MicroRNA-645, opreguleret i human adencarcinoma af gastrisk esophageal vejkryds, hæmmer apoptose ved at målrette tumor suppressor IFIT2

MicroRNA-645, opreguleret i human adencarcinoma af gastrisk esophageal vejkryds, hæmmer apoptose ved at målrette tumor suppressor IFIT2
Abstract
Baggrund
Et stigende mængde af beviser tyder på, at miRNA har en afgørende rolle i carcinogenese og kræft progression; Men rolle miRNA i tumorigenese af adencarcinoma af gastrisk esophageal junction (AGEJ) stort set uklar.
Metoder
SGC7901 og BGC-823 gastrisk cancer cellelinjer blev anvendt. De udtryk for miR-645 og IFIT2 (Interferon-induceret protein med tetratricopeptide gentager 2) blev undersøgt ved QRT-PCR, blev de udtryk for IFIT2 undersøgt af western blotting og immunhistokemi assay. Celleapoptosen blev bestemt ved FACS. MIR-645-inhibitor, efterligner og plasmid-IFIT2 transfektioner blev udført for at studere underskudsgivende og gain-funktion. Caspase-3/7-aktivitet blev undersøgt af caspase-3/7-assay.
Resultater
I den foreliggende undersøgelse har vi rapporteret en øget ekspression af MIR-645 i AGEJ kliniske prøver sammenlignet med parrede ikke-kræft væv. Vi har også observeret en signifikant miR-645 opregulering i to gastrisk cancer (GC) cellelinjer, SGC7901 og BGC-823, som blev brugt som celle modeller, fordi der var ingen ledige AGEJ cellelinjer, der er etableret til dato. Vi fandt, at inhibering af MIR-645 kunne sensibilisere dramatisk SGC7901 og BGC-823 celler til både serum starvation- og kemoterapeutisk lægemiddel-induceret apoptose ved opregulering IFIT2, en mediator af apoptose via en mitokondrie pathway, med en potentiel bindingssted for miR -645 i sin mRNA'er 3'UTR. Yderligere undersøgelser udstillet at IFIT2 udtryk falder i SGC7901 og BGC-823 celler og AGEJ væv. IFIT2
ektopisk ekspression fører til fremme af celle apoptose, hvilket indikerer, at IFIT2 kan fungere som en undertrykker i udviklingen af ​​AGEJ. Endvidere inhibering af MIR-645 inducerer opregulering af IFIT2 og øget caspase-3/7 Aktivitetsmenutast sammenlignet med kontrolgrupper.
Konklusioner Salg Vore data antyder, at MIR-645 fungerer som et onkogen i human AGEJ ved, at mindste delvist igennem, rettet IFIT2
.
Emneord
Adencarcinoma af gastrisk esophageal junction microRNA-645 IFIT2 Apoptose Baggrund
Nylige undersøgelser har antydet, at adencarcinoma af gastrisk esophageal junction (AGEJ) er forskellig fra distal mave, med forskellige risikofaktorer, tumor egenskaber og biologisk opførsel [1-4]. Desuden er forekomsten af ​​AGEJ været stigende gennem de seneste 30 år, især i USA og nordlige Kina [5-9].
MicroRNA (miRNA) er en gruppe af endogent udtrykt, ikke-kodende små RNA, 20- 25 nukleotider lange, som vides at negativt regulere genekspression gennem undertrykke translation eller nedsætte stabiliteten af ​​mRNA'er ved direkte binding til 3'-utranslaterede region (3'-UTR) af target mRNA'er [10, 11]. Akkumulerende beviser indikerer, at miRNA har vigtige roller i reguleringen fysiologiske og patologiske processer, herunder udvikling [12], metabolisme [13], celledeling [14], differentiering [15] og apoptose [16]. Desuden er afvigende post-transkriptionel regulering af mRNA'er af miRNA relateret til tumorigenese [17, 18]. De unormale udtryk profiler af miRNA er blevet rapporteret at blive detekteret i forskellige typer af humane tumorer, herunder lunge [19], bryst [20], prostata [21], lever [18], colon [22] og gastrisk cancer [23]. Desuden kan nogle miRNA fungere som onkogener [24-26] eller tumor supressors [27, 28] ved at regulere ekspressionen af ​​deres mål gener, som har vigtige roller i nogle vigtige veje involveret i cellecyklusprogression, apoptose eller proliferation. miRNA nedreguleret i tumorprøver såsom MIR-22 [29, 30], MIR-101 [31, 32], og MIR-7 [33, 34] normalt fungere som suppressive miRNA, mens miRNA opreguleret i tumorprøver såsom mIR-17 [35, 36], og mIR-21 [37, 38] normalt udøve oncogene roller. Disse undersøgelser tyder på, at dysregulering af miRNA ofte er involveret i carcinogenese og kræft progression.
