A transzkripciós faktor FOXO4 le szabályozott és gátolja a tumor proliferációját és metasztázis gyomorrák

A transzkripciós faktor FOXO4 le szabályozott és gátolja a tumor proliferációját és metasztázis gyomorrákban katalógusa Abstract Background katalógusa katalógusa FOXO4, tagja a FOXO család transzkripciós faktorok, jelenleg a hangsúly az intenzív tanulás. Szerepe és működése a gyomorrák még nem teljesen tisztázott. A jelen tanulmány célja az volt, hogy vizsgálja meg a expressziós profilját FOXO4 gyomorrákban és a hatás FOXO4 a rákos sejtek növekedését és metasztázis. Katalógusa Methods katalógusa immunhisztokémia, Western blot és qRT-PCR módszerrel vizsgáltuk a FOXO4 kifejezést gyomorrák sejteket és szöveteket. Cell biológiai vizsgálati eljárások, szubkután tumorképző és a farok vénán metasztatikus assay kombinálva lentivírus építési végeztük, hogy észleli a hatását FOXO4 a gyomorrák proliferáció és metasztázis in vitro és in vivo. Konfokális és QRT-PCR végeztünk, hogy vizsgálja meg a mechanizmusokat.
Eredmények
Azt találtuk, hogy a kifejezés a FOXO4 szignifikánsan csökkent legtöbb gyomorrák szövetek és különböző humán gyomorrák sejtvonalakon. Up-szabályozó FOXO4 gátolta a növekedés és metasztázis gyomorrák sejtvonalak in vitro és vezetett drámai csillapítás a tumor növekedés, és a máj és a tüdő metasztázis in vivo, míg a lefelé szabályozó FOXO4 specifikus siRNS elősegítette a növekedés és metasztázis a gyomorrák sejt vonalak. Továbbá azt találtuk, hogy fel-szabályozó FOXO4 idézhet jelentős G1 és az S fázis csökkentés és down-regulációja a kifejezés a vimentin.
Következtetés
Adataink arra utalnak, hogy a veszteség FOXO4 expresszió hozzájárul a gyomorrák növekedés és metasztázis és azt is szolgálhat a potenciális terápiás célpont gyomorrák. katalógusa Kulcsszavak katalógusa FOXO4 gyomorrák proliferációs metasztázis EMT Háttér katalógusa Bár az előfordulási gyomorrák (GC) csökken, akkor továbbra is a negyedik leggyakoribb daganat és a második vezető oka a rák okozta halál világszerte [1]. A kulcs molekulák részt vesznek a sejtek szaporodását és metasztázis GC progresszió segíthet klinikai diagnosztizálására vagy előrejelzésére progresszióját ez a betegség.
Tumor növekedés és anyagcsere különböző tényezőktől függ, beleértve a transzkripciós faktorokat [2-5]. A FOXO transzkripciós faktorok család négy nagyon rokon tagjai: FOXO1 FOXO3, FOXO4 és FOXO6 [6-8]. Az elmúlt években, FOXO kimutatták, hogy döntő szerepet játszanak a nagyszámú celluláris folyamatok, beleértve a proliferáció, az apoptózis, a differenciálódást, a stressz ellenállás, és metabolikus válaszok [9], és ezért ígéretes célpontjai új gyógyszer az onkológia területén [10, 11].
korábbi eredményei igazolták, hogy a FOXO4 mRNS expressziós szint volt drámaian alulszabályozott nyirokcsomó-pozitív kolorektális karcinóma szövetek képest nyirokcsomó-negatív szövetekben, azt javasolta, hogy működhet, mint egy negatív szabályozója a metasztázis kolorektális karcinóma [12]. Azonban a kifejezés és funkciója FOXO4 gyomorrákban nem voltak ismertek. A Munkánk célja az volt, hogy vizsgálja meg a lehetséges szerepét FOXO4 gyomorrákban kialakulásában. Itt azt jelentette, hogy FOXO4 elnyomására sejtek szaporodását és áttétek gyomorrákban rendelet által G1 sejtciklus-letartóztatása és vimentint. Katalógusa Methods katalógusa szövetmintából
A szövetminták, az összes beteg informált beleegyező használni felesleges kóros példányok kutatási célokra. A jegyzőkönyvek ebben a tanulmányban alkalmazott hagyta jóvá a kórházi Emberi alanyok bizottság. Az emberi szövetek által jóváhagyott intézményi felülvizsgálati tanács negyedik Katonai Orvostudományi Egyetem és megfelelnek a Helsinki Nyilatkozat, valamint a helyi jogszabályokat. Betegek A mintát a tanulmány aláírt informált hozzájárulását formákat.
