Il fattore di trascrizione FOXO4 è down-regolato e inibisce la proliferazione tumorale e metastasi in cancer

gastrico Il fattore di trascrizione FOXO4 è down-regolato e inibisce la proliferazione tumorale e le metastasi nel cancro gastrico
Abstract
sfondo
FOXO4, un membro della la famiglia FOXO di fattori di trascrizione, è attualmente al centro di un intenso studio. Il suo ruolo e la funzione di cancro gastrico non sono stati completamente chiariti. Il presente studio è stato finalizzato ad indagare il profilo di espressione di FOXO4 nel carcinoma gastrico e l'effetto di FOXO4 sulla crescita delle cellule tumorali e metastasi.
Metodi
immunoistochimica, Western blotting e qRT-PCR sono state eseguite per rilevare l'espressione FOXO4 in gastrica cellule tumorali e tessuti. Cellulari saggi biologici, tumorigenicità sottocutanea e coda vena saggio metastatico in combinazione con costruzione lentivirus sono stati eseguiti per rilevare l'impatto del FOXO4 al cancro gastrico nella proliferazione e le metastasi in vitro e in vivo. Confocale e qRT-PCR sono state eseguite per esplorare i meccanismi.
Risultati
Abbiamo scoperto che l'espressione di FOXO4 era diminuita significativamente nei tessuti tumorali più gastriche e in diverse linee di cellule di cancro gastrico umano. Up-regolazione FOXO4 ha inibito la crescita e le metastasi delle linee di cellule di cancro gastrico in vitro e ha portato alla drammatica attenuazione della crescita tumorale, e del fegato e del polmone metastasi in vivo, mentre down-regolazione FOXO4 con siRNA specifici promosso la crescita e la metastasi di cellule cancro gastrico Linee. Inoltre, abbiamo scoperto che up-regolazione FOXO4 potrebbe indurre significativo arresto G1 e la riduzione della fase S e down-regolazione dell'espressione di vimentina.
Conclusione
I nostri dati suggeriscono che la perdita di espressione FOXO4 contribuisce alla crescita del cancro gastrico e metastasi , e può servire come un potenziale bersaglio terapeutico per il cancro gastrico.
Parole
FOXO4 cancro gastrico proliferazione Metastasi EMT Sfondo
Sebbene l'incidenza di cancro gastrico (GC) è in calo, rimane il quarto cancro più comune e la seconda causa di morte per cancro in tutto il mondo [1]. Le molecole chiave coinvolte nella proliferazione cellulare e metastasi in progressione GC può essere di aiuto nella diagnosi clinica o predire la progressione di questa malattia.
Crescita tumorale e le metastasi dipendono da vari fattori, tra cui i fattori di trascrizione [2-5]. La famiglia di fattori di trascrizione FOXO comprende quattro componenti altamente correlati: FOXO1, foxo3, FOXO4, e FOXO6 [6-8]. Negli ultimi anni, FOXO hanno dimostrato di svolgere un ruolo cruciale in una pletora di processi cellulari, tra cui la proliferazione, l'apoptosi, differenziazione, resistenza allo stress, e le risposte metaboliche [9], e possono quindi essere bersagli promettenti per nuovi farmaci nel campo dell'oncologia [10, 11].
nostri risultati precedenti hanno dimostrato che il livello di espressione di mRNA FOXO4 era drammaticamente down-regolato nei linfonodi del colon-retto tessuti di carcinoma con linfonodi positivi rispetto ai tessuti con linfonodi negativi linfatiche, ha suggerito che può funzionare come un regolatore negativo della metastasi del carcinoma del colon [12]. Tuttavia, l'espressione e la funzione di FOXO4 nel cancro gastrico non erano ancora noti. Lo scopo del nostro lavoro è stato quello di indagare il possibile ruolo di FOXO4 in gastrica carcinogenesi del cancro. Qui, si segnala che la proliferazione cellulare FOXO4 repress e metastasi nel carcinoma gastrico dal ciclo cellulare arresto regolazione G1 e vimentina.
Metodi
campioni di tessuto Compra di campioni di tessuto, tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato da usare in eccesso patologico esemplari per scopi di ricerca. I protocolli utilizzati in questo studio sono stati approvati dalla protezione dell'ospedale del comitato soggetti umani. L'uso di tessuti umani è stato approvato dal Comitato Etico della Quarta Università Medica Militare e conforme alla Dichiarazione di Helsinki, così come la legislazione locale. I pazienti che forniscono campioni per lo studio firmato moduli di consenso informato.
