Mikrornk-645, regulira prema gore u ljudskom adencarcinoma želučanog jednjaka čvora, inhibira apoptozu ciljajući tumor supresor IFIT2

Mikrornk-645, regulira prema gore u ljudskom adencarcinoma želučanog jednjaka čvora, inhibira apoptozu ciljajući tumor supresorski IFIT2 pregled apstraktne pregled pozadine
sve veće količine dokaza ukazuje na to da miRNAs imaju ključnu ulogu u procesu karcinogeneze i raka progresije; Međutim, uloga miRNAs u nastanku tumora od adencarcinoma želučane jednjaka spoju (AGEJ) ostaje u velikoj mjeri nepoznat.
Metode
SGC7901 i korišteni su BGC-823 karcinoma želuca stanične linije. Izrazi Mir-645 i IFIT2 (interferon-induced proteina s tetratricopeptide ponavlja 2) ispitane su QRT-PCR, izrazi IFIT2 ispitana je pomoću Western blot pokusa i imunohistokemijski testu. Stanična apoptoza je određena sa FACS. Mir-645 Inhibitor, oponaša i plazmid-IFIT2 transfekcije su provedena na studij loss- i dobiti-funkciju. Kaspaze-3/7 aktivnost ispitana je kaspaze-3/7 testa. Pregled Rezultati
U ovom istraživanju smo izvijestili povećanu ekspresiju Mir-645 u AGEJ kliničkih uzoraka u usporedbi s uparenim non-kancerogen tkiva. Također smo uočili značajnu MIR-645 up-regulaciji u dva karcinom želuca (GC) staničnim linijama, SGC7901 i BGC-823, koji su korišteni kao modeli stanica jer nema dostupnih AGEJ stanične linije uspostavljene do danas. Otkrili smo da je inhibicija Mir-645 može senzibilizirati dramatično SGC7901 i BGC-823 stanica na oba seruma starvation- i kemoterapijski apoptoze uzrokovane lijekovima reguliranjem up-IFIT2, posrednik apoptoze putem mitohondrijske puta, s potencijalnim vezanja za MIR -645 u svom mRNA 3'UTR. Daljnja istraga izlagao da IFIT2 izraz smanjuje SGC7901 i BGC-823 stanica i AGEJ tkiva. IFIT2 pregled ektopično izraz dovodi do promocije stanične apoptoze, što pokazuje da IFIT2 može funkcionirati kao supresor u razvoju AGEJ. Nadalje, inhibicija Mir-645 izaziva up-regulaciji IFIT2 i povećana aktivnost kaspaze-3/7 u usporedbi s kontrolnim grupama. Pregled Zaključci
Naši podaci sugeriraju kako Mir-645 služi kao onkogena u ljudskoj AGEJ strane, na barem djelomično putem, ciljanje IFIT2 pregled.
Ključne riječi pregled Adencarcinoma želučane jednjaka razvodne mikrornk-645 IFIT2 apoptoze Pozadina pregled Nedavna istraživanja su pokazala da adencarcinoma želučane jednjaka spoju (AGEJ) se razlikuje od onog distalne želudac, s različitim faktorima rizika, karakteristikama tumora i biološkog ponašanja [1-4]. Štoviše, učestalost AGEJ je u porastu u proteklih 30 godina, osobito u SAD-u i sjevernoj Kini [5-9].
MikroRNA (miRNAs) su skupina endogeno izrazio, non-kodiranje male RNA, 20- 25 nukleotida za koje se zna da negativno regulira ekspresiju gena preko supresije prijevoda ili smanjuje stabilnost mRNA izravno vezati na 3'-netranslatiranu regiju (3'-UTR) ciljne mRNA [10, 11]. Prikupljeni dokazi ukazuju da miRNAs imaju važnu ulogu u reguliranju fizioloških i patoloških procesa, uključujući i razvoj [12], metabolizam [13], stanična proliferacija [14], diferencijacija [15] i apoptoze [16]. Dodatno, nenormalna nakon regulaciji transkripcije mRNA od miRNAs povezana s tumorigenesis [17, 18]. Nenormalna ekspresija profili miRNAs su izvijestili da se može detektirati u različitim tipovima humanih tumora uključujući pluća [19], dojke [20], prostate [21], jetre [18], kolona [22] i rakom želuca [23]. Štoviše, neki miRNAs može djelovati kao onkogena [24-26] ili tumorskih supresora [27, 28] regulira ekspresiju svojih ciljnih gena koji imaju važnu ulogu u nekim ključnim putova uključenih u progresije staničnog ciklusa, apoptoze ili proliferacije. miRNAs dolje regulirano kod tumorskih uzoraka, kao što su Mir-22 [29, 30], Mir-101 [31, 32] i Mir-7 [33, 34] obično funkcioniraju kao potiskuju miRNAs, dok miRNAs reguliran u tumorskim uzorcima, kao što su mir-17 [35, 36] i mir-21 [37, 38] obično vrše onkogene uloge. Ove studije ukazuju na to da deregulacija miRNAs često je uključen u karcinogeneze i progresiju raka.