Immunhisztokémia
immunhisztokémiai festést végeztünk az az avidin-biotin komplex immunperoxidáz módszerrel. Az elsődleges antitest ellen FOXO4 (1: 100, ab63254, ABCAM) PBS-ben, amely 1% (tömeg /térfogat) szarvasmarha-szérumalbumin (BSA). A negatív kontrollok végeztük helyett a primer antitest pre-immun egér szérummal. Kép kaptuk fénymikroszkóp (Olympus BX51 Olympus, Japán) felszerelt DP70 digitális fényképezőgép. A megfigyelő nem ismerte a személyazonosságát a minták gól immunreakciót. Katalógusa értékelése festés katalógusa értékeléséhez a sejtfestési a metszeteket két független patológusok ismerete nélkül a klinika patológiás állapotát a példányok . A sejteket, amelyeket festett barna tekintettük pozitívnak. A kifejezés a FOXO4 szerint értékeltük az arány a pozitív sejt per minta (R) és a festődés intenzitása (I). Az arány a pozitív sejt per minta pontoztuk a következők szerint: 0 festésére < 1%, 1 festésére 2% és 25%, 2 festésére 26% és 50%, 3 festésére 51% és 75%, és a 4. festésére > 75% a sejtek vizsgált. Az intenzitást osztályoztuk a következők szerint: 0, nincs jel; 1, gyenge festést; 2, mérsékelt festés; és a 3., erős festődést. A teljes pontszám (R × I) 0-12 végül számított és osztályozni, mint a negatív (-score: 0-2), illetve pozitív (+, 12/03). Katalógusa Tissue gyűjtemény katalógusa Tissue tömbök vásároltunk a Aomei társaság (Aomei C0124H, AM01C09, Aomei Biotechnology Co. Ltd., Xi'an, Kína) (Kiegészítő fájl 1: Table S1 és további fájl 2. táblázat S2). A Western blot analízis GC szövetek és a szomszédos nontumorous szöveteket szereztünk nyolc beteg átesett műtét a Általános Sebészeti Osztály a mi kórházban. Minden esetben a GC és a normál gyomornyálkahártya klinikai és patológiai bizonyított. A protokollok a vizsgálatok során használt hagyta jóvá a Kórház Emberi alanyok bizottság. A betegek, akik hozzájárultak friss sebészeti szövet a tanulmány aláírta beleegyező formákat.
RNS extrakció és valós idejű PCR
Az összes RNS-t a sejtekből extraháljuk Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), és a cDNS-t szintetizáltunk a Prime Script RT reagens készlettel (Takara Biotechnology, Dalian, Kína), a gyártó ajánlásainak megfelelően. A Light Cycler Fast Start DNA Master SYBR Green I rendszer (Roche, Basel, Svájc) használtunk a real-time PCR-rei. GAPDH mRNS-t használjuk belső kontroll, és a reakcióelegyet nélkül a templát DNS-t használjuk a negatív kontroll. Az összes mintát mértük függetlenül háromszor. A primer szekvenciák a következők voltak: GAPDH: (előre) 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 'és (fordított) 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'; FOXO4: (előre) 5'-CTTTCTGAAGACTGGCAGGAATGTG-3 'és (fordított) 5'-GATCTAGGTCTATGATCGCGGCAG-3'; E-cadherin: (előre) 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3'and (fordított) 5'AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 '; és Vimentin: (előre) 5'-CAGGCAAAGCAGGAGTCCAC -3'and (fordított) 5'-GCAGCTTCAACGGCAAAGTTC -3 '. Minden valós idejű PCR-reakciót hajtottunk végre három párhuzamossal.