Immunoistochimica
colorazione immunoistochimica è stata eseguita utilizzando il metodo dell'immunoperossidasi complesso avidina-biotina. L'anticorpo primario contro FOXO4 (1: 100, ab63254, Abcam) diluito in PBS contenente 1% (peso /volume) siero albumina bovina (BSA). I controlli negativi sono stati eseguiti sostituendo l'anticorpo primario con siero di topo pre-immune. Le immagini sono state ottenute al microscopio ottico (Olympus BX51, Olympus, Giappone) equipaggiato con una fotocamera digitale DP70. L'osservatore è stato accecato per l'identità dei campioni il punteggio immunoreattività
. Valutazione della colorazione
Per la valutazione della colorazione delle cellule, le sezioni sono state esaminate da due patologi indipendenti senza una preventiva conoscenza dello stato clinico-patologica dei campioni . Le cellule che sono stati macchiati marrone sono stati considerati positivi. L'espressione di FOXO4 è stata valutata in base al rapporto di cellule positive per esemplare (R) e intensità di colorazione (I). Il rapporto di cellule positive per campione è stato ottenuto come segue: 0 per la colorazione di < 1%, 1 per la colorazione del 2% al 25%, 2 per la colorazione del 26% al 50%, 3 per la colorazione del 51% al 75%, e 4 per la colorazione di > 75% delle cellule esaminate. L'intensità è stata classificata come segue: 0, nessun segnale; 1, debole colorazione; 2, colorazione moderata; e 3, forte colorazione. Un punteggio totale (R × I) da 0 a 12 è stato finalmente calcolato e classificato come negativo (-score: 0-2). O positivo (+, 3-12)
collezione Tessuto
array di tessuto sono stati acquistati da l'azienda Aomei (Aomei C0124H, AM01C09, Aomei Biotechnology Co. Ltd., Xi'an, Cina) (sui file 1: Tabella S1 e sui file 2: Tabella S2). Per l'analisi Western Blot, tessuti GC e tessuti nontumorous adiacenti sono stati ottenuti da otto pazienti che avevano subito un intervento chirurgico presso il Dipartimento di Chirurgia Generale nel nostro ospedale. Tutti i casi di GC e normale mucosa gastrica sono stati clinicamente e patologicamente provata. I protocolli utilizzati negli studi sono stati approvati dal Comitato per la protezione dei soggetti umani dell'ospedale. I pazienti che hanno contribuito tessuto chirurgico fresco per lo studio avevano firmato moduli di consenso informato.
Estrazione di RNA e real-time PCR
RNA totale dalle cellule è stato estratto utilizzando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), e cDNA è stato sintetizzato utilizzando il kit di reagenti Primo script RT (Takara Biotecnologie, Dalian, Cina) secondo le raccomandazioni del fabbricante. A Light Cycler Fast Start DNA Maestro SYBR Green I System (Roche, Basilea, Svizzera) è stato utilizzato per la PCR in tempo reale. GAPDH mRNA è stato utilizzato come controllo interno, e la miscela di reazione senza il DNA stampo è stato utilizzato come controllo negativo. Tutti i campioni sono stati misurati indipendentemente tre volte. Le sequenze dei primer sono stati i seguenti: GAPDH: (forward) 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 'e (reverse) 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'; FOXO4: (avanti) 5'-CTTTCTGAAGACTGGCAGGAATGTG-3 'e (indietro) 5'-GATCTAGGTCTATGATCGCGGCAG-3'; E-caderina: (avanti) 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3'and (reverse) 5'- AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 '; e Vimentin: (avanti) 5'-CAGGCAAAGCAGGAGTCCAC -3'and (reverse) 5'-GCAGCTTCAACGGCAAAGTTC -3 '. Tutte le reazioni PCR in tempo reale sono stati eseguiti in triplicato.
