MicroRNA-645, an-reglementéiert Mënsch adencarcinoma vun gastric esophageal menaarbecht, bremst apoptosis vun gezielt suppressor entholl IFIT2

MicroRNA-645, an-reglementéiert Mënsch adencarcinoma vun gastric esophageal menaarbecht, bremst apoptosis vun entholl suppressor IFIT2 VerfÜgung méiglech gezielt
Background VerfÜgung Beweiser ëmmer Kierper beweist dass miRNAs enger kritescher Roll an carcinogenesis a Kriibs Werdegang hunn; awer, d'Roll vun miRNAs an der tumorigenesis vun adencarcinoma vun gastric esophageal Potaschbierg (AGEJ) bleift gréisstendeels onkloer. VerfÜgung Method VerfÜgung D'SGC7901 an BGC-823 gastric Kriibs Zell Linnen agesat goufen. Den Ausdrock vun Mir-645 an IFIT2 (Interferon-entschlof FAQ mat tetratricopeptide Widerhuelung 2) vun qRT-Hinnen alleguer iwwerpréift goufen, den Ausdrock vun IFIT2 war déi westlech blotting an immunohistochemistry assay iwwerpréift. D'Zell apoptosis war vun FACS alles. Mir-645 inhibitor, mimics an plasmid-IFIT2 transfections sech standing der loss- a gewannen-Funktioun ze studéieren. Caspase-3/7 Aktivitéit iwwerpréift war vun caspase-3/7 assay. VerfÜgung Resultater VerfÜgung Am Moment studéieren, hu mir eng fräi Meenungsäusserung vum Mir-645 zu AGEJ Medeziner uplanzen Verglach mat vläit Net-kriibserreegend Stoffer gemellt. Mir gesinn och e wesentleche Mir-645 erop-Regulatioun vun zwee gastric Kriibs (GC) Zell Linnen, SGC7901 an BGC-823, deen als Zell Modeller benotzt huet, well et keng sinn AGEJ Zell Zeilen ze Datum gegrënnt gouf. Mir hu fonnt, datt inhibition vun Mir-645 SGC7901 dramatesch sensitize konnt an BGC-823 Zellen ze souwuel serum starvation- an chemotherapeutic EPO-entschlof apoptosis vun up-Regulatioun IFIT2, Vermëttler vun apoptosis via engem Kënschtlech Passerelle, mat engem grousse Potential bindend Site fir Mir -645 zu sengem mRNA d'3'UTR. Weider Enquête Schatzkummer datt IFIT2 Ausdrock Verloschter am SGC7901 an BGC-823 Zellen an AGEJ Stoffer. IFIT2 VerfÜgung ectopic Ausdrock féiert zu Promotioun vun Zell apoptosis, wat beweist, datt IFIT2 als suppressor zu der Entwécklung vun AGEJ Funktioun kënnen. Ausserdeem, inhibition vun Mir-645 induces up-Regulatioun vun IFIT2 a fräi caspase-3/7 Aktivitéit Verglach mat Kontroll Gruppen. VerfÜgung Konklusiounen VerfÜgung Eis Daten hindeit, datt Mir-645 Funktiounen als oncogene zu Mënsch AGEJ duerch, bei mannst deelweis duerch, gezielt IFIT2 VerfÜgung. VerfÜgung Schlësselwieder VerfÜgung adencarcinoma vun gastric esophageal menaarbecht microRNA-645 IFIT2 Apoptosis Background VerfÜgung rezenten Etuden ugeholl hunn, datt adencarcinoma vun gastric esophageal Potaschbierg (AGEJ) aus, datt vun distal isoléiert ass Mo, mat verschiddene Risiko Faktoren, entholl Charakteristiken, a biologescht Verhalen [1-4]. Ausserdem, huet d'Heefegkeet vun AGEJ schonn an den leschten 30 Joer waarden, virun allem an den USA an Norden China [5-9]. VerfÜgung microRNAs (miRNAs) sinn e Grupp vun endogenously ausgedréckt, Net-coding kleng RNAs, 20- 25 nucleotides zu Längt, déi bekannt gi bis erof Gentherapie Ausdrock duerch suppressing Iwwersetzung oder falender d'Stabilitéit vun mRNAs duerch direkt bindend fir d'3'-untranslated Regioun (3'-UTR) vun Zil- mRNAs [10, 11] regléieren. Beweiser aktueller beweist dass miRNAs wichteg Roll an Regulatioun gestallt an agebousst Prozesser hunn, Entwécklung dorënner [12], ukuerbelt [13], Zell Prolifératioun [14], dat [15] an apoptosis [16]. Ausserdeem, ass aberrant Post-transcriptional Regulatioun vun mRNAs vun miRNAs mat tumorigenesis Zesummenhang [17, 18]. D'Manque Ausdrock Profiler vun miRNAs gemellt goufen zu verschiddenen Zorte vu mënschlechen erhéijen dorënner haett [19], Broscht [20], Aarbecht [21], Liewer [18], Colon [22] an gastric Kriibs [23] nogewise ginn. Desweideren, kann e puer miRNAs als oncogenes Akt [24-26] oder entholl supressors [27, 28] vun der Ausdrock vun hirem Ziel Genen Regulatioun déi zu Zell Zyklus