Transkripcijos faktorius FOXO4 yra žemyn reguliuojama ir slopina naviko proliferaciją ir metastazes skrandžio vėžio

Transkripcijos faktorius FOXO4 žemyn reguliuojama ir slopina naviko proliferaciją ir metastazes skrandžio vėžio
tezės
Background pervežimas FOXO4, priklausanti FOXO šeimos transkripcijos veiksnių narys, šiuo metu intensyvaus tyrimo dėmesio centre. Jos vaidmuo ir funkcijos skrandžio vėžio nebuvo visiškai aiški. Šis tyrimas buvo skirtas ištirti išraiška profilį FOXO4 skrandžio vėžio ir FOXO4 poveikį vėžio ląstelių augimą ir metastazių.
Metodai
imunohistocheminis, imunoblotingo ir KRL-PGR buvo atliekama siekiant aptikti FOXO4 išraišką skrandžio vėžio ląstelės ir audiniai. Mobilaus ryšio biologiniai tyrimai, poodinio tumorogeniškumo ir uodegos veną metastazavęs tyrimas kartu su lentivirus statybos buvo atliktas siekiant nustatyti, ar FOXO4 poveikį į skrandžio vėžio proliferaciją ir metastazių in vitro ir in vivo. Confocal ir KRL-PGR buvo atliekama siekiant ištirti mechanizmus.
Rezultatai
Mes nustatėme, kad FOXO4 išraiška buvo žymiai sumažėjo daugumoje skrandžio vėžio audiniuose ir įvairiuose žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas. Iki reguliavimo FOXO4 slopino augimą ir metastazes skrandžio vėžio ląstelių linijų in vitro ir lėmė dramatišką silpninimo naviko augimui ir kepenų ir plaučių metastazės in vivo, o žemyn reguliavimo FOXO4 su konkrečiais siRNAs skatino augimą ir metastazes skrandžio vėžio ląstelių linijos. Be to, mes nustatėme, kad iki reguliavimo FOXO4 gali sukelti didelę G1 suėmimą ir S fazės mažinimas ir žemyn reglamentuojant vimentin išraiška.
Išvada
Mūsų duomenys rodo, kad nuostoliai FOXO4 išraiškos prisideda prie skrandžio vėžio augimo ir metastazių ir ji gali tarnauti kaip galimą terapinį tikslą skrandžio vėžio.
Raktiniai žodžiai
FOXO4 skrandžio vėžio išplitimas Metastazė EMT Background
Nors skrandžio vėžio atvejų (GC) mažėja, ji vis dar ketvirtoji dažniausia vėžio ir antra pagrindinė priežastis, dėl vėžio susijusių mirčių visame pasaulyje [1]. Pagrindiniai molekulės, dalyvaujančios ląstelių proliferaciją ir metastazių GC progresavimo gali padėti klinikinės diagnostikos ar prognozuoti šios ligos progresavimą.
Naviko augimą ir metastazių priklauso nuo įvairių veiksnių, įskaitant transkripcijos veiksnių [2-5]. FOXO transkripcijos veiksniai šeimą sudaro keturi labai panašių prisijungę: FOXO1, FOXO3, FOXO4 ir FOXO6 [6-8]. Pastaraisiais metais FOXO buvo įrodyta, kad žaisti lemiamus vaidmenis ląstelių procesus, įskaitant platinimo, apoptozės, diferenciacijos, atsparumas stresui, ir medžiagų apykaitos atsakymų gausa [9], ir todėl gali būti perspektyvūs tikslai naujų vaistų onkologijos srityje [10, 11].
Mūsų ankstesni rezultatai parodė, kad FOXO4 iRNR raiška lygis buvo smarkiai žemyn reguliuojama limfmazgių teigiamas storosios žarnos karcinoma audinių, palyginti su limfmazgių neigiamas audinių, parodė, kad tai gali veikti kaip neigiamas reguliatorius iš metastazių gaubtinės ir tiesiosios žarnos karcinoma [12]. Tačiau pasakymas ir funkcijos FOXO4 skrandžio vėžio buvo dar nežinomas. Mūsų darbo tikslas buvo ištirti galimą vaidmenį FOXO4 skrandžio vėžio kancerogenezėje. Čia mes pranešti, kad FOXO4 slopinti ląstelių proliferacija ir metastazių skrandžio vėžio reglamente G1 ląstelės ciklo arešto ir vimentin.
