MikroRNA-645, oppregulert i menneskelig adencarcinoma av mage esophageal krysset, hemmer apoptose ved å målrette tumor suppressor IFIT2

mikroRNA-645, oppregulert i menneskelig adencarcinoma av mage esophageal krysset, hemmer apoptose ved å målrette tumor suppressor IFIT2
Abstract
Bakgrunn
en økende mengde bevis indikerer at mirnas ha en kritisk rolle i kreftutvikling og kreft progresjon; Men rollen miRNAs i tumorigenesis av adencarcinoma av mage esophageal krysset (AGEJ) fortsatt i stor grad uklart.
Metoder
SGC7901 og BGC-823 magekreftcellelinjer ble brukt. Uttrykk for MIR-645 og IFIT2 (Interferon-indusert protein med tetratricopeptide gjentar 2) ble undersøkt ved QRT-PCR, ble uttrykk for IFIT2 undersøkt av western blotting og immunhistokjemi analyse. Den celle apoptose ble bestemt ved FACS. MiR-645-hemmer, etterligner og plasmid-IFIT2 transfections ble utført for å studere tap-og gain-funksjon. Caspase-3/7 aktivitet ble undersøkt av caspase-3/7 analysen.
Resultater
I denne studien har vi rapportert en økt uttrykk av MIR-645 i AGEJ kliniske prøver sammenlignet med sammenkoblede ikke-kreft vev. Vi har også observert en betydelig MIR-645 oppregulering i to magekreft (GC) cellelinjer, SGC7901 og BGC-823, som ble brukt som cellemodeller fordi det var ingen tilgjengelige AGEJ cellelinjer etablert for å date. Vi fant at hemming av MIR-645 kan bevisst dramatisk SGC7901 og BGC-823 celler både serum starvation- og kjemoterapeutisk legemiddelindusert apoptose med opp regulerende IFIT2, en formidler av apoptose via en mitokondrie vei, med en potensiell bindingssete for MIR -645 i sin mRNA er 3'UTR. Videre undersøkelser viste at IFIT2 uttrykk synker i SGC7901 og BGC-823 celler og AGEJ vev. IFIT2
ektopisk ekspresjon fører til fremming av celle apoptose, hvilket indikerer at IFIT2 kan fungere som en suppressor i utviklingen av AGEJ. Videre induserer inhibering av MIR-645 oppregulering av IFIT2 og økt caspase-3/7-aktivitet, sammenlignet med kontrollgruppene.
Konklusjoner
Våre data antyder at MIR-645 fungerer som et onkogen i human AGEJ ved, at minste delvis gjennom, målretting IFIT2
.
nøkkelord
Adencarcinoma av mage esophageal krysset mikroRNA-645 IFIT2 apoptose Bakgrunn
Nyere studier har antydet at adencarcinoma av mage esophageal krysset (AGEJ) er forskjellig fra distal magen, med ulike risikofaktorer, tumor egenskaper, og biologisk oppførsel [1-4]. Videre har forekomsten av AGEJ vært økende de siste 30 årene, spesielt i USA og Nord-Kina [5-9].