Costruzione oligonucleotidi e di produzione lentivirus
Tre coppie di oligonucleotidi siRNA mirati FOXO4 sono stati sintetizzati da GenePharma Co., Ltd. Le sequenze GAPDH sono stati utilizzati come controllo positivo. Una sequenza non correlato è stato usato come controllo negativo (fornito da GenePharma). Le sequenze sono state le seguenti: FOXO4 siRNA oligo-1: 5'-CGCGAUCAUAGACCUAGAUTTAUCUAGGUCUAUGAUCGCGTT-3 '(senso); FOXO4 siRNA oligo-2: 5'-CAGCUUCAGUCAGCAGUUATTUAACUGCUGACUGAAGCUGTT-3 '(senso); FOXO4 siRNA oligo-3: 5'-GUGACAUGGAUAACAUCAUTTAUGAUGUUAUCCAUGUCACTT-3 '(senso); GAPDH siRNA oligo (controllo positivo): 5'-GUAUGACAACAGCCUCAAGTT-3 '(senso); e controllo negativo: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 '. (senso)
Secondo i costruttori istruzioni, oligo FOXO4 siRNA sono state trasfettate in cellule utilizzando il reagente siRNA-Mate ™ (GenePharma Ltd., Shanghai, Cina). Dopo coltivate per 2 a 3 giorni, l'RNA totale e proteine ​​sono stati estratti. Per la trasfezione stabile, un lentivirale sovraespressione vettore (Lenti-FOXO4) è stato costruito (Shanghai GeneChem Co., Ltd., Shanghai, Cina). Utilizzando un GV166-puro Vector (GeneChem Co., Ltd., Shanghai, Cina), un vettore lentivirale che esprime GFP da solo (LV-controllo) è stato utilizzato come controllo negativo (NC).
Western Blot
Pari quantità di proteine ​​sono state separate mediante gel dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) elettroforesi sodio e trasferiti su una membrana di nitrocellulosa (Bio-Rad, Hercules, CA). FOXO4 policlonale di coniglio anticorpi (Abcam, 1: 500), CyclinD1 anticorpo policlonale di coniglio (ImmunoWay, 1: 1000), β-actina anticorpo monoclonale di topo (Sigma, 1: 2.000), E-caderina e Vimentin anticorpo policlonale di coniglio (Santa Cruz, CA, 1:. 1000) anticorpi sono stati utilizzati per gli esperimenti Western blot
proliferazione cellulare saggio
Il 3- [4,5-dimethylthiazol-2-il] -2,5-difenil-tetrazolio bromuro (MTT) saggio è stato eseguito per valutare la velocità di proliferazione delle cellule, ed è stata effettuata secondo le procedure standard. Ogni linea cellulare è stata rilevata in triplice copia
migrazione e test di invasione
saggi di migrazione Transwell sono state effettuate in camere di Boyden modificate (Transwell; Corning Inc. Lowell, MA, USA). Ad una densità di 5 × 10 3 cellule per pozzetto. Dopo 24 h di incubazione a 37 ° C, le cellule sulla superficie inferiore dei pozzetti sono stati fissati con 4% paraformaldeide, colorate con cristalvioletto 1%, e contate.
Saggio di screening ad alta contenuto
cellulare motilità era intervistati utilizzando un array Cellomics scansione VTI 1700 più (Thermo Scientific, USA). In breve, le cellule in fase di log sono state raccolte e placcati in piastre da 96 pozzetti (5 × 10 3 cellule /pozzetto). Dopo coltura durante la notte a 37 ° C per l'adesione, il mezzo di coltura è stato sostituito con terreno RPMI1640 privo di siero, e la coltura è stata continuata per altre 24 h. Poi, le cellule sono state lavate due volte con PBS freddo e colorate con Hoechst 33342 per 15 minuti in un incubatore. Successivamente, le cellule sono state nuovamente lavate due volte con PBS freddo ed esposti a diversi trattamenti. Motilità delle cellule è stato rilevato utilizzando il Array Cellomics Scan VTI 1700 più (Thermo Scientific) secondo il protocollo del produttore (ogni gruppo comprendeva cinque pozzi ripetute). Esperimenti
Il microscopio confocale a
Per microscopia confocale, le cellule sono state coltivate su Lab-Tek 24 pozzetti camera di diapositive (Thermo Fisher Scientific, Stati Uniti d'America). Dopo coltura durante la notte, le cellule sono state fissate, lavate, e permeabilizzate con 0,3% Triton X-100 in PBS per 10 min. Poi, le cellule sono state incubate con anticorpi primari contro E-caderina e vimentina (diluizione 1: 300, Abcam) notte a 4 ° C. Le cellule sono state anche incubate con Cy3-coniugati IgG anti-coniglio (diluizione 1:. 200 (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, USA) per 1 ora a temperatura ambiente al buio Il nucleo della cellula è stata contrastate con DAPI per 5 min . la fluorescenza è stato monitorato e fotografato con un microscopio confocale (Thermo Fisher Scientific, USA).