Werdegang, apoptosis oder Prolifératioun Équipe wichteg Roll am puer Schlëssel Weeër hunn. miRNAs verwandelt-reglementéiert entholl uplanzen wéi Mir-22 [29, 30], Mir-101 [31, 32], a Mir-7 [33, 34] normalerweis Funktioun als suppressive miRNAs, iwwerdeems miRNAs zu entholl uplanzen upregulated wéi Mir-17 [35, 36], a Mir-21 [37, 38] normalerweis oncogenic Rollen noutwänneg. Dës Studie weist dass dysregulation vun miRNAs dacks zu carcinogenesis a Kriibs Werdegang Équipe ass. VerfÜgung Eng rezent Etude huet kloer gestallt, dass Mir-645 kënnen d'entholl suppressor Roll an fortgeschratt serous spillt Kriibs fir Mir-645 vollt ass negatif verbonne mat globale Iwwerliewe vun et [39]. Am Moment studéieren, hunn mer dat Mir-645 Ausdrock vun AGEJ Medeziner uplanzen fräi war vill Verglach mat vläit Net-kriibserreegend Stoffer mat microRNA Fritten. Allerdéngs huet d'Roll vum Mir-645 zu der tumorigenesis vun AGEJ nach net studéiert ginn. Weider Etude gewisen, datt Mir-645 huet och vill weider-reglementéiert zwee gastric Kriibs (GC) Zell Linnen, SGC7901 an BGC-823, deen als Alternativ Zell Modeller am Moment Etude benotzt goufen. Inhibition vum Mir-645 zu SGC7901 an BGC-823 Zellen Trupen bedeitend der apoptosis vun SGC7901 an BGC-823 Zellen an der Bedingung vun serum Honger oder chemotherapeutic Drogenofhängeger vun up-Regulatioun IFIT2, Vermëttler vun apoptosis, mat engem grousse Potential bindend Site fir Mir -645 zu sengem mRNA d'3'UTR. Den Ausdrock Muster vum Mir-645 an IFIT2 zu AGEJ Medeziner Echantillon waren negativ soll, weider suggeréiert datt IFIT2 VerfÜgung ass eng Zilscheif Gentherapie vum Mir-645. Desweideren, inhibition vun Mir-645 Resultater am fräi caspase-3/7 Aktivitéit, déi vun IFIT2 ageschalt ass. An dëser Etude, mir propagéieren ob Mir-645 mënschlechen adencarcinoma vun gastric esophageal Potaschbierg bis-reglementéiert ass an apoptosis bremst vun entholl suppressor IFIT2 gezielt. VerfÜgung Method VerfÜgung IFLA- Ausso VerfÜgung Fir Otemschwieregkeeten Echantillonen, war schrëftlech informéiert Zoustëmmung aus Patiente kritt. D'Prozedure vun dëser Etude benotzt goufen duerch den institutionnelle Kritik Verwaltungsrot vun der Henan Universitéit vu Wëssenschaft an Technologie guttgeheescht a gouf zu der Helsinki Deklaratioun, a bis lokal Gesetzgebung conformed. VerfÜgung Zell Linnen a Kultur Konditiounen VerfÜgung SGC Gastric Kriibs Zell Linnen -7901, BGC-823 an normal gastric epithelial Zell Linn och, GES-1 waren Audit Moderniséierung vum Prof. Daiming Fan. All d'Zell Strecken an eisem Institut haten no recommandéiert Ëmwelt-. Zellen cultured sech zu RPMI-1640 mëttelfristeg (Invitrogen, Karlsbad CA, USA) mat 10% An et Bovine serum nà (FBS) (Invitrogen, Karlsbad CA, USA) op 37 ° C an engem 5% CO2 incubator. VerfÜgung Mënsch uplanzen VerfÜgung All experimentell Prozedure vun de Finanzpolitiker Kritik Verwaltungsrot vun der Henan Universitéit vu Wëssenschaft an Technologie guttgeheescht huet. Schrëftlech informéiert Zoustëmmung war fir all Patient Echantillon kritt. Mënsch AGEJ uplanzen (n = 43) an de Patient vläit Net-kriibserreegend uplanzen sech vu Patienten um éischte laizistesch Spidol, Henan Universitéit vu Wëssenschaft an Technologie, matt Awëllegung vun all Patient. VerfÜgung RNS Offäll, cDNA Synthes kritt, a grouss real-Zäit Hinnen alleguer (qRT-Hinnen alleguer) VerfÜgung Total RNS vun cultured Zellen war mat TRIzol reagent (Invitrogen, Karlsbad CA, USA) ofgebaut laut dem Protokoll an RNAs d'Hiersteller sech virun qRT-Hinnen alleguer Analyse bei -80 ° C gespäichert . Mature Mir-645 Ausdrock war mat engem mirVana TM qRT-Hinnen alleguer miRNA Detektioun Kit (Ambion Galaxy Austin, Texas), mat U6 wéi eng intern Kontroll fonnt. 