MicroRNA-645, up-urejena v človeški adencarcinoma želodčne požiralnika križišča, zavira apoptozo z usmerjanjem zaviralnih IFIT2

MicroRNA-645, up-urejena v človeški adencarcinoma želodčne požiralnika križišča, zavira apoptozo z usmerjanjem tumor dušenje IFIT2
Povzetek
Ozadje
Vedno več dokazov kaže, da imajo miRNAs ključno vlogo pri kancerogenosti in napredovanje raka; Vendar pa je vloga miRNAs v tumorigeneze za adencarcinoma želodčne požiralnika križišča (AGEJ) v veliki meri ostaja nejasno.
Metode
SGC7901 in so bili uporabljeni BGC-823 z rakom želodca celične linije. Izrazi Mir-645 in IFIT2 (interferon-inducirane protein z tetratricopeptide ponavlja 2) so bile pregledane s QRT-PCR, smo se izrazi IFIT2 pregledal zahodni blot in imunohistokemični testu. Apoptozo Celica je bila določena s FACS. MIR-645 inhibitor, posnema in plazmid-IFIT2 Transfekcije smo izvedli za preučevanje loss- in dobiček-funkcijo. Kaspaze-07/03 dejavnost je preizkusil kaspaze-07/03 testu.
Rezultati
V tej raziskavi smo poročali povečano izražanje miR-645 v kliničnih vzorcih AGEJ primerjavi s seznanjenimi ne-rakastih tkivih. Prav tako smo opazili precejšnje MIR-645 up-regulacije v dveh rak želodca (GC) celičnih linij, SGC7901 in BGC-823, ki so bili uporabljeni kot celičnih modelih, ker ni bilo na voljo celične linije AGEJ sedežem na dan. Ugotovili smo, da lahko zaviranje miR-645 senzibilizirati dramatično SGC7901 in BGC-823 celic tako v serumu starvation- in kemoterapevtskim apoptozo zaradi droge, ki ga up-regulacijo IFIT2, mediatorja apoptoze preko mitohondrijske poti, s potencialno vezavno mesto za miR -645 v njenih mRNA je 3'UTR. Nadaljnja preiskava razstavljena da IFIT2 izraz zmanjšanje SGC7901 in BGC-823 celic in AGEJ tkiv. IFIT2
ektopična ekspresija vodi do spodbujanja celične apoptoze, kar pomeni, da lahko IFIT2 deluje kot supresorski v razvoju AGEJ. Poleg tega zaviranje miR-645 inducirajo navzgor regulacijo IFIT2 in povečana aktivnost kaspaza-3/7 v primerjavi s kontrolnimi skupinami.
Sklepi
Naši podatki kažejo, da miR-645 funkcije kot onkogen v človeški AGEJ ga ob vsaj delno skozi, ciljanje IFIT2
.
Ključne besede
adencarcinoma želodca požiralnika junction microRNA-645 IFIT2 apoptoze Ozadje
so Nedavne študije kažejo, da je adencarcinoma želodca požiralnika stičišča (AGEJ) razlikuje od distalnega želodec, z različnimi dejavniki tveganja, značilnosti tumorjev in biološko obnašanje [1-4]. Poleg tega je incidenca AGEJ se povečuje v zadnjih 30 letih, še posebej v ZDA in na severu Kitajske [5-9].
MicroRNAs (miRNAs) so skupina endogeno izražena, nekodiran majhnih RNA, 20- 25 nukleotidov, ki so znani negativno regulira gensko ekspresijo po zatiranje prevod ali zmanjšuje stabilnost mRNA neposredno veže na 3'-neprevedene regije (3'-UTR) ciljnih mRNA [10, 11]. Kopičijo dokazi kažejo, da imajo miRNAs pomembno vlogo pri urejanju fizioloških in patoloških procesov, vključno z razvojem [12], presnova [13], proliferacijo celic [14], diferenciacija [15] in apoptoze [16]. Poleg tega je zmotna post-transkripcijski regulacijo mRNA z miRNAs povezana z tumorigeneze [17, 18]. Neobičajni izraz profili miRNAs so poročali, da se odkrijejo v različnih vrstah človeških tumorjev, vključno pljuč [19], dojke [20], prostate [21], jetra [18], na debelem črevesu [22] in rakom želodca [23]. Poleg tega se lahko nekateri miRNAs deluje kot onkogeni [24-26] ali tumorskih dušilcev [27, 28], ki ga ureja izražanje svojih ciljnih genov, ki imajo pomembno vlogo pri nekaterih ključnih poteh, ki sodelujejo pri celičnega cikla napredovanja, apoptoza ali orožja. miRNAs navzdol urejeno v tumorskih vzorcev kot miR-22 [29, 30], miR-101 [31, 32], in miR-7 [33, 34], običajno delujejo kot supresivno miRNAs, medtem ko miRNAs povečana pri tumorskih vzorcev, kot so miR-17 [35, 36], in miR-21 [37, 38] običajno izvajajo onkogeni vloge. Te študije kažejo, da je disregulacijo od miRNAs pogosto vpletena v kancerogenosti in napredovanju raka.
