MicroRNA-645, up-regulamentada em adencarcinoma humana da junção do esôfago gástrica, inibe a apoptose, visando supressor de tumor IFIT2

MicroRNA-645, up-regulamentada em adencarcinoma humana da junção do esôfago gástrica, inibe a apoptose, visando supressor de tumor IFIT2 da arte abstracta
Fundo
um crescente corpo de evidências indica que miRNAs têm um papel fundamental na carcinogênese e progressão do cancro; no entanto, o papel dos miRNAs na tumorigênese de adencarcinoma da junção do esôfago gástrica (AGEJ) permanece em grande parte obscura.
Métodos
O SGC7901 e BGC-823 linhas celulares de cancro gástrico foram utilizados. As expressões de miR-645 e IFIT2 (proteína do interferão-induzida com tetratricopeptide repete 2) foram examinadas por qRT-PCR, as expressões de IFIT2 foi examinado por transferência de Western e o ensaio de imuno-histoquímica. A apoptose das células foi determinada por FACS. MiR-645 inibidor, imita e transfections plasmídeo-IFIT2 foram realizadas para estudar a deficitária ou de função de ganho. atividade da caspase-3/7 foi examinada pelo ensaio caspase-3/7.
Resultados
No presente estudo, nós relataram um aumento da expressão de miR-645 em amostras clínicas AGEJ comparação com pareados tecidos não cancerosos. Observamos também uma significativa miR-645-regulação em duas linhas câncer gástrico (GC) celulares, SGC7901 e BGC-823, que foram utilizados como modelos celulares porque não havia linhas disponíveis celulares AGEJ estabelecidos até à data. Verificou-se que a inibição de miR-645 poderia sensibilizar dramaticamente SGC7901 e BGC-823 células de ambos inanição de soro e a apoptose induzida por droga quimioterapêutica por cima IFIT2-regulação, um mediador de apoptose através de uma via mitocondrial, com um potencial local de ligação para miR -645 na 3'UTR do seu ARNm. Outras investigações que exibiram expressão IFIT2 diminui em SGC7901 e células BGC-823 e tecidos AGEJ. IFIT2
expressão ectópica conduz à promoção de apoptose de células, indicando que IFIT2 pode funcionar como um supressor do desenvolvimento de AGEJ. Além disso, a inibição de miR-645 induz a regulação positiva de IFIT2 e aumento da actividade da caspase-3/7 em comparação com grupos de controlo.
Conclusões
nossos dados sugerem que o miR-645 funciona como um oncogene em AGEJ humano por, pelo menos parcialmente, através, visando IFIT2
.
Palavras-chave
Adencarcinoma de gástrica junção do esôfago fundo microRNA-645 IFIT2 apoptose
estudos recentes têm sugerido que adencarcinoma da junção do esôfago gástrica (AGEJ) é distinta da de distal estômago, com diferentes fatores de risco, características do tumor, e comportamento biológico [1-4]. Além disso, a incidência de AGEJ tem vindo a aumentar ao longo dos últimos 30 anos, especialmente nos Estados Unidos e norte da China [5-9].
MicroRNAs (miRNAs) são um grupo de endogenamente expressa, não-codificante pequenos RNAs, 20- 25 nucleótidos de comprimento, que são conhecidos para regular negativamente a expressão do gene através da repressão de tradução ou para diminuir a estabilidade do ARNm de ligação directa para a região 3 'não traduzida (3'-UTR) de mRNAs alvo [10, 11]. Acumulando evidência indica que miARNs tem papéis importantes na regulação de processos fisiológicos e patológicos, incluindo o desenvolvimento [12], no metabolismo [13], a proliferação de células [14], a diferenciação [15] e a apoptose [16]. Além disso, a regulação pós-transcrição aberrante do ARNm por miARNs está relacionada com tumorigénese [17, 18]. Os perfis de expressão anormal de miARNs têm sido relatados para ser detectado em vários tipos de tumores humanos, incluindo pulmonar [19], da mama [20], da próstata [21], fígado [18], do cólon [22] e do cancro gástrico [23]. Além disso, alguns miARN pode agir como oncogenes [24-26] ou supressores de tumor [27, 28], através da regulação da expressão dos genes alvo que têm um papel importante em algumas vias principais envolvidos na progressão do ciclo celular, apoptose ou proliferação. miARNs sub-regulada em amostras de tumor, tais como o miR-22 [29, 30], o miR-101 [31, 32], e miR-7 [33, 34] geralmente funcionar como miARNs supressivos, enquanto miARNs regulada positivamente em espécimes de tumor, tais como miR-17 [35, 36], e miR-21 [37, 38] geralmente exercem funções oncogénicas. Estes estudos sugerem que a desregulação dos miRNAs é frequentemente envolvidos na carcinogênese e progressão do câncer.