5'AGCGAAGGTGTGCTTTGAGA 3 ', R:: 5'GAGGGTCAATGGCGTTCTGA3 "(Produit Längt: IFIT2 Ausdrock war mat primers F fonnt 125 BP; TM: 60 ° C; GC%: F-50%, R-55%; Start-end: 643-748 BP) an GAPDH war wéi eng intern Kontroll benotzt. Hinnen alleguer Produiten op eng ethidium bromide-Kierchefënster 1,5% agarose gelies an visualized mat UV getrennt goufen. VerfÜgung Zell transfection VerfÜgung De Mënsch Mir-645 duplex agomir (400 nm), antagomir (400 nm) an negativ Kontroll huet sech entwéckelt a gëtt vun Ribobio (lousoihong Guangdong, China). Plasmid-IFIT2 an der negativer Kontroll plamid sech aus Ribobio INC (lousoihong Guangdong, China) kaaft VerfÜgung miRNA Zil- Cepheid VerfÜgung Potential miRNA Zil- Genen ze fannen, TargetScanHuman Websäit (http:.. //Www targetscan. org /) benotzt gouf, war d'obligatoresch fräi Energie berechent an biding Siten benotzt http analyséiert:.... //bibiserv techfak Uni-bielefeld de /rnahybrid Websäit VerfÜgung Vecteure gesond a luciferase reporter assay VerfÜgung fir IFIT2-3'UTR plasmid, eng Wild-Typ 3'-UTR Brochstéck vun mënschlech IFIT2 mRNA (1226-1233 NG, Genbank Bäitrëtt keen. NM_001547.4) wouvun der putative Mir-645 bindend Haaptrei bauen war Implikatioune vun RT-Hinnen alleguer an de Site tëscht Xho ech gekloonten an net ech afgerappt vun der luciferase reporter Gentherapie vun der psiCHECK ™ Vecteure (Promega, USA). A Mann- vun der eenzeger Mir-645 bindend Site (5'- AGCCTAG -3 "zu 5'- TCGGATC -3") an der 3'-UTR vun IFIT2 vum Site-Direkter Mutagenesis Kit (SBS Genetech, Peking, China abegraff ass ). Wild an Mann- Zorte vun pmirGLO-IFIT2-UTR vectors duerch DNA sequencing validéiert goufen VerfÜgung D'Nukleotid Message vun primers fir IFIT2-3'UTR (virstellen) Klon:. VerfÜgung IFIT2XhoIF2:. 5'CCGCTCGAG AGAATAGAGATGTGGTGCCCACTAGGCTACTGCTG 3 '
IFIT2NotIR2: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TTAAAATGGAATCAGTGACTTTTATTTCTCATAACAGAG 3 'The Nukleotid Message vun primers fir IFIT2-3'UTR (MT) Klon VerfÜgung:. VerfÜgung mutIFIT2F2: 5'TTCTAGGTAGATGCTGAATTCGGATCACATCAAAGTTGGTGTGAAC 3'. VerfÜgung mutIFIT2R2: 5'GTTCACACCAACTTTGATGTGATCCGAATTCAAGEJTCTACCTAGAA 3 ' . VerfÜgung BTS sech mat der Raumstatioun-645 mimics, NC an pmirGLO plasmid zu 24-gutt Placke mat lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) no der Taktik transfected. 48 h drop, waren Zellen recoltéiert a fir luciferase Aktivitéit analyséiert mat de Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA) a Réckstänn vun der GloMaxTM 20/20 erkennen System (E5331, Promega). VerfÜgung caspase-3/7 assay VerfÜgung d'Aktivitéit vun caspase-3 an caspase-7 vun 96-gutt Format fonnt gouf (2 × 10 3 Zellen /gutt) laut der Caspase-Glo 3/7 Assay (Promega) benotzt, fir d 'Instruktiounen. 100 μL Caspase-Glo 3/7 reagent sech an all gutt nà an da fir 1 h bei Raumtemperatur incubated follwong der luminescence nogewise gouf den M200 microplate fluorescence Lieser (s) benotzen. Den Hannergrond luminescence mat Zell Kultur an assay reagent (eidel Reaktioun) verbonne war vun experminteller Wäert subtracted. VerfÜgung MTT assay VerfÜgung BTS sech transfected mat 100 nm Mir-645 inhibitor (Genepharma, Shanghai, China), mimics (Ribobio INC ., lousoihong Guangdong, China) oder 100 nm plamid-IFIT2 (Ribobio Galaxy, China). Twenty-véier méi spéit, huet Zellen am 96-gutt Placke rakommen (2 × 10 3 /gutt). D'Wirtschaftlechkeet vun Zellen war vun MTT iwwerpréift (3-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide) assay (Fläch, USA) no Uweisungen um designéierte Zäit. VerfÜgung Western blotting VerfÜgung Total FAQ aus cultured Zellen lysed sech duerch Lysis Respektiv haltege PMSF op Äis. Dunn FAQ sech duerch 12% SDS polyacrylamide gels electrophoresed a sech dann zu engem PVDF Membran (Millipore) transferéiert. Schläimhait sech fir 1 h mat 5% Nët-Fett Mëllech Pudder bei Raumtemperatur blockéiert an Nuecht mat der Primärschoul antibodies incubated. Schläimhait sech no dräi 10 min Mëtten an TBS-T (triethanolaminebuffered Salins Léisung mat Tween) mat Première antibodies Fortgeschratten mat HRP fir 1 h bei Raumtemperatur incubated. Endlech, goufen d'Signaler ECL Kit fonnt