studi su animali Compra di ricerca sugli animali, topi nudi da 4 a 6 settimane di età sono stati acquistati dal Centro animali della Accademia Cinese delle Scienze (Shanghai, Cina) e mantenuto in cappe a flusso laminare sotto specifiche condizioni esenti da organismi patogeni. Tutte le procedure per la sperimentazione animale sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali cura degli animali e del Comitato uso del Esperimento Animal center della Quarta Università medica militare.
tumorigenicità nei topi nudi
cellule logaritmica di crescita sono state raccolte utilizzando tripsina e lavato due volte con PBS. Poi, 2 × 10 6 cellule in 0,2 ml sono stati iniettati per via sottocutanea nella regione posteriore superiore destro dei topi. Quattro settimane dopo l'inoculazione, i topi portatori di tumore sono stati sacrificati, e la dimensione del tumore è stata determinata mediante misurazione pinza della massa tumorale sottocutanea. Ogni gruppo sperimentale conteneva 6 topi. Due esperimenti indipendenti sono stati eseguiti, e che hanno dato risultati simili.
Coda vena saggio metastatico
Circa 2 × 10 6 celle sono stati sospesi in 0,2 ml di PBS sterile e iniettato nelle vene di coda di 10 topi. I topi sono stati poi monitorati per il volume del tumore e la salute generale, e dei loro polmoni e fegato sono stati regolarmente osservati al microscopio di imaging.
Analisi statistica
Tutte le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando SPSS 17.0 software statistico (SPSS, Inc., Chicago, Illinois). Le variabili con un valore di P inferiori a 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. χ
2 test sono stati usati per valutare la significatività delle differenze nella frequenza FOXO4 espressione tra tessuti GC e tessuti gastrici nontumorous adiacenti. Il t-test
(a ANOVA test) è stata eseguita per valutare la significatività della differenza tra proliferazione cellulare, cloni piastra, e saggi di migrazione. le curve di sopravvivenza globale sono state tracciate con il metodo di Kaplan-Meier e sono stati valutati per la significatività statistica utilizzando un log-rank test (il Mann-Whitney U
test e test di Kruskal-Wallis H sono stati adottati per altri dati).
Risultati
espressione di FOXO4 è down-regolato nei tessuti GC e linee cellulari
Per esaminare se l'espressione FOXO4 è stato modificato nel GC, l'espressione e la localizzazione subcellulare di FOXO4 sono stati studiati in un microarray di tessuto di 75 campioni GC appaiati utilizzando un saggio immunoistochimica. FOXO4 stato espresso principalmente nei nuclei delle cellule epiteliali situate nelle ghiandole gastriche di tessuti nontumorous (Figura 1A1), ma una piccola quantità è stata localizzata nel citoplasma. La colorazione FOXO4 nelle cellule epiteliali da campioni GC era debole. Tuttavia, la colorazione FOXO4 nei tessuti nontumorous (NT) è stato costantemente più forte di quella dei campioni GC, e non vi era una differenza significativa tra i risultati della colorazione del GC e campioni NT (Figura 1A2) (P < 0,05) .Abbiamo prossimo misurato il livello di FOXO4 in un pannello di tessuto microarray indipendente contenente 40 primarie CGS e corrispondenti linfonodali esemplari metastasi. Nel complesso, GC ha mostrato un livello di espressione inferiore del FOXO4 in lesioni metastatiche rispetto ai corrispondenti campioni elementari tumorali (Figure 1A3-A4) .I livelli di espressione di FOXO4 stati esaminati anche mediante western blot e RT-PCR in GC e tessuti normali adiacenti ottenuti da otto pazienti (Figura 1B). In sette degli otto casi, FOXO4 è stato trovato per avere una ridotta espressione nei tessuti tumorali, in linea con i risultati del immunoistochimica analysis.We ulteriormente rispetto ai livelli relativi FOXO4 mRNA e di espressione proteica tra 6 differenti linee cellulari GC (BGC-823, SGC7901 , MKN28, AGS, 9811, e MKN45) e l'immortale gastrica linea di cellule epiteliali GES-1. Ancora una volta, FOXO4 stata espressa ad un livello relativamente più basso in tutte le linee cellulari 6 GC rispetto alla normale immortale gastrica mucosa epiteliale GES-1 linea cellulare (Figura 1C). Questi risultati suggeriscono che FOXO4 può giocare un ruolo soppressivo nella carcinogenesi gastrica. Figura 1 FoxO4 è significativamente down-regolato nei tessuti GC e linee cellulari. analisi (A1) IHC di espressione FOXO4 in 75 GC associato e tessuti non tumorali adiacenti. (A2) Analisi statistica dell'espressione FOXO4 nei tessuti GC e tessuti dello stomaco non tumorali adiacenti. (A3) Rappresentante FOXO4expression nei tessuti GC primari e metastatici rilevati con metodi IHC. (A4) Analisi statistica dell'espressione FOXO4 tra tessuti GC con e senza metastasi linfonodali. (B1-B2) Real-time PCR e l'analisi western blot dell'espressione FOXO4 in 8 coppie di GC e tessuti non tumorali adiacenti. (C1-C2) Real-time PCR e analisi western blotting dell'espressione FOXO4 in diverse linee cellulari GC.
