O FOXO4 fator de transcrição é regulada para baixo e inibe a proliferação de tumores e metástases no cancro gástrico

O FOXO4 fator de transcrição é regulada para baixo e inibe a proliferação de tumores e metástases no cancro gástrico da arte abstracta
Fundo
FOXO4, um membro da família FOXO de fatores de transcrição, é atualmente o foco de intenso estudo. Seu papel e função no câncer gástrico não foram completamente elucidados. O objetivo deste estudo foi investigar o perfil de expressão de FOXO4 no câncer gástrico eo efeito da FOXO4 sobre o crescimento de células de câncer e metástase.
Métodos
imunohistoquímica, Western blot e qRT-PCR foram realizadas para detectar a expressão FOXO4 em gástrico células e tecidos de cancro. Celular ensaios biológicos, a tumorigenicidade e subcutânea veia da cauda ensaio metastático em combinação com a construção lentivírus foram realizados para detectar o impacto das FOXO4 de cancro gástrico em proliferação e metástase in vitro e in vivo. Confocal e qRT-PCR foram realizadas para explorar os mecanismos.

Resultados Encontrámos que a expressão de FOXO4 foi significativamente diminuída em mais tecidos de cancro gástrico e em várias linhas celulares de cancro gástrico humano. Up-regulação FOXO4 inibiu o crescimento e a metástase de linhas celulares de cancro gástrico in vitro e conduziram a atenuação dramática do crescimento do tumor, e no fígado e pulmão metástases in vivo, ao passo que para baixo-regulação FOXO4 com siRNAs específicos promoveu o crescimento e a metástase de células de cancro gástrico linhas. Além disso, descobrimos que up-regulação FOXO4 poderia induzir a apreensão do G1 significativa e redução de fase S e para baixo-regulação da expressão de vimentina.
Conclusão
Nossos dados sugerem que a perda de expressão FOXO4 contribui para o crescimento do câncer gástrico e metástase , e pode servir como um potencial alvo terapêutico para o câncer gástrico.
Palavras-chave
FOXO4 gástrica câncer Proliferação Metástase EMT fundo
Embora a incidência de câncer gástrico (GC) está em declínio, continua a ser o quarto câncer mais comum e segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [1]. As moléculas-chave envolvidas na proliferação celular e na progressão de metástases GC pode auxiliar no diagnóstico clínico ou prever a progressão desta doença.
Crescimento de tumores e metástases dependerá de vários factores, incluindo factores de transcrição [2-5]. A família fatores FOXO transcrição compreende quatro membros altamente relacionados: FOXO1, FOXO3, FOXO4 e FOXO6 [6-8]. Nos últimos anos, FOXO ter sido demonstrado que desempenham papéis cruciais em uma pletora de processos celulares, incluindo a proliferação, apoptose, diferenciação, resistência à tensão, e as respostas metabólicas [9], e pode, portanto, ser alvos promissores para novos medicamentos no campo da oncologia [10, 11].
os resultados anteriores demonstraram que o nível de expressão de ARNm de FOXO4 foi dramaticamente regulada para baixo em tecidos linfáticos de carcinoma colorectal nódulo positivo em comparação com tecidos linfáticos nó-negativo, sugeriu que podem funcionar como um regulador negativo do a metástase de carcinoma colorrectal [12]. No entanto, a expressão ea função dos FOXO4 no cancro gástrico não eram ainda conhecidos. O objetivo do nosso trabalho foi investigar o possível papel da FOXO4 na carcinogênese do câncer gástrico. Aqui, nós relatamos que a proliferação celular FOXO4 reprimir e metástase em câncer gástrico com a detenção do ciclo celular regulação G1 e vimentina.
Métodos
espécimes de tecido Compra de amostras de tecido, todos os pacientes forneceram consentimento informado para usar o excesso patológico amostras para fins de pesquisa. Os protocolos utilizados neste estudo foram aprovados pela Protecção do hospital de Seres Humanos Comissão. O uso de tecidos humanos foi aprovado pelo conselho de revisão institucional da Quarta Universidade Médica Militar e conformados com a Declaração de Helsínquia, bem como a legislação local. Os pacientes que fornecem amostras para o estudo assinaram o termo de consentimento informado.