benotzt (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) an de Schläimhait si gescannt an analyséiert e Bio-Rad ChemiDoc XRS + Imaging System mat Imaging Software (Versioun Quantitéit 1) benotzt. D'FAQ Ausdrock war fir eng endogenous Referenz (Tubulin) normalized a relativ zu der Kontroll. D'Spektren multicolor breet-Gamme FAQ Leeder (Fermentas) war wéi molekulare Bewaacher benotzt. All déi benotzt antibodies am Südweste blot assay sinn zu Weider Fichier opgezielt 1: Table S1 VerfÜgung Immunohistochemistry an immunohistochemical ukomm VerfÜgung Paraffin Rubriken, 4-μm an deck, sech op 65 ° C fir 2 h gebakene an deparaffinized.. Antigen retrieval war fir 15 Minutten am Asaz citrate Natrium Prellbock (PH 7,2) 95 ° C standing an dann drënner waren fir 30 Minutte bei Raumtemperatur gi si. No 15 Minutte mat 3% Waasserstoff Hem behandelt ginn d'endogenous peroxidase ze blockéieren, huet de Rubriken fir 30 Minutten mat normal Geess serum confining flësseg behandelt Net-spezifesch bindend ze reduzéieren an dann Kanéngchen polyclonal anti-IFIT2 (1: 500, HPA003408, Fläch-Aldrich. Shanghai, China) war de Rubriken fir 12 h bei 4 ° C incubated. No rewarming fir 1 h an wäschen fir 5 Mol, Rubriken sech fir 30 Minutte bei Raumtemperatur mat Première antibody incubated. Diaminobenzidine (botzt) war fir Faarf Reaktioune gebraucht. Kierzunge immunohistochemical staining Faarwen war wéi virdru beschriwwen [40]. VerfÜgung statistique Analyse VerfÜgung Data sech als Mëttler ± Fils vun dräi onofhängeg Experimenter ausgedréckt. Fir statistesch Tester, SPSS statistesch Software Package, version17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) benotzt gouf. D'Schüler an d'T VerfÜgung Azeton, déi ee-Manéier ANOVA an zwee-Manéier ANOVA Test huet fir famill Band Dicht vum südwestlechen blotting an MTT sel Wäerter gesuergt. D'Korrelatioun tëscht Mir-645 an IFIT2 war mat Spearman Geleeënheet Korrelatioun analyséiert. P Wäerter &Si besteet;. 0,05 waren statistesch relevant als VerfÜgung Resultater VerfÜgung läschten Beitrag vun Mir-645 sin weider-reglementéiert AGEJ Medeziner Echantillon VerfÜgung der Roll vum Mir-645 zu der tumorigenesis vun AGEJ ze bewäerten, mir éischt benotzt qRT - Hinnen alleguer Method Mir-645 Ausdrock vun 43 Mënsch AGEJ Medeziner Stoffer ze moossen, an fonnt dass Mir-645 huet vill weider-reglementéiert AGEJ Medeziner Stoffer Verglach mam Patient vläit gastric härzwierksam net-kriibserreegend Stoffer (Dorënner 1A). Gewanne weider Abléck an der Observatiounsplaz verwisen, iwwerpréift mir d'Relatioun tëscht Mir-645 Ausdrock an Patienten Medeziner Parameteren. Analyse gewisen, datt Mir-645 Ausdrock war onwichteg mam Alter, Geschlecht, entholl dat, lymphnode Metastasen an TNM Etapp (Table 1: D'Relatioun tëscht Medeziner Parameteren an Mir-645 Ausdrock am primäre gastric Cardia adenocarcinoma), mee war an engem positive Korrelatioun mat der entholl Gréisst, nämlech, entholl Gréisst grouss-oder-selwecht zu 5 cm Grupp zougedréckt a wesentleche fräi Mir-645 Ausdrock Verglach mat entholl Gréisst manner wéi 5 cm Grupp (Dorënner 1B & Table 1, t VerfÜgung moossen, * P
= 0.045). Figur 1 läschten Beitrag vun Mir-645 sin weider-reglementéiert AGEJ Medeziner Echantillon. A. Ausdrock vu Mir-645 zu 43 Mënsch AGEJ Medeziner Echantillon relativ zu der bascht vläit normale Mënsch gastric härzwierksam Net-kriibserreegend Stoffer, war déi grouss RT-Hinnen alleguer gemooss (Déi Wäerter déi mengen ± Sem weg, n = 3, t
moossen, * p &Si besteet; 0,05, ** p &Si besteet; 0,01, *** p &Si besteet; 0.001). B. Verglach vu Familljemembere Ausdrock vu Mir-645 zu Mënsch AGEJ Medeziner Echantillon vun verschidden entholl Gréisst. (Two-tailed t VerfÜgung moossen, * p &Si besteet; 0,05). VerfÜgung Table 1 D'Relatioun tëschent Medeziner Parameteren an Mir-645 Ausdrock am primäre gastric Cardia adenocarcinoma VerfÜgung Parameteren Séminairen VerfÜgung N VerfÜgung (%)
