Transkripsjonsfaktor FOXO4 er nedregulert og hemmer tumor spredning og metastase i magekreft

Transkripsjonsfaktor FOXO4 er nedregulert og hemmer tumor spredning og metastase i magekreft
Abstract
Bakgrunn
FOXO4, et medlem av FOXO familien av transkripsjonsfaktorer, er nå gjenstand for intens studie. Dens rolle og funksjon i magekreft er ikke fullstendig klarlagt. Denne studien var rettet til å undersøke uttrykket profilen til FOXO4 i magekreft og effekten av FOXO4 på kreftcellevekst og metastasering.
Metoder
Immunohistochemistry, Western blotting og QRT-PCR ble utført for å påvise FOXO4 uttrykk i gastrisk kreft celler og vev. Cellebiologiske analyser, subkutan og tumorgenisitet halevenen metastatisk assay i kombinasjon med lentivirus konstruksjon ble utført for å påvise virkningen av FOXO4 til magekreft i proliferasjon og metastaser in vitro og in vivo. Confocal og QRT-PCR ble utført for å utforske de mekanismer.
Resultater
Vi fant at uttrykket av FOXO4 ble betydelig redusert i de fleste mage kreft vev og i ulike menneskelige mage kreft cellelinjer. Opp regulerende FOXO4 hemmet veksten og metastasering av magecancercellelinjer in vitro og førte til dramatiske dempning av tumorveksten, og lever og lunge metastaser in vivo, mens nedregulere FOXO4 med spesifikke sirnas fremmet vekst og metastasering av magekreft celle linjer. Videre har vi funnet at opp-regulerer FOXO4 kan indusere betydelig G1 arrest og S-fasen reduksjon og nedregulering av uttrykket av vimentin.
Konklusjon
Våre data tyder på at tap av FOXO4 uttrykk bidrar til magekreft vekst og metastase og det kan tjene som et potensielt terapeutisk mål for magekreft.
nøkkelord
FOXO4 mage~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP spredning metastaser EMT Bakgrunn
Selv om forekomsten av magekreft (GC) er synkende, er det fortsatt den fjerde vanligste kreft og andre ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1]. De sentrale molekyler som er involvert i celle-proliferasjon og metastase i GC progresjon kan hjelpe til klinisk diagnostisering eller forutsi utviklingen av sykdommen.
Tumorvekst og metastase avhenge av forskjellige faktorer, inkludert transkripsjonsfaktorer [2-5]. Den FOXO transkripsjonsfaktorer familie består av fire svært beslektede medlemmer: FOXO1, FOXO3, FOXO4, og FOXO6 [6-8]. I de senere år har FOXO vist seg å spille viktige roller i en mengde cellulære prosesser, inkludert proliferasjon, apoptose, differensiering, stress motstand, og metaboliske responser [9], og kan derfor være lovende mål for nye medikamenter innen onkologi [10, 11].
våre tidligere resultater viste at FOXO4 mRNA-ekspresjonsnivået var dramatisk nedregulert i lymfeknute-positiv colorectal carcinoma vev sammenlignet med lymfeknute-negative vev, foreslo at det kan fungere som en negativ regulator av metastasering av tykktarmskreft [12]. Men uttrykket og funksjon FOXO4 i magekreft ble ikke kjent ennå. Målet med vårt arbeid har vært å undersøke hvilken rolle FOXO4 i magekreft kreftutvikling. Her rapporterer vi at FOXO4 undertrykke celleproliferasjon og metastase i magekreft ved reguleringen G1 cellesyklus arrest og vimentin.
Metoder
Vevsprøver
For vevsprøver, alle pasienter gitt informert samtykke til bruk av overskudds patologisk eksemplarer til forskningsformål. Protokollene som brukes i denne studien ble godkjent av sykehusets beskyttelse av menneske fag komiteen. Bruken av menneskelig vev ble godkjent av Institutional Review Board av den fjerde Military Medical University og dannet Helsinki-deklarasjonen, samt lokal lovgivning. Pasienter som gir prøvene for studien signert informert samtykke former.