Imunohistoquímica
coloração imuno-histoquímica foi realizada utilizando o método de imunoperoxidase complexo avidina-biotina. O anticorpo primário contra FOXO4 (1: 100, ab63254, Abcam) diluído em PBS contendo 1% (peso /vol) de albumina de soro bovino (BSA). Os controlos negativos foram realizados substituindo o anticorpo primário com soro de murganho pré-imune. As imagens foram obtidas em microscópio de luz (Olympus BX51, Olympus, Japão) equipado com uma câmera digital DP70. O observador cego para a identidade das amostras quando conseguir imunorreactividade.
Avaliação da coloração
Para avaliação da coloração celular, os cortes foram examinados por dois patologistas independentes sem conhecimento prévio da condição clínica-patológica dos espécimes . As células que foram coradas Brown foram considerados positivos. A expressão de FOXO4 foi avaliada de acordo com a proporção de células positivas por espécime (R) e a intensidade da coloração (I). A proporção de células positivas por espécime foi pontuado como se segue: 0 para a coloração de < 1%, 1 para a coloração de 2% a 25%, 2 para a coloração de 26% a 50%, 3 para a coloração de 51% a 75%, e 4 para a coloração de > 75% das células examinadas. A intensidade foi classificada como se segue: 0, sem sinais; 1, coloração fraca; 2, coloração moderada; e 3, de coloração forte. A pontuação total (R × I) de 0 a 12 foi finalmente calculada e classificado como negativo (-Score: 0-2). Ou positivo (+, 3-12) coleta de tecido
matrizes de tecido foram adquiridos a empresa Aomei (Aomei C0124H, AM01C09, Aomei Biotecnologia Co. Ltd., Xi'an, China) (arquivo adicionais 1: Tabela S1 e arquivo adicionais 2: Tabela S2). Para a análise western blot, tecidos GC e tecidos não tumorais adjacentes foram obtidas de oito pacientes que tinham sido submetidos a cirurgia no Departamento de Cirurgia Geral em nosso hospital. Todos os casos de GC e mucosa gástrica normal foram clinicamente e patologicamente comprovado. Os protocolos utilizados nos estudos foram aprovados pela protecção dos seres humanos Comitê do Hospital. Os pacientes que contribuíram tecido cirúrgico fresco para o estudo assinaram formulários de consentimento informado.
Extração de RNA e PCR em tempo real
RNA total das células foi extraído utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), e cDNA foi sintetizado usando o kit de reagentes Prime Script RT (Takara Biotecnologia, Dalian, China) de acordo com as recomendações do fabricante. Uma luz Cycler Fast Start DNA mestre SYBR Green I Sistema (Roche, Basileia, Suíça) foi utilizado para a PCR em tempo real. GAPDH mRNA foi usado como controlo interno, e a mistura de reacção sem o ADN molde foi utilizado como controlo negativo. Todas as amostras foram medidas, independentemente, três vezes. As sequências de iniciador foram como se segue: GAPDH: (directo) 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 'e (inverso) 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'; FOXO4: (directo) 5'-CTTTCTGAAGACTGGCAGGAATGTG-3 'e (inverso) 5'-GATCTAGGTCTATGATCGCGGCAG-3'; E-caderina: (avançar) 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3'and (reverso) 5'AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 '; e Vimentin: (avançar) 5'-CAGGCAAAGCAGGAGTCCAC -3'and (reverso) 5'-GCAGCTTCAACGGCAAAGTTC -3 '. Todas as reacções de PCR em tempo real foram efectuadas em triplicado. O oligonucleótido de construção e de produção
lentivírus
três pares de oligonucleótidos siRNA segmentação FOXO4 foram sintetizados por GenePharma Co., Ltd. As sequências GAPDH foram utilizados como um controlo positivo. Uma sequência não relacionada foi utilizado como um controlo negativo (fornecida por GenePharma). As sequências foram as seguintes: FOXO4 siARN oligo-1: 5'-CGCGAUCAUAGACCUAGAUTTAUCUAGGUCUAUGAUCGCGTT-3 '(com sentido); FOXO4 siARN oligo-2: 5'-CAGCUUCAGUCAGCAGUUATTUAACUGCUGACUGAAGCUGTT-3 '(com sentido); FOXO4 siARN oligo-3: 5'-GUGACAUGGAUAACAUCAUTTAUGAUGUUAUCCAUGUCACTT-3 '(com sentido); GAPDH siRNA oligo (controlo positivo): 5'-GUAUGACAACAGCCUCAAGTT-3 '(com sentido); e controle negativo: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 '. (sentido)