deklaréierter Ausdrock (Mëttler ± Sem)
p-Wäert
Alter (Joer) VerfÜgung ≥ 60 zu 15 (50) VerfÜgung 2,1286 ± 0,59201 VerfÜgung 0,568 VerfÜgung &Si besteet; 60 zu 15 (50) VerfÜgung 1,9571 ± 0,52402 VerfÜgung Geschlecht VerfÜgung Männlech VerfÜgung 18 (60) VerfÜgung 2,1111 ± 0,42783 VerfÜgung 0,462 VerfÜgung Weiblech VerfÜgung 12 (40) VerfÜgung 2,3333 ± 0,65328 VerfÜgung Gréisst VerfÜgung ≥5 VerfÜgung 13 (43.3) VerfÜgung 2,7385 ± 100128 VerfÜgung 0,004 * VerfÜgung &Si besteet; 5 bis 17 (56.7) VerfÜgung 1,8235 ± 1,52214 VerfÜgung Histologic dat VerfÜgung Ma (W) VerfÜgung 15 (50) VerfÜgung 2,138 ± 0,1866 VerfÜgung 0,9427 VerfÜgung LINN (P) VerfÜgung 15 (50) VerfÜgung 2,198 ± 0,1903 VerfÜgung Lymphatic Metastasen VerfÜgung Jo VerfÜgung 12 (40) VerfÜgung 2,4583 ± 0,77864 VerfÜgung &Si besteet; 0,001 ** VerfÜgung Nee VerfÜgung 18 (60) VerfÜgung 1,4944 ± 1,36273 VerfÜgung TNM Etapp VerfÜgung Etapp ech /II VerfÜgung 16 (53.3) VerfÜgung 2,9125 ± 1,33660 VerfÜgung &Si besteet; 0,001 ** VerfÜgung Etapp III /IV VerfÜgung 14 (46.7) VerfÜgung 1,4857 ± 0,73991 VerfÜgung (* p &Si besteet; VerfÜgung 0,05; ** P &Si besteet;. VerfÜgung 0.001) VerfÜgung Ausschöpfung vun Mir-645 apoptosis vun gastric Kriibs Zellen ënnerstëtzt VerfÜgung Fir d'Roll vum Mir-645 zu der phenotypic Charakteristiken vun AGEJ Werdegang ermëttelen, déi mir zwee gastric Kriibs ( GC) Zell Linnen, SGC7901 an BGC-823 als Zell Modeller. qRT-Hinnen alleguer Resultater weisen, datt Mir-645 Ausdrock war vill weider-reegelen Verglach mat sengem GC Zell Linn, GES-1 (Zousätzleche Fichier 2: Dorënner S1, P VerfÜgung &Si besteet; 0.001). VerfÜgung SGC7901 an BGC-823 Zellen sech mat alen Mir-645 mimics, inhibitor, mierkt transfected, oder Mir-NC transiently transfected. Als zu Dorënner 2A an D gewisen, show grouss RT-Hinnen alleguer Resultater datt Ausdrock vun miR- 645 mimics oder inhibitors vill weider-regléieren oder erof-regléieren aus der Ausdrock Niveau vum Mir-645, respektiv, vun SGC7901 an BGC-823 Zellen éischt zu fënneften Dag Post transfection (Dorënner 2A, P VerfÜgung &Si besteet; 0,001; Dorënner 2D, P VerfÜgung &Si besteet; 0,001) am Verglach zu NC an mierkt Kontrollen. Figur 2 Ausschöpfung vun Mir-645 ënnerstëtzt apoptosis vun gastric Kriibs (GC) Zellen. A & D. Den Niveau vum Mir-645 duerch grouss Hinnen alleguer op designéierte Zäit (One-Manéier ANOVA Analyse gemooss gouf, d'Wäerter vun der mëttlerer ± Fils, Dorënner 2A, F = 426,588, P &Si besteet weg; 0,001; Dorënner 2D, F = 685,026, P &Si besteet; 0.001). B & E. GC Zellen mat Mir-645 mimics transfected an inhibitor zu MTT assay Dag ënnerworf fir 6 Deeg (Two-Manéier ANOVA Analyse, Dorënner 2B, F = 52,602, p &Si besteet; 0,001; Dorënner 2E, F = 42,847, p &Si besteet; 0,001). C & F. GC Zellen Zellen mat Mir-645 mimics transfected an inhibitor sech no 72 h fir FACS Analyse gesammelt (D'Wäerter unzeginn mengen ± Fils, n = 3, One-Manéier ANOVA Analyse, Dorënner 2C-en, F = 121,600, p &Si besteet; 0,001; Dorënner 2C-b, F = 250,400, p &Si besteet; 0,001; Dorënner Fa, F = 194,815, p &Si besteet; 0,001; Dorënner 2F-b, F = 412,741, p &Si besteet; 0,001) zu SGC7901 an BGC-. 823 Zellen transfected mat Mir-645 inhibitors an mimics zougedréckt a wesentlech méi a méi héich Niveauen vun Zell Prolifératioun, respektiv, comparision mat der NC oder mierkt Gruppen an der Präsenz vun ADR (0,2 μg /ml) wéi déi vun MTT assay (Dorënner 2B alles, P VerfÜgung &Si besteet; 0,001; Dorënner 2E, P VerfÜgung &Si besteet; 0,001) zu Anniex Vapoptosis assay Schatzkummer bedeitendst fräi a rofgaang apoptosis Tauxe vum Mir-645 Ausschöpfung an ectopic Ausdrock Gruppen am Verglach mat NC Gruppen am serum-gratis. Zoustand oder an der Präsenz vun anticancer Drogenofhängeger, adriamycin (ADR) (Dorënner 2C ab, P VerfÜgung &Si besteet; 0,001; Dorënner 2 F ab, P VerfÜgung &Si besteet; 0.001). VerfÜgung IFIT2 ass eng Zilscheif vum Mir-645 VerfÜgung virdrun Donnéeën hindeit, datt Mir-645 