Nedavna studija je pokazala da Mir-645 može vršiti Tumor supresor ulogu u naprednim seroznog karcinoma jajnika za Mir-645 je negativno povezana s ukupnom preživljavanju ona [39]. U ovom istraživanju, otkrili smo da Mir-645 izražavanje bilo značajno povećao u AGEJ kliničkih uzoraka u usporedbi s uparenim non-kancerogen tkiva pomoću mikrornk čips. Međutim, uloga Mir-645 u nastanku tumora od AGEJ još nije istražena. Daljnje istraživanje je pokazalo da je Mir-645 je također značajno je povećana u dva karcinom želuca (GC) staničnim linijama, SGC7901 i BGC-823, koji su korišteni kao alternativni modeli stanica u ovom istraživanju. Inhibicija Mir-645 u SGC7901 i BGC-823 stanica značajno je smanjen apoptoze SGC7901 i BGC-823 stanica u stanju izgladnjivanjem i kemoterapijskih lijekova reguliranjem up-IFIT2, posrednik apoptoze, s potencijalnim vezanja za MIR -645 u svom mRNA 3'UTR. Način ekspresije Mir-645 i IFIT2 u AGEJ kliničkim uzorcima su u negativnoj korelaciji, što dodatno ukazuje na to da IFIT2 pregled je ciljni gen Mir-645. Nadalje, inhibicija miR-645 rezultira u povećanom kaspaza-3/7 aktivnosti, koji se aktivira s IFIT2. U ovoj studiji istraživali smo da li Mir-645 je viša u ljudskom adencarcinoma želučane jednjaka čvora i inhibira apoptozu ciljajući tumor supresorski IFIT2. Pregled Metode pregled etiku i gubitka Netlogu za uzorke tkiva, pismeni informirani pristanak bio dobiveno od bolesnika. Postupci koji se koriste u ovom istraživanju su odobreni od strane Institutional Review Board of Henan Sveučilištu znanosti i tehnologije te je uskladiti s Helsinškom deklaracijom i lokalnim propisima. Pregled Stanične linije i uvjeti uzgoja
rak želuca staničnim linijama SGC -7901, BGC-823 i ovjekovječio normalan želučane epitelnih stanica linije, GES-1 molimo dodjeljivalo prof Daiming Fan. Sve stanične linije su održavane u našem Institutu prema preporučenim protokolima. Stanice su kultivirane u RPMI-1640 mediju (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) na 37 ° C u 5% CO2 inkubatoru. Pregled ljudskih jedinki
Svi eksperimentalni postupci su odobreni od strane Institutional Review Board of Henan Sveučilištu znanosti i tehnologije. Pismeni informirani pristanak dobiven je za sve uzorcima bolesnika. Ljudska AGEJ primjerci (n = 43), a pacijent u paru ne-kancerogen primjerci dobiveni su od pacijenata na prvom povezanih bolnici, Henan sveučilište znanosti i tehnologije, uz informirani pristanak od svakog pacijenta. Pročišćavanje pregled RNA, sinteze cDNA i kvantitativno real-time PCR (QRT-PCR) pregled Ukupna RNA uzgojenim stanicama je ekstrahirana Trizol reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) u skladu s proizvođačevim protokol i RNA su pohranjene na -80 ° C prije QRT-PCR analize , Zreli Mir-645 je detektirana pomoću mirVana TM QRT-PCR za detekciju Kit Mirna (Ambion Inc. Austin, Texas), s U6 kao interna kontrola. IFIT2 ekspresija je otkrivena s klicama F: 5'AGCGAAGGTGTGCTTTGAGA 3 ', R: 5'GAGGGTCAATGGCGTTCTGA3' (dužine proizvoda: 125 bp Tm: 60 ° C; GC%: F-50%, R-55%; početak-kraj: 643-748 bp) i GAPDH je korištena kao interna kontrola. PCR proizvodi su razdvojeni na etidij 1,5% agaroznom gelu bromid umrljan i prikazan s UV.