Nedavna študija je pokazala, da lahko miR-645 izvajajo vlogo tumor dušenje v naprednih seroznega raka na jajčnikih za pokoj-645 je negativno povezana s splošno preživetje je [39]. V tej raziskavi smo ugotovili, da je bil miR-645 izraz v kliničnih vzorcih AGEJ bistveno povečal v primerjavi s seznanjenimi ne-rakavih tkiv, ki uporabljajo microRNA čipe. Vendar pa je vloga miR-645 v tumorigeneze za AGEJ še ni bila raziskana. Nadaljnja raziskava je pokazala, da je bil miR-645 tudi precej up-urejeno v dveh rak želodca (GC) celičnih linij, SGC7901 in BGC-823, ki so bili uporabljeni kot alternativnih modelov celic v tej študiji. Zaviranje miR-645 v SGC7901 in BGC-823 celic bistveno zavre apoptozo SGC7901 in BGC 823 celic v stanju v serumu lakote ali kemoterapevtskega zdravila, ki ga up-regulacijo IFIT2, mediatorja apoptoze, s potencialno vezavno mesto za miR -645 v njenih mRNA je 3'UTR. Izraz vzorec miR-645 in IFIT2 v kliničnih vzorcih AGEJ so bili negativni korelaciji, nadalje kaže, da
je IFIT2 cilj gen miR-645. Poleg tega je zaviranje miR-645 rezultatov povečano kaspaze-3/7 dejavnosti, ki se aktivira s IFIT2. V tej študiji smo raziskovali, ali je miR-645 up-urejena v človeški adencarcinoma želodčne požiralnika križišča in zavira apoptozo z usmerjanjem tumor dušenje IFIT2.
Metode
etiko izjavo
Za vzorcev tkiv, je pisno privolitev pridobljeni pri bolnikih. Postopki, ki se uporabljajo v tej študiji je odobril revizijski odbor institucionalni v Henan univerzi za znanost in tehnologijo in je bila skladna s Helsinške deklaracije, in z zakonodajo.
Celične linije in pogoji kultiviranja
želodčni rak celične linije SGC -7901, BGC-823 in ovekovečena normalno želodcu epitelne celične linije, so GES-1 je prijazno podelila prof Daiming Fan. Vse celične linije se je ohranila v našem zavodu v skladu s priporočenimi protokolov. Celice smo kultivirali v RPMI-1640 medij (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA), dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), pri 37 ° C v 5% CO2 inkubatorju.
Človeški primerki
vsi eksperimentalni postopke je odobril revizijski odbor institucionalni v Henan univerzi za znanost in tehnologijo. Pisna privolitev je bila pridobljena na vseh vzorcih bolnikov. Vzorci človekovih AGEJ (n = 43) in bolnikov v paru brez rakave vzorci so bili pridobljeni od bolnikov na prvi povezan bolnišnici, Henan univerza za znanost in tehnologijo, z informirano soglasje iz vsakega bolnika. čiščenje
RNA, cDNA sintezo in kvantitativno PCR v realnem času (QRT-PCR)
Total RNA iz gojenih celic smo ekstrahirali z TRIzola reagenta (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA) v skladu s proizvajalčevimi protokolarnih in RNA smo shranili pri -80 ° C pred analizo QRT-PCR . Mature miR-645 izraz je bila odkrita s pomočjo TM QRT PCR-Mirna Detection Kit za mirVana (Ambion Inc. Austin, Texas), z U6 kot notranje kontrole. IFIT2 izraz je bila odkrita z začetnih oligonukleotidov F: 5'AGCGAAGGTGTGCTTTGAGA 3 ", R: 5'GAGGGTCAATGGCGTTCTGA3" (dolžina izdelka: 125 bp; Tm: 60 ° C; GC%: F-50%, R-55%; start-end: 643-748 bp) in GAPDH smo uporabili kot notranje kontrole. PCR produkti so bili ločeni na etidijevim bromidom obarvanih 1,5% agaroznem gelu in vizualizirali z UV.