kënnen eng oncogene vun fortgeschratt serous spillt Kriibs ginn. Esou wäit si mir fir déi potentiell Ziler vum Mir-645 vun sind vum Target Scan Mënscherechter gesichte. Ënnert hinnen, IFIT2, entholl suppressor, fonnt huet putative Mir-645 bindend Siten an hirem 3'UTR (Dorënner 3A) ze hunn. Dunn standing mir luciferase reporter assay benotzt SGC7901 an BGC-823 Zellen fir z'iwwerpréiwen ob IFIT2 engem direkten Zil vum Mir-645 war. Wild-Typ an Mann- IFIT2-3'UTR wou sech den putative bindend Site vum Mir-645 gekloonten an psiCHECK-2 Vecteure matgeholl aus luciferase Gentherapie (Zousätzleche Fichier 3: Dorënner S2). Aféierung vum Mir-645 reduzéiert der lucirferase Aktivitéit aus der IFIT2 3'UTR reporter Vecteure vill (Dorënner 3B, P VerfÜgung &Si besteet; 0,001; Dorënner 3C, P VerfÜgung &Si besteet; 0,001), mä en Afloss huet net d'lucirferase Aktivitéit aus der Mann- IFIT2 3'UTR reporter Vecteure, den direkte Interaktioun vun Mir-645 mat IFIT2 ënnerstëtzen. Dës Resultater proposéiere weider dass Mir-645 der IFIT2 Ausdrock vun gezielt 3'-UTR vun IFIT2 mRNA oofgesinn kann. Figur 3 ausseet virausgesot bindend Siten tëscht Mir-645 an IFIT2. A. De Sënn Diagramm weist déi bauen vun Luc-IFIT2 3'UTR a Luc-IFIT2 3'Mut UTR. Béid Luc-IFIT2 3'UTR a Luc-IFIT2 3'Mut UTR sech an engem pmirGLO plasmid gekloonten afgerappt vun der Liichtkäfer luciferase coding Regioun tëscht der PmeI an XbaI Siten. B & C. SGC7901 Zellen (B) oder BGC-823 Zellen (C) geleet goufen durech-transfected mat der psiCHECK-2 gesond entweder IFIT2 3'UTR oder IFIT2 3'Mut UTR an entweder d'Mir-645 inhibitor oder de Bord-645 mimics fir 48 wouvun h. Wäerter weg d'famill luciferase Aktivitéit no normalization zu Renilla luciferase Aktivitéit (Déi Wäerter déi mengen ± Fils weg, n = 3, One-Manéier ANOVA Analyse, Dorënner 3B, F = 283,244, Dorënner 3C, F = 143,313. *** P &Si besteet;. 0.001) VerfÜgung Expression vum mir-645 an IFIT2 sinn zu AGEJ Medeziner Echantillon negatif Zesummenhang VerfÜgung weider fir der Relatioun tëscht mir-645 an IFIT2, mir zu 43 AGEJ Medeziner Echantillon der IFIT2 Ausdrock benotzt qRT-Hinnen alleguer iwwerpréift Bewäert . Et war AGEJ Stoffer haten eng formidabel ënneschten Ausdrock Niveau vun IFIT2 wéi der vläit Net-kriibserreegend Stoffer (Dorënner 4A), an IFIT2 Ausdrock fonnt huet inversely mat der entholl Gréisst (Dorënner 4B, P = VerfÜgung 0.0304) soll. Nämlech, entholl Gréisst grouss-oder-selwecht zu 5 cm Grupp huet bedeitend erof-reegelen IFIT2 Ausdrock Verglach mat entholl Gréisst manner wéi 5 cm Grupp. Fir d'Donnéeën validéieren, mir gemooss dono FAQ Ausdrock vun IFIT2 mat westlecher blotting (Dorënner 4C e-b), an d'Resultater zougedréckt engem ähnleche Muster un d'vun qRT-Hinnen alleguer fonnt Observatiounen. Immunohistochemistry assay Schatzkummer e wesentleche ofgeholl Ausdrock vun IFIT2 zu AGEJ Stoffer vläit Net-kriibserreegend Stoffer (Dorënner 4D e-b, P &Si besteet; VerfÜgung 0.001). Dann analyséiert mir d'Relatioun tëscht Mir-645 an IFIT2 Ausdrock an fonnt dass IFIT2 Ausdrock Niveau erof mat deem vum Mir-645 soll war (Dorënner 4E, P &Si besteet; VerfÜgung 0.01). Ausserdem, hun SGC7901 (Dorënner 4F engem) an BGC-823 (Dorënner 4F b) Zellen transfected mat Mir-645 inhibitor geklomme IFIT2 Ausdrock op d'FAQ a mRNA Niveauen am Verglach zu mierkt an NC Gruppen (Dorënner 4F ab, P &Si besteet;
