFIT2-3'UTR plasmidi, villityypin 3'-UTR-fragmenttia ihmisen IFIT2 mRNA (1226-1233 nt, Genbank-no. NM_001547.4), joka sisältää oletetun miR-645 sitoutuva sekvenssi monistettiin RT-PCR: llä ja kloonattiin n välissä Xho I: n ja Not I alavirtaan lusiferaasireportterigeenillä on psiCHECK ™ -vektoriin (Promega, USA). Mutantti yksittäisen miR-645 sitoutumiskohta (5'AGCCTAG -3 'to 5'TCGGATC -3) 3'-UTR IFIT2 sisällytti mutageneesillä Kit (SBS Genetech, Peking, Kiina ). Villi ja mutantti tyyppisiä pmirGLO-IFIT2-UTR vektorit validoitu DNA-sekvensoinnilla.
Nukleotidisekvenssit alukkeiden IFIT2-3'UTR (WT) klooni:
IFIT2XhoIF2: 5'CCGCTCGAG AGAATAGAGATGTGGTGCCCACTAGGCTACTGCTG 3 '.
IFIT2NotIR2: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TTAAAATGGAATCAGTGACTTTTATTTCTCATAACAGAG 3 '.
nukleotidisekvenssit alukkeiden IFIT2-3'UTR (MT) klooni:
mutIFIT2F2: 5'TTCTAGGTAGATGCTGAATTCGGATCACATCAAAGTTGGTGTGAAC 3'.
mutIFIT2R2: 5'GTTCACACCAACTTTGATGTGATCCGAATTCAAGEJTCTACCTAGAA 3 ' .
Solut transfektoitiin miR-645 jäljittelee, NC ja pmirGLO plasmidi 24-kuoppaisilla levyillä käyttäen lipofektamiinia ™ 2000 (Invitrogen) ohjeiden mukaisesti. 48 tuntia myöhemmin, solut kerättiin ja analysoitiin lusiferaasiaktiivisuus käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA) ja havaita GloMaxTM 20/20 tunnistusjärjestelmä (E5331, Promega).
Kaspaasi-3/7 määritys
kaspaasi-3 ja kaspaasi-7 havaittiin 96-kuoppaformaatissa (2 x 10 3 solua /kuoppa) käyttäen kaspaasi-Glo 3/7 Assay (Promega) ohjeiden mukaan. 100 ui Caspase-Glo 3/7 reagenssi täydennettiin kuhunkin kuoppaan ja sitten inkuboitiin huoneenlämpötilassa 1 h follwong luminesenssi havaittiin käyttäen M200 mikrolevyn fluoresenssin (TECAN). Taustalla luminenssi liittyvät soluviljelmässä ja määritysreagenssikoostumusta (tyhjä reaktio) vähennettiin kokeellisesta arvosta.
MTT-määritystä
transfektoitiin 100 nM miR-645 estäjä (Genepharma, Shanghai, Kiina), matkii (Ribobio Inc ., Guangzhou, Guangdong, Kiina) tai 100 nM plamida-IFIT2 (Ribobio Inc., Kiina). Kaksikymmentäneljä myöhemmin solut siemennettiin 96-kuoppalevyillä (2 x 10 3 /kuoppa). Solujen elinkelpoisuus tutkittiin MTT: tä (3-2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi) määritystä (Sigma, USA) ohjeiden mukaan nimetyissä aikaa.
Western blotting
Yhteensä proteiinin viljellyistä soluista lyysattiin Lysis Buffer joka sisältää PMSF jäällä. Sitten proteiini ajettiin elektroforeesilla 12% SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin sitten PVDF-kalvolle (Millipore). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitojauhetta huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan ja inkuboitiin yön yli primaarisilla vasta-aineilla. Membraanit inkuboitiin toissijaisen vasta-aineilla leimattu HRP 1 h jälkeen huoneenlämpötilassa kolme 10 minuutin pesua TBS-T: n (triethanolaminebuffered suolaliuos Tween). Lopuksi, signaalit havaittiin käyttämällä ECL (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) ja kalvot skannattiin ja analysoitiin käyttäen Bio-Rad ChemiDoc XRS + kuvantamisjärjestelmä kuvankäsittely (versio määrä 1). Proteiini ilmentyminen normalisoitu endogeenistä viite (Tubulin) ja suhteessa kontrolliin. Spectra monivärinen laaja kantaman proteiini tikapuut (Fermentas) käytettiin molekyyli- merkki. Kaikki käytetyt vasta-aineet western blot -määritys on lueteltu Muihin tiedosto 1: Taulukko S1.