En nylig undersøgelse har vist, at miR-645 kan udøve tumor suppressor rolle i fremskreden serøs ovariecancer for miR-645 er negativt forbundet med den samlede overlevelse det [39]. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at MIR-645 ekspression blev signifikant forøget i AGEJ kliniske prøver sammenlignet med parrede ikke-kræft væv under anvendelse microRNA chips. Imidlertid har den rolle, MIR-645 i tumorigenese af AGEJ ikke undersøgt endnu. Yderligere undersøgelse viste, at miR-645 var også signifikant opreguleret i to gastrisk cancer (GC) cellelinjer, SGC7901 og BGC-823, som blev brugt som alternative celle modeller i den foreliggende undersøgelse. Hæmning af miR-645 i SGC7901 og BGC-823 celler signifikant undertrykte apoptose af SGC7901 og BGC-823 celler i tilstanden af ​​serum sult eller kemoterapeutiske lægemiddel ved opregulering IFIT2, en mediator af apoptose, med et potentielt bindingssted for miR -645 i sin mRNA'er 3'UTR. Ekspressionsmønsteret for MIR-645 og IFIT2 i AGEJ kliniske prøver blev negativt korreleret, hvilket yderligere antyder, at IFIT2
er et målgen af ​​MIR-645. Endvidere inhibering af MIR-645 resulterer i forøget caspase-3/7 Aktivitetsmenutast, som aktiveres af IFIT2. I denne undersøgelse undersøgte vi, om miR-645 er opreguleret i human adencarcinoma af gastrisk esophageal krydset og hæmmer apoptose ved at målrette tumor suppressor IFIT2.
Metoder
Etik erklæring Hus Til vævsprøver, skriftligt informeret samtykke var opnået fra patienter. De procedurer, der anvendes i denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board i Henan Universitet for Videnskab og Teknologi og blev tilpasset til Helsingfors-erklæringen, og med lovgivning.
Cellelinjer og dyrkningsbetingelser
mavekræft cellelinjer SGC -7901, BGC-823 og udødeliggjort normal gastrisk epitelial cellelinje blev GES-1 venligt skænket af professor Daiming Fan. Alle cellelinier blev opretholdt i vores institut ifølge anbefalede protokoller. Celler blev dyrket i RPMI-1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
Menneskelige prøver
Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af Institutional Review Board i Henan University of Science and Technology. Skriftligt informeret samtykke blev opnået for alle patientprøver. Humane AGEJ prøver (n = 43) og patient parret ikke-kræft prøver blev opnået fra patienter på det første tilknyttede hospital, Henan University of Science and Technology, med informeret samtykke fra hver patient.
RNA oprensning, cDNA syntese, og kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR)
Totalt RNA fra dyrkede celler blev ekstraheret med TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens protokol og RNA'er blev opbevaret ved -80 ° C før QRT-PCR-analyse . Modent MIR-645-ekspression blev detekteret ved anvendelse af et Mirvana TM QRT-PCR miRNA Detection Kit (Ambion Inc. Austin, Texas), med U6 som en intern kontrol. IFIT2 ekspression blev detekteret med primere F: 5'AGCGAAGGTGTGCTTTGAGA 3 ', R: 5'GAGGGTCAATGGCGTTCTGA3' (produkt længde: 125 bp; Tm: 60 ° C; GC%: F-50%, R-55%; start-ende: 643-748 bp) og GAPDH blev anvendt som en intern kontrol. PCR-produkter blev separeret på en ethidiumbromid-farvet 1,5% agarosegel og visualiseret med UV.
