FOXO4 le facteur de transcription est régulée à la baisse et inhibe la prolifération tumorale et des métastases dans le cancer gastrique

Le FOXO4 facteur de transcription est régulée à la baisse et inhibe la prolifération tumorale et les métastases dans le cancer gastrique
Résumé de l'arrière-plan
FOXO4, un membre de la famille FOXO de facteurs de transcription, est actuellement l'objet d'études approfondies. Son rôle et la fonction dans le cancer gastrique ont pas été complètement élucidé. La présente étude a pour but d'étudier le profil d'expression de FOXO4 dans le cancer gastrique et l'effet de FOXO4 sur la croissance des cellules cancéreuses et les métastases.
Méthodes
immunohistochimie, Western blot et qRT-PCR ont été réalisées pour détecter l'expression de FOXO4 dans gastrique cellules et des tissus cancéreux. Des dosages biologiques cellulaires, sous-cutanée tumorigène et métastatique veine caudale de dosage en combinaison avec la construction lentivirus ont été réalisées pour détecter l'impact de FOXO4 de cancer gastrique dans la prolifération et les métastases in vitro et in vivo. Confocale et qRT-PCR ont été réalisées pour explorer les mécanismes
. Résultats
Nous avons constaté que l'expression de FOXO4 a diminué de manière significative dans les tissus cancéreux les plus gastriques et dans diverses lignées cellulaires de cancer gastrique humain. Régulant à la hausse FOXO4 a inhibé la croissance et la métastase des lignées cellulaires de cancer gastrique in vitro et a conduit à une atténuation considérable de la croissance tumorale, et le foie et les poumons des métastases in vivo, tandis que la régulation négative FOXO4 avec des ARNsi spécifiques favorisé la croissance et la métastase des cellules de cancer gastrique lignes. En outre, nous avons constaté que jusqu'à régulation FOXO4 pourrait induire importante arrestation de G1 et de réduction de la phase S et la régulation de l'expression de la vimentine.
Conclusion
Nos données suggèrent que la perte d'expression de FOXO4 contribue à la croissance du cancer de l'estomac et les métastases , et il peut servir de cible thérapeutique potentielle pour le cancer gastrique.
Mots-clés
FOXO4 cancer gastrique prolifération Métastase EMT Contexte
Bien que l'incidence du cancer gastrique (GC) est en baisse, il reste le quatrième cancer le plus fréquent et la deuxième principale cause de décès liés au cancer dans le monde [1]. Les molécules clés impliquées dans la prolifération cellulaire et les métastases dans la progression du GC peut faciliter le diagnostic clinique ou la prédiction de la progression de cette maladie.
La croissance tumorale et les métastases dépendent de divers facteurs, notamment des facteurs de transcription [2-5]. La famille des facteurs de transcription FOXO comprend quatre membres très apparentées: FOXO1, FOXO3, FOXO4 et FOXO6 [6-8]. Au cours des dernières années, FOXO ont été montré à jouer un rôle crucial dans une pléthore de processus cellulaires, y compris la prolifération, l'apoptose, la différenciation, la résistance au stress, et les réponses métaboliques [9], et peuvent donc être des cibles prometteuses pour de nouveaux médicaments dans le domaine de l'oncologie [10, 11].
Nos résultats précédents ont montré que le niveau d'expression FOXO4 ARNm était considérablement régulée à la baisse dans les tissus lymphatiques ganglionnaire carcinome colorectal par rapport aux tissus ganglionnaire lymphatiques, a suggéré qu'il peut fonctionner comme un régulateur négatif de la métastase du cancer colorectal [12]. Toutefois, l'expression et la fonction de FOXO4 dans le cancer gastrique ne sont pas encore connus. Le but de notre travail a été d'enquêter sur le rôle possible des FOXO4 dans la carcinogenèse du cancer gastrique. Ici, nous déclarons que la prolifération des cellules FOXO4 de réprimer et de métastases dans le cancer gastrique par l'arrestation et la vimentine cycle cellulaire G1 régulation.
Méthodes
échantillons de tissus
Pour les échantillons de tissus, tous les patients ont donné leur consentement éclairé à utiliser l'excès pathologique spécimens à des fins de recherche. Les protocoles utilisés dans cette étude ont été approuvés par la protection des sujets humains Comité de l'hôpital. L'utilisation de tissus humains a été approuvé par le comité d'examen institutionnel de la quatrième université médicale militaire et conforme à la Déclaration d'Helsinki, ainsi que la législation locale. Les patients qui fournissent des échantillons pour l'étude ont signé des formulaires de consentement éclairé.