Cell transfekciji
prehrano miR-645 duplex agomir The (400 nm), antagomir (400 nm) in negativni kontrolni bili zasnovani in ki jih Ribobio (Guangzhou, Guangdong, Kitajska). Plazmida-IFIT2 in negativne kontrole plamid so bili kupljeni od Ribobio Inc (Guangzhou, Guangdong, Kitajska)
Mirna ciljna predvidevanja
Za iskanje potencialnih ciljnih miRNA genov, spletno TargetScanHuman (http:.. //Www targetscan. org /) je bil uporabljen, je vezava prosta energija je bila izračunana in podajanje ponudb mesta smo analizirali z uporabo http:.... //bibiserv techfak uni-Bielefeld de /rnahybrid spletno
Vector konstrukti in luciferazni reporter test
za izdelavo IFIT2-3'UTR plazmida je bil divji tip 3'-UTR fragment humanega IFIT2 mRNA (1226-1233 nt, Genbank dostopovna št. NM_001547.4) vsebuje domnevnega miR-645 vezave sekvenco pomnožili RT-PCR in kloniramo v mesto med Xho I in ne bom dolvodno od luciferazno reporterskega gena vektorja psiCHECK ™ (Promega, ZDA). Mutant enotnega miR-645 vezavno mesto (5'AGCCTAG -3 'to 5'TCGGATC -3 "), v je 3'-UTR od IFIT2 vključila Site-usmerjeno mutagenezo Kit (SBS GENETECH, Peking, Kitajska ). Divje in mutant vrste pmirGLO-IFIT2-UTR vektorjev so potrdili zaporedja DNK
nukleotidnih zaporedij primerji za IFIT2-3'UTR (WT) klona.
IFIT2XhoIF2. 5'CCGCTCGAG AGAATAGAGATGTGGTGCCCACTAGGCTACTGCTG 3 '
IFIT2NotIR2: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TTAAAATGGAATCAGTGACTTTTATTTCTCATAACAGAG 3 '
nukleotidnih zaporedij primerji za IFIT2-3'UTR (MT) klona.
mutIFIT2F2: 5'TTCTAGGTAGATGCTGAATTCGGATCACATCAAAGTTGGTGTGAAC 3 ".
mutIFIT2R2: 5'GTTCACACCAACTTTGATGTGATCCGAATTCAAGEJTCTACCTAGAA 3' .
Celice so transfekciji s mIR-645 posnema, NC in pmirGLO plazmida v ploščah s 24 vdolbinami z uporabo Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen), v skladu z navodili. 48 ur kasneje smo celice poberemo in analizirajo za luciferazno aktivnost z Dual-luciferazno Reporter preskusnega sistema (Promega, ZDA) in zazna sistem za odkrivanje GloMaxTM 20/20 (E5331, Promega).
Kaspaze-07/03 test
aktivnost kaspaze-3 in kaspaze-7 je bila odkrita v formatu 96 vdolbinami (2 x 10 3 celic /vdolbinico) z uporabo kaspaze-Glo 3/7 testom (Promega) v skladu z navodili. 100 xl kaspazne-Glo 3/7 reagent smo dopolnili v vsako vdolbino in inkubiramo pri sobni temperaturi 1 uro follwong luminiscenco bila odkrita z M200 mikroplošča fluorescence bralnik (Tecan). Luminiscenč- ozadje povezana s celično kulturo in analiznega reagenta (prazno reakcija) odšteli od eksperimentalne vrednosti.
MTT test
celice transficiramo s 100 nM miR-645 inhibitor (Genepharma, Šanghaj, Kitajska), posnema (Ribobio Inc. ., Guangzhou, Guangdong, Kitajska) ali 100 nM plamid-IFIT2 (Ribobio Inc., Kitajska). Štiriindvajset kasneje smo celice zasejali v 96-vdolbinami (2 x 10 3 /jamico). Sposobnost preživetja celic, so bile pregledane z MTT (3-2, 5-difenil tetrazolijevega bromid) testa (Sigma, ZDA), v skladu z navodili v določenem času.
