Transkriptionsfaktom FOXO4 nedregleras och hämmar tumörtillväxt och metastaser i gastric cancer

transkriptionsfaktom FOXO4 nedregleras och hämmar tumörtillväxt och metastaser i magcancer Bild Sammanfattning
Bakgrund
FOXO4, en medlem av den FOXO familjen av transkriptionsfaktorer, är för närvarande föremål för intensiva studier. Dess roll och funktion i magcancer har inte helt klarlagd. Den aktuella studien syftade till att undersöka uttrycksprofilen för FOXO4 i magcancer och effekten av FOXO4 på cancercellernas tillväxt och metastasering.
Metoder
immunohistokemi, Western blotting och QRT-PCR utfördes för att detektera FOXO4 uttryck i gastrisk cancerceller och vävnader. Cellbiologiska analyser, subkutan tumorigenicitet och svansvenen metastatisk analys i kombination med lentivirus konstruktion utfördes för att detektera effekten av FOXO4 till magcancer i proliferation och metastas in vitro och in vivo. Konfokal och QRT-PCR utfördes för att undersöka mekanismerna.
Resultat
Vi fann att uttrycket av FOXO4 minskade signifikant i de flesta magcancer vävnader och i olika humana gastriska cancercellinjer. Uppreglera FOXO4 inhiberade tillväxt och metastas av gastriska cancercellinjer in vitro och ledde till dramatisk dämpning av tumörtillväxt, och lever och lunga metastas in vivo, medan nedreglering FOXO4 med specifika siRNA främjade tillväxt och metastasering av gastrisk cancercell rader. Dessutom fann vi att uppreglering FOXO4 kan innebära betydande G1 gripande och S-fas reduktion och nedreglering av uttrycket av vimentin.
Slutsats
Våra data tyder på att förlusten av FOXO4 uttryck bidrar till magcancer tillväxt och metastaser och det kan tjäna som ett potentiellt terapeutiskt mål för magcancer.
Nyckelord
FOXO4 gastric cancer spridning Metastas EMT bakgrund
Även om förekomsten av magsäckscancer (GC) minskar, det är fortfarande den fjärde vanligaste cancerformen och näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i världen [1]. De nyckelmolekyler involverade i cellproliferation och metastas i GC progression får stöd i klinisk diagnostik eller förutsäga utvecklingen av denna sjukdom.
Tumörtillväxt och metastas beror på olika faktorer, inklusive transkriptionsfaktorer [2-5]. Den FOXO transkriptionsfaktorer familj innefattar fyra starkt besläktade medlemmar: FOXO1, FOXO3, FOXO4 och FOXO6 [6-8]. Under de senaste åren har FOXO visats spela viktiga roller i en uppsjö av cellulära processer, inklusive spridning, apoptos, differentiering, stresstålighet och metaboliska svar [9], och kan därför vara lovande mål för nya läkemedel inom onkologi [10, 11].
Våra tidigare resultat visade att den FOXO4 mRNA-expressionsnivån var dramatiskt nedregleras i lymfkörtelpositiva kolorektala karcinomvävnader jämfört med lymfkörtel-negativa vävnader, föreslog att det kan fungera som en negativ regulator av metastas av kolorektalcancer [12]. Emellertid var uttrycket och funktionen av FOXO4 i magcancer inte känt ännu. Målet med vårt arbete har varit att undersöka den möjliga rollen av FOXO4 i magcancer cancer. Här rapporterar vi att FOXO4 FÖRTRÄNGA celltillväxt och metastaser i magcancer genom förordningen G1 cellcykelstopp och vimentin.
Metoder
Vävnadsprover Hus Till vävnadsprover, alla patienter förutsatt informerat samtycke att använda överskott patologiska exemplar för forskningsändamål. De protokoll som används i denna studie har godkänts av sjukhusets skydd för de mänskliga ämnen kommittén. Användningen av mänskliga vävnader godkändes av Institutional Review Board i fjärde militära Medical University och överensstämde med Helsingforsdeklarationen, liksom lokal lagstiftning. Patienter som tillhandahåller prover för studien undertecknade informerat samtycke former.