Um estudo recente indicou que miR-645 pode exercer o papel supressor de tumor no câncer de ovário seroso avançado para miR-645 está negativamente associado à sobrevida global de -lo [39]. No presente estudo, verificou-se que a expressão de miR-645 foi significativamente aumentada em amostras clínicas AGEJ em comparação com os tecidos emparelhados não-cancerosas usando chips de microRNA. No entanto, o papel de miR-645 na tumorigénese de AGEJ não foi ainda estudado. Estudos posteriores mostraram que miR-645 também foi significativamente sobre-regulada em duas linhas câncer gástrico (GC) celulares, SGC7901 e BGC-823, que foram utilizados como modelos celulares alternativos no presente estudo. A inibição de miR-645 em SGC7901 e células BGC-823 suprimiu significativamente a apoptose de SGC7901 e células BGC-823 na condição de privação de soro ou droga quimioterapêutica por cima de regulação de IFIT2, um mediador de apoptose, com um potencial local de ligação para miR -645 na 3'UTR do seu ARNm. O padrão de expressão de miR-645 e IFIT2 em amostras clínicas AGEJ foram negativamente correlacionadas, sugerindo ainda que IFIT2
é um gene alvo de miR-645. Além disso, a inibição de miR-645 resulta num aumento da actividade da caspase-3/7, o qual é activado por IFIT2. Neste estudo, nós investigamos se miR-645 é regulado para cima em adencarcinoma humana da junção do esôfago gástrica e inibe a apoptose, visando supressor de tumor IFIT2.
Métodos
Ética declaração
Para amostras de tecido, o consentimento informado por escrito foi obtidos a partir de pacientes. Os procedimentos utilizados neste estudo foram aprovados pelo Institutional Review Board da Universidade Henan da Ciência e Tecnologia e foi conformado com a Declaração de Helsínquia, e com a legislação local. Linhas
celulares e condições de cultura
linhas celulares de cancro gástrico SGC -7901, BGC-823 e imortalizado linha de células epiteliais gástrica normal, GES-1 foram gentilmente concedida pelo Prof. Daiming Fan. Todas as linhas celulares foram mantidas em nosso instituto de acordo com os protocolos recomendados. As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%.
espécimes humanos
Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Institutional Review Board da Universidade Henan da Ciência e Tecnologia. consentimento informado por escrito foi obtida para todas as amostras de doentes. espécimes AGEJ humanos (n = 43) e pacientes emparelhado espécimes não-cancerosas foram obtidas de pacientes no primeiro hospital afiliado, Henan Universidade de Ciência e Tecnologia, com o consentimento informado de cada paciente. purificação
RNA, síntese de cDNA e quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) o ARN total
de células de cultura foi extraído com o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante e os ARN foram armazenadas a -80 ° C antes da análise de qRT-PCR . expressão maduro miR-645 foi detectado usando um TM qRT-PCR Kit de Detecção de miARN miRvana (Ambion Inc. de Austin, Texas), com U6 como controlo interno. IFIT2 expressão foi detectada com os iniciadores F: 5'AGCGAAGGTGTGCTTTGAGA 3 ', R: 5'GAGGGTCAATGGCGTTCTGA3' (comprimento do produto: 125 pb; Tm: 60 ° C; GC%: F-50%, de R-55%; iniciar-final: 643-748 pb) e GAPDH foi usada como um controlo interno. Os produtos de PCR foram separados num gel de agarose a 1,5% corado com brometo de etídio e-visualizado com UV.