Oligonukleotid építési és lentivírus termelés
Három pár siRNS célzó oligonukleotidok FOXO4 szintetizáltuk GenePharma Co., Ltd. A GAPDH szekvenciákat alkalmaztuk pozitív kontrollként. Egy független szekvenciát alkalmaztuk negatív kontrollként (amelyet GenePharma). A szekvenciák a következők voltak: FOXO4 siRNS oligo-1: 5'-CGCGAUCAUAGACCUAGAUTTAUCUAGGUCUAUGAUCGCGTT-3 '(sense); FOXO4 siRNS oligo-2: 5'-CAGCUUCAGUCAGCAGUUATTUAACUGCUGACUGAAGCUGTT-3 '(sense); FOXO4 siRNS oligo-3: 5'-GUGACAUGGAUAACAUCAUTTAUGAUGUUAUCCAUGUCACTT-3 '(sense); GAPDH siRNS oligo (pozitív kontroll): 5'-GUAUGACAACAGCCUCAAGTT-3 '(sense); és negatív kontroll: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 '(ész). katalógusa szerint a gyártó utasításait, FOXO4 siRNS oligonukleotidok sejtekbe transzfektáljuk az siRNS-Mate ™ reagens (GenePharma Ltd., Shanghai, Kína). Miután tenyésztettük 2-3 napig, a teljes RNS-t és fehérjét extraháljuk. Stabil transz, lentivirális túltermelése vektor (Lenti-FOXO4) épült (Shanghai GeneChem Co., Ltd., Shanghai, Kína). Egy GV166-Puro Vector (GeneChem Co., Ltd., Shanghai, Kína), lentivirális vektor, amely expresszált GFP önmagában (LV-kontroll) alkalmaztunk egy negatív kontroll (NC).
Western blot
Egyenlő mennyiségű fehérjéket elválasztottuk nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélen (SDS-PAGE) elektroforézissel, és átvisszük egy nitro-cellulóz-membránra (Bio-Rad, Hercules, CA). FOXO4 nyúl poliklonális antitesttel (ABCAM, 1: 500), CyclinD1 nyúl poliklonális antitesttel (ImmunoWay, 1: 1000), β-aktin egér monoklonális antitestet (Sigma, 1: 2000), E-cadherin és Vimentin nyúl poliklonális antitesttel (Santa Cruz, CA, 1: 1000) antitesteket használtunk a Western-blot kísérletekben.
Cell proliferációs vizsgálati
hogy a 3- [4,5-dimetil-tiazol-2-il] -2,5-difenil-tetrazolium-bromid (MTT) vizsgálatot végeztünk, hogy értékelje a sejtproliferáció sebességétől, és végeztük standard eljárások szerint. Mindegyik sejtvonal volt kimutatható három példányban.
Migrációs és behatolás assay
Transwell migrációs vizsgálatokat végeztünk Módosított Boyden-kamrákat (Transwell; Corning Lowell, MA, USA), amelynek sűrűsége 5 × 10 3 sejt per lyuk. 24 óra eltelte után az inkubálást 37 ° C-on, a sejteket az alsó felülete a kutak fixáltuk 4% paraformaldehiddel, megfestettük 1% kristályibolya, és megszámoltuk.
Nagy tartalom szűrővizsgálatban
sejtmozgás volt megkérdezett egy Cellomics Array Scan VTI 1700 (Thermo Scientific, USA). Röviden, a sejteket a log fázisú begyűjtöttük és szélesztettünk 96 mérőhelyes lemezeken (5 × 10 3 sejt /mérőhely). Miután egy éjszakán át 37 ° C-on tapadás, a tápközeget helyettesítettük szérummentes RPMI 1640 tápközegben, és a tenyésztést folytatjuk további 24 órán át. Ezután a sejteket kétszer mostuk jéghideg PBS-ben és megfestettük Hoechst 33342-on 15 percig egy inkubátorban. Ezt követően, a sejteket ismét kétszer mostuk jéghideg PBS-sel, és ki vannak téve a különböző kezelések. Sejtmozgás alkalmazásával mutattuk Cellomics Array Scan VTI 1700 (Thermo Scientific) alkalmazásával a gyártó protokollja (mindegyik csoportban öt ismételt mérőhely).
Konfokális mikroszkópia
konfokális mikroszkópiával kísérletekhez a sejteket növesztjük Lab-Tek 24 lyukú kamra csúszdák (Thermo Fisher Scientific, USA). Miután egy éjszakán át tenyésztést, a sejteket fixáltuk, mostuk, és permeabilizált 0,3% Triton X-100 PBS-ben 10 percen át. Ezután a sejteket inkubáltuk primer antitestekkel elleni E-kadherin és vimentin (hígítás 1: 300, ABCAM) egy éjszakán át 4 ° C-on. A sejteket inkubáltuk Cy3-konjugált anti-nyúl IgG-t (hígítás 1: 200 (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, USA) 1 órán át szobahőmérsékleten sötétben. A sejtmag-ben ellenfestettük DAPI 5 percig . fluoreszcenciát és fényképezett egy konfokális mikroszkóppal (Thermo Fisher Scientific, USA). katalógusa Állatkísérletek
az állatkísérletek szőrtelen egerek 4-6 hetes korban vásároltunk az Animal Center a kínai Tudományos Akadémia (Sanghaj, Kína), és fenn lamináris áramlás szekrény alatt specifikus kórokozóktól mentes körülmények között. Minden eljárások állatkísérletek szerint végeztük az Institutional Animál Care and Use Committee iránymutatásai kísérlet Animal Center negyedik Katonai Orvostudományi Egyetem.