Cell transfekcije pregled Ljudski Mir-645 duplex agomir (400 nm), antagomir (400 nm) i negativna kontrola su dizajnirani i pruža Ribobio (Guangzhou, Guangdong, Kina). Plazmid-IFIT2 i negativne plamid kontrole su kupljeni od Ribobio Inc (Guangzhou, Guangdong, Kina)
Mirna meta predviđanja
biste pronašli potencijalne Mirna ciljnih gena, TargetScanHuman web stranicu (http:.. //Www targetscan. org /) se koristi, je izračunata vezanje slobodna energija i obvezujući stranice su analizirani pomoću http:.... //bibiserv techfak Uni-Bielefeld de /rnahybrid website pregled Vector gradi i Reporterski test pregled za konstruiranje plazmid IFIT2-3'UTR, divljeg tipa 3'-UTR fragment humanog IFIT2 mRNA (1226-1233 nt, GenBank pristupni br. NM_001547.4) sadrži pretpostavljenu vezne sekvence miR-645 je pojačan RT-PCR i kloniran u mjestu između Xho i i Not i nizvodno od reporterskog gena od psiCHECK ™ vektor (Promega, USA). Mutant jedinstvenog Mir-645 veznih mjesta (5'AGCCTAG -3 '5'TCGGATC -3') u 3'-UTR IFIT2 je uključena po ciljanom mutagenezom Kit (SBS Genetech, Peking, Kina ). Divlje i mutirani vrste pmirGLO-IFIT2-UTR vektora su potvrđene od strane sekvenciranje DNA
nukleotidnih sljedova od primera za IFIT2-3'UTR (WT) klona. Pregled IFIT2XhoIF2. 5'CCGCTCGAG AGAATAGAGATGTGGTGCCCACTAGGCTACTGCTG 3 '
IFIT2NotIR2: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TTAAAATGGAATCAGTGACTTTTATTTCTCATAACAGAG 3 '
nukleotidnih sljedova od primera za IFIT2-3'UTR (MT) klona.
mutIFIT2F2: 5'TTCTAGGTAGATGCTGAATTCGGATCACATCAAAGTTGGTGTGAAC 3'. pregled mutIFIT2R2: 5'GTTCACACCAACTTTGATGTGATCCGAATTCAAGEJTCTACCTAGAA 3 ' .
Stanice su transficirane Mir-645 oponaša, NC i pmirGLO plazmida u 24 jažica pomoću lipofektamina ™ 2000 (Invitrogen) prema uputama. 48 sati kasnije, stanice su sakupljene i analizirane na aktivnost luciferaze korištenjem Dual-Luciferase reporter Assay System (Promega, SAD) i detektiran pomoću sistema za detekciju GloMaxTM 20/20 (E5331, Promega). Pregled caspase-3/7 ispitivanje
aktivnost kaspaze-3 i kaspase-7 je otkriven u formatu od 96 jamica (2 × 10 3 stanica /jažica), koristeći caspase-Glo assay 3/7 (Promega) prema uputama. 100 ul kaspaze-Glo 3/7 reagensa je dodano u svaku jažicu i inkubirane su na sobnoj temperaturi tijekom 1 h follwong luminiscencija je detektiran pomoću M200 čitača mikroploče fluorescencije (Tecan). Pozadina luminiscencije povezan sa staničnom kulturom i reagensom (blank reakcija) oduzeta je od eksperimentalne vrijednosti. Pregled MTT test pregled Stanice su transficirane s 100 nM miR-645 inhibitora (Genepharma, Shanghai, Kina) oponaša (Ribobio Inc. ., Guangzhou, Guangdong, Kina) ili 100 nM plamid-IFIT2 (Ribobio Inc., Kina). Dvadeset i četiri dana kasnije, stanice su posađene u pločice s 96 jamica (2 × 10 3 /well). Vitalnost stanica je ispitana MTT (3-2, 5-difenil-tetrazolij-bromid) ispitivanje (Sigma, SAD), prema uputama u određenom trenutku.