MicroRNAs (mirnas) er en gruppe av endogent uttrykt, ikke-kodende små RNA, 20- 25 nukleotider i lengde, som er kjent for å ha negativ regulere genekspresjon gjennom undertrykke oversettelse eller redusere stabiliteten av mRNA ved direkte binding til den 3'-ikke-translaterte området (3'-UTR) av mål-mRNA [10, 11]. Samle bevis indikerer at mirnas har viktige roller i å regulere fysiologiske og patologiske prosesser, herunder utvikling [12], metabolisme [13], celleproliferasjon [14], differensiering [15] og apoptose [16]. I tillegg er avvikende post-transkripsjonell regulering av mRNA ved mirnas forbindelse med tumorgenese [17, 18]. Unormale ekspresjonsprofiler av mirnas har blitt rapportert å bli detektert i forskjellige typer av humane tumorer, inkludert lunge- [19], bryst [20], prostata [21], lever [18], tykktarm [22] og magekreft [23]. Dessuten kan noen mirnas fungere som onkogener [24-26] eller svulst supressors [27, 28] ved å regulere uttrykket av sine mål gener som har viktige roller i noen viktige veier som er involvert i cellesyklusprogresjon, apoptose eller spredning. mirnas nedregulert i vevsprøver som MIR-22 [29, 30], MIR-101 [31, 32], og MIR-7 [33, 34] vanligvis fungere som undertrykkende mirnas, mens mirnas oppregulert i vevsprøver som MIR-17 [35, 36], og MIR-21 [37, 38] vanligvis utøve onkogene roller. Disse studiene tyder på at feilregulering av miRNAs er ofte involvert i kreftutvikling og kreft progresjon., En fersk studie har indikert at MIR-645 kan utøve den tumor suppressor rolle i avansert serøs eggstokkreft for MIR-645 er negativt assosiert med total overlevelse av det [39]. I denne studien fant vi at Mir-645 uttrykk øker betydelig hos AGEJ kliniske prøver sammenlignet med sammenkoblede ikke-kreft vev ved hjelp av mikroRNA chips. Imidlertid har rollen som MIR-645 i tumorigenesis av AGEJ ikke undersøkt ennå. Videre studier viste at MIR-645 var også signifikant oppregulert i to magekreft (GC) cellelinjer, SGC7901 og BGC-823, som ble brukt som alternative cellemodeller i denne studien. Hemming av MIR-645 i SGC7901 og BGC-823 celler undertrykte betydelig apoptose av SGC7901 og BGC-823 celler i tilstanden til serum sult eller kjemoterapeutisk stoff med opptil regulerende IFIT2, en formidler av apoptose, med en potensiell bindingssete for MIR -645 i sin mRNA er 3'UTR. Uttrykket mønster av MIR-645 og IFIT2 i AGEJ kliniske prøver ble negativt korrelert, videre tyder på at IFIT2
er et mål gen av MIR-645. Videre inhibering av MIR-645 resulterer i øket caspase-3/7-aktivitet, som aktiveres ved IFIT2. I denne studien har vi undersøkt om MIR-645 er oppregulert i menneskelig adencarcinoma av mage esophageal knutepunkt og hemmer apoptose ved å målrette tumor suppressor IFIT2.
Metoder
Etikk uttalelse
For vevsprøver, skriftlig informert samtykke var oppnådd fra pasienter. De prosedyrer som brukes i denne studien ble godkjent av Institutional Review Board of Henan University of Science and Technology, og ble forvandlet til Helsinki-deklarasjonen, og til lokal lovgivning.
Cellelinjer og kulturforhold
magekreft cellelinjer SGC -7901, BGC-823 og udødelig normal gastrisk epitel cellelinje, GES-1 var velvillig gitt av professor Daiming Fan. Alle cellelinjene ble opprettholdt i vårt institutt i henhold til anbefalte protokoller. Celler ble dyrket i RPMI-1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator.
menneske~~POS=TRUNC prøver
Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Institutional Review Board of Henan University of Science and Technology. Skriftlig informert samtykke ble innhentet for alle pasientprøver. Menneske AGEJ prøver (n = 43) og pasient paret ikke-kreft prøver ble innhentet fra pasienter ved første tilknyttet sykehuset, Henan University of Science and Technology, med informert samtykke fra den enkelte pasient.
RNA rensing, cDNA syntese, og kvantitative real-time PCR (QRT-PCR)
Total RNA fra dyrkede celler ble ekstrahert med TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll og RNA ble lagret ved -80 ° C før QRT-PCR-analyse . Moden MIR-645 uttrykk ble oppdaget ved hjelp av en Mirvana TM QRT-PCR miRNA Detection Kit (Ambion Inc. Austin, Texas), med U6 som en intern kontroll. IFIT2 ekspresjon ble påvist med primere F: 5'AGCGAAGGTGTGCTTTGAGA 3 ', R: 5'GAGGGTCAATGGCGTTCTGA3' (produkt lengde: 125 bp; Tm: 60 ° C; GC%: F-50%, R-55%, start-ende: 643-748 bp) og GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. PCR produktene ble separert på en etidiumbromid-farget 1,5% agarosegel og visualisert med UV.