Immunohistokemi
Immunhistokemisk färgning utfördes med användning av avidin-biotin-komplex immunoperoxidas metod. Den primära antikroppen mot FOXO4 (1: 100, ab63254, Abcam) utspätt i PBS innehållande 1% (vikt /volym) bovint serumalbumin (BSA). Negativa kontroller utfördes genom att ersätta den primära antikroppen med för-immun musserum. Bilder erhölls under ett ljusmikroskop (Olympus BX51, Olympus, Japan) utrustad med en DP70 digitalkamera. Observatören var blind för identiteten av proverna när scoring Utvärderings immunreaktivitet.
Av färgning Hus Till utvärdering av cellfärgning, var sektionerna granskas av två oberoende patologer utan förkunskaper om kliniken-patologisk status av proverna . Celler som färgades brun ansågs vara positivt. Expressionen av FOXO4 utvärderades enligt kvoten av positiva celler per prov (R) och färgningsintensitet (I). Förhållandet mellan positiva celler per prov bedömdes enligt följande: 0 för färgning av < 1%, en för färgning av 2% till 25%, 2 för färgning av 26% till 50%, 3 för färgning av 51% till 75%, och 4 för färgning av > 75% av de undersökta cellerna. Intensiteten graderades enligt följande: 0, ingen signal; 1, svag färgning; 2, måttlig färgning; och 3, stark färgning. En totalpoäng (R × I) 0-12 slutligen beräknades och graderades som negativ (-score: 0-2). Eller positiv (+, 3-12) katalog Tissue samling
Vävnads arrayer köptes från den Aomei företaget (Aomei C0124H, AM01C09, Aomei Biotechnology Co. Ltd, Xi'an, Kina) (Ytterligare fil 1: Tabell S1 och övriga fil 2: Tabell S2). För Western blot-analys, var GC vävnader och angränsande nontumorous vävnader som erhållits från åtta patienter som genomgått kirurgi vid Institutionen för allmän kirurgi i vårt sjukhus. Samtliga fall av GC och normal magslemhinna var kliniskt och patologiskt bevisad. De protokoll som används i studierna godkändes av sjukhusets skydd för de mänskliga ämnen kommittén. Patienter som bidrog färska kirurgisk vävnad för studien hade undertecknat informerat samtycke former.
RNA-extraktion och realtids-PCR
Totalt RNA från cellerna extraherades med användning av Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), och cDNA syntetiserades med användning av Prime Script RT reagenskit (Takara Biotechnology, Dalian, Kina) enligt tillverkarens rekommendationer. Ett ljust Cycler Fast Start DNA master SYBR Green I System (Roche, Basel, Schweiz) användes för realtids-PCR. GAPDH-mRNA användes som intern kontroll, och reaktionsblandningen utan mall-DNA användes som negativ kontroll. Samtliga prover mättes oberoende tre gånger. Primersekvenserna var följande: GAPDH: (framåt) 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 'och (omvänt) 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'; FOXO4: (framåt) 5'-CTTTCTGAAGACTGGCAGGAATGTG-3 'och (omvänt) 5'-GATCTAGGTCTATGATCGCGGCAG-3'; E-cadherin (framåt) 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3'and (bakåt) 5'AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 '; och Vimentin: (framåt) 5'-CAGGCAAAGCAGGAGTCCAC -3'and (bakåt) 5'-GCAGCTTCAACGGCAAAGTTC -3 ". Alla realtid PCR-reaktioner utfördes i tre exemplar.