Immunohistochemistry
Immunhistokjemisk farging ble utført ved hjelp av avidin-biotin kompleks immunoperoxidase metode. Det primære antistoff mot FOXO4 (1: 100, ab63254, Abcam) fortynnet i PBS inneholdende 1% (vekt /volum) bovint serumalbumin (BSA). Negative kontroller ble utført ved å erstatte det primære antistoff med pre-immun museserum. Bilder ble oppnådd under et lysmikroskop (Olympus BX51, Olympus, Japan) er utstyrt med en DP70 digitalkamera. Observatøren ble blindet til identiteten til prøvene når scoring immunoreaktivitets.
Evaluering av flekker
For vurdering av cellefarging, ble seksjonene undersøkt av to uavhengige patologer uten tidligere kjennskap til klinikken-patologisk status av prøvene . Celler som ble farget brun ble ansett for å være positiv. Ekspresjon av FOXO4 ble evaluert i henhold til forholdet mellom positive celler per prøve (R) og fargeintensitet (I). Forholdet mellom positive celler per eksemplar ble scoret som følger: 0 for farging av < 1%, en for farging av 2% til 25%, 2 til farging av 26% til 50%, 3 for farging av 51% til 75%, og 4 for farging av > 75% av cellene ble undersøkt. Intensiteten ble gradert som følger: 0, ingen signal; 1, svak flekker; 2, moderat farging; og 3, sterk farging. En total poengsum (R × I) fra 0 til 12 ble endelig beregnet og vurdert som negative (-score: 0-2). Eller positive (+, 3-12)
Tissue samling
Tissue arrays ble kjøpt fra den Aomei selskap (Aomei C0124H, AM01C09, Aomei Bioteknologi Co Ltd, Xi'an, Kina) (tilleggsfiler 1: Tabell S1 og tilleggsfiler 2: Tabell S2). For den vestlige blot analyse, ble GC vev og tilstøtende nontumorous vev innhentet fra åtte pasienter som hadde gjennomgått kirurgi ved Institutt for generell kirurgi i våre sykehus. Alle tilfeller av GC og normal mageslimhinnen ble klinisk og patologisk bevist. Protokollene som brukes i studiene ble godkjent av sykehusets beskyttelse av menneske fag komiteen. Pasienter som har bidratt frisk kirurgisk vev for studien hadde signert informert samtykkeerklæringer.
RNA ekstraksjon og real-time PCR
Total RNA fra cellene ble utvunnet ved hjelp Trizol (Invitrogen, Carlsbad, California), og cDNA ble syntetisert ved hjelp Stats Script RT reagenssett (Takara Biotechnology, Dalian, Kina) i henhold til produsentens anbefalinger. A Light Cycler Fast Start DNA Master SYBR Grønn Jeg System (Roche, Basel, Sveits) ble brukt for real-time PCR. GAPDH mRNA ble benyttet som intern kontroll, og reaksjonsblandingen uten templat-DNA ble anvendt som den negative kontroll. Alle prøvene ble målt uavhengig av hverandre tre ganger. Primersekvensene var som følger: GAPDH: (forover) 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 'og (revers) 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'; FOXO4: (fremover) 5'-CTTTCTGAAGACTGGCAGGAATGTG-3 'og (revers) 5'-GATCTAGGTCTATGATCGCGGCAG-3'; E-cadherin: (fremover) 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3'and (revers) 5'AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 '; og vimentin: (fremover) 5'-CAGGCAAAGCAGGAGTCCAC -3'and (revers) 5'-GCAGCTTCAACGGCAAAGTTC -3 '. Alle real-time PCR reaksjoner ble utført i tre eksemplarer.