Western blot
skupnih beljakovin iz gojenih celic smo lizirali s liznega pufra vsebuje PMSF na ledu. Nato smo proteinski elektroforezi skozi 12% SDS poliakrilamidnih gelih in jih nato prenesemo v PVDF membrano (Millipore). Membrane smo blokirali s 5% nemastnega mleka v prahu, pri sobni temperaturi 1 h in inkubiramo preko noči s primarnimi protitelesi. Membrane smo inkubirali s sekundarnimi protitelesi označena s HO 1 uro pri sobni temperaturi po treh 10 min opere v TBS-T (triethanolaminebuffered solna raztopina s Tween). Končno so zaznali signale s pomočjo ECL komplet (Pierce Biotech., Rockford, IL, ZDA) in membrane so skenirani in analizirali z Bio-Rad ChemiDoc XRS sistem + slikanje s programsko opremo za slikanje (različica količina 1). Izraz protein smo normalizirali na endogeni referenco (tubulin) in glede na kontrolo. Spectra multicolor široko paleto protein lestev (Fermentas) je bil uporabljen kot molekulskega označevalca. Vse protitelesa, ki se uporabljajo v Western Blot testu so navedene v dodatni datoteki 1: Tabela S1
Imunohistokemija in imunohistokemični sedaj
Parafinski odseki, 4-im debeline so pekli 2 uri pri 65 ° C in deparaffinized.. Antigen Preiskovalna smo izvedli z uporabo citratnega pufra natrijev (pH 7,2) pri 95 ° C 15 minut in nato smo drsi ohladimo pri sobni temperaturi 30 minut. Potem se zdravijo s 3% vodikovega peroksida na 15 minut, da blokira endogenega peroksidazo, so odseki obdelamo z običajnimi koza serumu neprepustni tekočino za 30 minut za zmanjšanje nespecifične vezave in nato zajec poliklonski anti-IFIT2 (1: 500, HPA003408, Sigma-Aldrich. Šanghaj, Kitajska) je bil inkubiran odseke 12 ur pri 4 ° C. Po Ponovno segrevanje 1 h in izpiranjem za 5-krat, smo sekcije inkubirali s sekundarnim protitelesom 30 minut pri sobni temperaturi. Diaminobenzidine (DAB) smo uporabili za barvne reakcije. Kasnejše Imunohistokemijsko je dosegel kot je opisano prej [40].
Statistična analiza
Podatki so bili izraženi kot povprečje ± SD treh neodvisnih poskusov. Za statistične teste, SPSS statistični programski paket, version17.0 (SPSS, Chicago, IL, ZDA) je bila uporabljena. Študenta t
-test, enosmerna ANOVA in dvosmerno Test ANOVA so bile izvedene z relativno gostoto pasu zahodne s sušenjem in vrednot MTT OD. Korelacija med miR-645 in IFIT2 smo analizirali z Spearmanu rang korelacije. Vrednosti P. ≪ 0,05 smo imeli statistično značilno
Rezultati
izrazov Mir-645 so up-urejena v kliničnih vzorcih AGEJ PODJETJA
Za oceno vloge miR-645 v tumorigeneze za AGEJ, smo najprej uporabili QRT - PCR metoda za merjenje miR-645 ekspresijo 43 človeških kliničnih tkiv AGEJ, in ugotovil, da je miR-645 precej up-urejena v kliničnih tkivih AGEJ v primerjavi z bolnikom v paru želodčnih srčnih non-rakastih tkiv (Slika 1A). Da bi pridobili nadaljnji vpogled v ugotovitve zgoraj omenjeno, smo preverjali odnos med miR-645 izražanja in bolnike kliničnih parametrov. Analiza je pokazala, da je bil miR-645 izraz nepomembni starost, spol, diferenciacije tumorja, bezgavka metastaz in stopnji TNM (Tabela 1: Odnos med kliničnimi parametri in miR-645 izražanja v primarnem želodca Cardia adenokarcinom), vendar je bila v pozitivni korelaciji z velikost tumorja, in sicer velikost tumorja večja ali enaka skupini 5 cm pokazale znatno povečano miR-645 ekspresijo v primerjavi z velikostjo tumorja manj kot 5 cm filter (slika 1B & tabeli 1, t
-test, * p
= 0,045). Slika 1 Izrazi miR-645 so up-urejena v kliničnih vzorcih AGEJ. A. izraz miR-645 v kliničnih vzorcih 43 človeški AGEJ glede na sosednjima paru normalne človeške želodčne srčnih niso rakavih tkiv, je bila merjena s kvantitativno RT-PCR (Vrednosti kaže povprečje ± SEM, n = 3, t
-test, * p 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001). B. Primerjava relativnega izražanja miR-645 v kliničnih vzorcih človeških AGEJ različnih velikosti tumorja. (Two-tailed t
-test, * p < 0,05).