Oligonukleotid konstruktion och lentivirus produktions
Tre par siRNA oligonukleotider inriktade FOXO4 syntetiserades av GenePharma Co., Ltd. GAPDH sekvenser användes som en positiv kontroll. En obesläktad sekvens användes som en negativ kontroll (tillhandahållen av GenePharma). Sekvenserna var som följer: FOXO4 siRNA oligo-1: 5'-CGCGAUCAUAGACCUAGAUTTAUCUAGGUCUAUGAUCGCGTT-3 '(sense); FOXO4 siRNA oligo-2: 5'-CAGCUUCAGUCAGCAGUUATTUAACUGCUGACUGAAGCUGTT-3 '(sense); FOXO4 siRNA oligo-3: 5'-GUGACAUGGAUAACAUCAUTTAUGAUGUUAUCCAUGUCACTT-3 '(sense); GAPDH siRNA oligo (positiv kontroll): 5'-GUAUGACAACAGCCUCAAGTT-3 '(sense); och negativ kontroll: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ". (känsla) Review Enligt tillverkarens instruktioner, var FOXO4 siRNA oligos transfekteras in i celler med hjälp av siRNA-Mate ™ reagens (GenePharma Ltd, Shanghai, Kina). Efter odlades under två till tre dagar, totalt RNA och protein extraheras. För stabil transfektion, var en Lentiviral uttryck vektor (Lenti-FOXO4) konstruerade (Shanghai GeneChem Co, Ltd, Shanghai, Kina). Med användning av en GV166-puro Vector (GeneChem Co., Ltd., Shanghai, Kina), en lentivirusvektor som uttryckte GFP enbart (LV-kontroll) användes som en negativ kontroll (NC).
Western blöt
Lika mängder av proteiner separerades med användning av natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel (SDS-PAGE) elektrofores och överfördes till ett nitrocellulosamembran (Bio-Rad, Hercules, CA). FOXO4 polyklonal antikropp från kanin (Abcam, 1: 500), CyclinD1 polyklonal kaninantikropp (ImmunoWay, 1: 1000), β-aktin monoklonal musantikropp (Sigma, 1: 2000), E-cadherin och Vimentin polyklonal kaninantikropp (Santa Cruz, CA, 1:. 1000) antikroppar användes för western blöt experiment
cellprolifereringsanalys
3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyl-tetrazoliumbromid (MTT) analys utfördes för att utvärdera hastigheten för cellproliferation, och utfördes enligt standardförfaranden. Varje cellinje detekterades i tre exemplar
migration och invasion analys
Transwell migration utfördes i modifierade Boyden kammare (Transwell, Corning Lowell, MA, USA). Vid en densitet av 5 x 10 3 celler per brunn. Efter 24 h inkubation vid 37 ° C togs cellerna på den undre ytan av brunnarna fixerades med 4% paraformaldehyd, färgades med 1% kristallviolett och räknades.
Hög halt screeningsanalys
Cell motilitet var tillfrågade använder en Cellomics Array Scan VTI 1700 plus (Thermo Scientific, USA). I korthet ades celler i log-fasen skördades och utströks i 96-brunnsplattor (5 x 10 3 celler /brunn). Efter odling över natten vid 37 ° C under vidhäftning, var odlingsmediet ersättas med serumfritt RPMI1640-medium, och odlingen fortsattes under ytterligare 24 h. Därefter tvättades cellerna två gånger med iskall PBS och färgades med Hoechst 33342 under 15 min i en inkubator. Därefter överfördes cellerna tvättas åter två gånger med iskall PBS och exponerades för olika behandlingar. Cellrörlighet detekterades med användning av Cellomics Array Scan VTI 1700 plus (Thermo Scientific) enligt tillverkarens protokoll (varje grupp ingår fem upprepade brunnar).
Konfokalmikroskopi Hus Till konfokalmikroskopi experiment odlades celler på Lab-Tek 24 brunnar kammare diabilder (Thermo Fisher Scientific, USA). Efter över natten odling fixerades cellerna, tvättades och permeabiliserades med 0,3% Triton X-100 i PBS under 10 min. Därefter inkuberades cellerna med primära antikroppar mot E-cadherin och vimentin (spädning 1: 300, Abcam) över natten vid 4 ° C. Cellerna inkuberades också med Cy3-konjugerad anti-kanin IgG (utspädning 1:. 200 (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, USA) under 1 h vid rumstemperatur i mörker Cellkärnan motfärgades med användning av DAPI under 5 min . Fluorescens övervakades och fotograferades med ett konfokalmikroskop (Thermo Fisher Scientific, USA).
djur~~POS=TRUNC studier~~POS=HEADCOMP Hus till djurförsök, nakna möss fyra till sex veckors ålder köptes från Animal Center of Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina) och hölls i laminärt flöde skåp under specifika patogenfria betingelser. Alla förfaranden för djurförsök har utförts i enlighet med de Institutional Animal Care och användning kommittén riktlinjer Experiment Animal Center i fjärde militära Medical University.