Immunohistochimie
coloration immunohistochimique a été réalisée en utilisant la méthode d'immunoperoxydase complexe avidine-biotine. L'anticorps primaire contre FOXO4 (1: 100, ab63254, Abcam) dilué dans du PBS contenant 1% (poids /volume) d'albumine de sérum bovin (BSA). Des témoins négatifs ont été effectués en remplaçant l'anticorps primaire avec du sérum de souris pré-immun. Les images ont été obtenues sous un microscope optique (Olympus BX51, Olympus, Japon) équipé d'un appareil photo numérique DP70. L'observateur a été aveuglé à l'identité des échantillons lors de la notation de l'évaluation de l'immunoréactivité. De coloration
Pour l'évaluation de la coloration des cellules, les sections ont été examinées par deux pathologistes indépendants sans connaissance préalable de l'état clinique-pathologique des spécimens . Les cellules qui ont été colorées brun ont été considérés comme positifs. L'expression de la FOXO4 a été évaluée selon le rapport des cellules positives par échantillon (R) et l'intensité de coloration (I). Le rapport de cellules positives par échantillon a été marqué comme suit: 0 pour la coloration de < 1%, 1 pour la coloration de 2% à 25%, 2 pour la coloration de 26% à 50%, 3 pour la coloration de 51% à 75%, et 4 pour la coloration de > 75% des cellules étudiées. L'intensité a été notée comme suit: 0, aucun signal; 1, faible coloration; 2, coloration modérée; et 3, une forte coloration. Un score total (R × I) de 0 à 12 a finalement été calculé et classé comme négatif (-Score: 0-2). Ou positif (+, 3-12) collection de tissus
tableaux de tissus ont été achetés chez la société Aomei (Aomei C0124H, AM01C09, Aomei Biotechnology Co. Ltd, Xi'an, Chine) (fichiers supplémentaires 1: Tableau S1 et fichiers supplémentaires 2: Tableau S2). Pour l'analyse western blot, tissus GC et les tissus adjacents non tumoral ont été obtenus à partir de huit patients qui avaient subi une chirurgie au Département de chirurgie générale dans notre hôpital. Tous les cas de GC et de la muqueuse gastrique normale ont été cliniquement et histologiquement prouvé. Les protocoles utilisés dans les études ont été approuvées par la protection de l'Hôpital des sujets humains Comité. Les patients qui ont contribué le tissu chirurgical frais pour l'étude avaient signé des formulaires de consentement éclairé.
Extraction de l'ARN et en temps réel l'ARN total à partir des cellules a été extraites en utilisant Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), et l'ADNc de PCR a été synthétisé en utilisant le kit de réactifs Premier Script RT (Takara biotechnologie, Dalian, Chine) selon les recommandations du fabricant. A Light Cycler Fast Start DNA Master SYBR Green System I (Roche, Bâle, Suisse) a été utilisé pour la PCR en temps réel. ARNm de GAPDH a été utilisée comme contrôle interne, et le mélange réactionnel sans l'ADN de matrice a été utilisé comme témoin négatif. Tous les échantillons ont été mesurés indépendamment à trois reprises. Les séquences d'amorces sont les suivantes: GAPDH: (avant) 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 'et (inverse) 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'; FOXO4: (avant) 5'-CTTTCTGAAGACTGGCAGGAATGTG-3 'et (inverse) 5'-GATCTAGGTCTATGATCGCGGCAG-3'; E-cadhérine: (avant) 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3 'et (inverse) 5'AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3'; et vimentine: (avant) 5'-CAGGCAAAGCAGGAGTCCAC -3'and (inverse) 5'-GCAGCTTCAACGGCAAAGTTC -3 '. Toutes les réactions de PCR en temps réel ont été effectuées en triple.