tumorképző nude egerekben
logaritmikusan növő sejteket tripszin alkalmazásával betakarítottuk, és kétszer mostuk PBS-sel. Ezután 2 × 10 6 sejt 0,2 ml szubkután fecskendeztünk a jobb felső hátsó régió az egerek. Négy héttel a beoltás után, tumort hordozó egereket leöltük, és a mérete a tumor határoztuk tolómércével mérése szubkután tumor tömegét. Minden egyes kísérleti csoport tartalmazott 6 egerekben. Két független kísérletet végeztünk, és hasonló eredményt.
Farokvénába metasztatikus assay
Körülbelül 2 × 10 6 sejtet szuszpendáltunk 0,2 ml steril PBS-ben, és injektálunk a farokvénájába 10 egerekben. Az egereket ezután monitorozni tumortérfogat és az általános egészségi állapot, és azok tüdőt és a májat rendszeresen megfigyelhető segítségével képalkotó mikroszkópia.
Statisztikai analízis
Minden statisztikai analízist végeztünk SPSS 17.0 statisztikai szoftver (SPSS Inc., Chicago, Illinois). Változókat a P-érték kevesebb, mint 0,05 tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. χ katalógusa 2 tesztet alkalmaztunk, hogy értékelje a jelentőségét különbségek FOXO4 kifejezés jelentése között GC szövetek és a szomszédos nontumorous gyomor szöveteket. A T
-próba (egyirányú ANOVA teszt) végeztünk, hogy értékelje a jelentősége a különbség a sejtproliferációt, lemez klónok, és a migráció vizsgálatokban. A teljes túlélési görbéket a Kaplan-Meier-módszerrel, és értékeljük a statisztikai szignifikancia egy log-rank teszt (Mann-Whitney U teszt katalógusa és Kruskal-Wallis H tesztet el más adatok). Katalógusa Eredmények
kifejezése FOXO4 van lefelé szabályozni a GC szövetek és sejtvonalak
megvizsgálja, hogy a FOXO4 expresszióját megváltoztatja a GC, a véleménynyilvánítás és a sejten belüli lokalizációja FOXO4 vizsgáltuk a szöveti microarray 75 párosított GC mintákból immunhisztokémiai vizsgálati eljárásban. FOXO4 elsősorban kifejezve a magok hámsejtek található, a gyomor mirigyek nontumorous szövetekben (1A1), de egy kis összeget a citoplazmában. A FOXO4 festés hámsejtek GC minta gyenge volt. Azonban a FOXO4 festődés nontumorous szövetekben (NT) volt következetesen erősebb, mint hogy a GC-mintákban, és nem volt szignifikáns különbség a festési eredményeket a GC és az NT minta (ábra 1A2) (P < 0,05) .Mi Következő mért a FOXO4 szinten független szöveti microarray panel, amely 40 fő GC és a megfelelő nyirokcsomómetastasis példányok. Összességében, GC mutatott alacsonyabb expressziós szintjének FOXO4 metasztatikus léziók, mint a megfelelő primer tumor minták (ábrák 1A3-A4) .A expressziós szintjét FOXO4 is megvizsgáltak Western blot és RT-PCR GC és a szomszédos normális szövetekben nyert nyolc beteg (1B ábra). A hét a nyolc esetben, FOXO4 azt találták, hogy csökkent expressziót rákos szövetekben, összhangban az eredményeket az immunhisztokémiai analysis.We további képest relatív FOXO4 mRNS és fehérje expressziós szintek között 6 különböző GC sejtvonalak (BGC-823, SGC7901 , MKN28, AGS, 9811, és MKN45), és a halhatatlan gyomornyálkahártya sejtvonal GES-1. Ismét FOXO4 fejeztük viszonylag alacsonyabb szinten mind a 6 GC sejtvonalak, mint a normál halhatatlan gyomornyálkahártya epithelialis GES-1 sejtvonal (1C). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy FOXO4 játszhat elnyomó szerepet gyomor kialakulásában. 