celular a transfecção in the humano miR-645 duplex agomir (400 nM), antagomir (400 nM) e do controlo negativo foram concebidos e fornecida por Ribobio (Guangzhou, Guangdong, China). os plamid controlo negativo plasmídeo-IFIT2 e foram adquiridos a partir Ribobio Inc (Guangzhou, Guangdong, China)
miRNA previsão alvo
Para encontrar genes alvo miRNA potenciais, website TargetScanHuman (http:.. //www TargetScan. org /) foi utilizada, a energia livre de ligação foi calculada e locais que obriguem foram analisados ​​utilizando http:.... //bibiserv techfak uni-Bielefeld /website RNAhybrid
construções do vetor e luciferase repórter de ensaio
Para construir o plasmídeo IFIT2-3'UTR, um tipo selvagem 3'-UTR fragmento de ARNm IFIT2 humana (nt 1226-1233, acesso Genbank no. NM_001547.4) contendo a sequência de ligação de miR-645 putativo foi amplificado por RT-PCR e clonado no local Xho entre I e Not I a jusante do gene repórter da luciferase do vector psiCHECK ™ (Promega, EUA). Um mutante de local de ligação único miR-645 (5'- AGCCTAG -3 'para 5'-TCGGATC -3') no 3'UTR do IFIT2 foi incluído por Site-Directed Mutagenesis Kit (SBS Genetech, Pequim, China ). tipos selvagens e mutantes de vectores pmirGLO-IFIT2-UTR foram validados por sequenciação de ADN
As sequências de nucleótidos dos iniciadores para IFIT2-3'UTR clone (WT):.
IFIT2XhoIF2:. 5'CCGCTCGAG AGAATAGAGATGTGGTGCCCACTAGGCTACTGCTG 3 ' IFIT2NotIR2: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TTAAAATGGAATCAGTGACTTTTATTTCTCATAACAGAG 3 '
As sequências de nucleótidos dos iniciadores para IFIT2-3'UTR clone (MT):.
mutIFIT2F2: 5'TTCTAGGTAGATGCTGAATTCGGATCACATCAAAGTTGGTGTGAAC 3'.
mutIFIT2R2: 5'GTTCACACCAACTTTGATGTGATCCGAATTCAAGEJTCTACCTAGAA 3 ' .
as células foram transfectadas com o miR-645, NC e imita pmirGLO plasmídeo em placas de 24 poços utilizando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções. 48 h mais tarde, as células foram colhidas e analisadas quanto à actividade da luciferase utilizando a luciferase dupla Reporter Assay System (Promega, EUA) e detectada pelo sistema de detecção GloMaxTM 20/20 (E5331, Promega).
Ensaio de caspase-3/7
a actividade da caspase-3 e caspase-7 foi detectada em formato de 96 poços (2 × 10 3 células /cavidade) utilizando a caspase-Glo 3/7 Assay (Promega) de acordo com as instruções. 100 uL da Caspase-Glo 3/7 reagente foram suplementadas em cada poço e depois incubou-se à temperatura ambiente durante 1 h follwong a luminescência foi detectada utilizando o leitor de microplacas de fluorescência M200 (Tecan). A luminescência fundo associado com cultura de células e reagente de ensaio (reação em branco) foi subtraído do valor experimental. MTT
As células foram transfectadas com 100 nM miR-645 inibidor (Genepharma, Xangai, China), imita (Ribobio Inc ., Guangzhou, Guangdong, China) ou 100 nM plamid-IFIT2 (Ribobio Inc., China). Vinte e quatro mais tarde, as células foram semeadas em placas de 96 poços (2 × 10 3 /poço). A viabilidade das células foi analisada por MTT (brometo de 3-2, 5-difenil tetrazólio) ensaio (Sigma, EUA) de acordo com as instruções no tempo designado.