Tumörframkallande på nakna möss
logaritmiskt växande celler skördades med hjälp av trypsin och tvättades två gånger med PBS. Sedan 2 × 10 6 celler i 0,2 ml injicerades subkutant i den högra övre ryggpartiet av mössen. Fyra veckor efter inokuleringen fick tumörbärande mössen, och storleken av tumören bestämdes genom tjockleksmätning av den subkutana tumörmassan. Varje experimentgrupp innehöll 6 möss. Två oberoende experiment genomfördes, och de gav liknande resultat.
Svansvenen metastaser assay
Ungefär 2 x 10 6 celler suspenderades i 0,2 ml steril PBS och injicerades i svansvenerna om 10 möss. Mössen övervakades därefter för tumörvolymen och allmänna hälsa, och deras lungor och lever regelbundet observerats med hjälp av bildbehandling mikroskopi.
Statistisk analys
Alla statistiska analyser genomfördes med hjälp av SPSS 17,0 statistisk programvara (SPSS, Inc., Chicago, Illinois). Variabler med ett P-värde mindre än 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant. χ
2 tester användes för att utvärdera betydelsen av skillnader i FOXO4 uttryck frekvens mellan GC vävnader och angränsande nontumorous gastric vävnader. T
-testet (en envägs ANOVA test) utfördes för att utvärdera betydelsen av skillnaden mellan celltillväxt, platt kloner, och migrationsanalyser. Generellt kurvor överlevnad plottades med Kaplan-Meier-metoden och utvärderades för statistisk signifikans genom att använda en log-rank test (Mann-Whitney U
test och Kruskal-Wallis H testet antogs för andra data).
Resultat
expression av FOXO4 nedregleras i GC vävnader och cellinjer
att undersöka huruvida FOXO4 uttryck ändrades i GC var uttrycket och subcellulära lokalisering av FOXO4 studerats i en vävnad microarray av 75 parade GC prov genom att använda en immunohistokemisk analys. FOXO4 ades uttrycks huvudsakligen i kärnan av epitelceller som finns i de gastriska körtlar hos nontumorous vävnader (figur 1A1), men en liten mängd var lokaliserad till cytoplasman. Den FOXO4 färgning i epitelceller från GC proverna var svag. Emellertid FOXO4 färgning i nontumorous vävnader (NT) var genomgående starkare än den hos de GC prover, och det fanns en signifikant skillnad mellan färgnings resultaten av GC och NT prover (Figur 1A2) (P < 0,05) .Vi nästa mätte FOXO4 nivån i en oberoende vävnad microarray panel innehållande 40 primära GCS och motsvarande lymfkörtel metastasering exemplar. Sammantaget GC visade en lägre uttrycksnivå FOXO4 i metastaser jämfört med motsvarande primära tumörprover (Figurerna 1A3-A4) .De uttrycksnivåer av FOXO4 undersöktes också av western blot och RT-PCR i GC och angränsande normala vävnader som erhållits från åtta patienter (Figur 1B). I sju av de åtta fall har FOXO4 visade sig ha minskat uttryck i cancervävnader, i linje med resultaten från immunohistokemi analysis.We ytterligare jämfört de relativa FOXO4 mRNA och proteinuttrycksnivåer mellan 6 olika GC cellinjer (BGC-823, SGC7901 , MKN28, AGS, 9811, och MKN45) och odödliga gastrisk epitelceller linje GES-1. Återigen, var FOXO4 uttrycks vid en förhållandevis lägre nivå i alla cellinjer 6 GC jämfört med den normala odödliga gastrisk mukosal epitel GES-1-cellinjen (Figur 1C). Dessa resultat tyder på att FOXO4 kan spela en suppressiv roll vid gastrisk karcinogenes. Figur 1 FoxO4 är betydligt nedregleras i GC vävnader och cellinjer. (A1) IHC analys av FOXO4 uttryck i 75 parade GC och angränsande icke-tumörvävnad. (A2) Statistisk analys av FOXO4 uttryck i GC vävnader och angränsande icke-tumör magen vävnader. (A3) representant FOXO4expression i primära och metastatiska GC vävnader upptäckts av IHC metoder. (A4) Statistisk analys av FOXO4 uttryck mellan GC vävnader med och utan nod metastasering. (B1-B2) Real-time PCR och Western blot-analys av FOXO4 uttryck i 8 par GC och angränsande icke-tumörvävnad. (C1-C2) Real-time PCR och Western blotting analys av FOXO4 uttryck i olika GC cellinjer.