Tabela 1 Razmerje med kliničnimi parametri in miR-645 izražanja v primarnem želodca Cardia adenokarcinom
klinični parametri
N (%)
Sorodniki izraz (srednja vrednost ± SEM)
p-vrednost
Starost (leta)
≥ 60
15 (50)
2,1286 ± 0,59201
0,568
< 60
15 (50)
1,9571 ± 0,52402
spolov
moški
18 (60)
2,1111 ± 0.42783
0,462
ženski
12 (40)
2,3333 ± 0,65328
Velikost
≥5
13 (43,3)
2,7385 ± 100.128
0,004 *
< 5
17 (56,7)
1,8235 ± 1,52214
histološke diferenciacija
No (W)
15 (50)
2,138 ± 0,1866
0,9427
Slabo (P)
15 (50)
2,198 ± 0,1903
Limfna metastaze
Da
12 (40)
2.4583 ± 0.77864
< 0,001 **
št
18 (60)
1,4944 ± 1,36273
stage TNM
faza I /II
16 (53,3)
2.9125 ± 1.33660
< 0,001 **
stage III /IV
14 (46,7)
1.4857 ± 0,73991
(* p <
0,05; ** P. ≪
0,001)
Izčrpavanje miR-645 spodbuja apoptozo želodčnih rakavih celic
Da bi raziskali vlogo miR-645 v fenotipskih značilnosti AGEJ napredovanja, smo uporabili dva raka želodca ( GC) celične linije, SGC7901 in BGC-823 kot celičnih modelih. Rezultati QRT-PCR je pokazala, da je bil miR-645 izraz precej up-urejena v primerjavi z ovekovečena celično linijo GC, GES-1 (Dodatna datoteka 2: Slika S1, P
< 0,001).
SGC7901 in BGC-823 celice so bile prehodno transficirane z zrel miR-645 posnema, inhibitor, mock transficirana ali miR-NC. Kot je prikazano na sliki 2A in D, kvantitativni rezultati RT-PCR kažejo, da ekspresija miR- 645 posnema ali zaviralci močno navzgor regulacijo ali navzdol uravnavajo stopnjo ekspresije miR-645, in sicer v SGC7901 in BGC-823 celic iz prvi, peti dan po letu transfekciji (slika 2A, P
< 0,001; slika 2D, P
< 0,001) v primerjavi z NC in modelnim nadzora. Slika 2 Izčrpavanje miR-645 promovira apoptozo celic raka želodca (PK). A & D. Stopnja miR-645 je bila merjena s kvantitativno PCR ob določenem času (enosmerni ANOVA analizo vrednosti kažejo srednjo ± SD Slika 2A, F = 426,588, P < 0,001, slika 2d, F = 685,026, P <0,001). B &E. GC celice transfekciji s miR-645 posnema in inhibitor podvržen MTT testom na dan 6 dni (Two-way ANOVA analize, slika 2b, F = 52.602, p < 0,001; slika 2E, F = 42.847, p < 0,001). C & F. GC celice celice transficirane z miR-645 posnema in inhibitor bili zbrani za analizo FACS po 72 urah (Vrednosti kaže povprečje ± SD, n = 3, Enosmerna ANOVA analizo, slika 2C-a, F = 121,600, p lt; 0,001; 2C-b, F = 250,400, p < 0,001, slika Fa, F = 194,815, p < 0,001, slika 2F-b, F = 412,741, p < 0,001)
SGC7901 in BGC-. 823 transfektiranih s miR-645 zaviralcev posnema so pokazale bistveno nižje in višje stopnje celične proliferacije, v tem zaporedju, primerjavo so z NC ali modelnih skupin v prisotnosti ADR (0,2 mg /ml), ki ga MTT testa (slika 2B, P določi
< 0,001, slika 2E, P
< 0,001)
Anniex Vapoptosis test razstavljena pomembno povečala in zmanjšala stopnjo apoptozo izčrpavanja miR-645 in zunajmaternične izražanja skupin v primerjavi z NC skupin v prosti seruma. stanje ali v prisotnosti zdravila proti raku, adriamicin (ADR) (slika 2C ab P
< 0,001; Slika 2 F ab P
< 0,001).