Metodai
Audinių mėginiai
audinių pavyzdžių, visi pacientai pateikė sutikimą naudoti perteklių Patologinės egzemplioriams, dėl mokslinių tyrimų tikslais. Naudojami šiame tyrime protokolai buvo patvirtintas ligoninės apsaugoti žmogaus dalykai komitetas. Žmogaus audinių naudojimas buvo patvirtintas institucinio vertinimo tarybos ketvirtosios Karo medicinos universiteto ir atitiko Helsinkio deklaraciją, taip pat vietos įstatymus. Pacientai, teikiančios mėginius tyrime pasirašė informuoto asmens sutikimą formas.
Imunohistocheminis
imunohistocheminį dažymo atlikta naudojant avidino-biotino kompleksas imunoperoksidaziniu metodą. Pagrindinis antikūnas prieš FOXO4 (1: 100, ab63254, Abcam) atskiesti PBS, kuriame yra 1% (masė /tūris) jaučio serumo albumino (BSA). Neigiama kontrolė buvo atliktas pakeičiant pirminį antikūną su iš anksto-imuninės pelės serumo. Vaizdai buvo gauti pagal šviesos mikroskopu ( "Olympus BX51," Olympus ", Japonija) įrengta DP70 skaitmeninio fotoaparato. Stebėtojas buvo apakinti mėginių tapatumo, kai netikėtai reaktyvumas.
Vertinimas dažymo
Dėl vertinimo ląstelių dažymosi, sekcijos išnagrinėjo dviejų nepriklausomų patologai be išankstinių žinių apie klinikos-patologinės būklės egzempliorių , Ląstelių, kurios buvo nudažomi ruda buvo laikomas teigiamu. Iš FOXO4 išraiška buvo įvertintas pagal prie teigiamų ląstelių santykis per pavyzdį (R) ir dažymo intensyvumo (I). Teigiamų ląstelių viename bandinio santykis pelnytas taip: 0 dažymui < 1%, 1 dažymui nuo 2% iki 25%, 2 dažymui nuo 26% iki 50%, 3 dažymui 51% iki 75%, ir 4 dažymui > 75% ląstelių įvertinamų. Intensyvumas buvo rūšiuojami taip: 0, jokio signalo; 1, silpnas dažymo; 2, vidutinio dažymo; ir 3, stipri dėmių. Iš viso balas (R × I) 0 iki 12 pagaliau buvo apskaičiuotas ir įvertintas kaip neigiamas (-score: 0-2). Arba teigiamo (+, 3-12)
Audinių kolekcija
audinių matricos buvo įsigytas iš Aomei bendrovė (Aomei C0124H, AM01C09, Aomei biotechnologijos Co Ltd, Sianas, Kinija) (Papildoma failą 1: lentelė S1 ir papildomų failų 2: lentelė S2),. Dėl Vakarų dėmė analizė, GC audiniai ir gretimų nontumorous audiniai buvo gauti iš aštuonių pacientų, kuriems buvo atlikta operacija tuo Bendrosios chirurgijos mūsų ligoninėje departamentas. Visi GC ir normalus skrandžio gleivinės bylos buvo kliniškai ir patologiškai įrodyta. Naudojami tyrimų protokolai buvo patvirtintas ligoninės apsaugoti žmogaus dalykai komitetas. Pacientai, kurie prisidėjo šviežią chirurginės audinius tyrimo pasirašė informuoto asmens sutikimą formas.
RNR gavybos ir realaus laiko PGR
viso RNR iš ląstelių buvo išgautas naudojant Trizol (INVITROGEN, Karlovi Varai, CA), ir kDNR buvo susintetintas naudojant Prime scenarijus RT reagentas komplektas (TAKARA biotechnologijos, Dalianas, Kinija) pagal gamintojo rekomendacijas. Šviesos Jutiklis ciklų Greitas Startas DNR magistras SYBR Žalioji Aš sistema (Roche, Bazelis, Šveicarija) buvo naudojamas realaus laiko PGR. GAPDH mRNR buvo naudojamas kaip vidinis kontrolės sistemą, o reakcijos mišinys be šablono DNR buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė. Visi iš mėginių buvo matuojamas nepriklausomai tris kartus. Pradmenys sekos buvo taip: GAPDH: (į priekį) 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 'ir (atvirkštinės) 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'; FOXO4: (pirmyn) 5'-CTTTCTGAAGACTGGCAGGAATGTG-3 "ir (reversas) 5'-GATCTAGGTCTATGATCGCGGCAG-3"; El cad: (pirmyn) 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3'and (reversas) 5'-AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 "; ir Vimentin: (pirmyn) 5'-CAGGCAAAGCAGGAGTCCAC -3'and (reversas) 5'-GCAGCTTCAACGGCAAAGTTC -3 ". Visi realaus laiko PGR reakcijos buvo atliekami tris kartus.