Construction oligonucléotidique et de production de lentivirus Trois paires d'oligonucléotides siRNA ciblant FOXO4 ont été synthétisés par GenePharma Co., Ltd Les séquences de GAPDH ont été utilisées comme témoin positif. Une séquence non apparentée a été utilisé comme témoin négatif (fourni par GenePharma). Les séquences sont les suivantes: ARNsi FOXO4 oligo- 1: 5'-CGCGAUCAUAGACCUAGAUTTAUCUAGGUCUAUGAUCGCGTT-3 '(sens); FOXO4 ARNsi oligo- 2: 5'-CAGCUUCAGUCAGCAGUUATTUAACUGCUGACUGAAGCUGTT-3 '(sens); FOXO4 ARNsi oligo- 3: 5'-GUGACAUGGAUAACAUCAUTTAUGAUGUUAUCCAUGUCACTT-3 '(sens); GAPDH siRNA oligo (contrôle positif): 5'-GUAUGACAACAGCCUCAAGTT-3 '(sens); et contrôle négatif: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 '. (sens)
Selon les fabricants instructions, oligos FOXO4 siARN ont été transfectées dans des cellules en utilisant le réactif siRNA-Mate ™ (GenePharma Ltd., Shanghai, Chine). Après avoir mis en culture pendant 2 à 3 jours, l'ARN total et de protéines ont été extraites. Pour la transfection stable, un vecteur de surexpression lentiviral (Lenti-FOXO4) a été construit (Shanghai GeneChem Co., Ltd, Shanghai, Chine). L'utilisation d'un GV166-puro Vector (GeneChem Co., Ltd, Shanghai, Chine), un vecteur lentiviral qui exprimait la GFP seule (LV-commande) a été utilisé comme témoin négatif (NC).
Western blot
Equal des quantités de protéines ont été séparés en utilisant un gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium électrophorèse (SDS-PAGE) et transférées sur une membrane de nitrocellulose (Bio-Rad, Hercules, CA). FOXO4 anticorps polyclonal de lapin (Abcam, 1: 500), CyclinD1 anticorps polyclonal de lapin (ImmunoWay, 1: 1000), l'anticorps monoclonal de souris β-actine (Sigma, 1: 2000), E-cadhérine et de la vimentine anticorps polyclonal de lapin (Santa Cruz, CA, 1:. 1000) anticorps ont été utilisés pour les expériences de western blot test
de prolifération cellulaire
Le 3- [4,5-diméthylthiazol-2-yl] -2,5-diphényl-tétrazolium (MTT) essai a été réalisé pour évaluer la vitesse de prolifération cellulaire, et a été réalisée selon des procédures standard. Chaque lignée cellulaire a été détectée en triple
Migration et test d'invasion
Transwell tests de migration ont été effectuées dans des chambres de Boyden modifiées (Transwell; Corning Inc. Lowell, MA, USA). À une densité de 5 x 10 3 cellules par puits. Après 24 h d'incubation à 37 ° C, les cellules sur la surface inférieure des puits ont été fixées avec du paraformaldehyde à 4%, colorés avec 1% de cristal violet et dénombrées.
Haute teneur essai de criblage
motilité cellulaire était interrogés à l'aide d'une matrice Cellomics balayage VTI 1700 plus (Thermo Scientific, États-Unis). En bref, les cellules dans la phase log ont été récoltées et étalées dans des plaques à 96 puits (5 x 10 3 cellules /puits). Après une culture pendant une nuit à 37 ° C pour l'adhérence, le milieu de culture a été remplacé par un milieu RPMI 1640 exempt de sérum, et la culture a été continuée pendant un temps supplémentaire de 24 h. Ensuite, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS glacé et colorées avec Hoechst 33342 pendant 15 min dans un incubateur. Ensuite, les cellules ont été à nouveau lavées deux fois avec du PBS glacé et exposés à des traitements différents. Motilité cellulaire a été détectée en utilisant la matrice Cellomics scan VTI 1700 plus (Thermo Scientific) selon le protocole du fabricant (chaque groupe comprenait cinq puits répétées). Expériences
microscopie confocale
Pour confocal microscopie, les cellules ont été cultivées sur Lab-Tek 24 puits chambre diapositives (Thermo Fisher Scientific, États-Unis). Après culture pendant une nuit, les cellules ont été fixées, lavées et perméabilisées avec 0,3% de Triton X-100 dans du PBS pendant 10 min. Ensuite, les cellules ont été incubées avec des anticorps primaires contre la E-cadhérine et de la vimentine (dilution 1: 300, Abcam) pendant une nuit à 4 ° C. Les cellules ont également été incubées avec Cy3 conjugué IgG anti-lapin (dilution 1:. 200 (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, USA) pendant 1 h à température ambiante dans l'obscurité Le noyau de la cellule a été ensuite contre en utilisant DAPI pendant 5 min . fluorescence a été contrôlé et photographié avec un microscope confocal (Thermo Fisher Scientific, États-Unis).