Western blotting
proteína total a partir de células cultivadas foram lisadas por um tampão de lise contendo PMSF no gelo. Em seguida, a proteína foram sujeitas a electroforese através de géis de SDS 12% de poliacrilamida e foram então transferidos para uma membrana de PVDF (Millipore). As membranas foram bloqueadas com leite em pó não gordo a 5% à temperatura ambiente durante 1 h e incubadas durante a noite com anticorpos primários. As membranas foram incubadas com anticorpos secundários marcados com HRP durante 1 hora à temperatura ambiente depois de três lavagens de 10 min em TBS-T (solução salina triethanolaminebuffered com Tween). Finalmente, os sinais foram detectadas utilizando o kit ECL (Pierce Biotech., Rockford, IL, EUA) e as membranas foram digitalizados e analisados ​​utilizando um sistema de imagem + Bio-Rad ChemiDoc XRS com software de imagem (versão quantidade de 1). A expressão da proteína foi normalizada para uma referência endógena (Tubulina) e em relação ao controlo. O multicolor escada proteína ampla gama Spectra (Fermentas) foi utilizado como marcador molecular. Todos os anticorpos utilizados no ensaio Western Blot estão listados em arquivo adicional 1: Tabela S1
imuno-histoquímica e imuno-histoquímica de pontuação
secções de parafina, 4-um de espessura, foram cozidos durante 2 h a 65 ° C e desparafinizados.. A recuperação de antígenos foi realizada utilizando tampão de citrato de sódio (pH 7,2) a 95 ° C durante 15 minutos e, em seguida, as lâminas foram arrefecidos à temperatura ambiente durante 30 minutos. Depois de ser tratada com peróxido de hidrogénio a 3% durante 15 minutos para bloquear a peroxidase endógena, as secções foram tratadas com líquido confinando soro normal de cabra durante 30 minutos, para reduzir a ligação e, em seguida, policlonal de coelho anti-IFIT2 (um não-específica: 500, HPA003408, Sigma-Aldrich. Xangai, China) foi incubada as secções durante 12 h a 4 ° C. Após reaquecimento, durante 1 h e lavar por 5 vezes, as secções foram incubadas com anticorpo secundário por 30 minutos à temperatura ambiente. Diaminobenzidina (DAB) foi utilizado para reacções de cor. Subsequente coloração imuno-histoquímica foi pontuado como anteriormente descrito [40]. Análise estatística

Os dados foram expressos como média ± DP de três experiências independentes. Para os testes estatísticos, pacote de software estatístico SPSS, version17.0 (SPSS, Chicago, IL, EUA) foi utilizado. Do estudante t
-teste, o one-way ANOVA e duas vias análise de variância foram realizadas para a densidade de banda relativa de transferência Western e valores MTT OD. A correlação entre o miR-645 e IFIT2 foi analisada com Spearman. valores <P;. 0,05 foram considerados estatisticamente significativos
Resultados
expressões de miR-645 está regulado para cima em amostras clínicas AGEJ
Para avaliar o papel do miR-645 na tumorigênese de AGEJ, nós utilizado pela primeira vez qRT - PCR para medir a expressão de miR-645 de 43 tecidos clínicos AGEJ humanos, e descobriram que miR-645 foi significativamente sobre-regulada em tecidos clínicos AGEJ comparação com pacientes emparelhado tecidos não cancerosos cardíacos gástricas (Figura 1A). Para obter mais insights sobre a observação mencionado acima, foi examinada a relação entre a expressão de miR-645 e pacientes parâmetros clínicos. A análise mostrou que a expressão de miR-645 era irrelevante com a idade, o sexo, a diferenciação do tumor, metástase linfonodo e estágio TNM (Tabela 1: A relação entre parâmetros clínicos e miR-645 expressão em adenocarcinoma do cárdia gástrico primário), mas foi em uma correlação positiva com o tamanho do tumor, ou seja, o tamanho do tumor maior do que ou igual a 5 centímetros grupo mostrou significante aumento da expressão de miR-645 em comparação com o tamanho do tumor a menos de 5 cm grupo (Figura 1B & Tabela 1, t
-test, * P
= 0,045). Figura 1 Expressões de miR-645 está regulado para cima em amostras clínicas AGEJ. A. expressão de miR-645 em amostras clínicas 43 AGEJ humano relativamente aos tecidos adjacentes emparelhados normais humanas gástricas cardíacos não-cancerosas, foi medido por RT-PCR quantitativo (Os valores indicam a média ± SEM, n = 3, t
-test, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001). B. Comparação da expressão relativa de miR-645 em amostras clínicas AGEJ humano de tamanho diferente do tumor. (Dois-atado t
-teste, * p < 0,05).