Cell transfektion
humane MIR-645 duplex agomir (400 nM), antagomir (400 nM) og negativ kontrol blev udformet og leveret af Ribobio (Guangzhou, Guangdong, Kina). Plasmid-IFIT2 og den negative kontrol plamid blev købt fra Ribobio Inc (Guangzhou, Guangdong, Kina)
miRNA target forudsigelse
at finde potentielle miRNA målgener, TargetScanHuman hjemmeside (http:.. //Www Targetscan. org /) blev anvendt, bindingen fri energi blev beregnet, og biding sites blev analyseret ved hjælp af http:.... //bibiserv techfak uni-Bielefeld de /rnahybrid hjemmeside
Vector konstruktioner og luciferase reporter assay
til konstruktion IFIT2-3'UTR plasmid blev en vildtype 3'-UTR fragment af human IFIT2 mRNA (1226-1233 nt, GenBank nr. NM_001547.4) indeholdende det formodede mIR-645 bindende sekvens amplificeret ved RT-PCR og klonet ind på webstedet mellem Xho i og Not i nedstrøms for luciferasereportergenet af psiCHECK ™ vektor (Promega, USA). En mutant af den fælles miR-645 bindingssted (5'AGCCTAG -3 "til 5'TCGGATC -3) i 3'-UTR af IFIT2 blev inkluderet ved mutagenese Kit (SBS Genentech, Beijing, Kina ). Vilde og mutante former for pmirGLO-IFIT2-UTR vektorer blev valideret ved DNA-sekventering
Nukleotidsekvenserne for primerne for IFIT2-3'UTR (WT) klon:.
IFIT2XhoIF2:. 5'CCGCTCGAG AGAATAGAGATGTGGTGCCCACTAGGCTACTGCTG 3 '
IFIT2NotIR2: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TTAAAATGGAATCAGTGACTTTTATTTCTCATAACAGAG 3'
nukleotidsekvenserne for primerne for IFIT2-3'UTR (MT) klon:.
mutIFIT2F2: 5'TTCTAGGTAGATGCTGAATTCGGATCACATCAAAGTTGGTGTGAAC 3 '.
mutIFIT2R2: 5'GTTCACACCAACTTTGATGTGATCCGAATTCAAGEJTCTACCTAGAA 3' .
Celler blev transficeret med miR-645 efterligner, NC og pmirGLO plasmid i 24-brønds plader ved hjælp af Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) i henhold til instruktionerne. 48 timer senere blev celler høstet og analyseret for luciferaseaktivitet under anvendelse af Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA) og detekteres af GloMaxTM 20/20 detektionssystem (E5331, Promega).
Caspase-3/7-assay
aktiviteten af ​​caspase-3 og caspase-7 blev påvist i 96-brønds format (2 × 10 3 celler /brønd) ved anvendelse af caspase-Glo 3/7 assay (Promega) ifølge vejledningen. 100 pi Caspase-Glo 3/7 reagens blev suppleret i hver brønd og derefter inkuberet ved stuetemperatur i 1 time follwong luminescensen blev påvist under anvendelse af M200 mikroplade fluorescenslæser (Tecan). Baggrunden luminescens forbundet med celledyrkning og assayreagens (blank reaktion) blev trukket fra eksperimentelle værdi.
MTT-assay
Celler blev transficeret med 100 nM MIR-645 inhibitor (Genepharma, Shanghai, Kina), efterligner (Ribobio Inc ., Guangzhou, Guangdong, Kina) eller 100 nM plamid-IFIT2 (Ribobio Inc., Kina). Fireogtyve senere blev celler podet i 96-brønds plader (2 × 10 3 /brønd). Cellernes levedygtighed blev undersøgt ved MTT (3-2, 5-diphenyl tetrazoliumbromid) assay (Sigma, USA) ifølge instruktionerne på angivne tidspunkt.