FOXO4 inibisce la proliferazione GC in vitro e induce arresto del ciclo cellulare nella fase G0 /G1
Per studiare il ruolo di FOXO4 in crescita GC, abbiamo stabilito due linee cellulari stabili (denotato SGC7901-FoxO4 e SGC7901-NC) dopo l'infezione con il lentivirus LV- FoxO4 o LV-NC, rispettivamente. Dopo la selezione puromicina ripetute, RT-PCR e l'analisi Western Blot ha confermato che SGC7901-FoxO4 ha mostrato espressione FOXO4 superiore rispetto a SGC7901-NC (Figura 2A1-A2). Il saggio MTT ha mostrato che up-regolazione dell'espressione FOXO4 significativamente inibito la proliferazione delle cellule GC (Figura 2A3, P < 0,01) .In contrasto, la linea cellulare BGC823, che ha relativamente più elevata espressione endogena, è stata transitoriamente trasfettate con FOXO4 siRNA o il controllo negativo. Tre coppie di oligonucleotidi siRNA mirati FOXO4 sono stati sintetizzati e trasfettate in BGC823 cellule (BGC823-FOXO4si1, BGC823-FOXO4si2 e BGC823-FOXO4si3), e cellule trasfettate con siRNA oligo controllo negativo sono stati etichettati BGC823-sinc. qRT-PCR e Western Blot ha dimostrato che siRNA numero oligo 1 è stato il più efficace, così, questo costrutto è stato selezionato per un ulteriore studio (Figura 2B1-B2). Di conseguenza, le curve di crescita hanno indicato che down-regolazione dell'espressione di FOXO4 ha provocato un aumento della proliferazione tra le cellule GC (Figura 2B3) .Abbiamo anche eseguito un saggio di formazione di colonie piatto. Questi risultati hanno rivelato che le cellule SGC7901-FOXO4 prodotto un minor numero di colonie di cellule rispetto alle cellule di controllo SGC7901-NC (Figura 2C1-C2, P < 0,05). Successivamente, abbiamo usato l'analisi FACS per esaminare gli effetti del FOXO4 sul ciclo cellulare. cellule SGC7901-FOXO4 visualizzati significativa arresto G1 e riduzione di fase S (Figura 2D1-D2), che ha indicato che FOXO4 inibito GC proliferazione come risultato di arresto del ciclo cellulare G1. Per rafforzare questa osservazione, abbiamo rilevato l'espressione di CyclinD1 che è un marker di fase G1 con Western Blot, ha dimostrato che CyclinD1had una relativamente maggiore espressione nella linea cellulare 7801-NC rispetto alle cellule 7901-FOXO4 (Figura 2E1-E2). Figura 2 Effetto del FOXO4 sulla regolazione della proliferazione delle cellule GC. (A1-A2) espressione relativa di FOXO4 in SGC-7901 cellule trasfettate con LV-FOXO4 o LV-controllo, che è stata confermata mediante real-time PCR e western blot. I valori rappresentano i mezzi provenienti da tre esperimenti separati, e le barre di errore rappresentano il SEM (** P < 0,01). (A3) I tassi di proliferazione delle cellule sono stati misurati utilizzando il saggio MTT. I valori rappresentano i mezzi provenienti da tre esperimenti separati, e le barre di errore rappresentano il SEM (* P < 0,05). (B1-B2) espressione relativa di FOXO4 in BGC-823 cellule trasfettate con inibitore nucleotidico FOXO4 oligo o il controllo nucleotide oligo, che è stata confermata mediante real-time PCR e western blot. I valori rappresentano i mezzi provenienti da tre esperimenti separati, e le barre di