Western blot-pregled ukupnih proteina iz kulture stanica su lizirane Lysis Pufer sadrži PMSF na ledu. Zatim protein se elektroforezi u 12% SDS poliakrilamidnim gelovima i zatim su prenesene na PVDF membranu (Millipore). Membrane su blokirane u 5% bezmasnim mlijekom u prahu, na sobnoj temperaturi 1 sat i inkubirano preko noći sa primarnim antitijelima. Membrane su inkubirane sa sekundarnim antitijelima obilježenim s HRP tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi, tri puta po 10 min ispiranja u TBS-T (triethanolaminebuffered fiziološka otopina s Tween). Konačno, signali su detektirani pomoću ECL kita (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) i membrane su skenirani i analizirani pomoću Bio-Rad ChemiDoc XRS + Imaging sustav sa slike (verzija količina 1). Ekspresija proteina se normalizira na endogeni referenca (tubulina), a u odnosu na kontrolu. Spektara višebojni širokog raspona protein ljestve (Fermentas) je korišten kao molekularni marker. Svi antitijela se koriste u Western blot analizi su prikazani u Dodatni datoteke 1: Tablica S1 pregled imunohistokemija i imunohistokemijska bodovanja pregled Parafinski rezovi, 4 um debljine, su pečeni 2 sata na 65 ° C i deparafmizirani.. Antigen dohvat je izvedena korištenjem citratnog natrij pufera (pH 7.2) na 95 ° C tijekom 15 minuta, a zatim su ohlađeni stakalca na sobnoj temperaturi 30 minuta. Poslije tretmana sa 3% -tnim vodikovim peroksidom na 15 minuta da se blokira endogene peroksidaze, sekcije su tretirani s graničnim tekućinom normalnom kozjem serumu tijekom 30 minuta da bi se smanjilo nespecifično vezanje i zečje poliklonalno anti-IFIT2 (1: 500, HPA003408, sigma-Aldrich, Shanghai, Kina) inkubira odjeljaka 12 h na 4 ° C. Nakon rewarming 1 h i pranje za 5 puta, sekcije su inkubirane s sekundarnih antitijela tijekom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Diaminobenzidinu (DAB) se koriste za reakcije u boji. Zatim Imunokemijsko bojenje je ocijenjen kao što je opisano [40]. Pregled Statistička analiza pregled Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD tri neovisna pokusa. Za statističke testove, SPSS statistički softver paket, version17.0 (SPSS, Chicago, IL, SAD) je bio korišten. Student-ov t-test pregled je jednosmjerna ANOVA i dvosmjerna ANOVA test se izvodi za relativne gustoće band zapadne hibridizacija i MTT OD vrijednosti. Korelacija između Mir-645 i IFIT2 analizirana s Spearmanov rang korelacije. Vrijednosti <p;. 0,05 smatrane su statistički značajne pregled Rezultati
Iskaze Mir-645 se regulira prema gore u AGEJ kliničkim uzorcima
Ocijeniti ulogu Mir-645 u nastanku tumora od AGEJ, prvo smo koristili QRT - PCR metoda za mjerenje mir-645 ekspresiju 43 ljudskih AGEJ kliničkim tkiva, te je utvrdio da mir-645 bila je značajno viša u AGEJ kliničkim tkiva u usporedbi s pacijentima u paru želučanih srčanih non-kancerogen tkiva (Slika 1a). Da bi dobio dodatne uvide u promatranju gore navedenog, ispitali smo odnos između Mir-645 izražavanja i bolesnika kliničkih parametara. Analiza je pokazala da je Mir-645 je izraz bio irelevantan s dobi, spolu, diferencijacije tumora, limfni čvor metastazama i TNM fazi (Tablica 1: Odnos između kliničkih parametara i Mir-645 izražavanja u osnovnoj želučane cardia adenokarcinom), ali je u pozitivnoj korelaciji s veličina tumora, naime, veličina tumora veća od ili jednaka 5 cm skupine pokazuju značajnu povećani miR-645 ekspresiju u usporedbi s veličinom tumora manje od 5 cm skupina (Slika 1B & tablici 1, t-test pregled * P