Oligonukleotid konstruksjon og lentivirus produksjon
Tre par siRNA oligonukleotider rettet mot FOXO4 ble syntetisert ved GenePharma Co., Ltd GAPDH sekvensene ble brukt som en positiv kontroll. En ikke-relatert sekvens ble anvendt som en negativ kontroll (levert av GenePharma). Sekvensene var som følger: FOXO4 siRNA oligo-1: 5'-CGCGAUCAUAGACCUAGAUTTAUCUAGGUCUAUGAUCGCGTT-3 '(sense); FOXO4 siRNA oligo-2: 5'-CAGCUUCAGUCAGCAGUUATTUAACUGCUGACUGAAGCUGTT-3 '(sense); FOXO4 siRNA oligo-3: 5'-GUGACAUGGAUAACAUCAUTTAUGAUGUUAUCCAUGUCACTT-3 '(sense); GAPDH siRNA oligo (positiv kontroll): 5'-GUAUGACAACAGCCUCAAGTT-3 '(sense); og negativ kontroll: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 '. (forstand)
Ifølge produsentens instruksjoner, FOXO4 siRNA oligonukleotider ble transfektert inn i cellene ved hjelp av siRNA-Mate ™ reagens (GenePharma Ltd, Shanghai, Kina). Etter å ha dyrket i 2 til 3 dager, ble totalt RNA og protein ekstrahert. For stabil transfeksjon, ble en lentiviral overekspresjon vektor (Lenti-FOXO4) konstruert (Shanghai GeneChem Co., Ltd, Shanghai, Kina). Ved hjelp av en GV166-puro Vector (GeneChem Co., Ltd, Shanghai, Kina), en lentiviral vektor som uttrykte GFP alene (LV-kontroll) ble brukt som en negativ kontroll (NC).
Western blot
Equal mengder av proteinene ble separert ved anvendelse av natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel (SDS-PAGE) elektroforese og overført til en nitrocellulosemembran (Bio-Rad, Hercules, CA). FOXO4 kanin polyklonalt antistoff (Abcam, 1: 500), CyclinD1 kanin polyklonalt antistoff (ImmunoWay, 1: 1000), β-actin mus monoklonalt antistoff (Sigma, 1: 2000), E-cadherin og vimentin kanin polyklonalt antistoff (Santa Cruz, CA, 1:. 1000) antistoffer ble benyttet for Western blot eksperimenter
celleproliferasjonsanalyse
3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) analysen ble utført for å evaluere hastigheten av celleproliferasjon, og ble utført i henhold til standardprosedyrer. Hver cellelinje ble påvist i triplikat
migrering og invasjon assay
Transwell migrering ble utført i modifisert Boyden kammere (Transwell; Corning Inc. Lowell, MA, USA). Ved en tetthet på 5 x 10 3 celler per brønn. Etter 24 timers inkubering ved 37 ° C ble cellene på den nedre overflaten av brønnene fiksert med 4% para-formaldehyd, farget med 1% krystallfiolett og tellet.
Internett-innhold screeningsanalyse
Cell motilitet var kartlagt ved hjelp av en Cellomics Array Scan VTI 1700 plus (Thermo Scientific, USA). I korte trekk ble celler i log-fase høstet og sådd ut i 96-brønners plater (5 x 10 3 celler /brønn). Etter dyrking over natten ved 37 ° C for adhesjon, ble kulturmediet erstattet med serumfritt RPMI 1640 medium, og kulturen ble fortsatt i ytterligere 24 timer. Deretter ble cellene vasket to ganger med iskald PBS og farget med Hoechst 33342 i 15 minutter i en inkubator. Deretter ble cellene igjen vasket to ganger med iskald PBS og utsatt for forskjellige behandlinger. Cellemotilitet ble oppdaget ved hjelp av Cellomics Array Scan VTI 1700 plus (Thermo Scientific) i henhold til produsentens protokoll (hver gruppe inkluderte fem gjentatte brønner).
Konfokalmikroskopi
For konfokal mikroskopi eksperimenter, celler ble dyrket på Lab-Tek 24-brønn kammer lysbilder (Thermo Fisher Scientific, USA). Etter over natten dyrking ble cellene fiksert, vasket og permeabilisert med 0,3% Triton X-100 i PBS i 10 min. Deretter ble cellene inkubert med primære antistoffer mot E-cadherin og vimentin (fortynning 1: 300, Abcam) over natten ved 4 ° C. Cellene ble også inkubert med Cy3-konjugert anti-kanin-IgG (fortynning 1:. 200 (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, USA) i 1 time ved romtemperatur i mørket cellekjernen ble motfarget ved hjelp av DAPI i 5 min . Fluorescens ble overvåket og fotografert med en konfokal mikroskop (Thermo Fisher Scientific, USA).