De acordo com os fabricantes' instruções, oligos FOXO4 siRNA foram transfectados em células usando o reagente siRNA-Mate ™ (GenePharma Ltd., Shanghai, China). Depois de cultivadas durante 2 a 3 dias, o ARN total e as proteínas foram extraídas. Para a transfecção estável, um vector de sobre-expressão de lentivírus (Lenti-FOXO4) foi construído (Xangai GeneChem Co., Ltd., Shanghai, China). Usando um GV166-Puro Vector (GeneChem Co., Ltd., Shanghai, China), um vector lentiviral que expressaram a GFP sozinho (LV-controlo) foi utilizado como um controlo negativo (CN).
Western blot
Igual quantidades de proteínas foram separados usando gel de poliacrilamida-sulfato (SDS-PAGE) de electroforese de dodecilo de sódio e transferida para uma membrana de nitrocelulose (Bio-Rad, Hercules, CA). anticorpo policlonal de coelho FOXO4 (Abcam, 1: 500), anticorpo policlonal de coelho CyclinD1 (ImmunoWay, 1: 1000), anticorpo monoclonal de ratinho β-actina (Sigma, 1: 2000), E-caderina e anticorpo policlonal de coelho de vimentina (Santa Cruz, CA, 1:. foram utilizados 1000) os anticorpos para as experiências de western blot
proliferação celular in the 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil-tetrazólio (MTT) ensaio foi realizado para avaliar a velocidade de proliferação de células, e foi realizada de acordo com procedimentos padrão. Cada linha de células foi detectada em triplicado
Migração e ensaio de invasão
ensaios de migração Transwell foram realizados em câmaras de Boyden modificada (Transwell; Corning Inc. Lowell, MA, EUA). A uma densidade de 5 x 10 3 células por cavidade. Após 24 h de incubação a 37 ° C, as células na superfície inferior dos poços foram fixadas com paraformaldeído a 4%, coradas com 1% de violeta de cristal e contadas.
Ensaio de rastreio de alto conteúdo
motilidade celular foi pesquisados ​​utilizando uma matriz Cellomics digitalização VTI 1700 mais (Thermo Scientific, EUA). Em resumo, as células em fase log foram colhidas e plaqueadas em placas de 96 poços (5 x 10 3 células /cavidade). Após cultura durante a noite a 37 ° C durante a adesão, o meio de cultura foi substituído com meio RPMI 1640 isento de soro, e a cultura foi continuada durante um adicional de 24 h. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS gelado e coradas com Hoechst 33342 durante 15 min numa incubadora. Subsequentemente, as células foram novamente lavadas duas vezes com PBS gelado e expostos a diferentes tratamentos. motilidade celular foi detectada usando a matriz de digitalização Cellomics VTI 1700 adição (Thermo Scientific) de acordo com o protocolo do fabricante (cada grupo incluiu cinco poços repetida). experimentos
Microscopia Confocal Para a microscopia confocal
, as células foram cultivadas no Lab-Tek lâminas de câmaras de 24 alvéolos (Thermo Fisher Scientific, EUA). Após cultura durante a noite, as células foram fixadas, lavadas e permeabilizadas com 0,3% de Triton X-100 em PBS durante 10 min. Em seguida, as células foram incubadas com anticorpos primários contra a E-caderina e vimentina (diluição 1: 300, Abcam) durante a noite a 4 ° C. As células foram também incubadas com Cy3-conjugado anti-IgG de coelho (diluição 1:. 200 (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, EUA) durante 1 h à temperatura ambiente no escuro O núcleo da célula foi contrastadas com DAPI durante 5 min . fluorescência foi monitorizada e fotografada com um microscópio confocal (Thermo Fisher Scientific, EUA). os estudos em animais
Para a pesquisa animal, ratos pelados 4 a 6 semanas de idade foram adquiridos a partir do Centro animal da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China) e mantidos em armários de fluxo laminar sob condições específicas isentos de agentes patogénicos. Todos os procedimentos para a experimentação animal foram realizados de acordo com as diretrizes animal Care Institucional e Comitê de Uso do Experimento Centro animal da Quarta Universidade médica Militar.