= 0.045). Slika 1 Iskazi Mir-645 se regulira prema gore u AGEJ kliničkim uzorcima. A. izraz Mir-645 u 43 ljudski AGEJ kliničkim uzorcima u odnosu na susjedne uparenim normalnih ljudskih želučanih srčanih non-kancerogen tkiva, izmjerena je kvantitativnom RT-PCR (Vrijednosti pokazuju srednju vrijednost ± SEM, n = 3, t
-test, * p < 0.05, ** p < 0.01; *** p < 0,001). B. usporedba relativne ekspresije Mir-645 u ljudski AGEJ kliničkim uzorcima različitih veličina tumora. (Dvosmjerni t pregled -test, * p < 0,05). Pregled Tablica 1. Odnos kliničkih parametara i Mir-645 izražavanja u osnovnoj želučane cardia adenokarcinom pregled Klinički parametri pregled pregled N (%)
Rođaci izraz (srednja vrijednost ± SEM)
p-vrijednost
Dob (godine) pregled ≥ 60 pregled, 15 (50) pregled 2,1286 ± 0,59201 pregled 0.568 izvoznici < 60 pregled, 15 (50)
1,9571 ± 0,52402 pregled Spol pregled muški pregled, 18 (60) pregled 2,1111 ± 0.42783
0,462 pregled Ženski pregled, 12 (40) pregled 2,3333 ± 0,65328 pregled Veličina pregled ≥5 pregled 13 (43,3) pregled 2,7385 ± 100.128 pregled 0,004 * izvoznici < 5. pregled 17 (56,7) pregled 1,8235 ± 1,52214 pregled Histološka diferencijacija pregled Well (W) pregled, 15 (50) pregled 2,138 ± 0,1866 pregled 0,9427 pregled Loše (P) pregled, 15 (50) pregled 2,198 ± 0,1903 pregled Limfna metastaze pregled Da
12 (40)
2.4583 ± 0.77864 izvoznici &0,001 ** pregled Nikakva
18 (60) pregled 1,4944 ± 1,36273 pregled TNM stadij pregled faza I /II
16 (53,3)
2.9125 ± 1.33660 izvoznici &0,001 ** pregled faza III /IV pregled, 14 (46,7)
1.4857 ± 0,73991
(* p < pregled, 0,05; ** P. ≪ pregled 0,001) pregled Iscrpljivanje Mir-645 promiče apoptoze želučanih stanica raka
Istražiti ulogu Mir-645 u fenotipskih karakteristika AGEJ napredovanja, koristili smo dva rak želuca ( GC) stanične linije, SGC7901 i BGC-823 kao modeli stanica. QRT-PCR rezultati su pokazali da miR-645 ekspresija bila značajno je povećana u usporedbi s besmrtnim linijskim stanicama koje GC, GES-1 (Dodatna datoteka 2: Slika S1 P pregled < 0,001). pregled SGC7901 i BGC-823 stanice su transfecirane sa zrelim miR-645 oponaša, inhibitora lažno transfektirane ili Mir-NC. Kao što je prikazano na Slici 2A i D, kvantitativni rezultati RT-PCR pokazuju da je ekspresija miR- 645 imitira ili inhibitori značajno se reguliraju ili silazno reguliraju razinu ekspresije Mir-645, respektivno, u SGC7901 i BGC-823 stanica iz prvi petog dana poslije transfekcije (Slika 2A, P pregled i 0,001 Slika 2D, P pregled < 0,001) u usporedbi s NC i lažno kontrole. Slika 2 Iscrpljivanje Mir-645 promiče apoptoza karcinoma želuca (GC) stanica. A & D. Razina Mir-645 je mjeren kvantitativnim PCR u određenom trenutku (jednosmjernim ANOVA analize vrijednosti pokazuju srednju ± SD, Slika 2A, F = 426,588, P < 0.001 Slika 2D, F = 685,026, P <0,001). B &E. GC stanice transfektirane s miR-645 oponaša i inhibitora podvrgnut MTT ispitivanja dan tijekom 6 dana (Dvosmjerna ANOVA analize, slika 2B, F = 52.602, p 0,001; Slika 2E, F = 42.847, p < 0.001). C & F. GC stanica podvrgnutih transfekciji miR-645 oponaša i inhibitor se sakupe za FACS analizu nakon 72 sata (Vrijednosti pokazuju srednju vrijednost ± SD, n = 3, jednosmjerna ANOVA analize, slika 2C-a, F = 121,600, p < 0,001 Slika 2C-b, F = 250,400, p < 0.001 Slika Fa, F = 194,815, p < 0.001 Slika 2F-b, F = 412,741, p 0,001) pregled SGC7901 i BGC-. 823 stanice transfecirane miR-645 inhibitora i imitacije pokazala značajno niže i više razine stanične proliferacije, respektivno, usporedbom sa NC ili lažno skupina u prisutnosti ADR (0.2 ug /mL) kao što je određena MTT analize (slika 2B, P pregled i 0,001; Slika 2E, P izvoznici < 0,001) pregled Anniex Vapoptosis testu pokazuju značajno povećavati i smanjivati ​​apoptoze stope Mir-645 omotača i ektopične ekspresije grupe u usporedbi s NC skupinama u serum-free. stanje ili u prisutnosti lijekom protiv raka, adriamicin (ADR) (Slika 2C ab, P