Tabela 1 A relação entre parâmetros clínicos e expressão de miR-645 em adenocarcinoma do cárdia gástrico primário
parâmetros clínicos
N (%)
Parentes expressão
valor-p
Idade (anos)
(± SEM médio) ≥ 60
15 (50)
2,1286 ± 0,59201
0,568 Art < 60
15 (50)
1,9571 ± 0,52402
Sexo Masculino

18 (60)
2,1111 ± 0,42783
0,462
Feminino
12 (40)
2,3333 ± 0,65328
Tamanho
≥5
13 (43,3)
2,7385 ± 100128
0,004 * Art < 5
17 (56,7)
1,8235 ± 1,52214
diferenciação histológica
Bem (W)
15 (50)
2,138 ± 0,1866 0,9427

mal (P)
15 (50)
2,198 ± 0,1903
linfática metástase
Sim
12 (40)
2,4583 ± 0,77864 Art < 0,001 **
Sem
18 (60)
1,4944 ± 1,36273
estágio TNM
fase I /II
16 (53,3)
2,9125 ± 1,33660 Art < 0,001 **
fase III /IV
14 (46,7)
1,4857 ± 0,73991
(* p <
0,05; ** P <.
0,001)
Esgotamento de miR-645 promove a apoptose das células cancerosas gástricas
Para investigar o papel do miR-645 das características fenotípicas da progressão AGEJ, usamos dois cancro gástrico ( linhas celulares GC), SGC7901 e BGC-823 como modelos celulares. resultados qRT-PCR mostraram que miR-645 foi significativamente regulada para cima em comparação com a linha de células imortalizadas GC, GES-1 (arquivo adicionais 2: Figura S1, P Art < 0,001).
SGC7901 e BGC-823 As células foram transitoriamente transfectadas com madura miR-645 imita, inibidor, zomba transfectadas, ou miR-NC. Como mostrado na Figura 2A e D, os resultados quantitativos de RT-PCR indicam que a expressão de miR- 645 imita ou inibidores significativamente regular positivamente ou regular negativamente o nível de miR-645, a expressão respectivamente, em SGC7901 e BGC-823 células a partir da primeiro ao quinto dias após a transfecção (Figura 2A, P
< 0,001; Figura 2D, P
< 0,001) em comparação com controlos simulados e NC. Figura 2 Esgotamento de miR-645 promove a apoptose das células cancerosas gástrica (CG). A & D. O nível de miR-645 foi medida por PCR quantitativo em tempo designado (One-way ANOVA, os valores indicam a média ± desvio padrão, a Figura 2A, M = 426,588, P < 0,001; Figura 2D, F = 685,026, P < 0,001). B & E. células GC transfectadas com miR-645 imita e o inibidor submetido a ensaio MTT por dia durante 6 dias (duas vias de análise Anova, Figura 2B, F = 52.602, p < 0,001; Figura 2E, F = 42,847, p < 0,001). C & F. células células GC transfectadas com miR-645 imita e inibidor foram coletadas para análise FACS após 72 h (Os valores indicam a média ± SD, n = 3, One-way análise de variância, Figura 2C-a, F = 121,600, p < 0,001; Figura 2C-b, f = 250,400, p < 0,001; Figura Fa, M = 194,815, p < 0,001; Figura 2F-b, f = 412,741, p < 0,001)
SGC7901 e BGC-. 823 células transfectadas com miR-645 e inibidores imita mostraram níveis significativamente mais baixos e mais elevados de proliferação de células, respectivamente, comparação com o NC ou grupos simulados na presença de ADR (0,2 ug /mL), como determinado pelo ensaio de MTT (Figura 2B, P Art < 0,001; Figura 2E, P Art < 0,001)
ensaio Anniex Vapoptosis exibiu significativo aumento e diminuição das taxas de apoptose de miR-645 exaustão e grupos de expressão ectópica em comparação com os grupos de NC no livre de soro-. condições ou na presença de fármacos contra o cancro, a adriamicina (ADR) (Figura 2C AB, P
< 0,001; Figura 2 F AB, P <
; 0,001).
