El foxo4 factor de transcripción es el regulado e inhibe la proliferación tumoral y la metástasis en el cáncer gástrico

El foxo4 factor de transcripción es regulada hacia abajo e inhibe la proliferación tumoral y la metástasis en el cáncer gástrico
Resumen Antecedentes

foxo4, un miembro de la familia de factores de transcripción FOXO, es actualmente el foco de un intenso estudio. Su papel y función en el cáncer gástrico no han sido completamente aclarada. El presente estudio tuvo como objetivo investigar el perfil de expresión de foxo4 en el cáncer gástrico y el efecto de foxo4 sobre el crecimiento celular del cáncer y la metástasis.
Métodos
inmunohistoquímica, Western Blot y QRT-PCR se realizaron para detectar la expresión de foxo4 gástrico células cancerosas y tejidos. Cell ensayos biológicos, la tumorigenicidad subcutánea y vena de la cola de ensayo metastásico en combinación con la construcción de lentivirus se realizaron para detectar el impacto de foxo4 de cáncer gástrico en la proliferación y la metástasis in vitro e in vivo. Confocal y QRT-PCR se llevaron a cabo para explorar los mecanismos.
Resultados
Hemos encontrado que la expresión de foxo4 se redujo significativamente en los tejidos de cáncer más gástricas y en varias líneas celulares de cáncer gástrico humano. Hasta la regulación de foxo4 inhibió el crecimiento y la metástasis de las líneas celulares de cáncer gástrico in vitro y condujo a la atenuación dramática del crecimiento del tumor y el hígado y el pulmón metástasis in vivo, mientras que abajo de la regulación foxo4 con siRNAs específicos promovido el crecimiento y la metástasis de células de cáncer gástrico líneas. Por otra parte, se encontró que hasta la regulación de foxo4 podría inducir la detención de G1 y la reducción significativa de la fase S y la baja regulación de la expresión de vimentina.
Conclusión
Nuestros datos sugieren que la pérdida de expresión foxo4 contribuye al crecimiento del cáncer gástrico y metástasis y puede servir como una posible diana terapéutica para el cáncer gástrico.
Palabras clave
foxo4 cáncer gástrico proliferación Metástasis EMT Antecedentes
Aunque la incidencia de cáncer gástrico (CG) está disminuyendo, sigue siendo el cuarto tipo de cáncer más común y la segunda causa de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. Las moléculas clave implicadas en la proliferación celular y la metástasis en la progresión GC pueden ayudar en el diagnóstico clínico o la predicción de la progresión de esta enfermedad.
El crecimiento tumoral y la metástasis dependen de varios factores, incluyendo factores de transcripción [2-5]. La familia de factores de transcripción FoxO comprende cuatro miembros muy relacionados: FoxO1, FOXO3, foxo4, y FOXO6 [6-8]. En los últimos años, FOXO han demostrado que desempeñan papeles cruciales en una plétora de procesos celulares, incluyendo la proliferación, la apoptosis, la diferenciación, la resistencia al estrés, y las respuestas metabólicas [9], y por lo tanto pueden ser objetivos prometedores para nuevos medicamentos en el campo de la oncología [10, 11].
Nuestros resultados anteriores demostraron que el nivel de expresión de ARNm foxo4 fue drásticamente reducido regulado en los ganglios tejidos de carcinoma colorrectal con ganglios positivos en comparación con los tejidos de los ganglios linfáticos negativos, sugirió que podría funcionar como un regulador negativo de la metástasis de carcinoma colorrectal [12]. Sin embargo, la expresión y función de foxo4 en el cáncer gástrico no se conocen todavía. El objetivo de nuestro trabajo ha sido investigar el posible papel de foxo4 en la carcinogénesis del cáncer gástrico. En este caso, nos informan de que la proliferación de células foxo4 reprimir y metástasis en el cáncer gástrico por la detención del ciclo celular G1 regulación y vimentina.