tumorigenicidade em ratinhos nus
células crescimento logarítmico foram colhidas utilizando tripsina e lavadas duas vezes com PBS. em seguida, 2 × 10 6 células em 0,2 mL foram injectadas por via subcutânea na região dorsal superior direito dos ratinhos. Quatro semanas após a inoculação, os ratinhos portadores de tumor foram sacrificados, e o tamanho do tumor foi determinado por medição calibre da massa do tumor subcutâneo. Cada grupo experimental continha 6 ratinhos. Duas experiências independentes foram realizados, e eles produziram resultados semelhantes.
Veia da cauda ensaio metastático
Aproximadamente 2 × 10 6 células foram suspensas em 0,2 ml de PBS estéril e injectado nas veias da cauda de 10 ratinhos. Os ratos foram então monitorados para o volume do tumor e saúde em geral, e os seus pulmões e fígados foram regularmente observados por microscopia de imagem.
Análise estatística
Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS 17.0 software estatístico (SPSS, Inc., Chicago, Illinois). As variáveis ​​com um valor P inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. χ
foram usados ​​2 testes para avaliar a significância das diferenças na frequência de expressão FOXO4 entre tecidos GC e tecidos gástricos não tumorais adjacentes. O t
-test (a one-way ANOVA) foi realizada para avaliar a significância da diferença entre a proliferação celular, clones de placas, e os ensaios de migração. As curvas de sobrevida global foram plotados utilizando o método de Kaplan-Meier e foram avaliadas para significância estatística usando um teste de log-rank (foram adotadas de Mann-Whitney U
de teste e teste de Kruskal-Wallis H para outros dados).
Resultados
expressão da FOXO4 é regulada para baixo em tecidos GC e linhas celulares
Para examinar se a expressão FOXO4 foi alterada em GC, a expressão e localização subcelular de FOXO4 foram estudados em um tissue microarray de 75 amostras de GC emparelhadas usando um ensaio imuno-histoquímico. FOXO4 foi expresso principalmente no núcleo das células epiteliais localizadas nas glândulas gástricas de tecidos não tumorais (Figura 1A1), mas uma pequena quantidade estava localizada no citoplasma. A coloração FOXO4 em células epiteliais de amostras GC era fraco. No entanto, a coloração FOXO4 nos tecidos não tumorais (NT) foi consistentemente mais forte do que as amostras de GC, e houve uma diferença significativa entre os resultados de coloração da GC e amostras NT (Figura 1A2) (P < 0,05) .Nós próxima mediram o nível FOXO4 em um painel independente de tissue microarray contendo 40 exemplares metástases em linfonodos primários GCs e correspondentes. Em geral, os GC mostrou um nível inferior de expressão FOXO4 em lesões metastáticas em comparação com as correspondentes amostras de tumores primários (Figuras 1A3-A4) .Os níveis de expressão FOXO4 também foram examinados por Western blot e RT-PCR em GC e tecidos normais adjacentes obtidos a partir de oito doentes (Figura 1B). Em sete dos oito casos, FOXO4 foi encontrada para ter expressão reduzida em tecidos cancerosos, consistente com os resultados a partir da imuno-histoquímica analysis.We adicional comparou os relativos níveis de mRNA e da expressão da proteína FOXO4 entre 6 linhas de células de GC diferentes (BGC-823, SGC7901 , MKN28, AGS, 9811, e MKN45) e a linha celular epitelial gástrica imortal GES-1. Mais uma vez, FOXO4 foi expresso a um nível relativamente mais baixo em todas as linhas celulares GC 6 