errore rappresentano il SEM (** P < 0,01). (B3) I tassi di proliferazione delle cellule sono stati misurati utilizzando il saggio MTT. I valori rappresentano i mezzi da tre esperimenti separati e le barre di errore rappresentano la SEM (* P < 0,05). formazione (C1-C2) Colonia di SGC07901 cellule trasfettate con LV-FOXO4 e LV-controllo è stato effettuato da semina cellule su piastre per 2 settimane, e il numero di colonie è stato contato. I valori rappresentano i mezzi provenienti da tre esperimenti separati, e le barre di errore rappresentano il SEM (* P < 0,05). (D1-D2) distribuzione del ciclo cellulare di SGC-7901 cellule trasfettate con LV-FOXO4 o LV-controllo. L'analisi del ciclo cellulare è stata eseguita 24 ore dopo la trasfezione. La distribuzione del ciclo cellulare è stata calcolata ed espressa come media ± SD di tre esperimenti separati. * P < 0.05. (E1-E2) espressione relativa di CyclinD1 in SGC-7901 cellule trasfettate con LV-FOXO4 o LV-controllo, che è stata confermata l'analisi Western Blot. I valori rappresentano i mezzi provenienti da tre esperimenti separati, e le barre di errore rappresentano il SEM (* P < 0,05).
FOXO4 inibisce la migrazione e l'invasione delle cellule GC in vitro
Per valutare l'influenza di FOXO4 su GC la migrazione e l'invasione, abbiamo accanto valutato l'effetto di espressione FOXO4 sulle capacità invasive e migratorie delle cellule GC utilizzando test in vitro transwell. I risultati hanno mostrato che la migrazione e l'invasione delle SGC-7901-FOXO4 cellule sono state sia notevolmente ridotti rispetto ai SGC-7901-NC cellule di controllo (Figura 3A1). Al contrario, l'esaurimento delle FOXO4 significativamente promosso la migrazione delle cellule e l'invasione in BGC823 cellule rispetto alle cellule di controllo (Figura 3A2). Inoltre, il test ad alta contenuto di screening ha mostrato la velocità motilità delle cellule SGC-7901-FOXO4 è significativamente inferiore rispetto alle cellule SGC-7901-NC, 15/19 punti di tempo hanno mostrato chiaramente la velocità motilità delle cellule SGC-7901-FOXO4 è inferiore cellule SGC-7901-NC (Figura 3B). Inoltre, saggi di guarigione della ferita hanno dimostrato che le cellule SGC-7901-FOXO4 chiusi ferite più lentamente rispetto SGC-7901-NC cellule (Figura 3C) (P < 0,05). Insieme, questi risultati hanno indicato che FOXO4 significativamente compromessa la migrazione delle cellule GC e l'invasione in vitro. Figura 3 Effetto della FOXO4 nel regolare le metastasi delle cellule GC. (A1-A2) Up-regolazione dell'espressione FOXO4 nelle cellule LV-FOXO4 diminuita SGC-7901 migrazione delle cellule e l'invasione in vitro, mentre l'inibizione dell'espressione FOXO4 con l'inibitore nucleotidico oligo di FOXO4 maggiore migrazione delle cellule BGC-823 e l'invasione. Capacità (B) la migrazione delle cellule è stata valutata mediante l'esecuzione di un test ad alto contenuto di SGC-7901 cellule trasfettate con LV-FOXO4 o LV-controllo. * P < Capacità 0,05 (C) la migrazione delle cellule è stato testato anche eseguendo un test di guarigione in SGC-7901 cellule trasfettate con LV-FOXO4 o LV-controllo. * P < 0.05.