-0,001; Slika 2 F ab P pregled < 0,001) pregled. IFIT2 je meta Mir-645
Prethodni podaci ukazuju na to da Mir-645 može biti onkogena naprednih serozni karcinom jajnika. Tako smo i dalje tražili potencijalne mete Mir-645 po algoritmu cilj skeniranja Čovjekom. Među njima, IFIT2, supresor tumora, utvrđeno je da su vezna mjesta potencijalnog Mir-645 u okviru svoje 3'UTR (slika 3A). Tada smo obavili luciferaze ispitivanjem koristeći SGC7901 i BGC-823 stanice kako bi provjerili je li IFIT2 bio izravan cilj Mir-645. Divljeg tipa i mutanta IFIT2-3'UTR sadrži pretpostavljenu vezno mjesto Mir-645 su bili klonirani u psiCHECK-2 vektor nizvodno od gena luciferaze (dodatne datoteke 3: Slika S2). Uvođenje Mir-645 smanjio lucirferase aktivnost iz IFIT2 3'UTR reporter vektor značajno (Slika 3B, P izvoznici < 0.001 Slika 3C, P izvoznici < 0,001), ali ne utječu na lucirferase aktivnosti iz mutant IFIT2 3'UTR reporter vektor, podržava izravnu interakciju Mir-645 sa IFIT2. Ovi rezultati ukazuju na to da miR-645 može umanjiti ekspresiju IFIT2 ciljanjem 3'-UTR IFIT2 mRNA. Slika 3 Validating predviđene vezna mjesta između Mir-645 i IFIT2. A. Shematski dijagram prikazuje konstrukt Luc-IFIT2 3'UTR i Luc-IFIT2 3'Mut UTR. I Luc-IFIT2 3'UTR i Luc-IFIT2 3'Mut UTR su klonirani u plazmid pmirGLO nizvodno od luciferaze krijesnice kodirajuće regije između Pmel i Xbal položaja. B &C. SGC7901 stanice (B), ili BGC-823 stanica (C), su ko-transfektirane s psiCHECK-2 konstruktima koji sadrže bilo IFIT2 3'UTR ili IFIT2 3'Mut UTR i bilo inhibitor miR-645 ili Mir-645 oponašatelja za 48 h. Vrijednosti pokazuju relativnu aktivnost luciferaze nakon normalizacije na Renilla aktivnost luciferaze (Vrijednosti pokazuju srednju vrijednost ± SD, n = 3, jednosmjerna ANOVA analize, Slika 3B, F = 283,244, Slika 3C, F = 143,313. *** P <. 0,001) pregled izražavanje Mir-645 i IFIT2 negativno se odnose na AGEJ kliničkim uzorcima
Kako bi se dodatno procijeniti odnos između Mir-645 i IFIT2, ispitali smo ekspresiju IFIT2 u 43 AGEJ kliničkim uzorcima pomoću QRT-PCR , Utvrđeno je AGEJ tkiva imala izuzetan nižu razinu ekspresije IFIT2 nego uparenih non-kancerogen tkiva (slika 4a) i IFIT2 izraz obrnuto je korelaciji s veličinom tumora (Slika 4B, P = 0,0304 pregled). Naime, veličina tumora veća od ili jednaka 5 cm skupini imali značajno podregulirani IFIT2 ekspresiju u usporedbi s veličinom tumora manje od 5 cm grupe. Za provjeru podataka, možemo naknadno se mjere ekspresiju proteina IFIT2 pomoću Western upijanja (Slika 4C a-b), a rezultati su pokazali sličan uzorak očitovanje pronašao QRT-PCR. Imunohistokemija testu pokazuju značajno smanjena ekspresija IFIT2 u AGEJ tkivima upareni nekancerozne tkiva (Slika 4D a-b, P < pregled 0,001). Zatim smo analizirali odnos između Mir-645 i IFIT2 izražavanja i otkrili da IFIT2 razina ekspresije negativno povezana sa onom Mir-645 (slika 4E, P < pregled, 0,01). Štoviše, SGC7901 (slika 4F a) i BGC-823 (slika 4F b) stanice obilježene Mir-645 inhibitora značajno su povećali IFIT2 izraz na proteina i mRNA u odnosu na lažno i NC (slika 4F ab, P <
0,01). Naši rezultati pokazuju da je Mir-645 može se izravno regulira ekspresiju IFIT2. Slika 4 Izražavanje Mir-645 i IFIT2 negativno koreliraju u AGEJ kliničkim uzorcima i IFIT2 je dolje regulirana u AGEJ tkiva u usporedbi s uparenim non-kancerogen tkiva. A. Ekspresija IFIT2 Netlogu i Mir-645 u AGEJ kliničkim uzorcima analizirani su kvantitativnog PCR. B. usporedba relativne ekspresije IFIT2