IFIT2 je cilj miR-645
Prejšnji podatki kažejo, da bi miR-645 onkogena naprednih seroznega raka na jajčnikih. Tako bomo še naprej iskali potencialne tarče miR-645, ki ga algoritem skeniranja ljudi. Med njimi IFIT2, tumor supresorski je bilo ugotovljeno, da imajo domnevni miR-645 veznih mest v njeni 3'UTR (slika 3A). Nato smo izvedli luciferazno novinar testom z uporabo SGC7901 in BGC-823 celic, da se preveri, ali je IFIT2 neposreden cilj miR-645. Divjega tipa in mutant IFIT2-3'UTR vsebuje domnevnega vezavno mesto Mira-645 so klonirali v psiCHECK-2 vektorja dolvodno od luciferazni gen (Dodatni datotek 3: Slika S2). Uvedba miR-645, zmanjšuje dejavnost lucirferase iz IFIT2 3'UTR novinar vektorja pomembno (slika 3B, P
< 0,001; slika 3C, P
< 0,001), vendar ni vplivalo na aktivnost lucirferase iz mutant IFIT2 3'UTR reporter vektor, ki podpira neposredno interakcijo miR-645 z IFIT2. Ti rezultati nakazujejo, da lahko miR-645 zatreti izražanje IFIT2 z osredotočanjem na 3'-UTR za IFIT2 mRNA. Slika 3 Preverjanje napovedane vezavna mesta med miR-645 in IFIT2. A. shema prikazuje konstrukt Luc-IFIT2 3'UTR in Luc-IFIT2 3'Mut UTR. Oba Luc-IFIT2 3'UTR in Luc-IFIT2 3'Mut UTR so klonirali v plazmid pmirGLO nižje od kresničkino luciferazo kodiranje območje med položaja PmeI in Xbal. B &C. SGC7901 celice (B) ali BGC-823 celice (C) so co-transfekcirajo s psiCHECK-2 konstrukte, ki vsebujejo bodisi IFIT2 3'UTR ali IFIT2 3'Mut UTR in bodisi inhibitor miR-645 ali MIR-645 posnema za 48 h. Vrednosti kažejo relativno luciferazno aktivnost po normalizaciji na Renilla luciferazne aktivnosti (Vrednosti kažejo povprečje ± SD, n = 3, Enosmerna ANOVA analizo, slika 3B, F = 283,244, 3C, F = 143,313. *** P <,. 0,001)
izražanje miR-645 in IFIT2 so negativno povezani v kliničnih vzorcih AGEJ PODJETJA
nadalje oceniti razmerje med miR-645 in IFIT2, smo pregledali IFIT2 izraz v 43 AGEJ kliničnih vzorcih z uporabo QRT-PCR . Ugotovljeno je bilo, AGEJ tkiva imel izjemno nižji nivo ekspresije IFIT2 kot seznanjenih ne-rakavih tkivih (slika 4A) in IFIT2 izraz je obratno povezana z velikostjo tumorja (slika 4B, P =
0,0304). Sicer velikost tumorja večja ali enaka 5 skupini cm pokazali znatno navzdol regulirano IFIT2 izraz primerjavi z velikostjo tumorja manj kot 5 skupini cm. Za potrditev podatkov, smo merijo beljakovin izražanje IFIT2 uporabo western blot (slika 4C a-b), in rezultati so pokazali podoben vzorec pripomb, ki jih QRT-PCR najti. Imunohistokemija test razstavljen znatno zmanjšano ekspresijo IFIT2 v AGEJ tkivih parnih ne-rakave tkiva (slika 4D a-b, P <
0,001). Nato smo analizirali odnos med miR-645 in IFIT2 izražanja in ugotovil, da je bil IFIT2 nivo izražanja negativno korelira s miR-645 (slika 4E, P <
0,01). Poleg tega SGC7901 (Slika 4F a) in BGC-823 (slika 4F b) celice transfektiramo z miR-645 inhibitor znatno povečal IFIT2 ekspresijo ob proteina in ravni mRNA v primerjavi z modelnimi in NC skupin (Slika 4F ab, P <
0,01). Naše ugotovitve kažejo, da lahko miR-645 neposredno regulira izražanje IFIT2. Slika 4 Expression miR-645 in IFIT2 negativno korelacijo v kliničnih vzorcih AGEJ in IFIT2 je navzdol urejena v AGEJ tkiva v primerjavi s seznanjenimi ne-rakastih tkivih. A. Izražanje IFIT2
in pokoj-645 v kliničnih vzorcih AGEJ smo analizirali s kvantitativno PCR. B. Primerjava relativnega izražanja IFIT2
v AGEJ kliničnih vzorcih človeških različnih velikosti tumorja. (T