IFIT2 é alvo de miR-645
dados anteriores sugerem que miR-645 pode ser um oncogene de câncer de ovário seroso avançado. Assim, ainda procurou os potenciais alvos de miR-645 pelo algoritmo de Alvo da Análise Humano. Entre eles, IFIT2, um supressor de tumor, foi encontrada para ter locais de ligação putativo miR-645 no seu 3'UTR (Figura 3A). Em seguida, foi realizado ensaio de repórter luciferase utilizando células SGC7901 e BGC-823 para verificar se IFIT2 era um alvo direto de miR-645. De tipo selvagem e mutante IFIT2-3'UTR contendo o sítio de ligação putativo do miR-645 foram clonados no vector de psiCHECK-2 a jusante do gene da luciferase (de arquivo adicionais 3: Figura S2). Introdução de miR-645 reduziu a actividade lucirferase do vector repórter IFIT2 3'UTR significativamente (Figura 3B, P
< 0,001; Figura 3C, P
< 0,001), mas não afectou a actividade de lucirferase o vector repórter mutante IFIT2 3'UTR, apoiando a interação direta de miR-645 com IFIT2. Estes resultados sugerem ainda que o miR-645 pode suprimir a expressão IFIT2 por segmentação da 3'UTR do ARNm IFIT2. Figura 3 Validar os locais de ligação previstos entre miR-645 e IFIT2. A. O diagrama esquemático mostra a construção de Luc-IFIT2 3'UTR e Luc-IFIT2 3'Mut UTR. Ambos Luc-IFIT2 3'UTR e Luc-IFIT2 3'Mut UTR foram clonados num plasmídeo pmirGLO a jusante da região codificante de luciferase de pirilampo entre os locais PmeI e XbaI. B & C. SGC7901 células (B) ou células BGC-823 (C) foram co-transfectadas com os psiCHECK-2 construções contendo quer IFIT2 3'UTR ou IFIT2 3'Mut UTR e ou o inibidor de miR-645 ou o miR-645 para 48 imita h. Os valores indicam a actividade de luciferase após a normalização em relação à actividade de luciferase de Renilla (Os valores indicam a média ± DP, n = 3, de um modo análise ANOVA, Figura 3B, M = 283,244, Figura 3C, M = 143,313. *** P <. 0,001)
expressão de miR-645 e IFIT2 são negativamente relacionados em amostras clínicas AGEJ
Para avaliar ainda mais a relação entre o miR-645 e IFIT2, examinámos a expressão IFIT2 em 43 AGEJ amostras clínicas utilizando qRT-PCR . Verificou-se tecidos AGEJ tinha um nível de expressão nitidamente menor do que as de IFIT2 tecidos emparelhados não cancerosos (Figura 4A), e expressão IFIT2 foi inversamente correlacionado com o tamanho do tumor (Figura 4B, P = 0,0304
). Ou seja, o tamanho do tumor maior do que ou igual a 5 centímetros grupo mostraram significativa expressão sub-regulada IFIT2 comparação com o tamanho do tumor a menos de 5 cm grupo. Para validar os dados, subsequentemente, mensuradas a expressão da proteína de IFIT2 usando western blot (Figura 4C a-b), e os resultados mostraram um padrão semelhante às observações encontrados por qRT-PCR. A imuno-histoquímica ensaio exibiram uma significativa redução da expressão de IFIT2 nos tecidos emparelhados AGEJ tecidos não cancerosos (Figura 4D a-b, P < 0,001)
. Em seguida, analisou-se a relação entre o miR-645 e IFIT2 expressão e constatou que o nível de expressão foi IFIT2 negativamente correlacionada com a de miR-645 (Figura 4E, P < 0,01
). Além disso, as células SGC7901 (Figura 4F a) e BGC-823 (Figura 4F b) transfectadas com o miR-645 inibidor aumentou significativamente a expressão IFIT2 na proteína e níveis de ARNm em comparação com grupos simulados e NC (Figura 4F AB, P <
0,01). Nossas descobertas indicam que miR-645 pode regular directamente a expressão de IFIT2. Figura 4 A expressão de miR-645 e IFIT2 correlacionar negativamente em amostras clínicas AGEJ e IFIT2 foi regulada para baixo em tecidos AGEJ comparação com pareados tecidos não cancerosos. A. Expressão de IFIT2
e miR-645 em amostras clínicas AGEJ foram analisadas por PCR quantitativa. B. Comparação da expressão relativa de IFIT2
em amostras clínicas AGEJ humanos de diferentes dimensões de tumor. (T
-test, * p < 0,05). C. Expressão de IFIT2 examinados por Western blotting (a, b: os valores indicam a média ± DP, normalizada para a tubulina, n = 3, t
-test, *** p
< 0,001) D. uma. Imagens representativas mostradas são coloração imuno-histoquímica positiva de IFIT2 em amostras AGEJ humanos e combinados tecidos normais adjacentes (ampliação de 200 ×). b. pontuações de coloração de IFIT2 (t
-teste, *** p Art < 0,001). parcelas E. dispersão que mostra a correlação linear negativa entre a expressão de mRNA de IFIT2
e que de miR-645 em 43 AGEJ amostras clínicas. F. expressão IFIT2 e IFIT2
medido por transferência de Western em SGC7901 (a) e células BGC-823 (b). (Os valores indicam a média ± SD, n = 3, One-way análise ANOVA, p *** Art < 0,001)
IFIT2 medeia a função de miR-645 através da promoção SGC7901 e BGC-823 células.