em comparação com a linha normal da mucosa epitelial gástrica imortal GES-1 celular (Figura 1C). Estes resultados sugerem que FOXO4 pode desempenhar um papel supressivo na carcinogénese gástrica. Figura 1 FoxO4 é significativamente regulada para baixo em tecidos GC e linhas celulares. Análise (A1) IHC de expressão FOXO4 em 75 GC emparelhado e tecidos não tumorais adjacentes. (A2) A análise estatística de expressão FOXO4 em tecidos GC e tecidos do estômago não-tumorais adjacentes. (A3) FOXO4expression Representante em tecidos primários e metastáticos GC detectados por métodos de IHC. (A4) A análise estatística da expressão FOXO4 entre tecidos GC com e sem metástase. (B1-B2) PCR em tempo real e análise por Western blot da expressão FOXO4 em 8 pares de GC e tecidos não tumorais adjacentes. (C1-C2) PCR em tempo real e análise de transferência de western da expressão FOXO4 em diferentes linhas celulares de GC.
FOXO4 inibe a proliferação in vitro de GC e induz a paragem do ciclo celular na fase G0 /G1
Para investigar o papel de FOXO4 no crescimento GC, estabelecemos duas linhas de células estáveis ​​(denotado SGC7901-FoxO4 e SGC7901-NC) após a infecção com o lentivírus LV- FoxO4 ou LV-NC, respectivamente. Após selecção puromicina repetido, RT-PCR e uma análise de Western blot confirmou que SGC7901-FoxO4 mostraram maior expressão FOXO4 comparação com SGC7901-NC (Figura 2A1-A2). O ensaio de MTT mostraram que a sobre-regulação da expressão FOXO4 inibiu significativamente a proliferação de células de GC (Figura 2A3, P < 0,01) .Em contrapartida, a linha celular BGC823, que tem relativamente maior expressão endógena, foi transfectado transientemente com FOXO4 siRNA ou o controlo negativo. Três pares de oligonucleótidos siRNA segmentação FOXO4 foram sintetizados e transfectado para células BGC823 (BGC823-FOXO4si1, BGC823-FOXO4si2, e BGC823-FOXO4si3), e as células transfectadas com ARNsi oligo de controlo negativo foram marcadas BGC823-SINC. qRT-PCR e Western blot mostrou que siRNA número de oligo 1 foi o mais eficaz, por isso, esta construção foi seleccionado para posterior estudo (Figura 2B1-B2). Por conseguinte, as curvas de crescimento indicaram que estabelece-regulação da expressão de FOXO4 resultou num aumento da proliferação de células entre GC (Figura 2B3) .também realizado um ensaio de formação de colónias da placa. Estes resultados revelaram que as células SGC7901-FOXO4 produziu menos colónias de células em comparação com células de controlo SGC7901-NC (Figura 2C1-C2, P < 0,05). Em seguida, utilizamos a análise FACS para examinar os efeitos de FOXO4 no ciclo celular. células SGC7901-FOXO4 exibida a paragem em G1 e a redução significativa da fase S (Figura 2D1-D2), o que indica que a proliferação FOXO4 GC inibido como o resultado de paragem do ciclo celular G1. Para reforçar esta observação, foi detectada a expressão de CyclinD1 que é um marcador da fase G1 com western blot, que demonstrou que CyclinD1had uma expressão relativamente mais elevada na linha celular de 7801-NC do que as células 7901-FOXO4 (Figura 2E1-E2). Figura 2 Efeito de FOXO4 na regulação da proliferação de células de GC. (A1-A2) A expressão relativa de FOXO4 em SGC-7901 células transfectadas com VE-FOXO4 ou LV-controlo, que foi confirmada por PCR em tempo real e análise de Western blot. Os valores representam as médias de três experiências separadas, e as barras de erro representam o SEM (** P < 0,01). (A3) As taxas de