dyre~~POS=TRUNC studier~~POS=HEADCOMP
for dyreforsøk, hårløse mus 4 til 6 ukers alder ble kjøpt fra Animal Center of Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina) og vedlikeholdes i laminær skap under patogenfrie forhold. Alle prosedyrer for dyreforsøk ble utført i samsvar med Institutional Animal Care og bruk komité retningslinjer Experiment Animal Center for fjerde Military Medical University.
tumorgenisitet i nakne mus
Logaritmisk voksende celler ble høstet ved bruk av trypsin og vasket to ganger med PBS. Deretter ble 2 x 10 6-celler i 0,2 ml ble injisert subkutant i den høyre øvre ryggområdet hos musene. Fire uker etter inokulering, ble tumorbærende musene avlivet, og størrelsen på tumoren ble bestemt ved kalibermåling av det subkutane tumormassen. Hver eksperimentelle gruppen inneholdt 6 mus. To uavhengige eksperimenter ble utført, og de ga lignende resultater.
Halevenen metastatisk assay
Omtrent 2 x 10 6-celler ble suspendert i 0,2 ml steril PBS og injisert inn i halevenene på 10 mus. Musene ble deretter overvåket for tumorvolumet og generell helse, og lungene og leveren ble regelmessig observert ved hjelp av bildemikroskopi.
Statistisk analyse
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 17.0 statistisk programvare (SPSS Inc., Chicago, Illinois). Variabler med en P-verdi mindre enn 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant. χ
2 tester ble brukt for å vurdere betydningen av forskjeller i FOXO4 uttrykk frekvens mellom GC vev og tilstøtende nontumorous mage vev. T
-test (en enveis ANOVA-test) ble utført for å vurdere betydningen av forskjellen mellom celleproliferasjon, plate kloner, og migrasjons analyser. Totalt overlevelseskurver ble plottet ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og ble vurdert for statistisk signifikans ved hjelp av en log-rank test (Mann-Whitney U
test og Kruskal-Wallis H-testen ble vedtatt for andre data).
Resultater
Expression of FOXO4 er nedregulert i GC vev og cellelinjer
å undersøke om FOXO4 uttrykket ble endret i GC, ble uttrykket og subcellulære lokalisering av FOXO4 studert i en vev microarray av 75 parvise GC prøver ved hjelp en immunhistokjemisk analyse. FOXO4 var hovedsakelig uttrykt i kjernen av epitelceller som ligger i de gastriske kjertler nontumorous vev (figur 1A1), men en liten mengde var lokalisert til cytoplasmaet. Den FOXO4 flekker i epitelceller fra GC prøvene var svakt. Imidlertid FOXO4 farging i nontumorous vev (NT) var gjennomgående sterkere enn den til GC prøvene, og det var en signifikant forskjell mellom de fargings resultatene av GC og NT prøver (figur 1A2) (P < 0,05) .Vi neste målte FOXO4 nivå i en selvstendig vev microarray panel inneholder 40 primære GCS og tilhørende lymfeknutemetastase prøver. Overall, GCer viste en lavere uttrykk nivå FOXO4 i metastatiske lesjoner sammenlignet med tilsvarende primære tumorprøver (Tall 1A3-A4) .De uttrykk nivåer av FOXO4 ble også undersøkt av western blot og RT-PCR i GC og tilstøtende normalt vev hentet fra åtte pasienter (Figur 1b). I sju av de åtte tilfellene ble FOXO4 funnet å ha redusert uttrykk i kreftvevet, i samsvar med resultatene fra immunhistokjemi analysis.We ytterligere sammenlignet den relative FOXO4 mRNA og protein uttrykk nivåer mellom 6 forskjellige GC cellelinjer (BGC-823, SGC7901 , MKN28, AGS, 9811, og MKN45) og den udødelige mage epiteliale cellelinje GES-en. Igjen FOXO4 ble uttrykt ved en forholdsvis lavere nivå i alle seks GC-cellelinjer sammenlignet med den normale udødelig gastrisk mucosal epitelial GES-1-cellelinje (figur 1C). Disse resultatene antyder at FOXO4 kan spille en rolle i undertrykkende gastrisk karsinogenese. Figur 1 FoxO4 er betydelig nedregulert i GC vev og cellelinjer. (A1) IHC analyse av FOXO4 ekspresjon i 75 sammenkoblet GC og tilstøtende ikke-tumorvevet. (A2) Statistisk analyse av FOXO4 ekspresjon i GC vev og tilstøtende ikke-tumormagevevet. (A3) Representant FOXO4expression i grunnskolen og metastatisk GC vev oppdages av IHC metoder. (A4) Statistisk analyse av FOXO4 uttrykk mellom GC vev med og uten metastaser. (B1-B2) Real-time PCR og Western blot analyse av FOXO4 uttrykk i 8 par GC og tilstøtende ikke-tumorvevet. (C1-C2) Real-time PCR og western blotting analyse av FOXO4 uttrykk i ulike GC cellelinjer.