Western blotting
totalt protein fra dyrkede celler blev lyseret ved Lysis Buffer indeholdende PMSF på is. Derefter protein elektroforese gennem 12% SDS polyacrylamidgeler og blev derefter overført til en PVDF-membran (Millipore). Membraner blev blokeret med 5% fedtfri mælkepulver ved stuetemperatur i 1 time og inkuberet natten over med primære antistoffer. Membraner blev inkuberet med sekundære antistoffer mærket med HRP i 1 time ved stuetemperatur efter tre 10 minutters vaske i TBS-T (triethanolaminebuffered saltopløsning med Tween). Endelig blev detekteret signalerne anvendelse af ECL kit (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA), og membranerne blev scannet og analyseret under anvendelse af et Bio-Rad ChemiDoc XRS + imaging system med billedbehandlingssoftware (version mængde 1). Proteinet ekspression blev normaliseret til en endogen reference (tubulin) og i forhold til kontrollen. Spectra flerfarvet bredspektret protein stige (Fermentas) blev anvendt som molekylær markør. Alle antistoffer anvendt i western-blot-assay, er vist i supplerende fil 1: Tabel S1
Immunhistokemi og immunhistokemisk scorings
Paraffinsnit, 4-um i tykkelse, blev bagt i 2 timer ved 65 ° C og deparaffineret.. Antigen genfinding blev udført under anvendelse citrat natrium (pH 7,2) ved 95 ° C i 15 minutter og derefter Objektglassene blev afkølet ved stuetemperatur i 30 minutter. Efter at være blevet behandlet med 3% hydrogenperoxid i 15 minutter for at blokere endogen peroxidase blev sektionerne behandlet med normalt gedeserum begrænse væske i 30 minutter for at reducere ikke-specifik binding og derefter kanin-polyklonalt anti-IFIT2 (1: 500, HPA003408, Sigma-Aldrich. Shanghai, Kina) inkuberet sektionerne i 12 timer ved 4 ° C. Efter genopvarmning i 1 time og vask i 5 gange, blev snit inkuberet med sekundært antistof i 30 minutter ved stuetemperatur. Diaminobenzidin (DAB) blev anvendt til farvereaktioner. Efterfølgende immunhistokemisk farvning blev bedømt som tidligere beskrevet [40].
Statistisk analyse
Data blev udtrykt som gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg. Til statistiske tests, SPSS statistisk software pakke, version17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) blev anvendt. Den studerendes t
-test, blev envejs ANOVA og to-vejs ANOVA test for relativ band tæthed af western blotting og MTT OD-værdier. Sammenhængen mellem miR-645 og IFIT2 blev analyseret med Spearman rank korrelation. P-værdier. ≪ 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant
Resultater
Udtryk for miR-645 er opreguleret i AGEJ kliniske prøver
For at vurdere betydningen af ​​miR-645 i tumorigenese af AGEJ, vi først brugt QRT - PCR-fremgangsmåden til måling af mIR-645 ekspression af 43 humane AGEJ kliniske væv, og fandt, at mIR-645 var signifikant opreguleret i AGEJ kliniske væv sammenlignet med patientens parret gastriske kardiale ikke-cancervæv (figur 1A). For at få yderligere indsigt i ovennævnte observation undersøgte vi sammenhængen mellem miR-645 udtryk og patienter kliniske parametre. Analyse viste, at miR-645-ekspression var irrelevant med alder, køn, tumor differentiering, lymfeknude metastaser og TNM stadie (Tabel 1: Forholdet mellem kliniske parametre og miR-645 udtryk i den primære gastrisk Cardia adenocarcinom), men var i en positiv korrelation med tumorstørrelsen, nemlig tumorstørrelse større end eller lig med 5 cm gruppen viste signifikant forøgede mIR-645-ekspression sammenlignet med tumorstørrelse under 5 cm gruppe (figur 1B & tabel 1, t
-test, * P
= 0,045). Figur 1 Udtryk for miR-645 er opreguleret i AGEJ kliniske prøver. A. ekspression af MIR-645 i 43 human AGEJ kliniske prøver i forhold til de tilstødende parrede normale humane gastriske kardiale ikke-cancervæv, blev målt ved kvantitativ RT-PCR (Værdierne angiver middelværdien ± SEM, n = 3, t
-test, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001). B. sammenligning af relativ ekspression af MIR-645 i human AGEJ kliniske prøver af forskellig tumorstørrelse. (To halede t
-test, * p < 0,05).