Oligonukleidų statybos ir lentivirus gamybos
trys poros siRNA oligonukleotidų skirtomis FOXO4 buvo sintetinamas GenePharma Co, Ltd GAPDH sekos buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė. Nesusijęs seka buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė (pateikta GenePharma). Sekos, buvo taip: FOXO4 siRNR oligo-1: 5'-CGCGAUCAUAGACCUAGAUTTAUCUAGGUCUAUGAUCGCGTT-3 '(pojūtis); FOXO4 siRNR oligo-2: 5'-CAGCUUCAGUCAGCAGUUATTUAACUGCUGACUGAAGCUGTT-3 "(jausmas); FOXO4 siRNR oligo-3: 5'-GUGACAUGGAUAACAUCAUTTAUGAUGUUAUCCAUGUCACTT-3 "(jausmas); GAPDH siRNR oligo (teigiama kontrolė): 5'-GUAUGACAACAGCCUCAAGTT-3 "(jausmas); ir neigiama kontrolė: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ". (jausmas)
Pagal gamintojo nurodymus, FOXO4 siRNA oligos buvo pernešta į ląsteles naudojant siRNR-Mate ™ reagentą (GenePharma Ltd, Šanchajus, Kinija). Po to, kai kultivuojamos nuo 2 iki 3 dienų, kad bendras RNR ir baltymų buvo paimti. Dėl stabilios transfekciją, lentiviruso raiškos vektorius (Lenti-FOXO4) buvo pastatytas (Shanghai GeneChem Co, Ltd, Šanchajus, Kinija). Naudojant GV166-Puro Vektorius (GeneChem Co, Ltd, Šanchajus, Kinija), lentiviruso vektorius, kad išreiškė GFP vienas (LV-kontrolė) buvo naudojamas kaip neigiamos kontrolės (NK).
Vakarų dėmė
Vienodas sumos baltymų buvo atskirtos naudojant natrio dodecilsulfato-poliakrilamido gelio (SDS-PAGE) elektroforezė ir perkelti į nitroceliuliozės membranos (Bio-Rad, Hercules, CA). FOXO4 triušis polikloninis antikūnas (Abcam, 1: 500), CyclinD1 triušis polikloninis antikūnas (ImmunoWay, 1: 1000), β-aktino pelės monokloninis antikūnas ( "Sigma, 1: 2000), E-cad ir Vimentin triušis polikloninis antikūnas (Santa Cruz, CA, 1:. 1000) antikūnai buvo naudojami Western blot eksperimentų
Mobilusis proliferacijos tyrimu
3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil-tetrazolio bromido (MTT) tyrimas buvo atliktas siekiant įvertinti ląstelių proliferacijos greitį, ir buvo atlikta pagal standartines procedūras. Kiekviena ląstelė linija buvo aptikta trimis egzemplioriais
Migracija ir invazija tyrimas
Transwell migracijos tyrimai buvo atlikti modifikuotų Boyden rūmų (Transwell; Corning Inc. "Lowell, MA, JAV). Esant tankiui 5 × 10 3 ląstelės per pat. Po to, kai 24 h inkubacijos esant 37 ° C, dėl apatinio paviršiaus šulinių ląstelės buvo nustatyti su 4% paraformaldehido, nudažomi su 1% violetinei ir suskaičiuoti. Viesbutis High-turinio atrankos tyrimas,
Mobilusis judrumas buvo apklaustųjų naudojant Cellomics Array Skenavimo VTi 1700 plius (Thermo Scientific, JAV). Trumpai tariant, ląstelės žurnalo etape buvo surinktos ir padengtą į 96-duobučių lėkštelėse (5 × 10 3 ląstelių /gerai). Po nakties kultūros esant 37 ° C temperatūroje sukibimo, kultūrinė terpė buvo pakeistas su serumo neturinčioje RPMI1640 terpėje, ir kultūra buvo tęsiamas už papildomą 24 h. Tada, ląstelės buvo plaunama du kartus ledinio PBS ir nudažomi su Hoechst 33342 15 min inkubatoriuje. Vėliau, ląstelės buvo vėl plaunama du kartus ledinio PBS ir veikiami įvairių gydymo. Mobilusis judrumas buvo aptiktas naudojant Cellomics Array Skenavimo VTi 1700 plius (Thermo Scientific) pagal gamintojo protokolą (kiekviena grupė įtraukti penkis pakartotinius šulinius).