Métodos Muestras de tejido
Opiniones de muestras de tejidos, todos los pacientes dieron su consentimiento informado para utilizar el exceso patológico Las muestras para fines de investigación. Los protocolos utilizados en este estudio fueron aprobados por Protección de Comité de Sujetos Humanos de la hospital. La utilización de tejidos humanos fue aprobado por la junta de revisión institucional de la Cuarta Universidad Médica Militar y conforme a la Declaración de Helsinki, así como la legislación local. Los pacientes con toma de muestras para el estudio firmaron formularios de consentimiento informado.
Inmunohistoquímica
La tinción inmunohistoquímica se realizó mediante el método de la inmunoperoxidasa avidina-biotina. El anticuerpo primario contra foxo4 (1: 100, ab63254, Abcam) diluido en PBS que contiene 1% (peso /volumen) de albúmina de suero bovino (BSA). Se realizaron controles negativos mediante la sustitución del anticuerpo primario con suero de ratón pre-inmune. Las imágenes se obtuvieron con un microscopio óptico (Olympus BX51, Olympus, Japón) equipado con una cámara digital DP70. El observador se desconocía la identidad de las muestras al anotar inmunorreactividad.
Evaluación de la tinción
Para la evaluación de la tinción celular, las secciones fueron examinadas por dos patólogos independientes sin conocimiento previo de la situación clínica-patológica de las muestras . Las células que se tiñeron de color marrón se consideran positivos. La expresión de foxo4 se evaluó de acuerdo a la proporción de células positivas por espécimen (R) y la intensidad de tinción (I). La proporción de células positivas por muestra se obtuvo como sigue: 0 para la tinción de < 1%, 1 para la tinción de 2% a 25%, 2 para la tinción de 26% a 50%, 3 para la tinción de 51% a 75%, y 4 para la tinción de > 75% de las células examinadas. La intensidad se calificó como sigue: 0, ninguna señal; 1, tinción débil; 2, tinción moderada; y 3, fuerte tinción. Una puntuación total (R × I) de 0 a 12 se calcula y finalmente clasificó como negativo (score: 0-2). O positivo (+, 3-12) Colección de tejidos
Arrays de tejido fueron adquiridos de la empresa Aomei (Aomei C0124H, AM01C09, Aomei Biotecnología Co. Ltd., Xi'an, china) (archivo adicional 1: Tabla S1 y archivo adicional 2: Tabla S2). Para el análisis de transferencia Western, tejidos GC y tejidos adyacentes nontumorous se obtuvieron de ocho pacientes que habían sido sometidos a cirugía en el Departamento de Cirugía General en nuestro hospital. Todos los casos de CG y la mucosa gástrica normal fueron probados clínicamente y patológicamente. Los protocolos utilizados en los estudios fueron aprobados por el Comité de Protección de Sujetos Humanos del Hospital. Los pacientes que han contribuido quirúrgica de tejido fresco para el estudio habían firmado formularios de consentimiento informado.
Extracción de RNA y PCR en tiempo real
ARN total de las células fue extraído por medio de Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), y cDNA fue sintetizado utilizando el kit de reactivos Primer Guión RT (Takara Biotecnología, Dalian, china) según las recomendaciones del fabricante. A Light Cycler Fast Start principal DNA SYBR Green System I (Roche, Basilea, Suiza) se utilizó para la PCR en tiempo real. GAPDH mRNA se utilizó como control interno, y se utilizó la mezcla de reacción sin la plantilla de ADN como control negativo. Todas las muestras se midieron de forma independiente tres veces. El primer secuencias fueron los siguientes: GAPDH: (avance) 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 'y (inverso) 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'; Foxo4: (avance) 5'-CTTTCTGAAGACTGGCAGGAATGTG-3 'y (inverso) 5'-GATCTAGGTCTATGATCGCGGCAG-3'; E-cadherina: (avance) 5'-3 'y GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-(inversa) 5'-AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3'; y vimentina: (avance) 5'-CAGGCAAAGCAGGAGTCCAC -3'and (inverso) 5'-GCAGCTTCAACGGCAAAGTTC -3 '. Todos en tiempo real las reacciones de PCR se realizaron por triplicado. Construcción de oligonucleótidos