Tabel 1 Forholdet mellem kliniske parametre og miR-645-ekspression i den primære gastrisk Cardia adenocarcinom
Klinisk parametre
N (%)
slægtninge udtryk (Middelværdi ± SEM)
p-værdi
Alder (år)
≥ 60
15 (50)
2,1286 ± 0,59201
0,568
< 60
15 (50)
1,9571 ± 0,52402
Køn
Mand
18 (60)
2,1111 ± 0,42783
0,462
Female
12 (40)
2,3333 ± 0,65328
Størrelse
≥5
13 (43,3)
2,7385 ± 100.128
0,004 *
< 5
17 (56,7)
1,8235 ± 1,52214
Histologisk differentiering
Well (W)
15 (50)
2,138 ± 0,1866
0,9427
Dårligt (P)
15 (50)
2,198 ± 0,1903
lymfatisk metastaser
Ja
12 (40)
2,4583 ± 0,77864
< 0,001 **
Ingen
18 (60)
1,4944 ± 1,36273
TNM stadie
fase I /II
16 (53,3)
2,9125 ± 1,33660
< 0,001 **
Stage III /IV
14 (46,7)
1,4857 ± 0,73991
(* p <
0,05; ** P. ≪
0,001)
Udtømning af miR-645 fremmer apoptose af gastriske kræftceller
For at undersøge betydningen af ​​miR-645 i fænotypiske egenskaber AGEJ progression, brugte vi to mavekræft ( GC) cellelinjer, SGC7901 og BGC-823 som celle modeller. QRT-PCR-resultater viste, at miR-645-ekspression var betydeligt opreguleret sammenlignet med udødeliggjort GC cellelinje, GES-1 (Yderligere fil 2: Figur S1, P
< 0,001).
SGC7901 og BGC-823 celler blev transient transficeret med modne mIR-645 efterligner, inhibitor, mock transficeret eller mIR-NC. Som vist i figur 2A og D, kvantitative RT-PCR resultater viser, at ekspression af miR- 645 efterligner eller inhibitorer markant opregulerer eller nedregulerer ekspressionsniveauet af MIR-645, henholdsvis i SGC7901 og BGC-823 celler fra først til femte dag efter transfektion (figur 2A, P
< 0,001, figur 2D, P
< 0,001) i forhold til NC og mock kontroller. Figur 2 Udtømning af miR-645 fremmer apoptose af gastrisk kræft (GC) celler. A & D. Niveauet af miR-645 blev målt ved kvantitativ PCR på angivne tidspunkt (One-way ANOVA-analyse, værdierne angiver middelværdien ± SD, figur 2A, F = 426,588, P < 0,001, figur 2D, F = 685,026, P <0,001). B &E. GC-celler transficeret med miR-645 efterligner og inhibitor udsat for MTT assay dagligt i 6 dage (Tovejs ANOVA analyse, figur 2B, F = 52.602, p < 0,001; Figur 2E, F = 42,847, p < 0,001). C & F. GC celler celler transficeret med miR-645 efterligner og inhibitor blev indsamlet for FACS-analyse efter 72 timer (Værdierne angiver middelværdien ± SD, n = 3, En-vejs ANOVA-analyse, Figur 2C-a, F = 121,600, s < 0,001, figur 2C-b, F = 250,400, s < 0,001, figur Fa, F = 194,815, s < 0,001; Figur 2F-b, F = 412,741, s < 0,001)
SGC7901 og BGC-. 823-celler transficeret med mIR-645 inhibitorer og efterligner viste signifikant lavere og højere niveauer af celleproliferation, henholdsvis sammenligning med NC eller mock grupper i nærvær af ADR (0,2 ug /ml) som bestemt ved MTT-assay (figur 2B, P
< 0,001, figur 2E, P
< 0,001)
Anniex Vapoptosis assay udviste signifikant øget og nedsat apoptose satser af miR-645 udtømning og ektopiske udtryk grupper sammenlignet med NC grupper i serum-fri. tilstand eller i overværelse af anticancer narkotika, adriamycin (ADR) (Figur 2C ab, P
< 0,001; Figur 2 F ab, P
< 0,001).