FOXO4 hemmer GC spredning in vitro og induserer cellesyklus arrest i G0 /G1 fase
å undersøke hvilken rolle FOXO4 i GC vekst, etablerte vi to stabile cellelinjer (betegnet SGC7901-FoxO4 og SGC7901-NC) etter infeksjon med LV- FoxO4 eller LV-NC lentivirus, henholdsvis. Etter gjentatte puromycin utvalg, RT-PCR og en western blot analyse bekreftet at SGC7901-FoxO4 viste høyere FOXO4 uttrykk i forhold til SGC7901-NC (figur 2A1-A2). MTT-analysen viste at oppregulering av FOXO4 ekspresjon hemmet signifikant proliferasjon av GC-celler (figur 2A3, P < 0,01) .I motsetning til dette BGC823 cellelinjen, som har forholdsvis høyere endogen ekspresjon, ble transient transfektert med FOXO4 siRNA eller den negative kontrollen. Tre par siRNA oligonukleotider rettet mot FOXO4 ble syntetisert og transfektert inn BGC823 celler (BGC823-FOXO4si1, BGC823-FOXO4si2, og BGC823-FOXO4si3), og celler transfektert med siRNA oligo negativ kontroll ble merket BGC823-sinc. QRT-PCR og Western blot viste at siRNA oligo nummer 1 var den mest effektive, så denne konstruksjonen ble valgt for videre studier (figur 2B1-B2). Følgelig vekstkurver indikerte at nedregulering av ekspresjon av FOXO4 resulterte i økt spredning blant GC-celler (figur 2B3) .Vi også utført en plate kolonidannelse assay. Resultatene viste at SGC7901-FOXO4 celler produseres færre cellekolonier i forhold til SGC7901-NC kontrollceller (Figur 2C1-C2, P < 0,05). Deretter brukte vi FACS-analyse for å undersøke effekten av FOXO4 på cellesyklusen. SGC7901-FOXO4 celler viste sterk G1 rest og i S-fasen reduksjon (figur 2D1-D2), som indikerte at FOXO4 inhiberte GC spredning som følge av G1 cellesyklus-stans. For å forsterke denne observasjonen, vi har oppdaget uttrykk for CyclinD1 som er en markør for G1 fase med western blot, det viste at CyclinD1had en relativt høyere uttrykk i 7801-NC cellelinje enn 7901-FOXO4 celler (Figur 2E1-E2). Figur 2 Effekt av FOXO4 på å regulere GC celleproliferasjon. (A1-A2) Relativ uttrykk for FOXO4 i SGC-7901 celler transfektert med LV-FOXO4 eller LV-kontroll, noe som ble bekreftet av real-time PCR og Western blot analyse. Verdiene representerer middel fra tre separate forsøk, og de Feilstolpene representerer SEM (** P 0,01). (A3) De spredningshastigheter på celler ble målt ved anvendelse av MTT-analysen. Verdiene representerer middel fra tre separate forsøk, og de Feilstolpene representerer SEM (* P < 0,05). (B1-B2) Relativ uttrykk for FOXO4 i BGC-823 celler transfektert med FOXO4 oligo nukleotid-hemmer eller oligo nukleotid kontroll, noe som ble bekreftet av real-time PCR og Western blot analyse. Verdiene representerer middel fra tre separate forsøk, og de Feilstolpene