1. ábra FoxO4 szignifikánsan down-szabályozott GC szövetekben és sejtvonalakban. (A1) IHC elemzése FOXO4 expresszió 75 páros GC és a szomszédos, nem daganatos szövetekben. (A2) statisztikai elemzése FOXO4 expresszió GC szövetekben és a szomszédos nem-daganatos gyomor szövetekben. (A3) Reprezentatív FOXO4expression primer és metasztatikus GC szövetekben kimutatható IHC módszerekkel. (A4) statisztikai elemzése FOXO4 kifejezés között GC szövetek és anélkül áttét. (B1-B2) Real-time PCR és Western blot analízise FOXO4 expresszió 8 pár GC és a szomszédos nem-daganatos szövetekben. (C1-C2) Real-time PCR és Western blot analízise FOXO4 kifejezés különböző GC sejtvonalak. Katalógusa FOXO4 gátolja GC szaporodását in vitro és sejtciklusleállást a G0 /G1 fázisban katalógusa Vizsgálni szerepe FOXO4 GC növekedés, hoztuk létre két stabil sejtvonalak (jelölésük SGC7901-FoxO4 és SGC7901-NC) végzett fertőzés után a LV- FoxO4 vagy LV-NC lentivírus, ill. Ismételt puromicin szelekció, RT-PCR és Western-blot elemzés megerősítette, hogy a SGC7901-FoxO4 kimutatta magasabb FOXO4 expressziója összehasonlítva SGC7901-NC (ábra 2A1-A2). Az MTT esszé azt mutatta, hogy a fel-regulációja FOXO4 expresszió szignifikánsan gátolta a proliferációt a GC-sejtek (ábra 2A3, a P < 0,01) .A szemben, a BGC823 sejtvonal alkalmazását, mely viszonylag magasabb endogén expresszióját, tranziensen transzfektált FOXO4 siRNS vagy a negatív kontroll. Három pár siRNS oligonukleotid célzó FOXO4 állítottunk elő és transzfektáltuk BGC823 sejtek (BGC823-FOXO4si1, BGC823-FOXO4si2 és BGC823-FOXO4si3), és transzfektált sejtek siRNS oligo negatív kontroll jelöltünk BGC823-sinc. QRT-PCR és Western blot azt mutatja, hogy az siRNS oligo 1-es szám volt a leghatékonyabb, így ez a szerkezet kiválasztott további vizsgálatban (ábra 2B1-B2). Ennek megfelelően a növekedési görbék azt mutatták, hogy le-expresszióját szabályozó FOXO4 eredményezett fokozott proliferáció között GC-sejtek (ábra 2B3) .Mi is végeztünk egy tányér telepképző assay. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy SGC7901-FOXO4 termelt sejtek kevesebb sejt kolóniákat képest SGC7901-NC kontroll sejtek (ábra 2C1-C2, P < 0,05). Következő lépésként használt FACS elemzés hatásainak vizsgálata FOXO4 a sejtciklust. SGC7901-FOXO4 sejteket mutatja jelentős a G1 leállást és az S fázis csökkentés (ábra 2D1-D2), ami azt jelezte, hogy a FOXO4 gátolta GC proliferációját eredményeként G1 sejtciklus-letartóztatását. Megerősíti ezt a megfigyelést, találtunk a kifejezés CyclinD1 amely a marker a G1 fázis western blot, azt mutatta, hogy CyclinD1had viszonylag magasabb expressziót az 7801-NC sejtvonal, mint a 7901-FOXO4 sejtek (ábra 2E1-E2). 2. ábra hatása FOXO4 szabályozására GC sejtburjánzást. (A1-A2) relatív expresszióját FOXO4 a SGC-7901 transzfektált sejtek LV-FOXO4 vagy LV-vezérlő, amely megerősítette real-time PCR és Western blot analízissel. Az értékek olyan eszköz három külön kísérlet, és a hiba sávok a SEM (** P < 0,01). (A3) A proliferációs sebességét a sejtek alkalmazásával mértük az MTT assay. Az értékek olyan eszköz három külön kísérlet, és a hiba sávok a SEM (* P < 0,05). (B1-B2) relatív expresszióját FOXO4 a BGC-823 sejteket transzfektáltunk FOXO4 oligo nukleotid inhibitort vagy oligo nukleotid szabályozás, amely megerősítette real-time PCR és Western blot analízissel. Az értékek olyan eszköz három külön kísérlet, és a hiba sávok a SEM (** P < 0,01). (B3) A proliferációs sebességét a sejtek alkalmazásával mértük az MTT assay. Az értékek olyan eszköz három külön kísérlet és a hiba sávok a SEM (* P < 0,05). (C1-C2) Colony képződését SGC07901 transzfektált sejtek LV-FOXO4 és az LV-Control végeztük vetés sejteket lemezekre 2 hétig, és a telepek számát ezután megszámoltuk. Az értékek olyan eszköz három külön kísérlet, és a hiba sávok a SEM (* P < 0,05). (D1-D2) Sejtciklus eloszlása ​​SGC-7901 transzfektált sejtek LV-FOXO4 vagy LV-ellenőrzés. Sejtciklus analízist végeztünk 24 órával a transzfekció után. A sejtciklus-eloszlást számítjuk és fejezzük ki, mint az átlag ± SD három külön kísérletben. * P < 0.05. (E1-E2) relatív expresszióját CyclinD1 a SGC-7901 transzfektált sejtek LV-FOXO4 vagy LV-kontroll, amelyet megerősített Western blot analízissel. Az értékek olyan eszköz három külön kísérlet, és a hiba sávok a SEM (* P < 0,05).