Confocal mikroskopija
Dėl Confocal mikroskopijos eksperimentai, ląstelės buvo auginamos laboratorijoje Tek 24-bei kameriniai skaidres (Thermo Fisher Scientific, JAV). Po nakties auginimo, ląstelės buvo nustatyti, plauti, ir padarytos laidžiomis su 0,3% Triton X-100 PBS 10 min. Tada, ląstelės buvo inkubuojamos su pirminių antikūnų prieš E-cad ir vimentin (skiedimo 1: 300, Abcam) per naktį 4 ° C temperatūroje. Ląstelės taip pat buvo inkubuojamos su Cy3-konjuguoto anti-triušio IgG (skiedimo 1:. 200 (Jackson imuniteto tyrimų, Vakarų Grove, Pensilvanija, JAV) 1 val kambario temperatūroje tamsoje ląstelės branduolį buvo counterstained naudojant DAPI 5 min . Fluorescencinis buvo stebimi ir fotografuojami su mikroskopas (Thermo Fisher Scientific, JAV).
gyvūnų tyrimai
dėl gyvūnų tyrimų, nuogas peles nuo 4 iki 6 savaičių amžiaus buvo įsigytos iš gyvūnų centras Kinijos mokslų akademijos (Šanchajus, Kinija) ir prižiūrimi laminarinio oro srauto spintos pagal konkrečius patogenais neužkrėstų sąlygomis. Visos procedūros eksperimentų su gyvūnais buvo atliekami laikantis institucinės gyvūnų globos ir vaistų komiteto gaires eksperimento gyvūnų centras ketvirtosios karo medicinos universitete.
tumorogeniš- nuogas Pelės
logaritmiškai augančioms ląstelėms buvo surinktos naudojant tripsino ir išplauti du kartus su PBS. Tada 2 × 10 6 ląstelių 0,2 ml buvo švirkščiamas į poodį į dešinę viršutinės nugaros srities pelių. Keturias savaites po to, kai buvo suleistas, naviko-guolis pelės buvo paaukotos, ir naviko dydis buvo nustatomas pagal apkaba matavimo poodinio naviko masės. Kiekvienas eksperimentinė grupė esančius 6 peles. buvo atlikti du nepriklausomi bandymai, ir jie davė panašius rezultatus.
uodegos venos metastazavusiu tyrimas
maždaug 2 × 10 6 ląstelės buvo sustabdytas 0,2 ml sterilaus PBS ir švirkščiamas į uodegą venose 10 pelių. tada Pelėms buvo stebimi naviko apimtį ir bendrą sveikatą ir jų plaučiai ir kepenys buvo nuolat stebimas naudojant vaizdavimo mikroskopu.
statistinė analizė
Visi statistinės analizės buvo atlikta naudojant SPSS 17.0 statistinį programinė įranga (SPSS, Inc., Chicago, illinois). buvo laikomi kintamieji su P vertė mažesnė nei 0,05 statistiškai reikšmingas. χ
2 testai buvo naudojami siekiant įvertinti skirtumų FOXO4 raiškos dažnį tarp GC audinių ir gretimų nontumorous skrandžio audinių reikšmę. T
-test (į vieną pusę ANOVA testas) buvo atliktas, siekiant įvertinti skirtumą tarp ląstelių proliferaciją, plokštės klonų ir migracijos tyrimų reikšmę. Bendras išgyvenamumas kreivės buvo brėžiamas naudojant Kaplan-Meier metodą ir buvo įvertintas statistinio reikšmingumo naudojant log-rank testą (Mann-Whitney U
bandymų ir Kruskal-Wallis H testas buvo priimtas kitais duomenimis).