y producción lentivirus
Tres pares de oligonucleótidos siRNA dirigidos foxo4 fueron sintetizados por GenePharma Co., Ltd. Las secuencias GAPDH fueron utilizados como control positivo. Una secuencia no relacionada se utilizó como control negativo (proporcionado por GenePharma). Las secuencias fueron las siguientes: foxo4 siRNA oligo-1: 5'-CGCGAUCAUAGACCUAGAUTTAUCUAGGUCUAUGAUCGCGTT-3 '(sentido); Foxo4 siRNA oligo-2: 5'-CAGCUUCAGUCAGCAGUUATTUAACUGCUGACUGAAGCUGTT-3 '(sentido); Foxo4 siRNA oligo-3: 5'-GUGACAUGGAUAACAUCAUTTAUGAUGUUAUCCAUGUCACTT-3 '(sentido); oligo GAPDH siRNA (control positivo): 5'-GUAUGACAACAGCCUCAAGTT-3 '(sentido); y control negativo: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 '. (sentido)
De acuerdo con las instrucciones del fabricante, oligos foxo4 siRNA fueron transfectadas en células utilizando el reactivo de siRNA-Mate ™ (GenePharma Ltd., Shanghai, China). Después se cultivaron durante 2 a 3 días, se extrajeron ARN total y proteínas. Para la transfección estable, un vector lentiviral sobreexpresión (Lenti-foxo4) se construyó (Shanghai GeneChem Co., Ltd., Shanghai, China). El uso de un GV166-puro vector (GeneChem Co., Ltd., Shanghai, China), un vector lentiviral que expresa GFP sólo se haya utilizado (LV-control) como control negativo (CN).
Western blot
Igualdad cantidades de proteínas se separaron usando gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) electroforesis en dodecil de sodio y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad, Hercules, CA). Foxo4 anticuerpo policlonal de conejo (Abcam, 1: 500), CyclinD1 anticuerpo policlonal de conejo (ImmunoWay, 1: 1000), el anticuerpo monoclonal de ratón β-actina (Sigma, 1: 2000), E-cadherina y anticuerpo policlonal de conejo vimentina (Santa Cruz, CA., 1: 1000 anticuerpos) se utilizaron para los experimentos de Western blot ensayo de proliferación de la célula
El 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil-tetrazolio (MTT) ensayo se realizó para evaluar la velocidad de la proliferación celular, y se realizó de acuerdo con procedimientos estándar. Se detectó cada línea celular por triplicado
Migración y ensayo de invasión
ensayos de migración Transwell se realizaron en cámaras de Boyden modificadas (Transwell; Corning Inc. Lowell, MA, USA). a una densidad de 5 × 10 3 células por pocillo. Después de 24 h de incubación a 37 ° C, las células de la superficie inferior de los pocillos se fijaron con paraformaldehído al 4%, se tiñeron con 1% de cristal violeta, y se contaron.
Ensayo de cribado de alto contenido
la motilidad de la célula era encuestados utilizando una matriz de Celómica Scan VTI 1.700 más (Thermo Scientific, EE.UU.). En resumen, se recogieron las células en la fase logarítmica y se sembraron en placas de 96 pocillos (5 x 10 3 células /pocillo). Después del cultivo durante la noche a 37 ° C para la adhesión, el medio de cultivo se reemplazó con medio RPMI1640 libre de suero, y el cultivo se continuó durante 24 h adicionales. Luego, las células se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo y se tiñeron con Hoechst 33342 durante 15 minutos en una incubadora. Posteriormente, las células se lavaron de nuevo dos veces con PBS enfriado en hielo y se expusieron a diferentes tratamientos. motilidad celular se detectó utilizando la matriz de Celómica Scan VTI 1.700 más (Thermo Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante (cada grupo incluyó cinco pozos repetidas).