IFIT2 er et mål for miR-645
Tidligere data tyder på, at miR-645 kunne være et onkogen af ​​fremskreden serøs kræft i æggestokkene. Således vi yderligere søgt efter de potentielle mål for miR-645 ved algoritmen af ​​Target Scan Menneske. Blandt dem, IFIT2, en tumor suppressor, viste sig at have formodet MIR-645 bindingssites inden dens 3'UTR (figur 3A). Derefter udførte vi luciferase reporter under anvendelse SGC7901 og BGC-823 celler for at kontrollere, om IFIT2 var et direkte mål for miR-645. Vildtype og mutant IFIT2-3'UTR indeholdende det formodede bindingssted MIR-645 blev klonet ind psiCHECK-2-vektoren nedstrøms fra luciferasegenet (Yderligere fil 3: Figur S2). Indførelse af miR-645 reducerede lucirferase aktivitet fra IFIT2 3'UTR reporter vektor signifikant (figur 3B, P
< 0,001; figur 3C, P
< 0,001), men påvirkede ikke lucirferase aktivitet fra mutanten IFIT2 3'UTR reporter vektor, støtter direkte interaktion af mIR-645 med IFIT2. Disse resultater antyder endvidere, at MIR-645 kan undertrykke IFIT2 ekspression ved at målrette 3'-UTR af IFIT2 mRNA. Figur 3 Validering de forudsagte bindingssteder mellem miR-645 og IFIT2. A. diagram viser konstruktionen af ​​Luc-IFIT2 3'UTR og Luc-IFIT2 3'Mut UTR. Både Luc-IFIT2 3'UTR og Luc-IFIT2 3'Mut UTR blev klonet i en pmirGLO plasmid nedstrøms for den ildflueluciferase-kodende region mellem Pmel og Xbal-stederne. B &C. SGC7901 celler (B) eller BGC-823 celler (C) blev cotransficeret med psiCHECK-2 konstruktioner indeholdende enten IFIT2 3'UTR eller IFIT2 3'Mut UTR og enten miR-645-hæmmer eller miR-645 efterligner til 48 h. Værdier angiver den relative luciferase aktivitet efter normalisering til Renilla luciferaseaktivitet (Værdierne angiver middelværdien ± SD, n = 3, En-vejs ANOVA-analyse, figur 3B, F = 283,244, figur 3C, F = 143,313. *** P <. 0,001)
ekspression af miR-645 og IFIT2 er negativt relateret i AGEJ kliniske prøver
for yderligere at vurdere forholdet mellem miR-645 og IFIT2 undersøgte vi IFIT2 udtryk i 43 AGEJ kliniske prøver ved hjælp QRT-PCR . Det blev fundet AGEJ væv havde en bemærkelsesværdig lavere ekspressionsniveau af IFIT2 end de parrede ikke-cancervæv (figur 4A), og IFIT2 ekspression blev omvendt korreleret med tumorstørrelsen (figur 4B, P =
0,0304). Nemlig tumorstørrelse større end eller lig med 5 cm gruppen viste signifikant nedreguleret IFIT2 ekspression sammenlignet med tumorstørrelse under 5 cm gruppe. For at validere data, vi efterfølgende målt protein udtryk for IFIT2 hjælp western blotting (figur 4C a-b), og resultaterne viste et lignende mønster på de bemærkninger, fundet af QRT-PCR. Immunhistokemi assay udviste en signifikant reduceret ekspression af IFIT2 i AGEJ væv parrede ikke-cancervæv (figur 4D a-b, P <
0,001). Derefter analyserede vi forholdet mellem miR-645 og IFIT2 udtryk og fandt, at IFIT2 udtryk niveau var negativt korreleret med den af ​​miR-645 (figur 4E, P <
0,01). Desuden SGC7901 (figur 4F a) og BGC-823 (figur 4F b) celler transficeret med miR-645-hæmmer har øget IFIT2 udtryk på protein og mRNA-niveauer i forhold til mock og NC-grupper (Figur 4F ab, P <
0,01). Vores resultater viser, at miR-645 direkte kan regulere ekspressionen af ​​IFIT2. Figur 4 Ekspression af miR-645 og IFIT2 negativt korrelere i AGEJ kliniske prøver og IFIT2 blev nedreguleret i AGEJ væv sammenlignet med parrede ikke-kræft væv. A. Ekspression af IFIT2
og MIR-645 i AGEJ kliniske prøver blev analyseret ved kvantitativ PCR. B. sammenligning af relativ ekspression af IFIT2
i AGEJ humane kliniske prøver af forskellig tumorstørrelse. (T