FOXO4 hämmar GC proliferation in vitro och inducerar cellcykelstopp i G0 /G1-fasen
att undersöka vilken roll FOXO4 GC tillväxt har vi etablerat två stabila cellinjer (betecknade SGC7901-FoxO4 och SGC7901-NC) efter infektion med LV- FoxO4 eller LV-NC lentivirus, respektive. Efter upprepad val puromycin, RT-PCR och en Western blot-analys bekräftade att SGC7901-FoxO4 uppvisade högre FOXO4 expression jämfört med SGC7901-NC (figur 2A1-A2). MTT-analysen visade att uppreglering av FOXO4 uttryck signifikant inhiberade proliferationen av GC-celler (figur 2A3, P < 0,01) .I motsats härtill den BGC823 cellinjen, som har relativt högre endogen expression, transfekterades transient med FOXO4 siRNA eller den negativa kontrollen. Tre par av siRNA-oligonukleotider riktade mot FOXO4 syntetiserades och transfekterades in BGC823 celler (BGC823-FOXO4si1, BGC823-FOXO4si2, och BGC823-FOXO4si3), och celler transfekterade med siRNA oligo negativ kontroll märktes BGC823-SINC. QRT-PCR och Western blöt visade att siRNA oligo nummer 1 var den mest effektiva, så, denna konstruktion valdes för vidare studier (figur 2B1-B2). Följaktligen tillväxtkurvorna visade att nedreglering av uttrycket av FOXO4 resulterade i ökad proliferation bland GC-celler (figur 2B3) .Vi utförde även en plattkolonibildningsanalys. Dessa resultat visade att SGC7901-FOXO4 celler produceras färre cellkolonier jämfört med SGC7901-NC kontrollceller (Figur 2C1-C2, P < 0,05). Därefter använde vi FACS analys för att undersöka effekterna av FOXO4 på cellcykeln. SGC7901-FOXO4 celler uppvisade signifikant G1 gripande och S-fas minskning (figur 2D1-D2), som indikerade att FOXO4 hämmade GC spridning till följd av G1 cellcykelstopp. För att förstärka denna observation, upptäckte vi ett uttryck för CyclinD1 som är en markör för G1 fas med western blöt, visade det sig att CyclinD1had en relativt högre uttryck i 7801-NC cellinje än 7901-FOXO4 celler (figur 2E1-E2). Figur 2 Effekt av FOXO4 om reglering GC celltillväxt. (A1-A2) Relativ uttryck av FOXO4 i SGC-7901-celler transfekterade med LV-FOXO4 eller LV-kontroll, vilket bekräftades genom realtids-PCR och Western blot-analys. Värdena representerar medelvärdena från tre separata experiment, och de felstaplarna representerar SEM (** P < 0,01). (A3) De förökningshastigheter av celler mättes med användning av MTT-analysen. Värdena representerar medelvärdena från tre separata experiment, och de felstaplarna representerar SEM (* P < 0,05). (B1-B2) Relativ uttryck av FOXO4 i BGC-823-celler transfekterade med FOXO4 oligo nukleotid hämmare eller oligo nukleotid kontroll, vilket bekräftades genom realtids-PCR och Western blot-analys. Värdena representerar medelvärdena från tre separata experiment, och de