experimentos de microscopía confocal de microscopía confocal Para
, las células fueron cultivadas en Lab-Tek 24 y la cámara de diapositivas (Thermo Fisher Scientific, EE.UU.). Después del cultivo durante la noche, se fijaron las células, se lavaron, y se permeabilizaron con 0,3% Triton X- 100 en PBS durante 10 min. A continuación, las células se incubaron con anticuerpos primarios contra E-cadherina y vimentina (dilución 1: 300, Abcam) durante la noche a 4 ° C. Las células también se incubaron con IgG anti-conejo conjugado con Cy3 (dilución 1:. 200 (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, EE.UU.) durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad El núcleo de la célula se counterstained utilizando DAPI durante 5 minutos . la fluorescencia se controló y se fotografiaron con un microscopio confocal (Thermo Fisher Scientific, EE.UU.). los estudios en animales
Para la investigación con animales, ratones desnudos de 4 a 6 semanas de edad fueron comprados del Centro Animal de la Academia china de Ciencias (Shanghai, china) y se mantuvieron en cabinas de flujo laminar en condiciones libres de patógenos específicos. Todos los procedimientos para la experimentación con animales se realizaron de acuerdo con las directrices Institucional de Cuidado de animales y el empleo del Experimento Centro Animal de la Cuarta Universidad médica Militar.
tumorigenicidad en ratones desnudos
células en crecimiento logarítmico se cosecharon usando tripsina y se lavó dos veces con PBS. Después, 2 × 10 se inyectaron 6 células en 0,2 ml por vía subcutánea en la región trasera superior derecha de los ratones. Cuatro semanas después de la inoculación, los ratones portadores de tumor se sacrificaron, y el tamaño del tumor se determinó por medición del calibre de la masa tumoral subcutánea. Cada grupo experimental contenía 6 ratones. Se realizaron dos experimentos independientes, y que dieron resultados similares.
Tail vena ensayo metastásico
Aproximadamente 2 × 10 6 células se suspendieron en 0,2 ml de PBS estéril y se inyecta en las venas de la cola de 10 ratones. Los ratones fueron controlados a continuación, para el volumen del tumor y estado general de salud y sus pulmones e hígados se observaron regularmente utilizando imágenes de microscopía.
El análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron con SPSS 17,0 software estadístico (SPSS, Inc., Chicago, Illinois). Las variables con un valor de p inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. χ
2 pruebas se utilizaron para evaluar la significación de las diferencias en la frecuencia de expresión foxo4 entre los tejidos y los tejidos gástricos GC no tumorosas adyacentes. El t-test
(un ANOVA de prueba de una sola vía) se realizó para evaluar la significación de la diferencia entre la proliferación celular, los clones de placas, y los ensayos de migración. curvas de supervivencia global se representaron usando el método de Kaplan-Meier y se evaluaron para determinar la significación estadística usando una prueba de log-rank (la U de Mann-Whitney U
prueba y la prueba de Kruskal-Wallis H fueron adoptadas por otros datos).
Resultados
expresión de foxo4 es el regulado en los tejidos y líneas celulares GC
Para examinar si la expresión foxo4 fue alterada en GC, la expresión y localización subcelular de foxo4 fueron estudiados en un microarray de tejido de 75 muestras apareadas mediante el uso de GC un ensayo inmunohistoquímico. Foxo4 se expresó principalmente en los núcleos de las células epiteliales situados en las glándulas gástricas de los tejidos no tumorosas (Figura 1A1), pero una pequeña cantidad se localizó en el citoplasma. La tinción foxo4 en células epiteliales a partir de muestras de GC era débil. Sin embargo, la tinción foxo4 en los tejidos no tumorosas (NT) fue consistentemente más fuerte que la de las muestras de GC, y no había una diferencia significativa entre los resultados de la tinción de la GC y muestras NT (Figura 1A2) (P < 0,05) .We siguiente medido el nivel foxo4 en un panel independiente de microarrays de tejidos que contiene 40 muestras