études animales
Pour la recherche animale, des souris nude 4 à 6 semaines d'âge ont été achetés à partir du Centre des animaux de l'Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine) et maintenues dans des hottes à flux laminaire dans des conditions exempts d'agents pathogènes spécifiques. Toutes les procédures pour l'expérimentation animale ont été réalisées conformément aux lignes directrices Institutional animal Care et l'utilisation du Comité de l'expérience animal Center de la quatrième université médicale militaire.
tumorigène dans les cellules en croissance logarithmique des souris nude ont été récoltées en utilisant la trypsine et lavées deux fois avec du PBS. Ensuite, 2 x 10 IO6 cellules dans 0,2 ml ont été injectées par voie sous-cutanée dans la région arrière supérieure droite de la souris. Quatre semaines après l'inoculation, les souris porteuses de tumeur ont été sacrifiés, et la taille de la tumeur a été déterminée par mesure d'épaisseur de la masse de la tumeur sous-cutanée. Chaque groupe expérimental contenait 6 souris. Deux expériences indépendantes ont été réalisées, et ils ont donné des résultats similaires.
Tail veine test métastatique
Environ 2 x 10 6 cellules en suspension dans 0,2 ml de PBS stérile et injecté dans les veines de la queue de 10 souris. Les souris ont ensuite été surveillés pour le volume de la tumeur et la santé globale, et leurs poumons et le foie ont été régulièrement observés en microscopie imagerie.
Analyse statistique
Toutes les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant SPSS 17.0 logiciel statistique (SPSS, Inc., Chicago, Illinois). Les variables avec une valeur de P inférieure à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. χ
2 tests ont été utilisés pour évaluer l'importance des différences de FOXO4 fréquence d'expression entre les tissus du GC et les tissus gastriques adjacents non tumoral. Le t
-test (un test ANOVA à sens unique) a été réalisée pour évaluer l'importance de la différence entre la prolifération cellulaire, les clones de la plaque, et les essais de migration. Résultats des courbes de survie globale ont été tracées selon la méthode de Kaplan-Meier et ont été évalués pour la signification statistique en utilisant un test du log-rank (le test de Mann-Whitney U et Kruskal-Wallis H essai ont été adoptées pour d'autres données). de
expression de FOXO4 est régulée à la baisse dans les tissus du GC et des lignées cellulaires
Pour examiner si l'expression de FOXO4 a été modifié en GC, l'expression et la localisation subcellulaire de FOXO4 ont été étudiés dans un microréseau tissulaire de 75 échantillons GC appariés en utilisant un dosage immunohistochimique. FOXO4 était principalement exprimé dans les noyaux des cellules épithéliales situées dans les glandes gastriques des tissus non tumoral (figure 1A1), mais une petite quantité a été localisée dans le cytoplasme. La coloration de FOXO4 dans les cellules épithéliales des échantillons de GC était faible. Toutefois, la coloration FOXO4 dans les tissus non tumoral (NT) était toujours plus forte que celle des échantillons de GC, et il y avait une différence significative entre les résultats de la coloration de la CPG et les échantillons NT (figure 1A2) (P < 0,05) .Nous suivant mesuré le niveau de FOXO4 dans un panneau de tissu microarray indépendant contenant 40 primaires GCS et correspondants des ganglions lymphatiques échantillons de métastases. Dans l'ensemble, GC a montré un niveau d'expression plus faible de FOXO4 dans les lésions métastatiques par rapport aux échantillons correspondants primaires de tumeurs (figures 1A3-A4) .Les niveaux de FOXO4 d'expression ont également été examinées par western blot et RT-PCR en GC et les tissus normaux adjacents obtenus à partir de huit patients (figure 1B). Dans sept des huit cas, FOXO4 a été constaté que l'expression réduite dans les tissus cancéreux, en accord avec les résultats de l'immunohistochimie analysis.We plus par rapport aux niveaux relatifs FOXO4 ARNm et l'expression des protéines chez les 6 lignées de cellules GC différentes (BGC-823, SGC7901 , MKN28, AGS, 9811 et MKN45) et l'estomac lignée de cellules épithéliales immortel GES-1. Encore une fois, FOXO4 a été exprimé à un niveau relativement plus faible dans toutes les lignées cellulaires 6 GC par rapport à la ligne normale épithéliale immortelle muqueuse gastrique de GES-1 cellule (figure 1C). Ces résultats suggèrent que FOXO4 peut jouer un rôle suppressive dans la carcinogenèse gastrique. Figure 1 FoxO4 est significativement régulée à la baisse dans les tissus du GC et des lignées cellulaires. analyse (A1) IHC d'expression de FOXO4 dans 75 GC appariés et les tissus non tumoraux adjacents. (A2) Analyse statistique de l'expression FOXO4 dans les tissus du GC et des tissus non tumoraux adjacents estomac. (A3) représentant FOXO4expression dans les tissus primaires et métastatiques GC détectés par des méthodes IHC. (A4) Analyse statistique de l'expression FOXO4 entre les tissus du GC avec ou sans métastases ganglionnaires. (B1-B2), la PCR en temps réel et analyse par Western blot de l'expression dans FOXO4 8 paires de CPG et les tissus non tumoraux adjacents. (C1-C2) PCR en temps réel et l'analyse western blot de l'expression de FOXO4 dans différentes lignées cellulaires de GC.