Immunohistokemia ja immunohistokemiallinen pisteytys
Parafiinisektioista, 4 um paksu, paistettiin 2 h 65 ° C: ssa ja parafiini. Antigeeni haku suoritettiin käyttäen sitraatti- natrium-puskuria (pH 7,2) 95 ° C: ssa 15 minuuttia ja sitten liukuu jäähdytettiin huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Sen jälkeen, kun käsiteltiin 3% vetyperoksidia 15 minuutin estää endogeenisen peroksidaasin, leikkeet käsiteltiin normaalilla vuohen seerumilla rajoittamalla nesteen 30 minuuttia vähentää ei-spesifisen sitoutumisen ja sitten kanin polyklonaalista anti-IFIT2 (1: 500, HPA003408, Sigma-Aldrich. Shanghai, Kiina) inkuboitiin osiot 12 tuntia 4 ° C: ssa. Jälkeen rewarming 1 h ja pesu 5 kertaa, leikkeitä inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen kanssa 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Diaminobentsidiiniä (DAB) käytettiin värireaktiot. Myöhemmät immunohistokemiallisella värjäyksellä teki kuten aiemmin on kuvattu [40].
Tilastollinen analyysi
Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tilastollista testeissä, SPSS-ohjelmisto, version17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) käytettiin. Opiskelijan t
-testissä, yksisuuntainen ANOVA ja kaksisuuntainen ANOVA testi tehtiin suhteellisen bändi tiheyden western blotting ja MTT OD-arvot. Korrelaatio miR-645 ja IFIT2 analysoitiin Spearmanin. P-arvot < 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.
Tulokset
ilmaisujen miR-645 ovat säädellään ylöspäin AGEJ kliinisissä näytteissä
arvioimiseksi roolin miR-645 on kasvainten synnyssä on AGEJ, ensin käytetty qRT - PCR tapa mitata miR-645 ilmentymä 43 ihmisen AGEJ kliininen kudoksista, ja havaitsi, että miR-645 oli merkitsevästi säädellään ylöspäin AGEJ kliinisissä kudoksissa verrattuna potilaan pariksi mahalaukun sydän- ei-syöpä kudoksiin (kuvio 1A). Päästääkseen oivalluksia havainto edellä mainittiin, tutkimme suhdetta miR-645 ilmaisun ja potilaiden kliininen parametrit. Analyysi osoitti, että miR-645 ilmentyminen oli merkityksetöntä iän, sukupuolen, kasvain eriyttäminen, imusolmuke etäpesäke ja TNM-luokitus (taulukko 1: suhde kliinisten parametrien ja miR-645 ilmentymisen ensisijainen mahalaukun cardia adenokarsinoomaa), mutta oli positiivinen korrelaatio kasvaimen koko, nimittäin, kasvaimen koko on suurempi tai yhtä suuri kuin 5 cm ryhmä osoitti merkittävästi lisääntynyt miR-645 ilmentyminen verrattuna kasvaimen koko on alle 5 cm: n ryhmässä (kuvio 1 B & taulukko 1, t
-testi, * P
= 0,045). Kuvio 1 ilmauksia miR-645 ovat säädellään ylöspäin AGEJ kliinisistä näytteistä. A. ilmentyminen miR-645 43 ihmisen AGEJ kliinisissä näytteissä suhteessa viereiseen pariksi normaalin ihmisen mahalaukun sydämen ei-syöpä kudoksiin, mitattiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä (arvot osoittavat, keskiarvo ± SEM, n = 3, t
-testi, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001). B. vertailu suhteellisen ilmentymisen miR-645 ihmisen AGEJ kliinisissä näytteissä eri kasvaimen kokoa. (Kahden otoksen t
-testi, * p < 0,05).