proliferação de células foram medidos utilizando o ensaio de MTT. Os valores representam as médias de três experiências separadas, e as barras de erro representam o SEM (* P < 0,05). (B1-B2) A expressão relativa de células em FOXO4 BGC-823 transfectadas com o inibidor de nucleótidos FOXO4 oligo nucleótido oligo ou controlo, que foi confirmada por PCR em tempo real e análise de Western blot. Os valores representam as médias de três experiências separadas, e as barras de erro representam o SEM (** P < 0,01). (B3) As taxas de proliferação de células foram medidos utilizando o ensaio de MTT. Os valores representam as médias de três experiências independentes e as barras de erro representam o SEM (* P < 0,05). formação (C1-C2) Colónia de SGC07901 células transfectadas com VE-FOXO4 e LV-controlo foi levado a cabo por inoculação de células em placas, durante 2 semanas, e o número de colónias foi então contado. Os valores representam as médias de três experiências separadas, e as barras de erro representam o SEM (* P < 0,05). (D1-D2) distribuição do ciclo celular da SGC-7901 transfectadas com LV-FOXO4 ou LV-controle. análise do ciclo celular foi realizada 24 horas após a transfecção. A distribuição do ciclo celular foi calculada e expressa como a média ± DP de três experiências separadas. * P < 0,05. (E1-E2) A expressão relativa de CyclinD1 em SGC-7901 células transfectadas com VE-FOXO4 ou LV-controlo, que foi confirmado análise Western Blot. Os valores representam as médias de três experiências separadas, e as barras de erro representam o SEM (* P < 0,05).
FOXO4 inibe a migração e a invasão de células in vitro GC
Para avaliar a influência da FOXO4 em CG migração e invasão, nós próxima avaliou o efeito de expressão FOXO4 nas capacidades invasivas e migratórias de células GC utilizando ensaios in vitro transpoço. Os resultados mostraram que a migração e a invasão de SGC-7901-FOXO4 células foram ambos notavelmente reduzida, em comparação com a SGC-7901-NC células de controlo (Figura 3A1). Em contraste, a depleção de FOXO4 promoveu significativamente a migração celular e invasão em BGC823 células em comparação com células de controlo (Figura 3A2). Além disso, o ensaio de alta teor de triagem mostrou a velocidade motilidade das células SGC-7901-FOXO4 é significativamente menor do que as células SGC-7901-NC, 15/19 pontos no tempo mostrou claramente a velocidade motilidade das células SGC-7901-FOXO4 é inferior células SGC-7901-NC (Figura 3B). Além disso, ensaios para cicatrização de feridas mostraram que as células SGC-7901-FOXO4 fechada feridas mais lentamente do que a SGC-7901-NC células (Figura 3C) (P < 0,05). Em conjunto, estes resultados indicaram que FOXO4 prejudicada significativamente a migração celular e invasão GC in vitro. Figura 3 Efeito de FOXO4 na regulação metástase de células de GC. (A1-A2) Up-regulação da expressão FOXO4 em células BT-FOXO4 diminuiu SGC-7901 migração celular e invasão in vitro, ao passo que a inibição da expressão FOXO4 utilizando o inibidor de oligo nucleótido de FOXO4 reforçada migração celular BGC-823 e invasão. capacidade (B) A migração celular foi avaliado através da realização de um ensaio de elevado teor em SGC-7901 células transfectadas com VE-FOXO4 ou LV-controlo. * P < 0,05 capacidade (C) A migração celular foi também testado através da realização de um ensaio de cicatrização de feridas em SGC-7901 células transfectadas com VE-FOXO4 ou LV-controlo. * P < 0,05.