-test, * p < 0,05). C. Ekspression af IFIT2 undersøgt ved Western blotting (a, b: De værdier viser gennemsnittet ± SD, normaliseret til tubulin, n = 3, t
-test, *** p
< 0,001) D. en. Repræsentative viste billeder er positive immunhistokemisk farvning af IFIT2 i humane AGEJ prøver og matchede tilstødende normale væv (forstørrelse 200 ×). b. Farvning snesevis af IFIT2 (t
-test, *** p
< 0,001). E. Scatter plots viser negative lineær korrelation mellem mRNA ekspressionen af ​​IFIT2
og af miR-645 i 43 AGEJ kliniske prøver. F. IFIT2 og IFIT2
ekspression målt ved western blotting i SGC7901 (a) og BGC-823-celler (b). (Værdierne angiver middelværdien ± SD, n = 3, En-vejs ANOVA-analyse, *** p
< 0,001)
IFIT2 formidler funktionen af ​​miR-645 ved at fremme SGC7901 og BGC-823 celler. apoptose
at bekræfte, at induktion af celle apoptose i SGC7901 og BGC-823 celler ved miR-645 blev formidlet ved at målrette IFIT2
, vi udførte IFIT2
plasmid transfektion i SGC7901 (figur 5A) og BGC-823 (figur 5B) celler til opregulere ekspressionen af ​​IFIT2. Western blotting og kvantitativ PCR viste, at opregulering af IFIT2 af IFIT2
plasmidtransfektion kunne reduceres væsentligt ved miR-645 efterligner. MTT-analysen viste, at celler transficeret med plasmid-IFIT2 proliferation blev undertrykt, men celler transficeret med miR-645 efterligner spredning steg væsentligt i forhold til plasmid-kontrol og plasmid-IFIT2 + miR-645 grupper (figur 5C ab, P <
0,001). Endvidere indføres IFIT2 fremmet apoptose af SGC7901 og BGC-823 celler og MIR-645 efterligner reduceret apoptose af celler induceret af IFIT2 opregulering sammenlignet med NC-gruppe i nærvær af ADR (figur 5E-F, P <
0,001). Vores resultater viste, at IFIT2 formidlede funktionen af ​​miR-645 til at hæmme SGC7901 og BGC-823 celler proliferation og inducerer celle apoptose. Figur 5 IFIT2 medierer funktionen af ​​MIR-645 ved at fremme GC celle apoptose. A & B. Ekspression af IFIT2 undersøgt af western blotting (A:. SGC7901, B, BGC-823 a, normaliseret til tubulin, værdierne angiver middelværdien ± SD, One-Way ANOVA-analyse, for SGC7901, F = 189,307, for BGC-823, F = 85,374 b, værdierne angiver middelværdien ± SD, One-Way ANOVA-analyse, for SGC7901, F = 85,374, for BGC-823, F = 219,921, *** p
< 0,001). C. SGC7901 (a) og BGC-823 (b) celler udsat for MTT-assay dagligt i 6 dage (de værdier viser gennemsnittet ± SD, To-ANOVA-analyse, for SGC7901, F = 13,768, for BGC-823, F = 16,409, *** p
< 0,001). D &E. SGC7901 (D) og BGC-823 (E) celler blev indsamlet til FACS-analyse efter 72 timer i nærværelse af ADR (0,05 ug /ml) (de værdier angiver middelværdien ± SD, n = 3, En-vejs ANOVA-analyse; for SGC7901, F = 361,749, for BGC-823, F = 229,952, *** p
. < 0,001)
Udtømmelse og opregulering af miR-645 ændret caspase-3/7 aktivitet
IFIT2 er blevet rapporteret at være en tumor suppressor via mediering celle apoptose gennem aktivering caspase-3/7-aktivitet. Caspase-Glo 3/7 assay viste, at MIR-645 depletering signifikant opreguleret, mens MIR-645 overekspression ned- reguleret caspase-3/7 Aktivitetsmenutast sammenlignet med mock og NC grupper i nærvær af ADR (0,2 ug /ml) (Figur 6A og B, P <
0,001) eller serum sult tilstand (figur 6C og D, P <
0,001). Disse resultater kombineret med observationer ovenstående foreslået, at miR-645, opreguleret i humane AGEJ væv, hæmmede celle apoptose og fremmer tumorigenicitet via undertrykke caspase-3/7 aktivitet ved at målrette IFIT2. Figur 6 Caspase-3/7 Aktivitetsmenutast. Anti-apoptotisk evne SGC7901 celler og BGC-823-celler efter udsættelse for ADR (0,2 ug /ml) eller serumudsultning blev evalueret ved caspase-3/7-aktivitet. A &C, SGC7901 celler; B & D, BGC-823 celler. (Værdierne angiver middelværdien ± SD, n = 3, One-Way ANOVA analyse for A, F = 183,930, for B, F = 1093,797, for C, F = 1861,50, for D, F = 1483,604, *** p