u AGEJ kliničkim uzorcima ljudske različitih veličina tumora. (T-test pregled, * p 0,05). C. Ekspresija IFIT2 ispitan pomoću Western blot (A, B: vrijednosti ukazuju na srednju ± SD, normalizirana na tubulin, n = 3, t pregled -test, *** p izvoznici < 0,001) D. a. Reprezentativne slike prikazane su pozitivni imunohistokemijski bojenje IFIT2 u ljudskim AGEJ uzoraka i odgovarajuće susjednim normalnim tkivima (uvećanjem 200 ×). b. Bojenje desetine IFIT2 (t pregled -test, *** p izvoznici < 0,001). E. Scatter parcela pokazuju negativnu linearnu korelaciju između ekspresije mRNA za IFIT2 Netlogu i da od Mir-645 u 43 AGEJ kliničkim uzorcima. F. IFIT2 and IFIT2 pregled ekspresija mjereno pomoću Western blot SGC7901 (a) i BGC-823 stanicama (b). (Vrijednosti pokazuju srednju ± SD, n = 3, One-way ANOVA analiza, *** p izvoznici < 0,001) pregled IFIT2 posreduje funkciju Mir-645 promicanjem SGC7901 i BGC-823 stanice. apoptoza pregled za potvrdu da je indukcija stanične apoptoze u SGC7901 i BGC-823 stanica za Mir-645 je posredovana ciljanje IFIT2
, proveli smo IFIT2 pregled plazmida transfekcije u SGC7901 (Slika 5a) i BGC-823 (Slika 5B) stanicama u svrhu regulacije ekspresiju IFIT2. Western blot i kvantitativna PCR je pokazao da se na regulaciju IFIT2 strane IFIT2 pregled plazmida transfekcije može biti znatno smanjen za Mir-645 oponaša. MTT test pokazao je da stanice transficirane s plazmidom-IFIT2 proliferacije potisnut, međutim, stanice transficirane miR-645 imitira proliferacije povećala značajno u usporedbi s plazmida kontrolu i plazmid IFIT2 + miR-645 skupine (Slika 5C ab, P '
0,001). Osim toga, uvođenje IFIT2 promovira apoptozu SGC7901 i BGC-823 stanica i Mir-645 oponaša smanjenu apoptozu stanica izazvanih IFIT2 up-regulaciji u usporedbi s NC skupine u prisutnosti ADR (Slika 5E-F, P <
0,001). Naši nalazi sugeriraju da IFIT2 posredovana funkciju Mir-645 u inhibiciji SGC7901 i BGC-823 stanica proliferaciju i inducira staničnu apoptozu. Slika 5 IFIT2 posreduje funkciju Mir-645 promicanjem GC staničnoj apoptozi. A & B. Izražavanje IFIT2 ispituje western blot analizom (A. SGC7901 B, BGC-823 a, normalizirana na tubulin, vrijednosti pokazuju srednju ± SD, jednosmjerna ANOVA analiza, za SGC7901, F = 189.307, za BGC-823, F = 85,374; b, vrijednosti pokazuju srednju ± SD, jednosmjerna ANOVA analiza, za SGC7901, F = 85,374, za BGC-823, F = 219,921; *** p izvoznici < 0,001). C. SGC7901 (a) i BGC-823 (b) stanice podvrgnute MTT testom dnevno za 6 dana (vrijednosti ukazuju na srednju ± SD, dvosmjerna ANOVA analize, za SGC7901, F = 13,768, za BGC-823, F = 16,409, *** p pregled < 0,001). D &E. SGC7901 (D) i BGC-823 (E) stanice su prikupljene za FACS analizu se nakon 72 h u prisutnosti ADR (0,05 ug /ml) (vrijednosti pokazuju srednju ± SD, n = 3, jednosmjerna ANOVA analize; za SGC7901, F = 361.749, za BGC-823, F = 229.952, *** p pregled. < 0,001) pregled, osiromašeni i up-regulaciji Mir-645 promijenila kaspaze-3/7 aktivnost
IFIT2 je izvijestila da se tumorski supresor putem posredovanju stanične apoptoze kroz aktiviranje kaspaze-3/7 aktivnost. Kaspaze-Glo 3/7 analiza je pokazala da miR-645 raspadanje značajno je povećana, dok miR-645 hiperekspresija preuzet regulirala kaspaze-3/7 Aktivnost u odnosu na lažno i NC u prisutnosti ADR (0.2 ug /mL) (Slika 6A i B, P < 0.001 pregled) ili gladovanja seruma uređaj (slika 6C i D, P < pregled 0,001). Ovi rezultati u kombinaciji s gore navedenim opažanjima sugerira da miR-645, doregulirani u ljudskim tkivima AGEJ staničnu apoptozu inhibiran i potiče tumorogenosti preko supresije kaspaze-3/7 aktivnost ciljajući IFIT2. Slika 6 kaspaze-3/7 aktivnost. Antiapoptotski sposobnost SGC7901 stanica i BGC-823 stanicama nakon izlaganja ADR (0.2 ug /mL) ili izgladnjivanjem procijenjena je kaspaza-3/7 aktivnosti. &Amp; C, SGC7901 stanice; B &D, BGC-823 stanice. (Vrijednosti ukazuju na srednju ± SD, n = 3, jednosmjerna ANOVA analize, jer A, F = 183.930, za B, F = 1093.797, jer C, F = 1861,50, za D, F = 1483.604, *** p