FOXO4 up-regulation inibisce tumorigenesi e metastasi delle cellule in vivo GC
Per confermare ulteriormente gli effetti della FOXO4 sulla tumorigenesi di GC, un saggio di formazione del tumore è stata eseguita in topi nudi. SGC7901-NC e le cellule SGC7901-FOXO4 sono stati inoculati per via sottocutanea nella regione posteriore in alto a destra di topi nudi in un unico sito. Quattro settimane più tardi, i topi che sono stati inoculati per via sottocutanea sono stati sacrificati, i tumori trapiantati sono stati asportati, e le dimensioni del tumore sono stati valutati (Figura 4A1-A3, P < 0,05). I risultati hanno rivelato una significativa diminuzione nelle dimensioni di xenotrapianti derivanti da FOXO4 up-regolati cells.To esplorare ulteriormente il ruolo di FOXO4 in metastasi tumorali in vivo, abbiamo impiantato SGC7901-NC e le cellule SGC7901-FOXO4 in topi nudi attraverso la vena della coda laterale . l'imaging Rappresentante bioluminescente (BLI) dei diversi gruppi è illustrata nella Figura 4B1. L'analisi istologica ulteriormente confermato che l'incidenza di polmone e metastasi epatiche nel gruppo SGC7901-FOXO4 era significativamente diminuito, rispetto al gruppo SGC7901-NC (Figura 4B2, B3). Il numero di noduli metastatici polmonari nel gruppo SGC7901-FOXO4 è stato ridotto, rispetto al gruppo SGC7901-NC (dati non mostrati). Fegato e metastasi polmonari sono stati ulteriormente comprovati da ematossilina e eosina (Figura 4C). Inoltre, il gruppo di topi nudi SGC7901-FOXO4 dimostrato più tempo di sopravvivenza globale rispetto al gruppo SGC7901-NC (Figura 4D). Questi dati hanno indicato che FOXO4 soppresso tumorigenesi cellule GC e metastasi in vivo. Figura 4 nella proliferazione vivo e test metastasi. (A1-A3), le cellule SGC-7901 trasfettate con LV-FOXO4 o LV-controllo sono state trapiantate sotto la pelle. Sei settimane più tardi, i tumori era più evidente nei topi impiantati con le cellule 7901-NC rispetto ai gruppi 7901-FOXO4: (6/6 nei 7901-NC gruppi e 3/6 nei gruppi 7901-FOXO4). I tumori sono stati sezionati e misurati. (B1-B3) cellule SGC-7901 trasfettate con LV-FOXO4 o LV-controllo sono stati iniettati nelle vene coda di topi nudi. Dieci settimane dopo, i topi impiantati con 7901-NC cellule mostravano metastasi polmonari ed epatiche, mentre sono state rilevate alcune metastasi nei topi impiantati con le cellule 7901-FOXO4: (per metastasi polmonari, 6/10 nei gruppi 7901-NC e 1/10 in i gruppi 7901-FoxO4, per metastasi epatiche, 3/10 nel 7901-NC gruppi e 0/10 in gruppi 7901-FoxO4. (C) Immagini che mostrano rappresentante ematossilina e eosina dei campioni polmonari e del tessuto del fegato dai diversi gruppi sperimentali * P <.. 0,05 (D) la sopravvivenza globale dei topi nudi in ogni gruppo
meccanismi molecolari della FOXO4 nella metastasi del GC
per esplorare possibili meccanismi per il ruolo di FOXO4 in GC metastasi, abbiamo esaminato l'espressione di molecole metastasi correlate, tra cui e-caderina, vimentina in SGC-7901-FOXO4 e cellule di controllo-NC SGC-7901 con RT-PCR (Figura 5A1-A2). I risultati hanno mostrato che FOXO4 sovraespressione marcatamente represso l'espressione di vimentina, anche se nessuna alterazione evidente è stata osservata per la E-caderina. I risultati di immunofluorescenza confocale inoltre ha prodotto conclusioni simili (Figura 5B1-B2). Figura 5 FOXO4 inibisce EMT nelle cellule GC. (A1-A2) Real-time PCR ha mostrato up-regolata l'espressione di marcatori epiteliali (E-caderina) e down-regolato espressione di marcatori mesenchimali (vimentina) nelle cellule 7901-FOXO4. (B1-B2) Immunofluorescenza ha mostrato l'espressione di marcatori epiteliali (E-caderina) e up-regolato down-regolato espressione di marcatori mesenchimali (vimentina) nelle cellule 7901-FOXO4.
Questi dati indicano che FOXO4 può in parte influenzare cellule GC metastasi regolando processo di EMT, e meccanismi molecolari aggiuntivi sarà studiata nel lavoro futuro.