Cell transfeksjon
menneskelige MIR-645 duplex agomir (400 nM), antagomir (400 nM) og negativ kontroll ble utformet og levert av Ribobio (Guangzhou, Guangdong, Kina). Plasmid-IFIT2 og negative kontroll plamid ble kjøpt fra Ribobio Inc (Guangzhou, Guangdong, Kina)
miRNA mål prediksjon
å finne potensielle miRNA målgener, TargetScanHuman hjemmeside (http:.. //Www targetscan. org /) ble brukt, bindingen fri energi ble beregnet og avventende steder ble analysert ved hjelp av http:.... //bibiserv techfak uni-Bielefeld de /rnahybrid nettstedet
Vector konstruerer og luciferase reporter analysen
for å konstruere plasmidet IFIT2-3'UTR, ble en villtype-3'-UTR-fragment av humant IFIT2 mRNA (1226-1233 nt, Genbank aksesjonsnr. NM_001547.4) inneholdende det antatte MIR-645 bindende sekvens amplifisert ved hjelp av RT-PCR og klonet inn i området mellom Xhol og NotI nedstrøms for luciferase reporter-genet av psiCHECK ™ vektor (Promega, USA). En mutant av singelen MIR-645 bindingssetet (5'AGCCTAG -3 'til 5'TCGGATC -3 ") i 3'-UTR av IFIT2 ble inkludert ved seterettet mutagenese Kit (SBS Genetech, Beijing, Kina ). Wild og mutante typer pmirGLO-IFIT2-UTR vektorer ble bekreftet ved DNA-sekvense
Nukleotidsekvensene av primerne for IFIT2-3'UTR (WT) klon:.
IFIT2XhoIF2:. 5'CCGCTCGAG AGAATAGAGATGTGGTGCCCACTAGGCTACTGCTG 3 '
IFIT2NotIR2: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TTAAAATGGAATCAGTGACTTTTATTTCTCATAACAGAG 3 '
nukleotidsekvensene av primere for IFIT2-3'UTR (MT) klone.
mutIFIT2F2: 5'TTCTAGGTAGATGCTGAATTCGGATCACATCAAAGTTGGTGTGAAC 3'.
mutIFIT2R2: 5'GTTCACACCAACTTTGATGTGATCCGAATTCAAGEJTCTACCTAGAA 3 ' .
Celler ble transfektert med Mir-645 etterligner, NC og pmirGLO plasmid i 24-brønners plater ved hjelp lipofektamin ™ 2000 (Invitrogen) i henhold til instruksjonene. 48 timer senere ble cellene høstet og analysert for luciferase-aktivitet ved bruk av dual-luciferase reporter Assay System (Promega, USA) og detektert av GloMaxTM 20/20 deteksjonssystem (E5331, Promega).
Caspase-3/7 analyse
aktivitet av kaspase-3 og kaspase-7 ble påvist i 96-brønners format (2 x 10 3 celler /brønn) ved hjelp av caspase-Glo 3/7 Assay (Promega) i henhold til instruksjonene. 100 ul Caspase-Glo 3/7 av reagens ble tilsatt til hver brønn og deretter inkubert ved romtemperatur i 1 time follwong den luminescens ble påvist ved hjelp av fluorescens-M200 mikroplateleser (Tecan). Bakgrunnen luminescens assosiert med cellekultur og assayreagens (blank reaksjon) ble trukket fra eksperimentell verdi.
MTT analyse
Cellene ble transfektert med 100 nM MIR-645 inhibitor (Genepharma, Shanghai, Kina), etterligner (Ribobio Inc ., Guangzhou, Guangdong, Kina) eller 100 nM plamid-IFIT2 (Ribobio Inc., Kina). Tjuefire senere, celler ble sådd i 96-brønns plater (2 x 10 3 /brønn). Levedyktigheten av celler ble undersøkt ved hjelp av MTT (3-2, 5-difenyl tetrazoliumbromid) analyse (Sigma, USA) i henhold til instruksjonene i angitt tidsperiode.