representerer SEM (** P 0,01). (B3) De spredningshastigheter på celler ble målt ved anvendelse av MTT-analysen. Verdiene representerer middel fra tre separate forsøk, og de Feilstolpene representerer SEM (* P < 0,05). (C1-C2) kolonidannelse av SGC07901 celler transfektert med LV-FOXO4 og LV-kontrollen ble utført ved såing av cellene på plater i 2 uker, og antallet kolonier ble deretter tellet. Verdiene representerer middel fra tre separate forsøk, og de Feilstolpene representerer SEM (* P < 0,05). (D1-D2) Cellesyklus fordeling av SGC-7901 celler transfektert med LV-FOXO4 eller LV-kontroll. Cellesyklusanalyse ble utført 24 timer etter transfeksjon. Cellesyklusfordelingen ble beregnet og uttrykt som gjennomsnitt ± SD for tre separate eksperimenter. * P < 0,05. (E1-E2) Relativ uttrykk for CyclinD1 i SGC-7901 celler transfektert med LV-FOXO4 eller LV-kontroll, noe som ble bekreftet western blot analyse. Verdiene representerer midler fra tre separate forsøk, og feilfelt representerer SEM (* P < 0,05).
FOXO4 hemmer migrasjon og invasjon av GC-celler in vitro
å evaluere påvirkning av FOXO4 på GC migrasjon og invasjon, evaluert vi neste effekten av FOXO4 uttrykk på invasiv og trekk evnene til GC celler ved hjelp av in vitro transwell analyser. Resultatene viste at migrering og invasjon av SGC-7901-celler ble FOXO4 begge særlig redusert sammenlignet med SGC-7901-NC kontrollceller (figur 3A1). I motsetning til utarming av FOXO4 betydelig fremmet celle migrasjon og invasjon i BGC823 celler sammenlignet med kontrollceller (figur 3A2). Videre er høyt innhold screeningsanalyse viste motiliteten hastigheten på SGC-7901-FOXO4 celler er betydelig lavere enn SGC-7901-NC-celler, 15/19 tidspunkt viste klart motiliteten hastigheten på SGC-7901-FOXO4 celler er lavere enn SGC-7901-NC celler (figur 3b). I tillegg sårhelende analyser viste at SGC-7901-FOXO4 celler lukket sår saktere enn SGC-7901-NC celler (figur 3C) (P < 0,05). Sammen utgjør disse resultatene indikerte at FOXO4 betydelig svekket GC celle migrasjon og invasjon in vitro. Figur 3 Effekt av FOXO4 i å regulere GC celle metastasering. (A1-A2) oppregulering av FOXO4 ekspresjon i LV-FOXO4 celler ble redusert SGC-7901 cellemigrering og invasjon in vitro, mens hemming av FOXO4 uttrykk ved hjelp av oligo-nukleotid inhibitor av FOXO4 forbedret BGC-823 celle-migrering og invasjon. (B) Cell migrasjon kapasitet ble evaluert ved å utføre et høyt innhold av analysen i SGC-7901 celler transfektert med LV-FOXO4 eller LV-kontroll. * P < 0,05 (C) Cell migrasjon kapasitet ble også testet ved å utføre en sårhelende analysen i SGC-7901 celler transfektert med LV-FOXO4 eller LV-kontroll. * P < 0,05.