FOXO4 inhibe GC prolifération in vitro et induit un arrêt du cycle cellulaire en phase G0 /G1
Pour étudier le rôle de FOXO4 de la croissance du GC, nous avons établi deux lignées cellulaires stables (notée SGC7901-FoxO4 et SGC7901-NC) après l'infection par le lentivirus LV- FoxO4 ou LV-NC, respectivement. Après une sélection répétée de la puromycine, la RT-PCR et une analyse par transfert Western a confirmé que SGC7901-FoxO4 a montré plus haut l'expression par rapport à FOXO4 SGC7901-NC (figure 2A1-A2). Le test MTT a montré que la régulation de l'expression de FOXO4 a significativement inhibé la prolifération des cellules GC (figure 2A3, P < 0,01) .En revanche, la lignée cellulaire BGC823, qui est l'expression endogène relativement élevée, a été transitoirement transfectée avec FOXO4 ARNsi ou le contrôle négatif. Trois paires d'oligonucléotides siRNA ciblant FOXO4 ont été synthétisés et transfectées dans BGC823 cellules (BGC823-FOXO4si1, BGC823-FOXO4si2 et BGC823-FOXO4si3), et les cellules transfectées avec le siRNA Oligo contrôle négatif ont été marqués BGC823-SINC. qRT-PCR et transfert de Western a montré que l'ARNsi nombre oligonucléotidique 1 a été le plus efficace, de sorte que, cette construction a été choisi pour une étude plus approfondie (figure 2B1-B2). En conséquence, les courbes de croissance ont indiqué que la régulation négative de l'expression de FOXO4 a entraîné une prolifération accrue entre les cellules GC (figure 2B3) .On a également effectué un essai de formation de colonies de la plaque. Ces résultats ont révélé que les cellules SGC7901-FOXO4 produit moins de colonies de cellules par rapport aux cellules de contrôle SGC7901-NC (Figure 2C1-C2, P < 0,05). Ensuite, nous avons utilisé une analyse FACS pour examiner les effets de FOXO4 sur le cycle cellulaire. les cellules SGC7901-FOXO4 affichées significative arrêt G1 et S la réduction de la phase (Figure 2D1-D2), ce qui indique que FOXO4 GC a inhibé la prolifération à la suite d'un arrêt G1 du cycle cellulaire. Pour renforcer cette observation, nous avons détecté l'expression de CyclinD1 qui est un marqueur de la phase G1 avec western blot, il a montré que CyclinD1had une expression relativement plus élevé dans la lignée cellulaire 7801-NC que les cellules 7901-FOXO4 (Figure 2E1-E2). Figure 2: Effet de la régulation FOXO4 sur la prolifération des cellules GC. (A1-A2) Expression relative de FOXO4 dans SGC-7901 cellules transfectées avec LV-FOXO4 ou LV-contrôle, ce qui a été confirmé par PCR en temps réel et l'analyse western blot. Les valeurs représentent les moyennes de trois expériences distinctes et les barres d'erreur représentent la SEM (** p < 0,01). (A3) Les taux de prolifération des cellules ont été mesurées en utilisant le test MTT. Les valeurs représentent les moyennes de trois expériences distinctes et les barres d'erreur représentent la SEM (* p < 0,05). (B1-B2) d'expression relative de FOXO4 dans BGC-823 cellules transfectées avec un inhibiteur nucléotidique FOXO4 oligo ou oligo contrôle nucléotidique, qui a été confirmée par PCR en temps réel et l'analyse western blot. Les valeurs représentent les moyennes de trois expériences distinctes et les