-test, * p 0.05). C. Izražanje IFIT2 pregledal zahodni blot analiza (a, b: Vrednosti kažejo povprečje ± SD, preračunana na tubulinu, n = 3, t
-test, *** p
< 0,001) D. a. Reprezentativni slike so prikazane pozitivne Imunohistokemijsko od IFIT2 v človeških AGEJ osebkov in izravnanih sosednjih normalnih tkivih (povečava 200 x). b. Obarvajo mnogo IFIT2 (t
-test, *** p
< 0,001). E. graf raztrosa prikazujejo negativno linearno korelacijo med mRNA izražanja IFIT2
in da Mir-645 v 43 AGEJ kliničnih vzorcih. F. IFIT2 and IFIT2
izraz merjena s zahodni blot v SGC7901 (a) in BGC-823 celic (b). (Vrednosti kažejo povprečje ± SD, n = 3, Enosmerna analiza ANOVA, *** p
< 0,001)
IFIT2 posreduje funkcijo miR-645 s spodbujanjem SGC7901 in BGC-823 celic. apoptoza
za potrditev, da je bila indukcija celične apoptoze v SGC7901 in BGC-823 celic, ki ga miR-645 posredovano z usmerjanjem IFIT2
, smo izvedli IFIT2
plazmidne transfekciji v SGC7901 (slika 5A) in BGC-823 (slika 5B) celice na navzgor regulira ekspresijo IFIT2. Western blot in kvantitativno PCR je pokazala, da bi se lahko up-regulacijo IFIT2 ga IFIT2
plazmida transfekciji znatno zmanjšal, miR-645 posnema. MTT testom so pokazali, da so celice transficirane z plazmida-IFIT2 proliferacije zatreti, vendar celice transfektirane z miR-645 posnema proliferacije občutno povišale v primerjavi s plazmidom kontrolo in plazmida-IFIT2 + miR-645 skupine (slika 5C ab, P <
0,001). Poleg tega je uvedba IFIT2 spodbuja apoptozo SGC7901 in BGC-823 celic in pokoj-645 oponaša znižano apoptozo celic z IFIT2 up-ureditev v primerjavi s skupino NC v prisotnosti ADR (Slika 5E-F, P <induciranih;
0,001). Naše ugotovitve kažejo, da IFIT2 posredovano funkcijo miR-645 pri zaviranju SGC7901 in BGC-823 celic proliferacijo in inducira apoptozo celic. Slika 5 IFIT2 posreduje funkcijo miR-645 s spodbujanjem GC apoptozo celic. A & B. Izražanje IFIT2 pregledal western blot (A:. SGC7901, B, BGC-823 A, normaliziran tubulinu, vrednosti kažejo povprečje ± SD, One-Way ANOVA analize, za SGC7901, F = 189.307, za BGC-823, F = 85,374; b, vrednosti kažejo povprečje ± SD, One-Way ANOVA analize, za SGC7901, F = 85,374, za BGC-823, F = 219,921; *** p
< 0,001). C. SGC7901 (a) in BGC-823 (b) celice izpostavljene MTT testom dnevno za 6 dni (v vrednosti pomenijo povprečje ± SD, Two-way ANOVA analize, za SGC7901, F = 13,768, za BGC-823, F = 16,409, *** p
< 0,001). D & E. SGC7901 (D) in BGC-823 celic (E) so bili zbrani za analizo FACS po 72 urah v prisotnosti ADR (0,05 g /ml) (v vrednosti pomenijo povprečje ± SD, n = 3, One-Way ANOVA analizo; za SGC7901, F = 361.749, za BGC-823, F = 229.952; *** p
. < 0,001)
Izčrpavanje in up-regulacijo miR-645 spremenila dejavnost kaspazo-3/7
IFIT2 so poročali, da je tumorski supresor preko posredovanja celic apoptozo preko aktiviranja kaspazo-3/7 aktivnost. Kaspaza-Glo 3/7 testa so pokazali, da miR-645 izčrpavanje močno navzgor regulirana, miR-645 prekomerno medtem navzdol regulirano dejavnost kaspazo-3/7 v primerjavi z modelnimi in NC skupinami v prisotnosti ARS (0,2 mg /ml) (Slika 6A in B, P <
0.001) ali stanje serum stradanje (slika 6C in D, P <
0.001). Ti rezultati v kombinaciji z ugotovitvami zgoraj navedenih predlagal, da miR-645, up-urejena v človeških AGEJ tkivih, blokiranem celične apoptoze in spodbuja tumorogenosti prek zatiranja kaspazo-3/7 aktivnost z usmerjanjem IFIT2. Slika 6 kaspazne-07/03 dejavnost. Anti-apoptotično sposobnost SGC7901 celic in BGC-823 celic po izpostavitvi ADR (0,2 mg /ml) ali serumu lakote je ocenil kaspaze-3/7 aktivnosti. A & C SGC7901 celice; B &D, BGC-823 celice. (Vrednosti kažejo povprečje ± SD, n = 3, One-Way ANOVA analize, za A, F = 183.930, za B, F = 1093.797; za C, F = 1861,50, za D, F = 1483.604, *** p