felstaplarna representerar SEM (** P < 0,01). (B3) De förökningshastigheter av celler mättes med användning av MTT-analysen. Värdena representerar medelvärdena från tre separata experiment och de felstaplar representerar SEM (* P < 0,05). (C1-C2) Kolonibildning av SGC07901 celler transfekterade med LV-FOXO4 och LV-kontroll genomfördes genom att så celler på plattor i 2 veckor, och antalet kolonier räknades sedan. Värdena representerar medelvärdena från tre separata experiment, och de felstaplarna representerar SEM (* P < 0,05). (D1-D2) Cellcykel distribution av SGC-7901-celler transfekterade med LV-FOXO4 eller LV-kontroll. Cellcykelanalys utfördes 24 h efter transfektion. Cellcykelfördelning beräknades och uttrycktes som medelvärdet ± standardavvikelse för tre separata experiment. * P < 0,05. (E1-E2) Relativ expression av CyclinD1 i SGC-7901-celler transfekterade med LV-FOXO4 eller LV-kontroll, vilket bekräftades western blot-analys. Värdena representerar medelvärdena från tre separata experiment, och de felstaplarna representerar SEM (* P < 0,05).
FOXO4 hämmar migration och invasion av GC-celler in vitro
För att utvärdera inflytandet av FOXO4 på GC migration och invasion, nästa utvärderade vi effekten av FOXO4 expression på de invasiva och flytt förmågor av GC-celler med användning av in vitro-transwell-analyser. Resultaten visade att migration och invasion av SGC-7901-FOXO4 celler både särskilt minskas i jämförelse med SGC-7901-NC kontrollceller (figur 3A1). I motsats, utarmning av FOXO4 avsevärt främjat cellmigration och invasion i BGC823 celler jämfört med kontrollceller (Figur 3A2). Vidare screeningsanalysen med hög halt visade motilitet hastighet SGC-7901-FOXO4 celler är signifikant lägre än SGC-7901-NC-celler, 15/19 tidpunkter visade tydligt motilitet hastighet SGC-7901-FOXO4 celler är lägre än SGC-7901-NC-celler (figur 3B). Dessutom, sårläkande analyser visade att SGC-7901-FOXO4 celler slutna sår långsammare än SGC-7901-NC-celler (Figur 3C) (P < 0,05). Tillsammans indikerade dessa resultat att FOXO4 försämras avsevärt GC cellmigration och invasion in vitro. Figur 3 Effekt av FOXO4 vid reglering av GC cellmetastaser. (A1-A2) Uppreglering av FOXO4 expression i LV-FOXO4 celler minskade SGC-7901 cell migration och invasion in vitro, under det att hämning av FOXO4 uttryck med hjälp av oligo nukleotid hämmare av FOXO4 förbättrad BGC-823 cell migration och invasion. (B) Cellmigration kapacitet utvärderades genom att utföra en hög halt analys i SGC-7901-celler transfekterade med LV-FOXO4 eller LV-kontroll. * P < 0,05 (C) Cellmigration kapacitet testades också genom att utföra en sårläkande analys i SGC-7901-celler transfekterade med LV-FOXO4 eller LV-kontroll. * P < 0,05.