apoptose Para confirmar que a indução da apoptose celular em SGC7901 e BGC-823 células por miR-645 foi mediada por segmentação IFIT2
, foi realizada a transfecção de plasmídeo IFIT2
em SGC7901 (Figura 5A) e BGC-823 (Figura 5B) de células para sobre-regular a expressão de IFIT2. Western blot e PCR quantitativa mostrou que a sobre-regulação de IFIT2 por IFIT2
transfecção de plasmídeo pode ser reduzida significativamente por miR-645 imita. ensaio MTT mostrou que as células transfectadas com proliferação plasmídeo-IFIT2 foi suprimida, no entanto, as células transfectadas com a proliferação de miR-645 imita aumentou significativamente em comparação com o plasmídeo de controlo e do plasmídeo-IFIT2 + miR-645 os grupos (Figura 5C AB, P <
0,001). Além disso, a introdução de IFIT2 promoveu apoptose de SGC7901 e BGC-823 células e miR-645 imita reduziu a apoptose das células induzidas por sobre-regulação IFIT2 em comparação com o grupo CN na presença de ADR (Figura 5E-F, P <
0,001). Nossos achados sugerem que IFIT2 mediada a função de miR-645 na inibição SGC7901 e BGC-823 células proliferação e induzir a apoptose celular. Figura 5 IFIT2 medeia a função de miR-645, promovendo apoptose de células GC. A & B. Expressão de IFIT2 examinado por western blot (A:. SGC7901; B, BGC-823 a, normalizada para tubulina, os valores indicam a média ± SD, análise One-Way ANOVA, para SGC7901, F = 189,307, para BGC-823, F = 85,374; b, os valores indicam a média ± SD, One Way-análise ANOVA, para SGC7901, F = 85,374, para BGC-823, F = 219,921; *** p Art < 0,001). C. SGC7901 (a) e BGC-823 (b) células submetidas a ensaio MTT por dia durante 6 dias (os valores indicam a média ± SD, de duas vias análise ANOVA, para SGC7901, F = 13,768, para BGC-823, F = 16,409, p *** Art < 0,001). D & E. SGC7901 (D) e BGC-823 células (E) foram recolhidas para análise FACS depois de 72 h na presença de ADR (0,05 ug /mL) (os valores indicam a média ± DP, n = 3, uma maneira-análise ANOVA; para SGC7901, M = 361,749, para BGC-823, F = 229,952; *** p
. < 0,001)
Exaustão e a sobre-regulação de miR-645 alterado da actividade da caspase-3/7
IFIT2 tem sido relatada como sendo um supressor de tumor por meio de mediar a apoptose através da activação de células a actividade da caspase-3/7. Caspase-Glo 3/7 ensaio mostrou que o miR-645 depleção significativamente regulada para cima, enquanto que a sobre-expressão de miR-645 regulado a jusante a actividade da caspase-3/7 em comparação com os grupos simulados e NC em presença de ADR (0,2 ug /ml) (Figura 6A e B, P < 0,001
) ou a condição de privação de soro (Figura 6C e D, P < 0,001
). Estes resultados, combinados com observações mencionadas acima sugeriu que miR-645, up-regulada nos tecidos AGEJ humanos, a apoptose celular inibida e promove tumorigenicidade via suprimindo 3-caspase /7 atividade, visando IFIT2. Figura 6 A caspase-3/7 actividade. capacidade anti-apoptótica de células e SGC7901 BGC-823 células após exposição a ADR (0,2 ug /ml) ou privação de soro foi avaliado pela actividade de caspases-3/7. A & C, SGC7901 células; B & D, as células BGC-823. (Os valores indicam a média ± SD, n = 3, One-Way análise ANOVA; para A, F = 183,930, para B, F = 1.093,797; para C, F = 1861,50, para D, F = 1.483,604, *** p
. < 0,001)
Discussão e conclusões