Taulukko 1 välinen suhde kliinisten parametrien ja miR-645 ilmentymisen ensisijainen mahalaukun cardia adenokarsinoomaa
Clinical parametrit
N (%)
sukulaiset lauseke (keskiarvo ± SEM)
p-arvo
Ikä (vuosia)
≥ 60
15 (50) B- 2,1286 ± 0,59201
0,568
< 60
15 (50)
1,9571 ± 0,52402
Sukupuoli
Mies
18 (60) B 2,1111 ± 0,42783
0,462
Nainen
12 (40) B 2,3333 ± 0,65328
Koko
≥5
13 (43,3) B 2,7385 ± 100.128
0,004 *
< 5
17 (56,7) B 1,8235 ± 1,52214
histologisen erilaistumisen
Well (W) B 15 (50) B 2,138 ± 0,1866
0,9427
Huonosti (P)
15 (50) B 2.198 ± 0,1903
Lymphatic etäpesäke
Kyllä
12 (40) B 2,4583 ± 0,77864
< 0,001 **
Ei
18 (60) B 1,4944 ± 1,36273
TNM
vaihe I /II
16 (53,3) B 2,9125 ± 1,33660
< 0,001 **
vaiheen III /IV
14 (46,7)
1,4857 ± 0,73991
(* p <
0,05; ** P <
0,001).
Ehtyminen miR-645 edistää apoptoosin mahalaukun syöpäsolujen
tutkimiseksi roolin miR-645 fenotyyppisten ominaisuuksien AGEJ etenemisen, käytimme kahta mahasyövän ( GC) solulinjat, SGC7901 ja BGC-823 solu malleja. qRT-PCR tulokset osoittivat, että miR-645 ilmentyminen oli merkitsevästi säädelty verrattuna kuolemattomaksi tehdyn GC solulinjan, GES-1 (Additional tiedosto 2: Kuva S1, P
< 0,001).
SGC7901 ja BGC-823 solut transfektoitiin ohimenevästi kypsä miR-645 jäljittelee, estäjä, valetransfektoidut tai miR-NC. Kuten kuviossa 2A ja D, kvantitatiivinen RT-PCR tulokset osoittavat, että ilmentyminen asennuspalveli- 645 jäljittelee tai inhibiittorit merkittävästi säätää ylös tai alas-säätelemään tasoa miR-645, vastaavasti, SGC7901 ja BGC-823 solut Ensimmäisessä viidessä päivässä tuntia transfektion (kuvio 2A, P
< 0,001; kuviossa 2D, P
< 0,001) verrattuna NC ja mock valvontaa. Kuvio 2 ehtyminen miR-645 edistää apoptoosin mahasyövän (GC) soluja. A & D. Taso miR-645 mitattiin kvantitatiivisen PCR nimetyissä aika (Yksisuuntainen ANOVA, arvot ilmoittavat keskiarvo ± SD, kuva 2A, F = 426,588, P < 0,001; kuviossa 2D, F = 685,026, P <0,001). B & E. GC-solut, jotka on transfektoitu miR-645 matkii ja inhibiittori, suoritettiin MTT-määritystä päivittäin 6 päivää (Kaksisuuntainen ANOVA, kuvio 2B, F = 52,602, p < 0,001; kuvio 2E, F = 42,847, p < 0,001). C & F. GC-solut, jotka oli transfektoitu miR-645 matkii ja inhibiittorin kerättiin FACS-analyysillä sen jälkeen, kun 72 h (arvot osoittavat keskiarvo ± SD, n = 3, Yksisuuntainen ANOVA, kuvio 2C-a, F = 121,600, p < 0,001; Kuva 2C-b, F = 250,400, p < 0,001; Kuva Fa, F = 194,815, p < 0,001; Kuva 2F-b, F = 412,741, p < 0,001).