FOXO4 sobre-regulação inibe a tumorigénese e metástase de células in vivo GC
Para confirmar ainda mais os efeitos de FOXO4 na tumorigénese de GC, um ensaio de formação de tumor foi realizada em ratinhos nus. células SGC7901-FOXO4 SGC7901-NC e foram inoculadas por via subcutânea na região superior das costas direito de ratinhos nus em um único local. Quatro semanas mais tarde, os ratinhos que foram inoculados por via subcutânea, foram sacrificados, os tumores transplantados foram excisadas, e os tamanhos dos tumores foram avaliadas (Figura 4A1-A3, P < 0,05). Os resultados revelaram uma diminuição significativa nos tamanhos de xenoenxertos resultantes da sobre-regulada FOXO4 cells.To explorar ainda mais o papel da FOXO4 na metástase do tumor in vivo, implantou-SGC7901 NC e células SGC7901-FOXO4 em ratinhos nus através da veia lateral da cauda . imagiologia bioluminescente representativas (BLI) dos diferentes grupos está apresentada na Figura 4B1. A análise histológica confirmou ainda que a incidência de metástases do pulmão e do fígado no grupo SGC7901-FOXO4 foi significativamente reduzida, em comparação com o grupo SGC7901-NC (Figura 4B2, B3). O número de nódulos metastáticos do pulmão no grupo SGC7901-FOXO4 também foi reduzida, em comparação com o grupo SGC7901-NC (dados não mostrados). Do fígado e metástases do pulmão foram ainda evidenciado pela hematoxilina e eosina (Figura 4C). Além disso, o grupo de ratinhos nus SGC7901-FOXO4 demonstrado mais tempo global de sobrevivência em comparação com o grupo SGC7901-NC (Figura 4D). Estes dados indicaram que FOXO4 suprimida tumorigênese celular GC e metástase in vivo. A Figura 4 na proliferação in vivo e ensaio de metástase. (A1-A3) células SGC-7901 transfectadas com VE-FOXO4 ou LV-controlo foram transplantadas sob a pele. Seis semanas mais tarde, os tumores foram mais claramente visto em ratinhos implantados com células 7901-NC, em comparação com os grupos 7901-FOXO4: (6/6 nos grupos 7901-NC e 3/6 em grupos 7901-FOXO4). Os tumores foram dissecados e medido. (B1-B3) células SGC-7901 transfectadas com VE-FOXO4 ou LV-controlo foram injectados na veia da cauda de ratinhos nus. Dez semanas depois, os ratos implantados com 7901-NC células mostraram metástases hepáticas e pulmonares, enquanto alguns foram detectadas metástases em ratinhos implantados com células 7901-FOXO4: (por metástase pulmonar, 6/10 nos grupos 7901-NC e 1/10 em os grupos 7901-FoxO4, por metástases hepáticas, 3/10, em 7901-NC grupos e 0/10 em grupos 7901-FoxO4. (C) Imagens que mostram a hematoxilina e eosina representativo de amostras de tecido do pulmão e do fígado a partir de diferentes grupos experimentais * P <.. 0,05 (D) a sobrevida global dos ratos nus em cada grupo
mecanismos moleculares de FOXO4 na metástase do GC
para explorar possíveis mecanismos para o papel de FOXO4 na metástase GC, examinamos a expressão de moléculas relacionadas à metástase, incluindo e-caderina, vimentina em células de controlo-NC SGC-7901 usando RT-PCR (Figura 5A1-A2) SGC-7901-FOXO4 e. os resultados mostraram que FOXO4 superexpressão marcadamente reprimiu a expressão de vimentina, embora tenha sido observado nenhuma alteração óbvia para E-caderina. Os resultados de imunofluorescência confocal também rendeu conclusões semelhantes (Figura 5B1-B2). Figura 5 FOXO4 inibe EMT em células de GC. (A1-A2) PCR em tempo real mostraram sobre-regulada a expressão de marcadores epiteliais (E-caderina) e expressão sub-regulada de marcadores mesenquimais (vimentina) em células 7901-FOXO4. (B1-B2) imunofluorescência mostrou a expressão de marcadores epiteliais (E-caderina) e regulado para cima regulada negativamente a expressão de marcadores mesenquimais (vimentina) em células 7901-FOXO4.
Estes dados indicam que pode influenciar FOXO4 parcialmente célula CG metástase, regulando processo EMT, e mecanismos moleculares adicionais serão estudados em trabalhos futuros.