Western blotting
Total protein fra dyrkede celler ble lysert ved Lysis Buffer inneholder PMSF på is. Deretter protein ble underkastet elektroforese gjennom 12% SDS-polyakrylamidgeler og ble deretter overført til en PVDF-membran (Millipore). Membranene ble blokkert med 5% ikke-fett melkepulver ved romtemperatur i 1 time og inkubert over natten med primære antistoffer. Membraner ble inkubert med sekundære antistoffer merket med HRP i 1 time ved romtemperatur etter tre 10 min vaskinger i TBS-T (triethanolaminebuffered saltvann med Tween). Til slutt ble de signaler som påvist ved anvendelse av ECL-sett (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) og membranene ble scannet og analysert ved bruk av en Bio-Rad ChemiDoc XRS + avbildningssystem med bilde (versjon mengde 1). Proteinet ekspresjon ble normalisert til en endogen referanse (Tubulin) og i forhold til kontrollgruppen. Den Spectra flerfarget bredt spekter protein stige (Fermentas) ble anvendt som molekyl markør. Alle antistoffer som brukes i western blot analysen er oppført i tilleggsfiler 1: Tabell S1
Immunohistochemistry og immunhistokjemisk scoring
Parafin seksjoner, fire-mikrometer i tykkelse, ble bakt i 2 timer ved 65 ° C og deparaffinized.. Antigen gjenfinning ble utført ved anvendelse av citrat natrium-buffer (pH 7,2) ved 95 ° C i 15 minutter og deretter objektglass ble avkjølt ved romtemperatur i 30 minutter. Etter å ha blitt behandlet med 3% hydrogenperoksid i 15 minutter for å blokkere endogen peroksidase, ble delene behandlet med normalt geiteserum begrensnings væske i 30 minutter for å redusere ikke-spesifikk binding, og deretter kanin polyklonalt anti-IFIT2 (1: 500, HPA003408, Sigma-Aldrich. Shanghai, Kina) ble inkubert seksjonene i 12 timer ved 4 ° C. Etter gjenoppvarming i 1 time og vasking 5 ganger ble snittene inkubert med sekundært antistoff i 30 minutter ved romtemperatur. Diaminobenzidin (DAB) ble anvendt for fargereaksjoner. Påfølgende immunhistokjemisk farging ble scoret som tidligere beskrevet [40].
Statistisk analyse
Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige forsøk. For statistiske tester, SPSS statistisk programvare pakken, version17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) ble brukt. Studentens t
-test, enveis ANOVA og to-veis ANOVA-testen ble utført for relativ bandet tetthet av western blotting og MTT OD verdier. Korrelasjonen mellom MIR-645 og IFIT2 ble analysert med Spearman rank korrelasjon. P-verdier. ≪ 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Expressions of Mir-645 er oppregulert i AGEJ kliniske prøver
For å vurdere rollen til MIR-645 i tumorigenesis av AGEJ, vi først brukt QRT - PCR-metode for å måle MIR-645 ekspresjon av 43 humane kliniske AGEJ vev, og fant at MIR-645 var signifikant oppregulert i AGEJ kliniske vev sammenlignet med pasient parede gastriske hjerte ikke-cancerøse vev (Figur 1a). For å få ytterligere innsikt i observasjons nevnt ovenfor, undersøkte vi sammenhengen mellom Mir-645 uttrykk og pasientene i kliniske parametre. Analyser viste at Mir-645 uttrykk var irrelevant med alder, kjønn, tumor differensiering, lymfeknute metastaser og TNM stadium (tabell 1: Forholdet mellom kliniske parametre og Mir-645 uttrykk i primær mage Cardia adenokarsinom), men var i en positiv korrelasjon med tumorstørrelse, nemlig tumorstørrelse større enn eller lik 5 cm gruppe viste signifikant øket MIR-645 ekspresjon sammenlignet med tumorstørrelse mindre enn 5 cm gruppe (figur 1B &Co. tabell 1, t
-test, * P
= 0,045). Figur 1 Uttrykk for MIR-645 er oppregulert i AGEJ kliniske prøver. A. ekspresjon av MIR-645 i 43 human AGEJ kliniske prøver i forhold til de tilstøtende sammenkoblede normale humane gastriske kardiale ikke-cancervev, ble målt med kvantitativ RT-PCR (Verdiene angir gjennomsnitt ± SEM, n = 3, t
-test, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001). B. sammenligning av relative uttrykk for MIR-645 i menneskelig AGEJ kliniske prøver av forskjellig tumorstørrelse. (Two-tailed t
-test, * p < 0,05).