de metástasis de ganglios linfáticos primarios y GCs correspondientes. En general, los GC mostró un menor nivel de expresión de foxo4 en lesiones metastásicas en comparación con las correspondientes muestras tumorales primarias (Figuras 1A3-A4) .Los niveles de expresión de foxo4 también fueron examinados por Western blot y RT-PCR en GC y tejidos normales adyacentes obtenidos a partir de ocho pacientes (Figura 1B). En siete de los ocho casos, foxo4 se encontró que tenía una expresión reducida en los tejidos cancerosos, en consonancia con los resultados de la inmunohistoquímica analysis.We comparación aún más los niveles relativos de ARNm foxo4 y de expresión de proteínas entre las 6 líneas celulares diferentes GC (BGC-823, SGC7901 , MKN28, AGS, 9811, y MKN45) y la línea de células epiteliales gástricas inmortal GES-1. Una vez más, foxo4 se expresó en un nivel relativamente bajo en todas las líneas celulares 6 GC en comparación con la línea normal de la mucosa del epitelio gástrico inmortal GES-1 células (Figura 1C). Estos resultados sugieren que foxo4 puede jugar un papel en la carcinogénesis de supresión gástrico. Figura 1 foxo4 es significativamente reducido regulado en los tejidos y líneas celulares de GC. análisis (A1) IHC de expresión foxo4 en 75 GC emparejado y los tejidos no tumorales adyacentes. (A2) El análisis estadístico de expresión en los tejidos foxo4 GC y tejidos del estómago no tumorales adyacentes. (A3) FOXO4expression Representante en los tejidos GC primarios y metastásicos detectados por métodos IHC. (A4) El análisis estadístico de expresión entre los tejidos foxo4 GC con y sin metástasis en los ganglios. (B1-B2) PCR en tiempo real y análisis de transferencia Western de la expresión foxo4 en 8 pares de GC y tejidos no tumorales adyacentes. (C1-C2) PCR en tiempo real y análisis de transferencia de Western de la expresión foxo4 en diferentes líneas celulares GC.
Foxo4 inhibe la proliferación de GC in vitro e induce la detención del ciclo celular en la fase G0 /G1
Para investigar el papel de foxo4 en el crecimiento de GC, se han establecido dos líneas celulares estables (denotado SGC7901-foxo4 y SGC7901-NC) después de la infección con el lentivirus LV- foxo4 o LV-NC, respectivamente. Después de la selección de puromicina repetida, RT-PCR y un análisis de transferencia Western confirmó que SGC7901-foxo4 mostró una expresión más alta en comparación con foxo4 SGC7901-NC (Figura 2A1-A2). El ensayo MTT mostró que la regulación de la expresión foxo4 inhibió significativamente la proliferación de células GC (Figura 2A3, P < 0,01) .En cambio, la línea celular BGC823, que tiene relativamente más alta expresión endógena, se transfectó transitoriamente con foxo4 siRNA o el control negativo. Tres pares de oligonucleótidos siRNA dirigidos foxo4 se sintetizaron y se transfectaron en células (BGC823 BGC823-FOXO4si1, BGC823-FOXO4si2, y BGC823-FOXO4si3), y las células transfectadas con siRNA oligo control negativo fueron etiquetados BGC823-SINC. QRT-PCR y Western blot mostraron que siRNA oligo número 1 fue el más eficaz, por lo que, este constructo fue seleccionada para el estudio adicional (Figura 2B1-B2). En consecuencia, las curvas de crecimiento indican que la regulación negativa de la expresión de foxo4 resultó en aumento de la proliferación entre las células GC (Figura 2B3) .También realizó un ensayo de formación de colonias de la placa. Estos resultados revelaron que las células SGC7901-foxo4 producen menor número de colonias de células en comparación con células de control SGC7901-NC (Figura 2C1-C2, P < 0,05). A continuación, se utilizó el análisis FACS para examinar los efectos de foxo4 sobre el ciclo celular. células SGC7901-foxo4 muestran la detención en G1 y la reducción significativa de la fase S (Figura 2D1-D2), lo que indica que la proliferación foxo4 GC inhibido como resultado de la detención del ciclo celular G1. Para reforzar esta observación, se detectó la expresión de CyclinD1 que es un marcador de la fase G1 con transferencia de western, se demostró que CyclinD1had una expresión relativamente