barres d'erreur représentent la SEM (** p < 0,01). (B3) Les taux de prolifération des cellules ont été mesurées en utilisant le test MTT. Les valeurs représentent les moyennes de trois expériences distinctes et les barres d'erreur représentent la SEM (* p < 0,05). (C1-C2), la formation de colonies de cellules transfectées avec SGC07901 LV-FOXO4 et LV-contrôle a été réalisée par ensemencement des cellules sur les plaques pendant 2 semaines, et le nombre de colonies a ensuite été compté. Les valeurs représentent les moyennes de trois expériences distinctes et les barres d'erreur représentent la SEM (* p < 0,05). (D1-D2) la distribution du cycle cellulaire de la CGT-7901 cellules transfectées avec LV-FOXO4 ou LV-contrôle. L'analyse du cycle cellulaire a été effectuée 24 heures après la transfection. La distribution du cycle cellulaire a été calculé et exprimé en tant que moyenne ± écart-type de trois expériences distinctes. * P < 0,05. (E1-E2) Expression relative de CyclinD1 dans SGC-7901 cellules transfectées avec LV-FOXO4 ou LV-contrôle, ce qui a été confirmé l'analyse western blot. Les valeurs représentent les moyennes de trois expériences distinctes et les barres d'erreur représentent la SEM (* p < 0,05).
FOXO4 inhibe la migration et l'invasion des cellules in vitro GC
Afin d'évaluer l'influence de FOXO4 CG migration et l'invasion, nous avons ensuite évalué l'effet de l'expression de FOXO4 sur les capacités invasives et migratoires des cellules GC en utilisant tests in vitro transwell. Les résultats ont montré que la migration et l'invasion de la CGT-7901-FOXO4 cellules ont tous deux été notablement réduite par rapport à SGC-7901-NC cellules de contrôle (figure 3A1). En revanche, l'épuisement des FOXO4 promu de manière significative la migration cellulaire et invasion BGC823 cellules par rapport aux cellules témoins (figure 3A2). En outre, le dosage à haut contenu de dépistage a montré la vitesse de la motilité des cellules SGC-7901-FOXO4 est significativement plus faible que les cellules SGC-7901-NC, 15/19 points de temps ont clairement montré la vitesse de la motilité des cellules SGC-7901-FOXO4 est inférieure à cellules SGC-7901-NC (figure 3B). En outre, des essais de cicatrisation montré que les cellules CGT-7901-FOXO4 plaies fermées plus lentement que le SGC-7901-NC cellules (figure 3C), (P < 0,05). Ensemble, ces résultats indiquent que FOXO4 altéré de manière significative la migration des cellules GC et l'invasion in vitro. Figure 3: Effet de FOXO4 dans la régulation de la métastase des cellules GC. (A1-A2) La régulation de l'expression FOXO4 dans les cellules BT-FOXO4 diminué CGT-7901 migration cellulaire et l'invasion in vitro, alors que l'inhibition de l'expression FOXO4 en utilisant l'inhibiteur oligo- nucléotidique de FOXO4 améliorée BGC-823 migration cellulaire et l'invasion. capacité (B) de la migration cellulaire a été évaluée en effectuant un essai de haute teneur en SGC-7901 cellules transfectées avec LV-FOXO4 ou LV-contrôle. * P < capacité 0,05 (C) de la migration cellulaire a également été testé en effectuant un test de cicatrisation dans SGC-7901 cellules transfectées avec LV-FOXO4 ou LV-contrôle. * P < 0,05.