Tabell 1 Forholdet mellom kliniske parametre og Mir-645 uttrykk i primær mage Cardia adenokarsinom
kliniske parametre Book N (%)
Slektninger uttrykk (Mean ± SEM)
p-verdi
Alder (år)
≥ 60
15 (50)
2,1286 ± 0,59201
0,568
< 60
15 (50)
1,9571 ± 0,52402
Kjønn
Mann fra 18 (60)
2,1111 ± 0,42783
0,462
Kvinne
12 (40)
2,3333 ± 0,65328
Størrelse
≥5
13 (43,3)
2,7385 ± 100 128
0,004 *
< 5
17 (56,7)
1,8235 ± 1,52214
Histologisk differensiering
Well (W)
15 (50)
2,138 ± 0,1866
0,9427
Dårlig (P)
15 (50)
2,198 ± 0,1903
lymphatic metastase
Ja
12 (40)
2,4583 ± 0,77864
< 0,001 **
Ingen
18 (60)
1,4944 ± 1,36273
TNM stadium
Stage I /II
16 (53,3)
2,9125 ± 1,33660
< 0,001 **
Stage III /IV
14 (46,7)
1,4857 ± 0,73991 plakater (* p <
0,05; ** P. ≪
0,001)
Nedbryting av MIR-645 fremmer apoptose av magekreftceller
For å undersøke hvilken rolle MIR-645 i fenotypiske egenskapene til AGEJ progresjon, brukte vi to magekreft ( GC) cellelinjer, SGC7901 og BGC-823 som cellemodeller. QRT-PCR resultater viste at Mir-645 uttrykk var signifikant oppregulert sammenlignet med immortalisert GC cellelinje, GES-en (tilleggsfiler 2: Figur S1, P
< 0,001).
SGC7901 og BGC-823 cellene ble transient transfektert med moden Mir-645 etterligner, inhibitor, mock transfektert eller MIR-NC. Som vist i figur 2A og D, kvantitative RT-PCR-resultater viser at ekspresjon av speil 645 etterligner eller inhibitorer vesentlig oppregulerer eller ned-regulerer ekspresjonsnivået av MIR-645, henholdsvis i SGC7901 og BGC-823 celler fra første-femte dag etter transfeksjon (figur 2A, P
< 0,001; figur 2D, P
< 0,001) sammenlignet med NC og håne kontroller. Figur 2 Nedbryting av MIR-645 fremmer apoptose av magekreft (GC) celler. A & D. Nivået på MIR-645 ble målt ved kvantitativ PCR på angitt tidspunkt (Enveis ANOVA analyse, verdiene angir gjennomsnitt ± SD, figur 2A, F = 426,588, P < 0,001; figur 2D, F = 685,026, P <0,001). B & E. GC-celler transfektert med Mir-645 etterligner og hemmer utsatt for MTT analyse daglig i 6 dager (Toveis ANOVA analyse, figur 2B, F = 52.602, p < 0,001; figur 2E, F = 42,847, p < 0,001). C & F. GC celler celler transfektert med Mir-645 etterligner og inhibitor ble samlet for FACS analyse etter 72 timer (Verdiene angir gjennomsnitt ± SD, n = 3, One-way ANOVA analyse, Figur 2C-en, F = 121,600, p < 0,001; figur 2C-B, F = 250,400, p < 0,001; figur Fa, F = 194,815, p < 0,001; figur 2F-b, F = 412,741, p < 0,001)
SGC7901 og BGC-. 823-celler transfektert med MIR-645-inhibitorer og etterligner viste betydelig lavere og høyere nivåer av celleproliferasjon, henholdsvis sammenligning med NC eller mock-grupper i nærvær av ADR (0,2 ug /ml) som bestemt ved MTT-analysen (figur 2B, P
< 0,001; figur 2E, P
< 0,001) Anniex Vapoptosis analysen
utstilt betydelig økt og redusert apoptose priser av MIR-645 uttømming og ektopisk uttrykk grupper sammenlignet med NC grupper i serumfritt. tilstand eller i nærvær av anticancer medikament, adriamycin (ADR) (figur 2C ab, P
< 0,001; figur 2 F ab, P
< 0,001).