más alto en la línea celular 7801-NC de las células 7901-foxo4 (Figura 2E1-E2). Figura 2 Efecto de foxo4 en la regulación de la proliferación celular GC. (A1-A2) Expresión relativa de foxo4 en las células SGC-7901 transfectadas con LV-LV-foxo4 o de control, lo cual fue confirmado por PCR en tiempo real y análisis de Western blot. Los valores representan las medias de tres experimentos separados, y las barras de error representan el SEM (** p < 0,01). (A3) Las tasas de proliferación de las células se midieron usando el ensayo de MTT. Los valores representan las medias de tres experimentos separados, y las barras de error representan el SEM (* P < 0,05). (B1-B2) Expresión relativa de foxo4 en BGC-823 células transfectadas con el inhibidor nucleótido foxo4 oligo o control de nucleótidos oligo, que fue confirmada por PCR en tiempo real y análisis de Western blot. Los valores representan las medias de tres experimentos separados, y las barras de error representan el SEM (** p < 0,01). (B3) Las tasas de proliferación de las células se midieron usando el ensayo de MTT. Los valores representan las medias de tres experimentos independientes y las barras de error representan el SEM (* P < 0,05). formación (C1-C2) Colonia de SGC07901 células transfectadas con LV-foxo4 y LV-control fue llevado a cabo por la siembra de células sobre placas durante 2 semanas, y luego se contó el número de colonias. Los valores representan las medias de tres experimentos separados, y las barras de error representan el SEM (* P < 0,05). (D1-D2) la distribución del ciclo celular de las células SGC-7901 transfectadas con LV-foxo4 o LV-control. El análisis del ciclo celular se realizó 24 h después de la transfección. La distribución del ciclo celular se calcula y se expresa como la media ± desviación estándar de tres experimentos separados. * P < 0.05. (E1-E2) Expresión relativa de CyclinD1 en las células SGC-7901 transfectadas con LV-LV-foxo4 o de control, lo cual fue confirmado Western blot. Los valores representan las medias de tres experimentos separados, y las barras de error representan el SEM (* P < 0,05).
Foxo4 inhibe la migración y la invasión de las células in vitro GC
Para evaluar la influencia de foxo4 en GC migración y la invasión, el próximo evaluó el efecto de la expresión foxo4 en las capacidades invasivas y migratorias de células GC utilizando ensayos in vitro transwell. Los resultados mostraron que la migración y la invasión de SGC-7901-foxo4 células fueron tanto notablemente reducidos en comparación con SGC-7901-NC células de control (Figura 3A1). En contraste, el agotamiento de foxo4 promovió significativamente la migración celular y la invasión en BGC823 células en comparación con las células control (Figura 3A2). Además, el ensayo de alto contenido de cribado mostró la velocidad de la motilidad de las células SGC-7901-foxo4 es significativamente menor que las células SGC-7901-NC, 15/19 puntos de tiempo mostraron claramente la velocidad de la motilidad de las células SGC-7901-foxo4 es inferior a células SGC-7901-NC (Figura 3B). Además, los ensayos de curación de heridas mostraron que las células SGC-7901-foxo4 cerraron las heridas más lentamente que SGC-7901-NC células (Figura 3C) (P < 0,05). En conjunto, estos resultados indicaron que foxo4 significativamente afectada la migración celular y la invasión GC in vitro. Figura 3 Efecto de la foxo4 en la regulación de la metástasis de células GC. (A1-A2) Up-regulación de la expresión en las células foxo4 LV-foxo4 disminuyó SGC-7901 la migración celular y la invasión in vitro, mientras que la inhibición de la expresión foxo4 usando el inhibidor de oligo nucleótidos de foxo4 mejorada BGC-823 la migración celular y la invasión. la capacidad (B) La migración celular se evaluó mediante la realización de un ensayo de alto contenido en células SGC-7901 transfectadas con LV-foxo4 o LV-control. * P < capacidad 0.05 (C) La migración celular se ensayó también mediante la realización de un ensayo de curación de heridas en las células SGC-7901 transfectadas con LV-foxo4 o LV-control. * P < 0.05.