SGC7901 ja BGC- 823-solut transfektoitu miR-645-inhibiittorit ja jäljittelee osoittivat huomattavasti alhaisemmat ja korkeammat solujen lisääntymistä vastaavasti vertailu kanssa NC tai mock ryhmien läsnäollessa ADR (0,2 ug /ml) määritettynä MTT: llä (kuvio 2B, P
< 0,001; kuvio 2E, P
< 0,001).
Anniex Vapoptosis määritys osoitti merkittävästi lisätä ja laski apoptoosin määriä miR-645 ehtyminen ja kohdunulkoinen ilmaisun ryhmissä verrattuna NC ryhmien seerumittomassa ehto tai läsnäollessa syöpälääke, adriamysiini (ADR) (kuvio 2C ab, P
< 0,001; Kuva 2 F ab, P
< 0,001).
IFIT2 on tavoite miR-645
Aiemmat tiedot viittaavat siihen, että miR-645 voisi olla onkogeeni kehittyneiden vakavien munasarjasyöpä. Niinpä me edelleen etsitään mahdollisia kohteita miR-645 by algoritmilla Target Scan Human. Niistä, IFIT2, tuumorisuppressori, havaittiin oletetun miR-645 sitoutumiskohtien sen 3'-UTR (kuvio 3A). Sitten suoritimme lusiferaasireportterista määritys käyttäen SGC7901 ja BGC-823-solujen tarkastaa, IFIT2 oli välittömänä kohteena miR-645. Villityypin ja mutantti-IFIT2-3'UTR sisältävät oletetun sitoutumiskohdan miR-645 kloonattiin psiCHECK-2 vektori alavirtaan lusiferaasigeeni (Additional tiedosto 3: Kuva S2). Esittely miR-645 vähensi lucirferase aktiivisuutta IFIT2 3'UTR reportteri vektori merkittävästi (kuvio 3B, P
< 0,001; kuvio 3C, P
< 0,001), mutta ei vaikuttanut lucirferase aktiivisuuden mutantti IFIT2 3'UTR reportteri vektori, joka tukee suoraa vuorovaikutusta miR-645 kanssa IFIT2. Nämä tulokset viittaavat edelleen siihen, että miR-645 voi estää IFIT2 ilmaisua kohdistamalla 3'-UTR IFIT2 mRNA. Kuva 3 Validating ennustetun sitoutumiskohtien välillä miR-645 ja IFIT2. A. kaaviokuva näyttää rakennelma Luc-IFIT2 3'UTR ja Luc-IFIT2 3'Mut UTR. Sekä Luc-IFIT2 3'UTR ja Luc-IFIT2 3'Mut UTR kloonattiin pmirGLO plasmidiin alavirtaan tulikärpäsen lusiferaasi koodaavan alueen välillä PmeI ja Xbal-. B &C. SGC7901 soluja (B) tai BGC-823-solut (C) kotransfektoitiin kanssa psiCHECK-2 konstrukteja, jotka sisältävät joko IFIT2 3'UTR tai IFIT2 3'Mut UTR ja joko miR-645-estäjän tai miR-645 jäljittelee 48 h. Arvot osoittavat suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus jälkeen normalisoinnin Renilla lusiferaasiaktiivisuutta (arvot osoittavat keskiarvo ± SD, n = 3, Yksisuuntainen ANOVA, kuvio 3B, F = 283,244, kuvio 3C, F = 143,313. *** P <0,001).