FOXO4 oppregulering inhiberer tumorigenesis og metastasering av GC-celler in vivo
For ytterligere å bekrefte effektene av FOXO4 på tumorgenese av GC, ble en tumordannelse målingen ble utført på nakne mus. SGC7901-NC og SGC7901-FOXO4 celler ble inokulert subkutant inn i høyre øvre ryggområdet hos nakne mus på et enkelt sted. Fire uker senere ble musene som ble subkutant inokulert ble avlivet, de transplanterte tumorer ble skåret ut, og tumorstørrelsene ble evaluert (figur 4A1-A3, P < 0,05). Resultatene viste en signifikant reduksjon i størrelsen av xenotransplantater som følge av FOXO4 oppregulert cells.To ytterligere å undersøke rollen til FOXO4 i tumormetastaser in vivo, implanterte vi SGC7901-NC og SGC7901-FOXO4 celler i nakne mus via den laterale halevenen . Representative bioluminescent imaging (BLI) av de forskjellige grupper er vist i figur 4B1. Histologisk analyse bekreftet videre at forekomsten av lunge og levermetastaser i SGC7901-FOXO4 gruppe ble signifikant redusert, sammenlignet med SGC7901-NC gruppe (figur 4B2, B3). Antall lungemetastatiske noduler i SGC7901-FOXO4 gruppe ble også redusert, sammenlignet med den SGC7901-NC gruppe (data ikke vist). Lever og lunge metastaser ble ytterligere dokumentert av hematoxylin og eosin-farging (figur 4C). Videre SGC7901-FOXO4 gruppe nakne mus viste lengre total overlevelse tid i forhold til den SGC7901-NC gruppe (figur 4D). Disse data indikerte at FOXO4 trykt GC celle tumorigenesis og metastasering in vivo. Figur 4 In vivo proliferasjon og metastase assay. (A1-A3) SGC-7901 celler transfektert med LV-FOXO4 eller LV-kontroll ble transplantert under huden. Seks uker senere, tumorene ble mer tydelig i mus implantert med 7901-NC-celler i forhold til 7901-FOXO4 grupper: (6/6 i 7901-NC-grupper og 3/6 i 7901-FOXO4 grupper). Tumorene ble dissekert og målt. (B1-B3) SGC-7901-celler transfektert med LV-FOXO4 eller LV-kontroll ble injisert inn i halevenen til nakne mus. Ti uker senere, mus implantert med 7901-NC celler viste lunge- og levermetastaser, mens noen metastaser påvist i mus implantert med 7901-FOXO4 celler: (for lungemetastaser, 6/10 i 7901-NC grupper og 1/10 i de 7901-FoxO4 grupper, levermetastaser, 3/10 i 7901-NC grupper og 0/10 i 7901-FoxO4 grupper. (C) Bilder viser representant hematoxylin og eosin farging av lunge og lever vevsprøver fra de ulike forsøksgrupper * P <.. 0.05 (D) Total overlevelse av hårløse mus i hver gruppe
Molekylære mekanismer for FOXO4 i metastasering av GC
å utforske mulige mekanismer for rollen som FOXO4 i GC metastaser, undersøkte vi uttrykket av metastaserelaterte molekyler, inkludert E-cadherin, vimentin i SGC-7901-FOXO4 og SGC-7901-NC kontrollceller ved hjelp av RT-PCR (figur 5A1-A2). resultatene viste at FOXO4 overekspresjon markert trykt uttrykk for vimentin, selv om ingen åpenbar endring ble observert for E-cadherin. De immunfluorescens confocal resultatene også gitt tilsvarende konklusjoner (figur 5b1-B2). Figur 5 FOXO4 hemmer EMT i GC-celler. (A1-A2) Real-time PCR viste oppregulert uttrykk for epiteliale markører (E-cadherin) og nedregulert uttrykk for mesenchymale markører (vimentin) i 7901-FOXO4 celler. (B1-B2) Immunofluorescens farging viste oppregulert ekspresjon av epitel-markører (E-cadherin) og ned-regulert ekspresjon av mesenchymale markører (vimentin) i 7901-FOXO4 celler.
Disse data indikerer at FOXO4 delvis kan påvirke GC celle metastase ved å regulere EMT prosess, og ytterligere molekylære mekanismene som skal studeres i det videre arbeidet.
diskusjon
gaffelhodeboksen klasse O (FOXO) familie av transkripsjonsfaktorer er evolusjonært konservert og karakterisert ved de såkalte gaffelhodeboks DNA- bindende domene. I pattedyr, den FOXO genet familien består av fire medlemmer: FOXO1, FOXO3A, FOXO4, og FOXO6. Tallrike studier har vist at FOXO proteiner spiller en viktig rolle i en rekke normale biologiske prosesser, inkludert cellulær proliferasjon, cellesyklusstans, stressrespons, og apoptose [10, 13, 14], såvel som i sykdommer som kreft og diabetes mellitus [15]. Det er imidlertid lite studie rapporterte om rollen til FOXO4 spiller i GC.