IFIT2 er et mål på MIR-645
Tidligere data tyder på at Mir-645 kan være et onkogen av avansert serøs eggstokkreft. Dermed ytterligere søkte vi for potensielle mål av MIR-645 ved algoritme av Target Scan menneske. Blant dem, IFIT2, en tumor suppressor, ble funnet å ha antatte MIR-645 bindingssteder innenfor sitt 3'UTR (figur 3A). Deretter utførte vi luciferase reporter analysen bruker SGC7901 og BGC-823 celler for å verifisere om IFIT2 var et direkte mål på MIR-645. Wild-type og mutant IFIT2-3'UTR inneholder den antatte bindingssetet av MIR-645 ble klonet inn psiCHECK-2 vektor nedstrøms fra luciferase genet (tilleggsfiler 3: Figur S2). Innføring av MIR-645 reduserte lucirferase aktivitet fra IFIT2 3'UTR reporter vektor betydelig (figur 3B, P
< 0,001; figur 3C, P
< 0,001), men ikke påvirke lucirferase aktivitet fra mutant IFIT2 3'UTR reporter vektor, støtter direkte interaksjon av MIR-645 med IFIT2. Disse resultatene videre foreslå at MIR-645 kan undertrykke IFIT2 uttrykk ved å målrette den 3'-UTR av IFIT2 mRNA. Figur 3 Validating den anslåtte bindingsseter mellom MIR-645 og IFIT2. A. Prinsippskissen viser konstruksjonen av Luc-IFIT2 3'UTR og Luc-IFIT2 3'Mut UTR. Både Luc-IFIT2 3'UTR og Luc-IFIT2 3'Mut UTR ble klonet inn i en pmirGLO plasmid nedstrøms ildflue luciferase kodende område mellom PmeI og Xbal. B & C. SGC7901 celler (B) eller BGC-823 celler (C) ble ko-transfektert med psiCHECK-2 konstruerer inneholder enten IFIT2 3'UTR eller IFIT2 3'Mut UTR og enten MIR-645-hemmer eller Mir-645 etterligner for 48 h. Verdier indikerer den relative luciferase-aktivitet etter normalisering til Renilla luciferase-aktivitet (Verdiene angir gjennomsnitt ± SD, n = 3, en-veis ANOVA-analyse, 3B, F = 283,244, figur 3C, F = 143,313. *** P <. 0.001)
uttrykk for MIR-645 og IFIT2 er negativt relatert i AGEJ kliniske prøver
å vurdere forholdet mellom MIR-645 og IFIT2 videre, undersøkte vi IFIT2 uttrykk i 43 AGEJ kliniske prøver å bruke QRT-PCR . Det ble funnet AGEJ vev hadde en bemerkelsesverdig lavere ekspresjonsnivå av IFIT2 enn de sammenkoblede ikke-cancerøse vev (figur 4A), og IFIT2 ekspresjon ble inverst korrelert med tumorstørrelsen (figur 4B, P =
0,0304). Nemlig tumorstørrelse større enn eller lik 5 cm gruppe viste signifikant nedregulert IFIT2 ekspresjon sammenlignet med tumorstørrelse mindre enn 5 cm gruppe. For å validere dataene, vi senere målt protein uttrykk for IFIT2 å bruke Western blotting (figur 4C a-b), og resultatene viste et lignende mønster observasjoner funnet av QRT-PCR. Immunhistokjemi analyse viste en betydelig redusert uttrykk for IFIT2 i AGEJ vev sammenkoblede ikke-kreft vev (figur 4D a-b, P <
0,001). Deretter analyserte vi forholdet mellom MIR-645 og IFIT2 uttrykk og funnet ut at IFIT2 uttrykk nivået var negativt korrelert med at av MIR-645 (figur 4E, P <
0,01). Videre SGC7901 (figur 4F a) og BGC-823 (figur 4F b) celler transfektert med MIR-645 inhibitor har betydelig økt IFIT2 uttrykk på protein og mRNA nivåer i forhold til mock og NC gruppene (figur 4F ab, P <
0,01). Våre funn tyder på at Mir-645 kan direkte regulerer uttrykket av IFIT2. Figur 4 Uttrykk for MIR-645 og IFIT2 negativt korrelert i AGEJ kliniske prøver og IFIT2 ble nedregulert i AGEJ vev sammenlignet med sammenkoblede ikke-kreft vev. A. Uttrykk for IFIT2 Hotell og MIR-645 i AGEJ kliniske prøver ble analysert ved kvantitativ PCR. B. sammenligning av relative uttrykk for IFIT2
i humane AGEJ kliniske prøver av forskjellig tumorstørrelse. (T