ilmentäminen miR-645 ja IFIT2 ovat negatiivisesti sukua AGEJ kliinisissä näytteissä
arvioidaan tarkemmin suhdetta miR-645 ja IFIT2 selvitimme IFIT2 ilmaisua 43 AGEJ kliinisissä näytteissä käyttämällä qRT-PCR . Todettiin AGEJ kudoksista oli merkittävä alempi ilmentymistaso IFIT2 kuin pariksi ei-syöpä kudosten (kuvio 4A), ja IFIT2 ilmentyminen korreloi käänteisesti kasvaimen koko (kuvio 4B, P =
0,0304). Nimittäin, kasvaimen koko on suurempi tai yhtä suuri kuin 5 cm ryhmä osoitti merkittävää alassäädetty IFIT2 ilmentyminen verrattuna kasvaimen koko on alle 5 cm ryhmä. Validoida tiedot, me myöhemmin mitattiin proteiinin ilmentymistä IFIT2 käyttäen western blotting (kuvio 4C a-b), ja tulokset osoittivat samanlaista mallia huomautusten saapuvat qRT-PCR. Immunohistokemia määritys osoitti merkittävää vähentynyt ilmentyminen IFIT2 vuonna AGEJ kudoksissa pariksi ei-syöpä kudoksiin (kuvio 4D a-b, P <
0,001). Sitten analysoidaan suhdetta miR-645 ja IFIT2 ilmaisun ja totesi, että IFIT2 ilmentymistaso negatiivisesti korreloida miR-645 (kuvio 4E, P <
0,01). Lisäksi SGC7901 (kuvio 4F a) ja BGC-823 (kuvio 4F b) transfektoitujen solujen miR-645 estäjä ovat huomattavasti IFIT2 ilmentymisen proteiinin ja mRNA-tasot verrattuna mock ja NC ryhmiä (kuvio 4F ab, P <
0,01). Tuloksemme osoittavat, että miR-645 voi suoraan säädellä ilmentymistä IFIT2. Kuva 4 ilmentyminen miR-645 ja IFIT2 negatiivisesti korreloi AGEJ kliinisissä näytteissä ja IFIT2 oli säädellä vähentävästi AGEJ kudoksissa verrattuna pariksi ei-syöpä kudoksiin. A. ilmentäminen IFIT2
ja miR-645 AGEJ kliinisissä näytteissä analysoitiin kvantitatiivisella PCR. B. vertailu suhteellisen ilmentymisen IFIT2
ihmisen AGEJ kliinisissä näytteissä eri kasvaimen koko. (T
-testi, * p < 0,05). C. Expression of IFIT2 tutkittiin western blottauksella (a, b: arvot osoittavat keskiarvo ± SD, normalisoitu tubuliinin, n = 3, t
-testi, *** p
< 0,001) D. a. Kuvat ovat osoittaneet positiivisia immunohistokemiallisella värjäyksellä IFIT2 ihmisen AGEJ yksilöiden ja sovitettu viereisten normaaleissa kudoksissa (suurennus 200 x). b. Värjäystä tulokset IFIT2 (t
-testi, *** p
< 0,001). E. sirontakaavioissa osoittaa negatiivinen lineaarinen korrelaatio mRNA ilmaus IFIT2
ja että miR-645 43 AGEJ kliinisistä näytteistä. F. IFIT2 ja IFIT2
ilmaisun mitattuna western blotting in SGC7901 (a) ja BGC-823-solut (b). (Arvot osoittavat keskiarvo ± SD, n = 3, Yksisuuntainen ANOVA, *** p
< 0,001).