I foreliggende studie har vi funnet FOXO4 ekspresjon i ikke-tumorøse vev var gjennomgående sterkere enn den til GC prøvene, og GCer viste en lavere uttrykk nivå FOXO4 i metastatiske lesjoner sammenlignet med tilsvarende primærtumorprøver. De FOXO4 mRNA og protein ekspresjonsnivåene ble begge redusert i forskjellige typer av GC-cellelinjer sammenlignet med normal gastrisk mucosal epitelcellelinje, noe som tyder på at FOXO4 kan tjene som en negativ regulator for GC. I tillegg forhøyet ekspresjon av FOXO4 ekspresjon hemmet tumorcellevekst, invasjon og metastaser in vitro og in vivo, noe som indikerer at FOXO4 kan spille en rolle i progresjon GC og metastase.
De mekanismer som er ansvarlig for virkningen av FOXO4 endringer på GC utvikling og progresjon fortsatt uklare. Flere nyere studier har indikert at FOXO regulerer mange aspekter av kreft biologi. For eksempel er FOXO vanligvis dempes av PI3K /Akt signalveien, som hindrer FOXO translokasjon inn i kjernen, og FOXO regulere transkripsjonelle responser uavhengig av direkte DNA-binding via forbindelse med en rekke ubeslektede transkripsjonsfaktorer [16]. Våre funn viste at FOXO4 induserte signifikant G1 rest og S-fasen reduksjon i GC-celler, noe som indikerte at FOXO4 inhiberte GC proliferasjon kan i det minste delvis ved produktet av G1 cellesyklus-stans.
Et kritisk trinn i den metastatisk kaskade er fremgangsmåte ifølge epitelial til mesenchymale overgang (EMT) [17, 18]. Under EMT prosessen uttrykk for E-cadherin ble ofte nedregulert, mens noe av vimentin ofte viser oppregulert [19]. FOXO4 kan regulere EMT i magekreft. For å teste denne hypotesen, vurdert vi uttrykk for E-cadherin og vimentin i cellemodeller ovenfor. Selv om det ble observert noen åpenbar forandring av E-cadherin, ble en dramatisk reduksjon av vimentin ekspresjon vist i FOXO4 overekspresjon celler sammenlignet med kontrollcellene, som indikert ved immunfluorescens-analysen og QRT-PCR. Disse studiene antyder sterkt at FOXO4 kan hemme gastrisk cancer metastase ved å regulere EMT.
Konklusjon
Konklusjonen vår studie demonstrerer en kritisk funksjon av FOXO4 ved inhibering av GC proliferasjon og metastase til ved regulering av G1 cellesyklus-stans og EMT, antyder kan det tjene som en potensiell terapeutisk mål for magekreft
Merknader
Linna Su, Xiangqiang Liu, Na Chai bidratt likt til dette arbeidet
Forkortelser
FOXO4:..
gaffelhodeboks O4
BSA:
Bovine serum albumin
DAB:
Diaminobenzidin

QRT-PCR:
real-time kvantitativ PCR
MTT:
3- [4,5-2-yl] -2, 5-difenyl-tetrazoliumbromid
PBS:
Fosfatbufret saltvann
DMSO.
dimetylsulfoksid
<.no> Erklæringer
Takk
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (stipend nummer 81172062, 81270445). Vi takker professor Zengshan Li (Avdeling for patologi ved Xijing Hospital) for hans hjelp i patologisk analyse. Vi takker også Mrs. Zuhong Tian for hjelp med dyret bildebehandling eksperimenter. Forfatterne avslører ingen potensielle interessekonflikter
Electronic supplerende materiale
12885_2014_4601_MOESM1_ESM.doc tilleggsfiler. 1: Tabell S1: Informasjon vev array (human adenokarsinom i ventrikkel med matchet tilstøtende vev). Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• LIM homeodomain transkripsjonsfaktor Isl1 dirigerer normal pyloric utvikling ved å målrette Gata3
• Genetisk polymorfisme i osteopontin arrangøren øker risikoen for avstand metastaser og død hos kinesiske pasienter med mage cancer