. < 0,001)
diskussion og konklusioner
Selv akkumulere beviser har vist, at miRNA deregulering er involveret i tumor carcinogenese, progression, migration og invasion [41], metastaser [42, 43] og multiresistens [44-46]. Vides kun lidt om de roller, miRNA i udviklingen af ​​adencarcinoma af gastrisk esophageal junction (AGEJ). Her viste vi, at der miR-645-ekspression blev øget betydeligt i AGEJ kliniske prøver sammenlignet med parrede ikke-kræft væv og var signifikant opreguleret i to gastrisk cancer (GC) cellelinjer, SGC7901 og BGC-823, som blev brugt alternativ celle modeller, fordi ingen tilgængelige AGEJ cellelinjer blev etableret til dato. Hæmning af miR-645 i SGC7901 og BGC-823 celler signifikant induceret apoptose af SGC7901 og BGC-823 celler i tilstanden af ​​serum sult eller kemoterapeutiske lægemiddel ved opregulering IFIT2,
en mediator af apoptose, med en potentiel bindingssted for mIR-645 i dets mRNA s 3'UTR. Ekspressionsmønsteret for MIR-645 og IFIT2 i SGC7901 og BGC-823-celler og kliniske prøver blev negativt korreleret, hvilket yderligere antyder, at IFIT2
er et målgen af ​​MIR-645. Endvidere inhibering af MIR-645 resulterer i forøget caspase-3/7 Aktivitetsmenutast, som aktiveres af IFIT2. Alle disse resultater tyder på en grundlæggende rolle miR-645 i carcinogenese, især i udviklingen af ​​AGEJ.
For lidt apoptose er en afgørende årsag til carcinogenese fordi maligne celler død reduceres bemærkelsesværdigt [47, 48], hvilket resulterer i malign transformation de påvirkede celler, tumormetastase og multiresistens af cancerceller. Derfor apoptose er af stor betydning ved behandling af cancer og er et populært mål for mange behandlingsstrategier. I denne undersøgelse viste vi, at MIR-645 forringede cancerceller til serum deprivation-induceret apoptose, hvorimod nedbrydningen af ​​MIR-645 antagoniserede denne virkning af MIR-645, hvilket antyder, at MIR-645 kan spille en afgørende rolle i tilpasningen af ​​kræft celler til lav ernæring. Et stigende antal miRNA har været impliceret i cancercellen apoptose. På den ene side kunne microRNA fungere som tumorsuppressor via inducere apoptose, dvs. MIR-421, der inducerer celleproliferation og apoptose resistens i human nasopharyngeal carcinoma via nedregulering af FOXO4 [49]; MIR-149, der inducerer apoptose ved at inhibere Akt1 og E2F1 i humane cancerceller [50] og miRNA-31, hvilket inducerer apoptose i humane neuroblastomceller [51]. På den anden side kan microRNAer fungere som onkogener ved at undertrykke apoptose, dvs. MIR-24, som inhiberer apoptose og undertrykker Bim i muse cardiomyocytter [52]; MIR-886-5p, som inhiberer apoptose ved at nedregulere Bax-ekspression i humane cervikale carcinomceller [53], og MIR-183, som hæmmer TGF-β1-induceret apoptose ved nedregulering af PDCD4 ekspression i humane hepatocellulære carcinomceller [54] . Salg ISGs, IFN stimulerede gener, se gener, der tanscribed af IFN'er induktion. Blandt dem, kan 4 spille vigtige roller, der påvirker både inhibering af viral replikation og inhibering af cellulær proliferation [55, 56]. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Proteomanalyse af menneskelig gastrisk Cardia adenocarcinom med laser capture microdissection
• Terapeutisk potentiale PRL-3 målretning og kliniske betydning af PRL-3 genomisk forstærkning i gastrisk cancer