Foxo4 regulación inhibe la tumorigénesis y la metástasis de las células de GC en vivo
Para confirmar aún más los efectos de foxo4 en la tumorigénesis de GC, un ensayo de la formación de tumores se realizó en ratones desnudos. SGC7901-NC y las células SGC7901-foxo4 se inocularon por vía subcutánea en la región superior de la espalda derecho de ratones desnudos en un solo sitio. Cuatro semanas más tarde, los ratones que fueron inoculadas subcutáneamente fueron sacrificados, los tumores transplantados fueron extirpados, y los tamaños de los tumores se evaluaron (Figura 4A1-A3, P < 0,05). Los resultados revelaron una disminución significativa en el tamaño de los xenoinjertos resultantes de foxo4 hasta reguladas cells.To explorar más a fondo el papel de foxo4 en la metástasis tumoral in vivo, se implantó SGC7901-NC y las células SGC7901-foxo4 en ratones desnudos a través de la vena lateral de la cola . bioluminiscente de imágenes Representante (BLI) de los diferentes grupos se muestra en la figura 4B1. El análisis histológico confirmó, además, que la incidencia de cáncer de pulmón y las metástasis de hígado en el grupo SGC7901-foxo4 se redujo significativamente, en comparación con el grupo SGC7901-NC (Figura 4B2, B3). También se redujo el número de nódulos metastásicos de pulmón en el grupo SGC7901-foxo4, en comparación con el grupo SGC7901-NC (datos no mostrados). Hígado y metástasis pulmonar se evidenciaron aún más por hematoxilina y eosina (Figura 4C). Además, el grupo de ratones nude SGC7901-foxo4 demostró un tiempo más largo de supervivencia global en comparación con el grupo SGC7901-NC (Figura 4D). Estos datos indicaron que foxo4 suprime la tumorigénesis de células GC y la metástasis in vivo. La Figura 4 en la proliferación in vivo y el ensayo de metástasis. (A1-A3) las células SGC-7901 transfectadas con LV-foxo4 o LV-de control se transplantaron bajo la piel. Seis semanas más tarde, los tumores se observaron más claramente en ratones implantados con células 7901-NC en comparación con los grupos de 7901-foxo4: (6/6 en los 7901-NC grupos y 3/6 en grupos 7901-foxo4). Los tumores se diseccionaron y se midieron. (B1-B3) células SGC-7901 transfectadas con LV-foxo4 o LV-de control se inyectaron en las venas de la cola de ratones desnudos. Diez semanas después, los ratones implantados con 7901-NC células mostraron metástasis de pulmón e hígado, mientras que se detectaron pocas metástasis en ratones implantados con células 7901-foxo4: (para la metástasis de pulmón, 6/10 en los grupos de 7,901-NC y 1/10 en los grupos 7901-foxo4, para la metástasis de hígado, 3/10 en 7901-NC grupos y 0/10 en grupos 7901-foxo4. (C) imágenes que muestran hematoxilina y eosina representante tinción de muestras de pulmón y tejido hepático de los diferentes grupos experimentales * P <.. 0.05 (D) la supervivencia global de los ratones desnudos en cada grupo
mecanismos moleculares de la foxo4 en la metástasis de GC
a explorar mecanismos potenciales para el papel de foxo4 en la metástasis GC, hemos examinado la expresión de moléculas relacionadas con metástasis, incluyendo la e-cadherina, vimentina en células de control SGC-7901-NC utilizando RT-PCR (Figura 5A1-A2) SGC-7901-foxo4 y. los resultados mostraron que foxo4 sobreexpresión notablemente reprimida la expresión de vimentina, aunque no se observó ninguna alteración evidente de la E-cadherina. Los resultados de inmunofluorescencia confocal también arrojaron conclusiones similares (Figura 5B1-B2). Figura 5 foxo4 inhibe la EMT en las células de GC. (A1-A2) PCR en tiempo real mostró hasta reguladas expresión de marcadores epiteliales (E-cadherina) y la expresión de las reguladas de marcadores mesenquimales (vimentina) en las células 7901-foxo4. (B1-B2) La tinción de inmunofluorescencia mostró la expresión de marcadores epiteliales (E-cadherina) y hasta reguladas las reguladas expresión de marcadores mesenquimales (vimentina) en las células 7901-foxo4.
Estos datos indican que foxo4 puede influir parcialmente celular GC metástasis mediante el control de proceso de la EMT, y los mecanismos moleculares adicionales será estudiada en el trabajo futuro.