Embora o acúmulo de evidências têm mostrado que miRNAs desregulamentação está envolvido com a carcinogênese tumor, progressão, migração e invasão [41], metástase [42, 43] e multirresistência [44-46]. Pouco se sabe sobre os papéis dos miRNAs no desenvolvimento de adencarcinoma da junção do esôfago gástrica (AGEJ). Aqui, mostramos que a que a expressão de miR-645 foi significativamente aumentada em espécimes clínicos AGEJ em comparação com pares de tecidos não-cancerosas e era alternativa significativamente sobre-regulada em duas linhas celulares de cancro gástrico (CG), SGC7901 e BGC-823, que foram utilizados modelos celulares porque não há linhas celulares AGEJ disponíveis foram estabelecidos até à data. A inibição de miR-645 em células SGC7901 e BGC-823 induziu significativamente a apoptose das células e SGC7901 BGC-823 na condição de privação de soro ou droga quimioterapêutica por cima de regulação de IFIT2,
um mediador de apoptose, com um potencial local de ligação para miR-645 em 3'UTR do seu ARNm. O padrão de expressão de miR-645 e IFIT2 em SGC7901 e células BGC-823 e amostras clínicas foram negativamente correlacionadas, ainda sugerindo que IFIT2
é um gene alvo de miR-645. Além disso, a inibição de miR-645 resulta num aumento da actividade da caspase-3/7, o qual é activado por IFIT2. Todas estas descobertas sugerem um papel fundamental de miR-645 em carcinogénese, especialmente no desenvolvimento de AGEJ.
Muito pouca apoptose é uma causa importante de carcinogénese porque as células malignas morte são notavelmente reduzida [47, 48], resultando na transformação maligna das células afectadas, metástase de tumores e resistência a múltiplos fármacos de células cancerosas. Por isso, a apoptose é de grande importância no tratamento de cancro e é um alvo comum de muitas estratégias de tratamento. Neste estudo mostramos que o miR-645 células cancerosas deficientes ao soro a apoptose induzida por privação, ao passo que o esgotamento de miR-645 antagonizou o efeito de miR-645, sugerindo que o miR-645 pode desempenhar um papel crucial na adaptação de cancro células a baixa nutrição. número crescente de miARNs têm sido implicados na apoptose de células de cancro. Por um lado, microARNs pode funcionar como supressor de tumor através de indução da apoptose, isto é, o miR-421, que induz a proliferação de células e resistência à apoptose no carcinoma nasofaríngeo humano através de sub-regulação de FOXO4 [49]; miR-149, que induz a apoptose através da inibição da Akt1 e E2F1 em células de cancro humano [50] e miARN-31, o qual induz a apoptose em células do neuroblastoma humano [51]. Por outro lado, microARNs pode funcionar como oncogenes por suprimir a apoptose, isto é, o miR-24, que inibe a apoptose e reprime Bim em cardiomiócitos de rato [52]; miR-886-5p, que inibe a apoptose através da expressão do Bax-regulação para baixo em células de carcinoma cervical humano [53], e miR-183, que inibe a apoptose induzida por TGF-β1 por regulação negativa da expressão PDCD4 em células de carcinoma hepatocelular humano [54] .
ISGs, IFN estimulada genes, referem-se a genes que são tanscribed por indução IFNs. Entre eles, quatro podem desempenhar papéis importantes que afectam tanto a inibição da replicação virai e a inibição da proliferação celular [55, 56]. Estes genes podem inibir a replicação virai por sacrificar a célula através da promoção de apoptose e supressão da progressão do cancro através da inibição da sobrevivência de células malignamente transformados em benefício do hospedeiro [57]. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

• análise de proteoma de adenocarcinoma da cárdia gástrica humana pelo laser microdissecção de captura
• O potencial terapêutico da PRL-3 segmentação e relevância clínica da PRL-3 amplificação genómica no câncer gástrico