Discussione
la classe scatola forkhead O (FOXO) famiglia di fattori di trascrizione è evolutivamente conservata e caratterizzato dalla cosiddetta scatola forkhead DNA legame dominio. Nei mammiferi, la famiglia di geni FOXO è costituito da quattro membri: FOXO1, FOXO3A, FOXO4, e FOXO6. Numerosi studi hanno dimostrato che le proteine ​​FOXO svolgono un ruolo importante in una vasta gamma di processi biologici normali, quali la proliferazione cellulare, l'arresto del ciclo cellulare, la risposta allo stress, e apoptosi [10, 13, 14], come pure in malattie come il cancro e diabete mellito [15]. Tuttavia, c'è poco studio ha riportato circa il ruolo di FOXO4 gioca in GC.
Nel presente studio, abbiamo trovato l'espressione FOXO4 in tessuti non tumorali è stato costantemente più forte di quella dei campioni GC e GC hanno mostrato una minore espressione livello di FOXO4 nelle lesioni metastatiche rispetto ai campioni di tumore primario corrispondenti. I livelli di mRNA e FOXO4 espressione proteica sono stati entrambi ridotti in vari tipi di linee cellulari GC rispetto alla normale linea di cellule epiteliali della mucosa gastrica, suggerendo che FOXO4 potrebbe servire come regolatore negativo per GC. Inoltre, elevata espressione di espressione FOXO4 inibito la crescita delle cellule tumorali, invasione e metastasi in vitro e in vivo, indicando che FOXO4 può svolgere un ruolo nella progressione GC e metastasi.
I meccanismi responsabili per l'impatto delle alterazioni FOXO4 sullo sviluppo GC e la progressione rimangono poco chiari. Diversi studi recenti hanno indicato che FOXO regola molti aspetti della biologia del cancro. Ad esempio, FOXO è normalmente trattenuto dalla PI3K /Akt percorso di segnalazione, che impedisce FOXO traslocazione nel nucleo, e FOXO regolare le risposte trascrizionali indipendentemente DNA diretto legame con l'associazione con una varietà di fattori di trascrizione indipendenti [16]. I nostri risultati hanno dimostrato che FOXO4 indotto significativo arresto G1 e la riduzione della fase S nelle cellule GC, che ha indicato che FOXO4 inibito la proliferazione GC può almeno in parte dal risultato di G1 del ciclo cellulare arresto.
Un passo fondamentale nella cascata metastatica è la processo di transizione epiteliale a mesenchimale (EMT) [17, 18]. Durante il processo di EMT, l'espressione di E-caderina è stato spesso down-regolato, mentre che di vimentina, spesso si presenta-regolato [19]. FOXO4 può disciplinare EMT nel cancro gastrico. Per verificare questa ipotesi, abbiamo valutato le espressioni di E-caderina e vimentina nei modelli cellulari di cui sopra. Sebbene nessuna alterazione evidente è stato osservato per E-caderina, una diminuzione drammatica dell'espressione vimentina è stata visualizzata in cellule FOXO4 iperespressione rispetto alle cellule di controllo, come indicato da immunofluorescenza e qRT-PCR. Questi studi suggeriscono fortemente che FOXO4 potrebbe inibire la metastasi del cancro gastrico regolando EMT.
Conclusione
In conclusione, il nostro studio dimostra una funzione critica di FOXO4 nella inibizione della proliferazione GC e metastasi tramite la regolazione del ciclo cellulare G1 arresto e EMT, suggerisce che potrebbe servire come un potenziale target terapeutico per il cancro gastrico
Note
Linna Su, Xiangqiang Liu, Na Chai contribuito in maniera uguale a questo lavoro
Abbreviazioni
FOXO4:..
scatola Forkhead O4
BSA:
bovino albumina sierica
DAB:
Diaminobenzidina

qRT-PCR: Real-time PCR quantitativa
MTT:
3- [4,5-dimethylthiazol-2-il] -2, 5-difenil-tetrazolium bromide
PBS:
fosfato tamponata salina
DMSO:.
Dimetilsolfossido

Dichiarazioni
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation naturale della Cina (concessione numero 81.172.062, 81.270.445). Ringraziamo il Prof. Zengshan Li (Dipartimento di Patologia presso Xijing Hospital) per il suo aiuto in analisi patologica. Ringraziamo anche la signora Tian Zuhong per l'aiuto con gli esperimenti di imaging animale. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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