Discussão
a classe de caixa forkhead o (FOXO) da família de fatores de transcrição é evolutivamente conservada e caracteriza-se pela caixa de forkhead chamada DNA- domínio de ligação. Nos mamíferos, o gene família FOXO é composto por quatro membros: FOXO1, FOXO3a, FOXO4 e FOXO6. Numerosos estudos têm mostrado que as proteínas FOXO desempenham um papel importante numa grande variedade de processos biológicos normais, incluindo a proliferação celular, a paragem do ciclo celular, resposta ao stress, e a apoptose [10, 13, 14], bem como em doenças tais como o cancro e diabetes mellitus [15]. No entanto, há pouco estudo relatou sobre o papel da FOXO4 desempenha na GC.
No presente estudo, encontramos a expressão FOXO4 em tecidos não-tumorais foi consistentemente mais forte do que as amostras de GC e GC mostrou uma menor expressão nível de FOXO4 em lesões metastáticas em comparação com as amostras de tumor primária correspondente. Os níveis de mRNA e da expressão da proteína FOXO4 foram ambas reduzidas em vários tipos de linhas de células de GC em comparação com a linha epitelial da mucosa gástrica normal de células, sugerindo que FOXO4 pode servir como um regulador negativo para GC. Além disso, a expressão elevada de expressão FOXO4 inibiu o crescimento do tumor celular, invasão e metástase in vitro e in vivo, indicando que FOXO4 pode desempenhar um papel na progressão e metástase de GC.
Os mecanismos responsáveis ​​pelo impacto de alterações no desenvolvimento de GC FOXO4 e progressão permanecem obscuros. Vários estudos recentes têm indicado que FOXO regula muitos aspectos da biologia do cancro. Por exemplo, FOXO está normalmente retido por via PI3K /Akt via de sinalização, o que impede FOXO translocação para o núcleo, e FOXO regular as respostas transcripcionais independentemente de ADN de ligação directa através de associação com uma variedade de factores de transcrição independentes [16]. Nossos resultados mostraram que FOXO4 induzida prisão G1 significativa e redução de fase S em células de GC, o que indica que FOXO4 proliferação GC inibido pode, pelo menos em parte, pelo resultado da paragem do ciclo celular G1.
Um passo crítico na cascata metastática é o processo de epitelial para mesenquimal (EMT) [17, 18]. Durante o processo de EMT, a expressão de E-caderina foi muitas vezes sub-regulada, enquanto que de vimentina muitas vezes mostra-regulados [19]. FOXO4 pode regular EMT no câncer gástrico. Para testar esta hipótese, avaliamos as expressões de E-caderina e vimentina nos modelos celulares acima. Embora não se observou qualquer alteração óbvia para E-caderina, uma diminuição drástica da expressão de vimentina foi exibida em células FOXO4 superexpressão em comparação com as células de controlo, tal como indicado pelo ensaio de imunofluorescência e de qRT-PCR. Estes estudos sugerem fortemente que FOXO4 pode inibir a metástase do câncer gástrico, regulando EMT.
Conclusão
Em conclusão, nosso estudo demonstra uma função crítica de FOXO4 na inibição da proliferação de GC e metástases através da regulação da paragem do ciclo celular G1 e EMT, sugere que pode servir como um potencial alvo terapêutico para câncer gástrico
Notas
Linna Su, Xiangqiang Liu, Na Chai contribuíram igualmente para este trabalho
abreviações
FOXO4:..
caixa de forkhead O4
BSA:
albumina do soro bovino
DAB:
diaminobenzidina

qRT-PCR:
em tempo real PCR quantitativo
MTT:
3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2, 5-difenil-tetrazólio
PBS:
Tampão fosfato
DMSO:.
Dimetilsulfóxido

Declarações
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (número de concessão 81172062, 81270445). Agradecemos Prof. Zengshan Li (Departamento de Patologia da Xijing Hospital) por sua ajuda na análise patológica. Agradecemos também a Sra Zuhong Tian para a ajuda com experimentos com imagens de animais. Os autores revelam não haver potenciais conflitos de Interesse em material suplementar Electrónicas

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