-test, * p < 0,05). C. Ekspresjon av IFIT2 undersøkt ved western blotting (a, b: verdiene angir gjennomsnitt ± SD, normalisert til tubulin, n = 3, t
-test, *** p
< 0,001) D. en. Representative bilder som vises er positive immunhistokjemisk farging av IFIT2 i menneskelige AGEJ prøver og matchet tilstøtende normalt vev (forstørrelse 200 ×). b. Farging score til IFIT2 (t
-test, *** p
< 0,001). E. Spredningsplott som viser negativ lineær sammenheng mellom mRNA uttrykk for IFIT2 Hotell og at av MIR-645 i 43 AGEJ kliniske prøver. F. IFIT2 og IFIT2
uttrykk målt ved Western blotting i SGC7901 (a) og BGC-823 celler (b). (Verdiene angir gjennomsnitt ± SD, n = 3, One-way ANOVA analyse, *** p
< 0,001)
IFIT2 formidler funksjon av MIR-645 ved å fremme SGC7901 og BGC-823 celler. apoptose
å bekrefte at induksjon av celle apoptose i SGC7901 og BGC-823 celler ved MIR-645 ble formidlet ved å målrette IFIT2
, utførte vi IFIT2
plasmid transfeksjon i SGC7901 (figur 5A) og BGC-823 (figur 5B) celler til oppregulerer ekspresjonen av IFIT2. Western blotting og kvantitativ PCR viste at oppregulering av IFIT2 av IFIT2
plasmid transfeksjon kan reduseres betraktelig ved Mir-645 etterligner. MTT analyse viste at celler transfektert med plasmid-IFIT2 spredning ble undertrykt, men celler transfektert med Mir-645 etterligner spredning økte vesentlig sammenliknet med plasmid-kontroll og plasmid-IFIT2 + MIR-645 grupper (figur 5C ab, P <
0,001). Videre er innføringen av IFIT2 fremmet apoptose av SGC7901 og BGC-823-celler og MIR-645 etterligner redusert apoptose av celler indusert ved IFIT2 oppregulering sammenlignet med NC gruppe i nærvær av ADR (figur 5E-F, P <
0,001). Våre funn antydet at IFIT2 mediert funksjonen av MIR-645 i begrenser SGC7901 og BGC-823 celler spredning og indusere celle apoptose. Figur 5 IFIT2 medierer funksjonen av MIR-645 ved å fremme GC celle apoptose. A & B. Uttrykk for IFIT2 undersøkt av western blotting (A:. SGC7901; B, BGC-823 a, normalisert til tubulin, verdiene angir gjennomsnitt ± SD, One-Way ANOVA analyse, for SGC7901, F = 189,307, for BGC-823, F = 85,374, b, verdiene angir gjennomsnitt ± SD, One-Way ANOVA analyse, for SGC7901, F = 85,374, for BGC-823, F = 219,921; *** p
< 0,001). C. SGC7901 (a) og BGC-823 (b) celler som er utsatt for MTT-assay daglig i 6 dager (verdiene angir gjennomsnitt ± SD, To-veis ANOVA-analyse, for SGC7901, F = 13,768, for BGC-823, F = 16,409, *** p
< 0,001). D & E. SGC7901 (D) og BGC-823 (E) celler ble oppsamlet for FACS-analyse etter 72 timer i nærvær av ADR (0,05 ug /ml) (verdiene angir gjennomsnitt ± SD, n = 3, en-Way ANOVA-analyse; for SGC7901, F = 361,749, for BGC-823, F = 229,952; *** p
. < 0,001)
Nedbrytning og oppregulering av MIR-645 endret caspase-3/7 aktivitet
IFIT2 har blitt rapportert å være en tumor suppressor via medierer celleapoptose gjennom aktivering av kaspase-3/7-aktivitet. Caspase-Glo 3/7 analyse viste at MIR-645 uttømming signifikant oppregulert, mens MIR-645 overekspresjon down-regulerte caspase-3/7-aktivitet sammenlignet med mock og NC-grupper i nærvær av ADR (0,2 ug /ml) (Figur 6A og B, P <
0,001) eller serum sult tilstand (figur 6C og D, P <
0,001). Disse resultatene kombinert med observasjoner nevnt ovenfor foreslått at MIR-645, oppregulert i menneskelige AGEJ vev, hemmet celle apoptose og fremmer tumorigenicity via undertrykke caspase-3/7-aktivitet ved å målrette IFIT2. Figur 6 Caspase-3/7-aktivitet. Anti-apoptotiske evne SGC7901 celler og BGC-823-celler etter eksponering til ADR (0,2 ug /mL), eller serum sult ble evaluert ved caspaser-3/7-aktivitet. A &C, SGC7901 celler; B & D, BGC-823 celler. (Verdiene angir gjennomsnitt ± SD, n = 3, en-Way ANOVA-analyse, for A, F = 183,930, for B, F = 1093,797, for C, F = 1861,50, for D, F = 1483,604, *** p