0.01). Eis Conclusiounen unzeginn dat Mir-645 direkt den Ausdrock vun IFIT2 regléieren kann. Figur 4 Expression vum Mir-645 an IFIT2 vergläichen negatif zu AGEJ Medeziner Echantillonen an IFIT2 war verwandelt-reglementéiert AGEJ Stoffer Verglach mat vläit Net-kriibserreegend Stoffer. A. Expression vun IFIT2 VerfÜgung an Mir-645 zu AGEJ Medeziner Echantillon waren déi grouss Hinnen alleguer analyséiert. B. Verglach vu Familljemembere Ausdrock vun IFIT2 VerfÜgung zu Mënsch AGEJ Medeziner Echantillon vun verschidden entholl Gréisst. (T VerfÜgung moossen, * p &Si besteet; 0,05). C. Expression vun IFIT2 iwwerpréift duerch westlech blotting (en, b: d'Wäerter unzeginn mengen ± Fils, normalized zu tubulin, n = 3, t VerfÜgung Azeton, *** p VerfÜgung &Si besteet; 0.001) D. e. Vertrieder Biller gewise ginn positive immunohistochemical staining vun IFIT2 zu Mënsch AGEJ uplanzen an stemmt bascht normal Stoffer (Vergréisserung 200 ×). b. Staining Fändelen vun IFIT2 (t VerfÜgung Azeton, *** p VerfÜgung &Si besteet; 0.001). E. luucht Bauterrainen déi negativ linear Korrelatioun tëscht der mRNA Ausdrock vun IFIT2 VerfÜgung an dat vu Mir-645 zu 43 AGEJ Medeziner Echantillon weist. F. IFIT2 an IFIT2 VerfÜgung Ausdrock gemoos westlech blotting zu SGC7901 (en) an BGC-823 Zellen (b). (Déi Wäerter unzeginn mengen ± Fils, n = 3, One-Manéier ANOVA Analyse, *** p VerfÜgung &Si besteet; 0.001) VerfÜgung IFIT2 mediates d'Funktioun vum Mir-645 vun SGC7901 an BGC-823 Zellen Spur. apoptosis VerfÜgung fir ze bestätegen, datt de Aféierungs- vun Zell apoptosis zu SGC7901 an BGC-823 Zellen duerch mir-645 vun gezielt IFIT2 VerfÜgung mediated war, standing mir IFIT2 VerfÜgung plasmid transfection zu SGC7901 (Dorënner 5A) an BGC-823 (Well 5B) Zellen ze weider-regléieren den Ausdrock vun IFIT2. Western blotting a grouss Hinnen alleguer gewisen datt weider-Regulatioun vun IFIT2 vun IFIT2 VerfÜgung plasmid transfection bedeitend zur Mir-645 mimics ofgeholl ginn hätt. MTT assay gewisen, datt mat plasmid-IFIT2 Prolifératioun transfected Zellen opgeléist huet, awer, transfected Zellen mat Mir-645 mimics Prolifératioun geklomme Verglach mat plasmid-Kontroll a plasmid-IFIT2 + Mir-645 Gruppen (Dorënner 5C ab, P &Si besteet;
0.001). Ausserdeem, Aféierung vun IFIT2 gefördert apoptosis vun SGC7901 an BGC-823 Zellen an Mir-645 mimics reduzéiert apoptosis vun duerch IFIT2 entschlof Zellen up-Regulatioun am Verglach mat NC Grupp an der Präsenz vun ADR (Dorënner 5E-F, P &Si besteet; VerfÜgung 0.001). Eis Conclusiounen ugeholl datt IFIT2 d'Funktioun vum Mir-645 zu inhibiting SGC7901 an BGC-823 Zellen Prolifératioun an Pinguin Zell apoptosis mediated. Figur 5 IFIT2 mediates d'Funktioun vum Mir-645 vun GC Zell apoptosis Spur. A & B. Ausdrock vun IFIT2 duerch westlech iwwerpréift blotting (A:. SGC7901; B, BGC-823 engem, normalized zu tubulin, gitt weg d'Wäerter déi mengen ± Fils, One-Way ANOVA Analyse, fir SGC7901, F = 189,307, fir BGC-823, F = 85,374; b, déi Wäerter unzeginn mengen ± Fils, Analyse One-Way ANOVA, fir SGC7901, F = 85,374, fir BGC-823, F = 219,921; *** p VerfÜgung &Si besteet; 0.001). C. SGC7901 (en) an BGC-823 (b) fir MTT assay Dag ënnerworf Zellen fir 6 Deeg (de Wäerter unzeginn mengen ± Fils, Two-Manéier ANOVA Analyse, fir SGC7901, F = 13,768, fir BGC-823, F = 16,409, *** p VerfÜgung &Si besteet; 0.001). D & E. SGC7901 (D) an BGC-823 (E) Zellen sech fir FACS Analyse no 72 h an der Präsenz vun ADR (0,05 μg /ml) gesammelt (déi Wäerter déi mengen ± Fils weg, n = 3, One-Way ANOVA Analyse; fir SGC7901, F = 361,749, fir BGC-823, F = 229,952; *** p VerfÜgung &Si besteet;. 0.001) VerfÜgung Ausschöpfung a weider-Regulatioun vum Mir-645 der caspase-3/7 Aktivitéit verännert
IFIT2 gouf via mediating Zell apoptosis duerch activating caspase-3/7 Aktivitéit entholl suppressor gemellt ginn. Caspase-Glo 3/7 assay gewisen, datt Mir-645 Ausschöpfung vill weider-reegelen, iwwerdeems Mir-645 overexpression down- der caspase-3/7 Aktivitéit reegelen Verglach mat mierkt an NC Gruppen an der Präsenz vun ADR (0,2 μg /ML) (Well 6A a B, P &Si besteet; VerfÜgung 0.001) oder den serum Honger Bedingung (Dorënner 6C an d, P &Si besteet; VerfÜgung 0.001). Dës Resultater kombinéiert mat Observatioune Dënschdeg proposéiert uewen dass Mir-645, an-reglementéiert Mënsch AGEJ Stoffer, inhibited Zell apoptosis an ënnerstëtzt tumorigenicity via suppressing caspase-3/7 Aktivitéit vun IFIT2 gezielt. Figur 6 Caspase-3/7 Aktivitéit. Anti-apoptotic Fähegkeet vun SGC7901 Zellen an BGC-823 Zellen der aussetzt ADR (0,2 μg /ml) oder serum Honger war vun caspases-3/7 Aktivitéit bewäert. A & C, SGC7901 Zellen; B & D, BGC-823 Zellen. (De Wäerter unzeginn mengen ± Fils, n = 3, One-Way ANOVA Analyse; fir A, F = 183,930, fir B, F = 1093,797; fir C, F = 1861,50, fir D, F = 1483,604, *** p VerfÜgung &si besteet;. 