FOXO4 la régulation inhibe la tumorigenèse et la métastase des cellules in vivo GC
Pour confirmer davantage les effets de FOXO4 sur la tumorigenèse du GC, un essai de formation de la tumeur a été réalisée chez des souris nues. SGC7901-NC et les cellules SGC7901-FOXO4 sous-cutanée inoculées dans la région supérieure du dos droit de souris nues sur un seul site. Quatre semaines plus tard, les souris qui ont été inoculées par voie sous- cutanée ont été sacrifiées, les tumeurs transplantées ont été excisés, et les tailles des tumeurs ont été évaluées (figure 4A1-A3, P < 0,05). Les résultats ont révélé une diminution significative de la taille des xénogreffes résultant de FOXO4 régulés à la hausse cells.To explorer davantage le rôle de FOXO4 dans les métastases de la tumeur in vivo, nous avons implanté SGC7901-NC et les cellules SGC7901-FOXO4 dans des souris nues par la veine caudale latérale . l'imagerie bioluminescente représentative (BLI) des différents groupes est représenté sur la figure 4B1. L'analyse histologique a en outre confirmé que l'incidence du cancer du poumon et des métastases du foie dans le groupe SGC7901-FOXO4 était significativement diminué par rapport au groupe SGC7901-NC (figure 4B2, B3). Le nombre de nodules métastatiques pulmonaires dans le groupe SGC7901-FOXO4 a également été réduite, par rapport au groupe SGC7901-NC (données non présentées). Le foie et les métastases pulmonaires ont en outre été mis en évidence par hématoxyline et éosine (figure 4C). En outre, le groupe des souris nues de SGC7901-FOXO4 a démontré plus de temps de survie globale par rapport au groupe SGC7901-NC (Figure 4D). Ces données indiquent que FOXO4 supprimé tumorigenèse des cellules GC et les métastases in vivo. La figure 4 de la prolifération in vivo et le dosage de métastases. (A1-A3) cellules SGC-7901 transfectées avec LV-FOXO4 ou LV-contrôle ont été transplantés sous la peau. Six semaines plus tard, les tumeurs étaient plus clairement observés chez des souris implantées avec des cellules NC-7901, par rapport aux groupes FOXO4-7901: (6/6 dans les groupes 7901-NC et 3/6 dans les groupes FOXO4-7901). Les tumeurs ont été disséquées et mesurées. (B1-B3) des cellules CGT-7901 transfectées avec LV-LV FOXO4 ou de contrôle ont été injectés dans les veines caudales de souris nude. Dix semaines plus tard, les souris implantées avec 7901-NC cellules pulmonaires et hépatiques ont montré des métastases, alors que quelques métastases ont été détectées chez les souris implantées avec des cellules 7901-FOXO4: (pour les métastases du poumon, 6/10 dans les groupes 7901-NC et 1/10 dans les groupes FoxO4-7901, de métastases hépatiques, 3/10 7901-NC dans des groupes et des groupes 0/10 7901-FoxO4. (C) représentant des images montrant l'hématoxyline et à l'éosine d'échantillons pulmonaires et les tissus du foie à partir des différents groupes expérimentaux * P <.. 0,05 (D) de survie globale des souris nude dans chaque groupe
mécanismes moléculaires de FOXO4 dans la métastase du GC
pour explorer les mécanismes potentiels pour le rôle de FOXO4 dans GC métastase, nous avons examiné l'expression des molécules liées à des métastases, y compris E-cadhérine, vimentine dans SGC-7901-FOXO4 et SGC-7901-NC cellules de contrôle en utilisant RT-PCR (Figure 5A1-A2). les résultats ont montré que FOXO4 surexpression nettement réprimé l'expression de la vimentine, même si aucune modification évidente a été observée pour la E-cadhérine. Les résultats immunofluorescence confocale ont également donné des conclusions similaires (Figure 5B1-B2). Figure 5 FOXO4 inhibe EMT dans les cellules du GC. (A1-A2) PCR en temps réel a montré régulés à la hausse l'expression des marqueurs épithéliales (E-cadhérine) et l'expression régulée à la baisse des marqueurs mésenchymateuses (vimentine) dans les cellules 7901-FOXO4. (B1-B2) Immunofluorescence a montré une expression des marqueurs épithéliaux (E-cadhérine) et une régulation positive régulée à la baisse l'expression des marqueurs mésenchymateuses (vimentine) dans des cellules 7901-FOXO4.
Ces données indiquent que FOXO4 peut partiellement influencer la cellule GC métastases en régulant processus de EMT, et les mécanismes moléculaires supplémentaires sera étudiée dans les travaux futurs. de la discussion
la classe de boîte de forkhead O (FOXO) famille de facteurs de transcription est évolutivement conservée et caractérisée par la soi-disant boîte forkhead DNA- domaine de liaison. Chez les mammifères, la famille des gènes de FOXO se compose de quatre membres: FOXO1, FOXO3a, FOXO4 et FOXO6. De nombreuses études ont montré que les protéines FOXO jouent un rôle important dans une large gamme de processus biologiques normaux, y compris la prolifération cellulaire, l'arrêt du cycle cellulaire, la réponse au stress et à l'apoptose [10, 13, 14], ainsi que dans des maladies telles que le cancer et le diabète sucré [15]. Cependant, il y a peu d'étude a rapporté sur le rôle de FOXO4 joue dans GC.