. < 0,001)
diskusjon og konklusjoner
Selv akkumulere bevis har vist at mirnas deregulering er involvert med svulst kreftutvikling, progresjon, migrasjon og invasjon [41], metastase [42, 43] og multiresistens [44-46]. Lite er kjent om rollene mirnas i utviklingen av adencarcinoma av mage esophageal krysset (AGEJ). Her viste vi at det MIR-645-ekspresjon ble betydelig økt i AGEJ kliniske prøver, sammenlignet med sammenkoblede ikke-cancervev og var signifikant oppregulert i to magekreft (GC) cellelinjer, SGC7901 og BGC-823, som ble anvendt alternativ cellemodeller fordi ingen tilgjengelige AGEJ cellelinjer ble etablert for å date. Hemming av MIR-645 i SGC7901 og BGC-823 celler betydelig indusert apoptose av SGC7901 og BGC-823 celler i tilstanden til serum sult eller kjemoterapeutisk stoff med opptil regulerende IFIT2,
en formidler av apoptose, med en potensiell bindingssetet Mir-645 i sin mRNA er 3'UTR. Uttrykket mønster av MIR-645 og IFIT2 i SGC7901 og BGC-823 celler og kliniske prøver ble negativt korrelert, videre tyder på at IFIT2
er et mål gen av MIR-645. Videre inhibering av MIR-645 resulterer i øket caspase-3/7-aktivitet, som aktiveres ved IFIT2. Alle disse funnene tyder på en fundamental rolle MIR-645 i karsinogenese, særlig i utviklingen av AGEJ.
For lite apoptose er en viktig årsak til carcinogenese på grunn maligne celler død reduseres bemerkelsesverdig [47, 48], noe som resulterer i ondartet transformasjon av de berørte celler, tumormetastase og multiresistens av cancerceller. Derfor er apoptose av stor betydning ved behandling av kreft og er en populær mål i en rekke behandlingsstrategier. I denne studien viste vi at MIR-645 nedskrevne kreftceller til serum deprivasjon-indusert apoptose, mens uttømming av MIR-645 motvirket denne effekten av MIR-645, noe som tyder på at MIR-645 kan spille en avgjørende rolle i tilpasningen av kreft celler til lav ernæring. Økende antall mirnas har vært innblandet i kreftcellen apoptose. På den ene side kan microRNAs fungere som tumor suppressor via indusering av apoptose, dvs. MIR-421, som induserer celleproliferasjon og apoptose motstand i human nasofaryngeal karsinom via nedregulering av FOXO4 [49]; MIR-149, som induserer apoptose ved å hemme akt1 og E2F1 i humane kreftceller [50] og miRNA-31, som induserer apoptose i humane neuroblastom celler [51]. På den annen side kan microRNAs fungere som onkogener ved å undertrykke apoptose, dvs. MIR-24, som inhiberer apoptose og undertrykker Bim i mus kardiomyocytter [52]; MIR-886-5p, som inhiberer apoptose ved å nedregulere Bax ekspresjon i humane cervikale karsinomceller [53], og MIR-183, som inhiberer TGF-β1-indusert apoptose ved nedregulering av PDCD4 ekspresjon i humane leverkreft-celler [54] .
ISGs, IFN stimulert gener, se gener som tanscribed av IFN induksjon. Blant dem, kan 4 spiller viktige roller som påvirker både hemming av viral replikasjon og inhibering av cellulær proliferasjon [55, 56]. Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• Proteom analyse av menneskelig mage Cardia adenokarsinom med laser capture mikrodisseksjon
• Terapeutiske potensialet av PRL-3 målretting og kliniske betydningen av PRL-3 genomisk forsterkning i magekreft