0.001) VerfÜgung Diskussioun a Conclusioune VerfÜgung Obwuel Beweiser aktueller hu gewisen, datt miRNAs Dereguléierung mat entholl carcinogenesis Équipe ass, Werdegang, Migratioun an Invasioun [41], Metastasen [42, 43] an multidrug Resistenz [44-46]. Little ass an der Entwécklung vun adencarcinoma vun gastric esophageal Potaschbierg (AGEJ) iwwer d'Rollen vun miRNAs bekannt. Hei, awer mir, datt dat Mir-645 Ausdrock vill an AGEJ Medeziner uplanzen fräi war am Verglach mat vläit Net-kriibserreegend Stoffer an huet vill weider-reglementéiert zwee gastric Kriibs (GC) Zell Linnen, SGC7901 an BGC-823, déi alternativ agesat goufen Zell Modeller well keen sinn AGEJ Zell Zeilen ze Datum gegrënnt goufen. Inhibition vum Mir-645 zu SGC7901 an BGC-823 Zellen vill entschlof apoptosis vun SGC7901 an BGC-823 Zellen an der Bedingung vun serum Honger oder chemotherapeutic Drogenofhängeger vun up-Regulatioun IFIT2, VerfÜgung Vermëttler vun apoptosis, mat engem grousse Potential bindend Site fir Mir-645 an hir mRNA d'3'UTR. Den Ausdrock Muster vum Mir-645 an IFIT2 zu SGC7901 an BGC-823 Zellen a Krankheete Echantillon waren negativ soll, proposéiert weider, datt IFIT2 VerfÜgung eng Zilscheif Gentherapie vum Mir-645 ass. Desweideren, inhibition vun Mir-645 Resultater am fräi caspase-3/7 Aktivitéit, déi vun IFIT2 ageschalt ass. All dës Conclusiounen proposéiere eng fundamental Roll vum Mir-645 zu carcinogenesis, virun allem an der Entwécklung vun AGEJ. VerfÜgung ze kleng apoptosis ass eng wichteg Ursaach vun carcinogenesis well malignant Doud Zellen reduzéiert ginn bemierkenswäert [47, 48], geplatzt malignant Transformatioun vun de betraffene Zellen, entholl Metastasen an multidrug Resistenz vum Kriibs Zellen. Dofir, ass apoptosis vu grousser Wichtegkeet vun der Behandlung vun Kriibs an ass e beléifte Zilscheif vun villen Behandlung Strategien. An dëser Etude, awer mir dat Mir-645 leider Kriibs Zellen Entzuch-entschlof apoptosis zu serum hierkommen d'Ausschöpfung vun Mir-645 dësem Effet vum Mir-645 antagonized suggeréiert datt Mir-645 eng wichteg Roll an der Upassung vun Kriibs Leeschtung vläicht Zellen ze niddreg ernähren. Ëmmer mèi miRNAs goufen an de Kriibs Zell apoptosis agebonne. Op der enger Säit, microRNAs kéint als entholl suppressor Funktioun apoptosis via Pinguin, i.e. Mir-421, déi via verwandelt-Regulatioun vun FOXO4 [49] Zell Prolifératioun an apoptosis Resistenz zu Mënsch nasopharyngeal carcinoma induces; Mir-149, deen zu Mënsch Kriibs Zellen Akt1 an E2F1 vun inhibiting [50] an miRNA-31, déi am Mënsch neuroblastoma Zellen apoptosis apoptosis induces induces [51]. Op der aner Hand, kéint microRNAs als oncogenes Funktioun vun apoptosis suppressing, i.e. Mir-24, déi apoptosis an represses Bim zu Maus cardiomyocytes [52] bremst; Mir-886-5p, déi apoptosis vun verwandelt-Regulatioun Bax Ausdrock vun mënschlecher cervical carcinoma Zellen [53] bremst, a Mir-183, déi zur downregulation vun PDCD4 Ausdrock vun mënschlecher hepatocellular carcinoma Zellen TGF-β1-entschlof apoptosis bremst [54] . VerfÜgung ISGs, IFN Genen stimuléiert, kuckt Genen déi vun IFNs Aféierungs- tanscribed sinn. Ënnert hinnen, kann 4 wichteg Roll spillen, datt souwuel d'inhibition vun Haren Gedächtnis an d'inhibition vun bewosst Prolifératioun Afloss [55, 56]. All Auteuren liesen an guttgeheescht der Finale mëttelalterlech Handschrëft. VerfÜgung

• Proteome Analyse vum Mënsch gastric Cardia adenocarcinoma vun Laser knipsen microdissection
• Therapeutesch Potential vun Praxis-3 gezielt a Krankheete Bedeitung vun Praxis-3 Frankräich amplification zu gastric Kriibs