IFIT2 välittää funktio miR-645 edistämällä SGC7901 ja BGC-823-soluja apoptoosin
sen varmistamiseksi, että induktio solun apoptoosin SGC7901 ja BGC-823-soluissa miR-645 välittämä kohdistamalla IFIT2
, teimme IFIT2
plasmidin transfektion SGC7901 (kuvio 5A) ja BGC-823 (kuvio 5B) soluja ylös-säätelemään IFIT2. Western blotting ja kvantitatiivinen PCR osoitti, että säätely ylöspäin IFIT2 tekijänä IFIT2
plasmiditransfektiolla voitaisiin vähentää merkittävästi miR-645 jäljittelee. MTT-analyysi osoitti, että solut, jotka on transfektoitu plasmidi-IFIT2 leviämisen tukahdutettiin, mutta solut, jotka on transfektoitu miR-645 jäljittelee leviämisen kasvoi merkittävästi verrattuna plasmidi-ohjaus ja plasmidi-IFIT2 + miR-645 ryhmien (kuvio 5C ab, P <
0,001). Lisäksi käyttöönotto IFIT2 edistänyt apoptoosin SGC7901 ja BGC-823-solut ja miR-645 matkii vähensi apoptoosin soluissa indusoiman IFIT2 ylössäätöä verrattuna NC ryhmä läsnäollessa ADR (kuva 5E-F, P <
0,001). Meidän havainnot ehdotti, että IFIT2 välittämä toiminta miR-645 estossa SGC7901 ja BGC-823-solujen lisääntymistä ja indusoivan apoptoosia. Kuva 5 IFIT2 välittää funktio miR-645 edistämällä GC solujen apoptoosin. A & B. Expression of IFIT2 tutkittiin western blotting (A: SGC7901, B, BGC-823. A, normalisoitu tubuliinin, arvot ilmoittavat keskiarvo ± SD, One-Way ANOVA, sillä SGC7901, F = 189,307, sillä BGC-823, F = 85,374, b, arvot osoittavat keskiarvo ± SD, One-Way ANOVA, ja SGC7901, F = 85,374, ja BGC-823, F = 219,921; *** p
< 0,001). C. SGC7901 (a) ja BGC-823 (b) solut alistetaan MTT-määritystä päivittäin 6 päivää (arvot ilmoittavat keskiarvo ± SD, Kaksisuuntainen ANOVA, ja SGC7901, F = 13,768, ja BGC-823, F- = 16,409, *** p
< 0,001). D &E. SGC7901 (D) ja BGC-823 (E) solut kerättiin FACS-analyysillä sen jälkeen, kun 72 tuntia, kun läsnä on ADR (0,05 ug /ml) (arvot ilmoittavat keskiarvo ± SD, n = 3, One-Way ANOVA; for SGC7901, F = 361,749, sillä BGC-823, F = 229,952; *** p
< 0,001).
väheneminen ja säätely ylöspäin miR-645 muuttanut kaspaasi-3/7-aktiivisuus
IFIT2 on raportoitu olevan tuumorisuppressori kautta välittämisessä solujen apoptoosia aktivoimalla kaspaasi-3/7 aktiivisuutta. Kaspaasi Glo 3/7 testi osoitti, että miR-645 ehtyminen merkittävästi säädelty, kun taas miR-645 yliekspressio alaspäin säännelty kaspaasi-3/7-aktiivisuus verrattuna mock ja NC ryhmien läsnäollessa ADR (0,2 ug /ml) (Kuva 6A ja B, P <
0,001) tai seerumistarvaatio ehto (kuvio 6C ja D, P <
0,001). Nämä tulokset yhdessä havaintojen edellä esitetty, että miR-645, säädellään ylöspäin ihmisen AGEJ kudoksissa, esti apoptoosia ja edistää tuumorigeenisyystesti kautta tukahduttaa kaspaasi-3/7-aktiivisuus kohdistamalla IFIT2. Kuvio 6 Kaspaasi-3/7 aktiivisuutta. Anti-apoptoottisen kyky SGC7901 solujen ja BGC-823-soluissa sen jälkeen, kun altistus ADR (0,2 ug /ml) tai seerumistarvaatio arvioitiin kaspaasit-3/7 aktiivisuutta. A & C, SGC7901 solut; B &D, BGC-823 soluja. (Arvot ilmoittavat keskiarvo ± SD, n = 3, One-Way ANOVA, A, F = 183,930, B, F = 1093,797, C, F = 1861,50, D, F = 1483,604, *** p
< 0,001).