Discusión sobre The clase de cuadro de forkhead O (FOXO) la familia de factores de transcripción está conservado evolutivamente y se caracteriza por la caja forkhead llamado ADN dominio de unión. En los mamíferos, la familia de genes FOXO consta de cuatro miembros: FoxO1, FOXO3A, foxo4, y FOXO6. Numerosos estudios han demostrado que las proteínas FOXO juegan un papel importante en una amplia gama de procesos biológicos normales, incluyendo la proliferación celular, la detención del ciclo celular, la respuesta de estrés, y la apoptosis [10, 13, 14], así como en enfermedades tales como el cáncer y diabetes mellitus [15]. Sin embargo, hay poco estudio informó sobre el papel de foxo4 juega en GC.
En el presente estudio, encontramos la expresión foxo4 en tejidos no tumorales fue consistentemente más fuerte que la de las muestras de GC y GC mostró una menor expresión foxo4 nivel de las lesiones metastásicas en comparación con las correspondientes muestras de tumor primario. Los niveles de mRNA foxo4 y de expresión de proteínas se redujeron tanto en diversos tipos de líneas celulares de GC en comparación con la línea normal de las células de la mucosa epitelial gástrica, lo que sugiere que foxo4 podría servir como un regulador negativo para GC. Además, la expresión elevada de expresión foxo4 inhibió el crecimiento de células tumorales, invasión y metástasis in vitro e in vivo, lo que indica que foxo4 puede jugar un papel en la progresión de GC y la metástasis.
Los mecanismos responsables de los efectos de alteraciones en el desarrollo foxo4 GC y la progresión siguen sin estar claros. Varios estudios recientes han indicado que FOXO regula muchos aspectos de la biología del cáncer. Por ejemplo, FOXO está normalmente limitado por la PI3K /Akt vía de señalización, lo que evita la translocación FOXO en el núcleo, y FOXO regular las respuestas transcripcionales independientemente directa de ADN de unión a través de la asociación con una variedad de factores de transcripción no relacionadas [16]. Nuestros resultados mostraron que foxo4 induce la detención de G1 y S significativa reducción en fase en las células de GC, lo que indica que la proliferación foxo4 GC inhibido puede al menos en parte, por el resultado de la detención del ciclo celular G1.
Un paso crítico en la cascada metastásica es la proceso de transición epitelial a mesenquimal (EMT) [17, 18]. Durante el proceso de EMT, la expresión de E-cadherina era a menudo el regulado, mientras que por la vimentina menudo muestra hasta reguladas [19]. Foxo4 puede regular la EMT en el cáncer gástrico. Para probar esta hipótesis, se evaluó la expresión de E-cadherina y vimentina en los modelos celulares anteriores. Aunque no se observó ninguna alteración obvia para E-cadherina, una disminución dramática de la expresión de vimentina se muestra en las células de sobreexpresión foxo4 en comparación con las células de control, como se indica mediante el ensayo de inmunofluorescencia y QRT-PCR. Estos estudios sugieren fuertemente que foxo4 podría inhibir la metástasis del cáncer gástrico mediante la regulación de la EMT.
Conclusión
En conclusión, nuestro estudio demuestra una función crítica de foxo4 en la inhibición de la proliferación de GC y la metástasis a través de la regulación de la detención del ciclo celular G1 y EMT, sugiere que puede servir como una posible diana terapéutica para el cáncer gástrico
Notas
Linna su, Xiangqiang Liu, Na Chai contribuido igualmente a esta labor
abreviaciones
foxo4:..
caja forkhead O4
BSA: albúmina sérica bovina

DAB:
diaminobencidina

QRT-PCR:
-PCR cuantitativa en tiempo real
MTT:
3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2, 5-difenil-tetrazolio
PBS: tampón fosfato salino

DMSO:.
dimetilsulfóxido

Declaraciones
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (número de concesión 81172062, 81270445). Agradecemos al Prof. Zengshan Li (Departamento de Anatomía Patológica del Hospital Xijing) por su ayuda en el análisis patológico. También se agradece a la Sra Zuhong Tian por la ayuda con los experimentos de imagen animal. Los autores describen potenciales conflictos de interés en el material complementario Electrónico
12885_2014_4601_MOESM1_ESM.doc archivo adicional 1:. Tabla S1: La información de la matriz de tejido (adenocarcinoma gástrico humano con los tejidos adyacentes emparejados). Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

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