Dans la présente étude, nous avons trouvé l'expression de FOXO4 dans les tissus non tumoraux était toujours plus forte que celle des échantillons de GC et GC a montré une expression plus faible niveau de FOXO4 dans les lésions métastatiques par rapport aux échantillons de tumeurs primaires correspondants. Les niveaux d'ARNm et FOXO4 expression de la protéine ont été réduits dans divers types de lignées cellulaires de GC par rapport à la ligne normale de la muqueuse gastrique des cellules epitheliales, ce qui suggère que FOXO4 peut servir de régulateur négatif pour GC. En outre, une expression élevée de l'expression de FOXO4 a inhibé la croissance des cellules tumorales, l'invasion et les métastases in vitro et in vivo, ce qui indique que FOXO4 peut jouer un rôle dans la progression du GC et les métastases.
Les mécanismes responsables de l'incidence des modifications de FOXO4 sur le développement GC et la progression restent peu claires. Plusieurs études récentes ont indiqué que FOXO régit de nombreux aspects de la biologie du cancer. Par exemple, FOXO est normalement retenu par la /Akt signalisation PI3K, ce qui empêche FOXO translocation dans le noyau et FOXO réguler la transcription des réponses indépendamment de l'ADN de liaison directe par l'intermédiaire d'une association avec une variété de facteurs de transcription non apparentés [16]. Nos résultats ont montré que FOXO4 induite importante arrestation de G1 et S réduction de phase dans les cellules du GC, qui a indiqué que FOXO4 a inhibé la prolifération de GC peut au moins en partie par le résultat de G1 arrêt du cycle cellulaire.
Une étape cruciale dans la cascade métastatique est la processus de transition épithélio mésenchymateuse (EMT) [17, 18]. Pendant le processus d'EMT, l'expression de la E-cadhérine a souvent été régulée à la baisse, tandis que la vimentine montre souvent une régulation [19]. FOXO4 peut réglementer EMT dans le cancer gastrique. Pour tester cette hypothèse, nous avons évalué les expressions de E-cadhérine et vimentine dans les modèles au-dessus des cellules. Même si aucune altération évidente n'a été observée pour la E-cadhérine, une diminution spectaculaire de l'expression de la vimentine dans les cellules a été visualisée FOXO4 surexpression par rapport aux cellules témoins, comme indiqué par immunofluorescence et qRT-PCR. Ces études suggèrent fortement que FOXO4 pourrait inhiber les métastases de cancer gastrique en régulant EMT.
Conclusion
En conclusion, notre étude démontre une fonction critique de FOXO4 dans l'inhibition de la prolifération des GC et des métastases via la régulation de G1 arrêt du cycle cellulaire et EMT, suggère qu'il peut servir de cible thérapeutique potentielle pour le cancer gastrique
Remarques
Linna Su, Xiangqiang Liu, Na Chai a contribué également à ce travail
abréviations
FOXO4:..
box Forkhead O4
BSA:
sérum-albumine bovine
DAB:
diaminobenzidine

qRT-PCR:
temps réel de PCR quantitative
MTT:
3- [4,5-diméthylthiazol-2-yl] -2, 5-diphényl-tétrazolium bromure
PBS: phosphate
solution saline tamponnée
DMSO:.
diméthylsulfoxyde

Déclarations Remerciements
Ce travail a été soutenu par la national science Foundation naturel de Chine (numéro de subvention 81172062, 81270445). Nous remercions Prof. Zengshan Li (Département de pathologie à l'Hôpital Xijing) pour son aide dans l'analyse pathologique. Nous remercions également Mme Zuhong Tian pour l'aide avec des expériences d'imagerie animale. Les auteurs décrivent pas de conflits d'intérêts potentiels
matériel supplémentaire électronique
12885_2014_4601_MOESM1_ESM.doc fichiers supplémentaires 1:. Tableau S1: Information de la matrice tissulaire (adénocarcinome gastrique humaine avec les tissus adjacents appariés). Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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