FOXO4 uppreglering inhiberar tumorigenes och metastas av GC-celler in vivo
att ytterligare bekräfta effekterna av FOXO4 på tumörgenes av GC, var en tumörbildningsanalys utförs i nakna möss. SGC7901-NC och SGC7901-FOXO4 celler subkutant inokulerades i den högra övre delen av ryggen regionen av nakna möss på ett enda ställe. Fyra veckor senare, möss som subkutant inokulerade avlivades ades de transplanterade tumörer skars ut och tumörstorlekarna utvärderades (figur 4A1-A3, P < 0,05). Resultaten visade en signifikant minskning av de storlekar av xenotransplantat som härrör från FOXO4 uppregleras cells.To ytterligare utforska rollen av FOXO4 i tumörmetastas in vivo, implanteras vi SGC7901-NC och SGC7901-FOXO4 celler in i nakna möss genom den laterala svansvenen . Representativ självlysande imaging (BLI) av de olika grupperna visas i figur 4B1. Histologisk analys bekräftades ytterligare att förekomsten av lung- och levermetastaser i SGC7901-FOXO4 gruppen minskade signifikant, jämfört med SGC7901-NC-gruppen (figur 4B2, B3). Antalet lungmetastatiska noduler i SGC7901-FOXO4 gruppen minskade också, jämfört med den SGC7901-NC-gruppen (data ej visade). Lever och lunga metastas rades vidare framgår av hematoxylin och eosin-färgning (fig 4C). Vidare SGC7901-FOXO4 grupp nakna möss demonstreras längre total överlevnadstid jämfört med SGC7901-NC-gruppen (Figur 4D). Dessa data indikerade att FOXO4 tryckt GC celltumörbildning och metastas in vivo. Figur 4 In vivo proliferation och metastas-analys. (A1-A3) SGC-7901-celler transfekterade med LV-FOXO4 eller LV-kontroll transplanterades under huden. Sex veckor senare, tumörer mer tydligt hos möss implanterade med 7901-NC-celler jämfört med 7901-FOXO4 grupper: (6/6 i 7901-NC grupper och 3/6 i 7901-FOXO4 grupper). Tumörerna dissekerades och mätas. (B1-B3) SGC-7901-celler transfekterade med LV-FOXO4 eller LV-kontroll injicerades i svansvenerna hos nakna möss. Tio veckor senare, möss implanterade med 7901-NC celler visade lung- och levermetastaser, medan några metastaser detekterades i möss implanterade med 7901-FOXO4 celler (för lungmetastaser, 6/10 i 7901-NC grupper och 1/10 i de 7901-FoxO4 grupper, levermetastaser, 3/10 i 7901-NC grupper och 0/10 i 7901-FoxO4 grupper. (C) bilder som visar representativ hematoxylin och eosin färgning av lung- och levervävnadsprover från olika experimentella grupper * P <.. 0.05 (D) Total överlevnad av nakna möss i varje grupp
molekylära mekanismer FOXO4 i metastasering av GC
att undersöka potentiella mekanismer för rollen som FOXO4 GC metastaser, undersökte vi uttrycket av metastaser relaterade molekyler, inklusive E-cadherin, vimentin i SGC-7901-FOXO4 och SGC-7901-NC kontrollceller med hjälp av RT-PCR (figur 5A1-A2). resultaten visade att FOXO4 uttryck markant undertryckt uttryck för vimentin, även om ingen uppenbar förändring observerades för E-cadherin. De immunofluorescens konfokala resultat gav också liknande slutsatser (figur 5B1-B2). Figur 5 FOXO4 hämmar EMT i GC-celler. (A1-A2) Realtids-PCR visade uppreglerat uttryck av epiteliala markörer (E-cadherin) och nedregleras expression av mesenkymala markörer (vimentin) i 7901-FOXO4 celler. (B1-B2) Immunofluorescens färgning visade uppreglerat uttryck av epiteliala markörer (E-cadherin) och nedregleras expression av mesenkymala markörer (vimentin) i 7901-FOXO4 celler.
Dessa data visar att FOXO4 delvis kan påverka GC cell metastas genom att reglera EMT process, och ytterligare molekylära mekanismer kommer att studeras i det fortsatta arbetet.