. < 0,001)
Razprava in zaključki
Čeprav se kopičijo dokazi pokazali, da je miRNAs deregulacija ukvarja z tumorja rakotvornost, napredovanja, migracije in invazije [41], metastaz [42, 43] in odpornosti proti več [44-46]. Malo je znanega o vlogi miRNAs pri razvoju adencarcinoma želodčne požiralnika križišča (AGEJ). Tukaj smo pokazali, da je bila ta miR-645 izraz v kliničnih vzorcih AGEJ bistveno povečal v primerjavi s seznanjenimi ne-rakavih tkiv in je bila precej up-urejeno v dveh rak želodca (GC) celičnih linij, SGC7901 in BGC-823, ki so bili uporabljeni alternativni celični modeli, ker ni na voljo AGEJ celične linije so bile določene na dan. Zaviranje miR-645 v SGC7901 in BGC-823 celic močno inducirano apoptozo SGC7901 in BGC 823 celic v stanju v serumu lakote ali kemoterapevtskega zdravila, ki ga up-regulacijo IFIT2
mediatorja apoptoze, s potencialno vezavno mesto za pokoj-645 v svojem mRNA je 3'UTR. Izraz vzorec miR-645 in IFIT2 v SGC7901 in BGC-823 celic in kliničnih vzorcev so bili negativni korelaciji, nadalje kaže, da IFIT2
je ciljni gen miR-645. Poleg tega je zaviranje miR-645 rezultatov povečano kaspaze-3/7 dejavnosti, ki se aktivira s IFIT2. Vse te ugotovitve kažejo bistveno vlogo miR-645 v karcinogenezo, zlasti pri razvoju AGEJ.
Premalo apoptozo je eden od bistvenih vzrok karcinogenezo saj se malignih celic smrti skrajša izredno [47, 48], kar maligne transformacije prizadetih celic, tumorske metastaze in odpornosti proti več rakavih celic. Zato, apoptoza je zelo pomembna pri zdravljenju raka in je priljubljena tarča številnih strategij zdravljenja. V tej študiji smo pokazali, da miR-645 oslabljene rakave celice na serumski s pomanjkanjem inducirano apoptozo, ker je izčrpavanje miR-645 antagonistično ta učinek miR-645, kar pomeni, da lahko miR-645 igrajo ključno vlogo pri prilagajanju raka celice za nizko prehrane. Večje število miRNAs so bili vpleteni v rakave celice apoptoze v. Na eni strani, lahko microRNAs delujejo kot tumorski supresorski preko induciranje apoptoze, tj miR-421, ki inducira celično proliferacijo in odpornost apoptozo v nazofaringealnega karcinoma humani po navzdol-regulacijo FOXO4 [49]; miR-149, ki inducira apoptozo z zaviranjem Akt1 in E2F1 v človeških rakavih celic [50] in miRNA-31, ki inducira apoptozo v nevroblastoma celicami [51]. Po drugi strani pa microRNAs lahko delujejo kot onkogenov odpravljen apoptozo, tj miR-24, ki inhibira apoptozo in zatira BIM v kardiomiocitih mišjih [52]; miR-886-5p, ki inhibira apoptozo ga navzdol regulacijo Bax izražanja v človeških materničnega celic karcinoma [53], in miR-183, ki zavira TGF-β1-inducirano apoptozo s downregulation od PDCD4 izražanja v človeških jetrnih celic karcinoma celic [54] .
ISGs, IFN spodbudila gene, se nanašajo na gene, ki so tanscribed z indukcijo IFN. Med njimi 4 lahko igrajo pomembno vlogo, ki vplivajo tako na inhibicijo virusnega podvajanja in inhibicijo celične proliferacije [55, 56]. Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• Analiza Proteome človeške želodčne Cardia adenokarcinom z laserskim zajem mikrodisekcijo
• Terapevtski potencial PRL-3 ciljno usmerjenostjo in klinični pomen PRL-3 genomske pomnoževanje pri raku želodca