FOXO4 gátolja a migrációt és invázió GC sejtek in vitro
kiértékelésére a befolyása a FOXO4 GC migrációs és behatolás, mi mellett értékeltük a hatását FOXO4 kifejezés a inváziós és migrációs képességeit GC sejtek in vitro transwell vizsgálatokban. Az eredmények azt mutatták, hogy a migráció és invázió SGC-7901-FOXO4 sejteket egyaránt jelentősen csökkent, összehasonlítva SGC-7901-NC kontroll sejtek (ábra 3A1). Ezzel szemben, a kimerülése FOXO4 jelentősen elősegítette a sejtmigrációt és inváziót BGC823 sejtekben, mint a kontroll sejtek (ábra 3A2). Továbbá a magas tartalom szűrővizsgálatban mutatta a motilitás sebességét SGC-7901-FOXO4 sejtek jelentősen alacsonyabb, mint SGC-7901-NC-sejtek, 15/19 időpontokban világosan mutatta a motilitás sebességét SGC-7901-FOXO4 sejtjeiben alacsonyabb, mint SGC-7901-NC-sejtek (3B). Továbbá, sebgyógyító vizsgálatok azt mutatták, hogy SGC-7901-FOXO4 sejtek zárt sebek lassabban SGC-7901-NC sejtek (3C, ábra) (P < 0,05). Együttesen ezek az eredmények azt mutatták, hogy FOXO4 jelentősen károsodott GC-migráció és invázió in vitro. 3. ábra hatása FOXO4 szabályozásában GC-metasztázis. (A1-A2) up-regulációját FOXO4 expresszió LV-FOXO4 sejtek csökkent SGC-7901 sejt migrációs és behatolás in vitro, míg a gátlása FOXO4 kifejezés használatával az oligo nukleotid inhibitor FOXO4 fokozott BGC-823 sejt migrációt és inváziót. (B) A sejtmigrációt kapacitás értékeltük elvégzésével egy magas tartalom assay SGC-7901 transzfektált sejtek LV-FOXO4 vagy LV-ellenőrzés. * P < 0,05 (C) A sejtmigrációt kapacitás is teszteltük elvégzésével egy sebgyógyító assay SGC-7901 transzfektált sejtek LV-FOXO4 vagy LV-ellenőrzés. * P < 0.05.