keskustelu ja johtopäätökset
Vaikka saatu todisteita ovat osoittaneet, että miRNA vapauttaminen on mukana kasvain syövän synnyn, etenemisen, muuttoliike ja invaasio [41], etäpesäke [42, 43] ja monilääkeresistenssi [44-46]. Tiedetään vain vähän roolit miRNA kehittämisessä adencarcinoma mahalaukun ruokatorven risteyksessä (AGEJ). Täällä, osoitimme että miR-645 ilmentyminen oli lisääntynyt AGEJ kliinisissä näytteissä verrattuna pariksi ei-syöpä kudoksiin ja oli merkitsevästi säädellään ylöspäin kaksi mahasyövässä (GC) solulinjat, SGC7901 ja BGC-823, jota käytettiin vaihtoehtoista solumalleja koska ei saatavilla AGEJ solulinjat perustettiin tasalla. Esto miR-645 SGC7901 ja BGC-823 solut merkittävästi indusoi apoptoosin SGC7901 ja BGC-823 solujen kunnon seerumistarvaatio moterapeuttisista lääkettä jopa säätelevä IFIT2
välittäjänä apoptoosin, joilla on mahdollisesti sitoutumiskohtaan mir-645 sen mRNA: n 3'UTR. Ekspressiokuviota miR-645 ja IFIT2 in SGC7901 ja BGC-823-soluissa ja kliiniset näytteet korreloivat negatiivisesti lisäksi viittaa siihen, että IFIT2
on kohdegeeni miR-645. Lisäksi esto miR-645 johtaa lisääntyneeseen kaspaasi-3/7 aktiivisuutta, joka aktivoituu IFIT2. Kaikki nämä löydökset viittaavat keskeinen rooli miR-645 Karsinogeneesin erityisesti kehitettäessä AGEJ.
Liian vähän apoptoosia on yksi keskeinen syy syövän takia pahanlaatuisten solujen kuolemaa vähenevät huomattavasti [47, 48], jolloin pahanlaatuisiksi on vaikuttanut solujen kasvaimen etäpesäke ja monilääkeaineresistenssin syöpäsolujen. Näin ollen apoptoosin on suuri merkitys syövän hoidossa, ja se on suosittu tavoite monien hoidon strategioita. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että miR-645 heikentynyt syöpäsolujen seerumideprivaatiolle indusoiman apoptoosin, kun taas ehtyminen miR-645 antagonisoi tämä vaikutus miR-645, mikä viittaa siihen, että miR-645 voi olla ratkaiseva rooli mukauttaminen syöpä solujen alhainen ravitsemus. Yhä useammat miRNA on osallisena syöpäsolujen apoptoosia. Yhtäältä, MikroRNA voisi toimia tuumorisuppressoriproteiinia kautta aiheuttamaan apoptoosin eli miR-421, joka indusoi solujen lisääntymisen ja apoptoosin resistenssin ihmisen nenänielun karsinooman kautta alas-säätely FOXO4 [49]; miR-149, joka indusoi apoptoosia estämällä Akt1 ja E2F1 ihmisen syöpäsoluissa [50] ja miRNA-31, joka indusoi apoptoosia humaanineuroblastoomasoluja [51]. Toisaalta, MikroRNA voi toimia onkogeenien tukahduttamalla apoptoosin eli miR-24, joka estää apoptoosin ja tukahduttaa Bim hiiren sydänlihassolujen [52]; miR-886-5p, joka estää apoptoosia alaspäin säätäminen Bax ilmentymistä ihmisen kohdunkaulansyövän solut [53], ja miR-183, joka estää TGF-β1 aiheuttaman apoptoosin downregulation PDCD4 ilmentymisen ihmisen maksasyövän solut [54] .
ISGs, IFN stimuloi geenejä, katso geenejä, jotka tanscribed mukaan IFN induktion. Niistä, 4 voi olla tärkeitä tehtäviä, jotka vaikuttavat sekä viruksen replikaation estymiseen ja solun proliferaation inhibitio [55, 56]. Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

• Proteomianalyysi Ihmisen mahalaukun cardia adenokarsinoomaa laser kaapata mikrodissektion
• Terapeuttinen potentiaali PRL-3 kohdentamista ja kliininen merkitys PRL-3 genomivahvistuksen mahasyövän