. < 0,001) pregled, Rasprava i zaključci pregled Iako gomilaju dokazi pokazuju da miRNAs deregulacija je surađivala s tumora karcinogeneze, napredovanje, migracije i invazije [41], metastaze [42, 43] i rezistencije na lijekove [44-46]. Malo se zna o ulogama miRNAs u razvoju adencarcinoma želučane jednjaka čvora (AGEJ). Evo, pokazali smo da je Mir-645 izražavanje bilo značajno povećao u AGEJ kliničkih uzoraka u usporedbi s uparenim non-kancerogen tkiva i bila je značajno viša u dvije karcinom želuca (GC) staničnim linijama, SGC7901 i BGC-823, koji su se alternativno modeli stanica jer nema raspoloživih stanične linije AGEJ uspostavljeni su u toku. Inhibicija Mir-645 u SGC7901 i BGC-823 stanicama značajno inducira apoptozu SGC7901 i BGC-823 stanica u stanju izgladnjivanjem i kemoterapijskih lijekova reguliranjem up-IFIT2,
posrednika apoptoze, s potencijalnim veznog mjesta za Mir-645, u svojoj mRNA 3'UTR. Način ekspresije Mir-645 i IFIT2 u SGC7901 i BGC-823 stanica i kliničkim uzorcima su u negativnoj korelaciji, što dodatno ukazuje na to da IFIT2 pregled je ciljni gen Mir-645. Nadalje, inhibicija miR-645 rezultira u povećanom kaspaza-3/7 aktivnosti, koji se aktivira s IFIT2. Svi ovi rezultati ukazuju na temeljnu ulogu Mir-645 u karcinogeneze, posebice u razvoju AGEJ.
Premali apoptoza je jedan ključni uzrok karcinogeneze jer maligne stanice smrti smanjeni su izuzetno [47, 48], što je rezultiralo maligne transformacije od pogođenih stanica, metastaza i multidrug stanica raka. Stoga, apoptoza je od velike važnosti u liječenju raka i omiljeno meta mnogih strategija tretmana. U ovom istraživanju, pokazali smo da Mir-645 slabovidne stanice raka u serumu deprivacijom inducirana apoptoza, dok iscrpljivanje Mir-645 antagonizirati ovaj učinak Mir-645, što ukazuje da je Mir-645 može igrati ključnu ulogu u adaptaciji raka stanica na niskoj prehrane. Veći broj miRNAs su uključene u stanice raka apoptozom. S jedne strane, mikroRNA mogu služiti kao supresor tumora putem poticanja apoptoze, tj miR-421, što izaziva povećanje broja stanica i otpornost apoptozu u ljudskim karcinoma nazofarinksa preko podreguliranjem FOXO4 [49]; Mir-149, koji se inducira apoptozu inhibirajući Akt1 i E2F1 u ljudskim stanicama raka [50] i Mirna-31, koji inducira apoptozu u ljudskim stanicama neuroblastoma [51]. S druge strane, mikroRNA mogu služiti kao onkogena supresijom apoptoze, tj miR-24, koji inhibira apoptozu i potiskuje BIM u mišjim kardiomiocitima [52]; Mir-886-5p, koji inhibira apoptozu podreguliranjem Bax ekspresije u ljudskim stanicama cervikalnog karcinoma [53] i miR-183, koji inhibira TGF-β1 inducirane apoptoze silazni PDCD4 ekspresije u stanicama ljudskog hepatocelularnog karcinoma [54] .
ISGs, IFN stimulirana gena, odnose se na genima koji su tanscribed indukcijom malene. Među njima, 4 može igrati važnu ulogu koje utječu i inhibiciju virusne replikacije i inhibiciju proliferacije stanica, [55, 56]. Svi autori pročitali i odobrili konačnu rukopis. Pregled

• Proteom analiza ljudskog želuca cardia adenokarcinoma lasersko snimanje microdissection
• Terapijski potencijal PRL-3 usmjerenosti i kliničkog značaja PRL-3 genomske pojačanja u želučanom cancer