FOXO4 up-szabályozás gátolja tumorigenezis és metasztázis a GC-sejtek in vivo
Annak további igazolására, hatásainak FOXO4 a tumorigenezis GC, egy daganatképződés vizsgálatot végeztünk csupasz egerekben. SGC7901-NC és SGC7901-FOXO4 sejteket szubkután oltottuk be a jobb felső hátsó régió nude egerek egyetlen helyszínen. Négy héttel később az egereket, amelyek szubkután oltottuk leöltük, az átültetett tumorokat kimetszettük, és a tumor méretét értékeltük (ábra 4A1-A3, P < 0,05). Az eredmények azt mutatták jelentős csökkenése a méret a xenograftok eredő FOXO4 felülszabályozott cells.To tovább vizsgálja a szerepe a FOXO4 tumor metasztázis in vivo, a beültetett SGC7901-NC és SGC7901-FOXO4 sejtek csupasz egerekbe keresztül az oldalsó farokvénába . Reprezentatív biolumineszcens képalkotás (BLI) a különböző csoportok ábrán látható 4B1. Szövettani elemzés alátámasztotta, hogy az előfordulási gyakorisága a tüdő és a máj metasztázis a SGC7901-FOXO4 csoportban szignifikánsan csökkent, míg az SGC7901-NC-csoport (ábra 4B2, B3). Száma tüdő metasztázisos gócok a SGC7901-FOXO4 csoport is csökkent, összehasonlítva a SGC7901-NC-csoport (az adatokat nem mutatjuk). Máj és a tüdő metasztázis további bizonyítéka hematoxilin-eozin festéssel (4C). Továbbá a SGC7901-FOXO4 csoport nude egerek hosszabb teljes túlélési idő, mint a SGC7901-NC-csoport (ábra 4D). Ezek az adatok azt mutatták, hogy FOXO4 elfojtott GC sejt tumorigenezis és metasztázis in vivo. 4. ábra in vivo proliferáció és metasztázis vizsgálatban. (A1-A3) SGC-7901 transzfektált sejtek LV-FOXO4 vagy LV-kontroll transzplantáltunk a bőr alatt. Hat héttel később, a daganatok voltak egyértelműen látható implantált egerekben 7901-NC sejtek, mint a 7901-FOXO4 csoportok: (6/6 a 7901-NC csoportok és 3/6 a 7901-FOXO4 csoport). A tumorokat kimetszettük és mértük. (B1-B3) SGC-7901 transzfektált sejtek LV-FOXO4 vagy LV-kontroll injektáltunk a farokvénájába csupasz egerekben. Tíz hét múlva az egereket implantáltunk 7901-NC sejtek mutattak a tüdő és a máj áttétek, mivel kevés áttétek mutattunk implantált egerekben 7901-FOXO4 sejteket: (a tüdő metasztázis, 6/10 a 7901-NC csoportok és 1/10 az 7901-FoxO4 csoportok, a máj metasztázis, 10/03 a 7901-NC csoportok és 0/10 az 7901-FoxO4 csoportok. (C) Kép bemutató reprezentatív hematoxilin-eozin festéssel tüdő és a máj szöveteiben mintát a különböző kísérleti csoportok * P < 0,05. (D) teljes túlélés a meztelen egér minden csoportban. katalógusa molekuláris mechanizmusai FOXO4 a metasztázis GC
feltárása lehetséges mechanizmusok szerepére FOXO4 GC metasztázis, kifejeződését vizsgáltuk metasztázis-rokon molekulák, beleértve az E-cadherin, vimentin az SGC-7901-FOXO4, SGC-7901-NC kontroll sejtek felhasználásával RT-PCR (ábra 5A1-A2). az eredmények azt mutatták, hogy a FOXO4 overexpressziója jelentősen elfojtott a kifejezés a vimentin, a bár nem egyértelmű változást figyeltünk meg az E-cadherin. Az immunfluoreszcens konfokális eredményeket is hoztak hasonló következtetésekre (ábra 5B1-B2). 5. ábra FOXO4 gátolja EMT GC sejtekben. (A1-A2) Real-time PCR felbukkant-szabályozott expressziójának epithelialis markerek (E-cadherin) és le-szabályozott expressziójának mesenchymalis markerek (vimentin) A 7901-FOXO4 sejteket. (B1-B2) Immunofluoreszcens festés azt mutatta, up-szabályozott expressziójának epithelialis markerek (E-cadherin) és le-szabályozott expressziójának mesenchymalis markerek (vimentin) A 7901-FOXO4 sejtek.
Ezek az adatok azt jelzik, hogy FOXO4 részlegesen befolyásolhatja a GC-sejt metasztázis szabályozása által EMT folyamat, és további molekuláris mechanizmusok fogják tanulmányozni a további munkához. katalógusa Megbeszélés katalógusa a forkhead box osztály O (FOXO) család transzkripciós faktorok evolúciósan konzervált jellemzi az úgynevezett forkhead box DNS- kötő domént. Az emlősökben a FOXO gén család négy tagja: FOXO1 Foxo3a, FOXO4 és FOXO6. Számos tanulmány kimutatta, hogy a FOXO fehérjék fontos szerepet játszanak a széles körű normális biológiai folyamatok, beleértve a sejtproliferáció, sejtciklus, a stressz válasz, és az apoptózis [10, 13, 14], valamint az olyan betegségek, mint a rák és a diabetes mellitus [15]. Azonban kevés tanulmány beszámolt a szerepe FOXO4 játszik a GC.