Diskussion
forkhead box klass O (FOXO) familj av transkriptionsfaktorer är evolutionärt bevarad och kännetecknas av så kallade forkhead box DNA- bindande domän. Hos däggdjur, det FOXO genfamiljen består av fyra medlemmar: FOXO1, FOXO3A, FOXO4 och FOXO6. Ett flertal studier har visat att FOXO proteiner spelar en viktig roll i ett brett spektrum av normala biologiska processer, inklusive cellproliferation, cellcykelstopp, stress, och apoptos [10, 13, 14], såväl som i sjukdomar såsom cancer och diabetes mellitus [15]. Men det finns lite studie rapporterade om rollen av FOXO4 spelar i GC.
I den aktuella studien fann vi FOXO4 uttryck i icke-tumörvävnad var genomgående starkare än GC prov och GC visade en lägre uttryck nivå av FOXO4 i metastatiska lesioner jämfört med de motsvarande primära tumörprover. De FOXO4 mRNA och proteinexpressionsnivåer var båda minskas i olika typer av GC cellinjer jämfört med den normala gastrointestinala epitelcellinje, vilket antyder att FOXO4 kan tjäna som en negativ regulator för GC. Dessutom, förhöjt uttryck av FOXO4 uttryck inhiberade tumörcelltillväxt, invasion och metastas in vitro och in vivo, vilket indikerar att FOXO4 kan spela en roll i GC progression och metastasering. Sälja The mekanismer som ansvarar för effekten av FOXO4 förändringar GC utveckling och progression fortfarande oklara. Flera nya studier har indikerat att FOXO reglerar många aspekter av cancerbiologi. Till exempel är FOXO normalt begränsas av PI3K /Akt signalvägen som förhindrar FOXO translokering in i kärnan, och FOXO reglera transkriptionella responser oberoende av direkt DNA-bindning via association med en rad olika orelaterade transkriptionsfaktorer [16]. Våra resultat visade att FOXO4 inducerade betydande G1 gripande och S-fas minskning av GC-celler, vilket indikerade att FOXO4 inhiberade GC proliferation kan åtminstone delvis av resultatet av G1 cellcykelstopp.
Ett kritiskt steg i metastaserande kaskaden är process av epitelceller till mesenkymala övergång (EMT) [17, 18]. Under EMT processen, uttrycket av E-cadherin var ofta nedregleras, medan vilken av vimentin ofta visar uppreglerade [19]. FOXO4 kan reglera EMT i magcancer. För att testa denna hypotes, bedömde vi uttryck för E-cadherin och vimentin i cellmodeller ovan. Även om ingen uppenbar förändring observerades för E-cadherin, var en dramatisk minskning av vimentin expression visas i FOXO4 överuttryck celler jämfört med kontrollcellerna, såsom indikeras av immunofluorescensanalys och QRT-PCR. Dessa studier tyder starkt på att FOXO4 kan inhibera gastrisk cancermetastas genom kontroll av EMT.
Slutsats
Sammanfattningsvis vår studie visar på en kritisk funktion av FOXO4 vid hämning av GC proliferation och metastas via regleringen av G1-cell-cykelarrest och EMT, antyder att det kan fungera som ett potentiellt terapeutiskt mål för magcancer
Notes
Linna Su, Xiangqiang Liu, Na Chai bidragit lika för detta arbete
Förkortningar
FOXO4..
forkhead box O4
BSA:
Bovinserumalbumin
DAB:
Diaminobenzidine

QRT-PCR:
realtid kvantitativ PCR
MTT:
3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2, 5-difenyl-tetrazoliumbromid
PBS:
Fosfatbuffrad saltlösning
DMSO.
Dimetylsulfoxid


förklaringarna
Tack
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (bidrag nummer 81.172.062, 81.270.445). Vi tackar Prof. Zengshan Li (Institutionen för patologi vid Xijing-sjukhuset) för hans hjälp i patologisk analys. Vi tackar också fru Zuhong Tian för hjälpen med djur imaging experiment. Alla författare läst och godkänt den slutliga manuskriptet.

• LIM homeodomänen transkriptionsfaktor Isl1 styr normal pyloric utveckling genom att rikta Gata3
• Genetiska polymorfismer i osteopontin promotorn ökar risken för distansmetastaser och död i kinesiska patienter med magcancer