A jelen tanulmányban azt találtuk, az FOXO4 kifejezés nem-daganatos szövetek következetesen erősebb, mint hogy a GC-mintákban, és GC mutatott alacsonyabb expressziót szintje FOXO4 metasztatikus léziók, mint a megfelelő primer tumor mintákban. A FOXO4 mRNS és fehérje expressziós szintek egyaránt csökkent a különböző típusú GC sejtvonalak, mint a normál gyomornyálkahártya epiteliális sejtvonal, ami arra utal, hogy a FOXO4 szolgálhat egy negatív szabályozója GC. Továbbá, emelkedett expressziója FOXO4 expresszió gátolta a tumor sejtek növekedését, invázió, és metasztázis in vitro és in vivo, jelezve, hogy FOXO4 játszhat szerepet GC progresszió és a metasztázist.
Felelős mechanizmusok a hatását a FOXO4 elváltozásokra GC fejlesztés és progresszió továbbra sem tisztázott. A közelmúltban számos tanulmány azt mutatta, hogy FOXO szabályozza sok szempontból a rák biológia. Például FOXO általában fékezi a PI3K /Akt jelátviteli útvonal, amely megakadályozza, hogy FOXO transzlokációját a sejtmagba, és FOXO szabályozzák a transzkripciós válasz függetlenül közvetlen DNS-kötő keresztül egyesület a különböző nem rokon transzkripciós faktorok [16]. Eredményeink azt mutatták, hogy FOXO4 indukált jelentős a G1 leállást és az S fázis csökkenése GC sejtekben, ami azt jelezte, hogy a FOXO4 gátolta GC proliferáció legalább részben az eredménye G1 sejtciklus-letartóztatása.
Egyik kritikus lépés a metasztatikus kaszkád a folyamat epithelialis a mesenchymalis tranzíció (EMT) [17, 18]. Az EMT folyamat, a kifejezés az E-cadherin gyakran alulszabályozott, míg melyik vimentin gyakran azt mutatja, up-regulációját [19]. FOXO4 szabályozhatják EMT gyomorrákban. Ezen hipotézis, megvizsgáltuk a kifejezést az E-cadherin és vimentin a cellában modellen. Bár nincs nyilvánvaló változás volt megfigyelhető az E-kadherin, drámai csökkenését vimentin expressziót jelenik FOXO4 overexpresszió sejtek összehasonlítva a kontroll sejtek, amint azt immunfluoreszcens assay és QRT-PCR. Ezek a tanulmányok azt sugallják, hogy FOXO4 gátolhatják gyomorrák metasztázis szabályozása által EMT. Katalógusa Következtetés
Összefoglalva, tanulmány azt bizonyítja, kritikus funkciója FOXO4 gátlását GC proliferáció és metasztázis keresztül a szabályozás G1 sejtciklus-letartóztatását és EMT, azt sugallja, hogy szolgálhat potenciális terápiás célpont gyomorrák. katalógusa megjegyzi katalógusa Linna Su, Xiangqiang Liu, Na Chai hozzájárult egyaránt ezt a munkát. katalógusa rövidítések katalógusa FOXO4:
Forkhead box O4
BSA: katalógusa szarvasmarha szérum albumin
DAB: katalógusa Diaminobenzidine Matton
qRT-PCR: katalógusa valós idejű kvantitatív PCR
MTT: katalógusa 3- [4,5-dimetil-2-il] -2, 5-difenil-tetrazolium-bromid
PBS: katalógusa foszfáttal pufferolt sóoldat
DMSO: katalógusa szulfoxidot. katalógusa
nyilatkozatok katalógusa Köszönetnyilvánítás katalógusa Ezt a munkát támogatott Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (támogatás száma 81172062, 81270445). Köszönetet mondunk Dr. Zengshan Li (Department Patológia Xijing Kórház) nyújtott segítségéért patológiai elemzése. Mi is köszönjük Mrs. Zuhong Tian a segítséget az állatok képalkotó kísérletek. A szerzők nyilvánosságra nem lehetséges érdekellentétek.

• LIM homeodomain transzkripciós faktor Isl1 irányítja normális pylorus fejlődését célzó Gata3
• Genetikai polimorfizmusok a oszteopontin promoter növeli a távolság metasztázis és halál kínai betegek gyomor cancer