Rezultatai
išraiška FOXO4 yra žemyn reguliuojama GC audinių ir ląstelių linijų
išnagrinėti, ar FOXO4 išraiška buvo pakeista GC pasakymas ir pavienių ląstelių tyri- mas lokalizacija FOXO4 buvo tiriamas audinio microarray 75 suporuotų GC mėginių, naudojant imunohistocheminiu. FOXO4 daugiausia buvo išreikštas dėl epitelio ląstelių, esančių skrandžio liaukų nontumorous audinių (1A1 pav) branduolių, bet maža suma buvo lokalizuota į citoplazmą. FOXO4 dažymo ir epitelio ląstelių iš GC mėginių buvo silpnas. Tačiau FOXO4 dažymo ir nontumorous audinių (NT) buvo nuosekliai stipresnis nei GC mėginių, ir ten buvo didelis skirtumas tarp dažymo rezultatus GC ir NT mėginių (1A2 pav) (p < 0,05) Mes Kitas matuojamas FOXO4 lygį nepriklausoma audinių mikrogardeliq skydelyje, kuriame yra 40 pirminių gCS ir atitinkamus limfmazgių metastazių pavyzdžius. Apskritai, GCS parodė mažesnę raišką lygį FOXO4 metastazių pakitimų palyginti su atitinkamu pirminių navikų mėginiuose (Skaičiai 1A3-A4), taip pat buvo išnagrinėtos .Sriegines ekspresijos lygis FOXO4 iki Vakarų dėmė ir RT-PGR GC ir gretimuose normaliuose audiniuose, gautų iš aštuoni pacientai (1b pav.) Septyniose iš aštuonių atvejais FOXO4 buvo nustatyta, kad sumažino išraišką vėžinių audinių, nuosekliai su rezultatais iš imunohistocheminiu analysis.We dar palyginti santykinius FOXO4 iRNR ir baltymų ekspresijos lygį tarp 6 skirtingų GC ląstelių linijas (bgc-823, SGC7901 , MKN28, AGS, 9811 ir MKN45) ir nemirtingi skrandžio epitelio ląstelių linija GES-1. Vėlgi, FOXO4 buvo išreikšta gana žemesniame lygyje visuose 6 GC ląstelių linijų, palyginti su įprastu nemirtingos skrandžio gleivinės epitelio GES-1 ląstelių linijos (1c pav). Šie rezultatai rodo, kad FOXO4 gali žaisti slopinančio vaidmenį skrandžio kancerogenezėje. 1 pav FoxO4 yra gerokai žemyn reguliuojama GC audinių ir ląstelių linijų. (A1) IHC analizė FOXO4 raiškos 75 suporuotų GC ir gretimų ne tumoro audiniuose. (A2) Statistinė analizė FOXO4 raiškos GC audinių ir gretimų ne tumoro skrandžio audinius. (A3) atstovas FOXO4expression aptiktų IHC metodus pradinių ir metastazavusiu GC audiniuose. (A4 formato) Statistinė analizė FOXO4 išraiškos tarp GC audinių su ir be mazgo metastazių. (B1-B2), Realaus laiko PGR ir Vakarų dėmė analizė FOXO4 išraiškos 8 porų GC ir gretimų ne tumoro audiniuose. (C1-C2) Realaus laiko PGR ir imunoblotingu analizė FOXO4 raiškos skirtingų GC ląstelių linijų.
FOXO4 slopina GC proliferaciją in vitro ir skatina ląstelių ciklo suėmimą į G0 /G1 fazės pervežimas Ištirti vaidmenį FOXO4 GC augimo, mes sukūrėme du stabilius ląstelių linijas (žymimas SGC7901-FoxO4 ir SGC7901-NC) po infekcijos su LV- FoxO4 ar LV-NC lentiviruso, atitinkamai. Po pakartotinio puromicino atrankos, AT-PGR ir Vakarų dėmė analizė patvirtino, kad SGC7901-FoxO4 parodė didesnį FOXO4 išraiška, palyginti su SGC7901-NC (pav 2A1-A2). MTT analizė parodė, kad iki-regulation FOXO4 išraiškos žymiai slopinamas GC ląstelių proliferaciją (2A3 paveiksle, P < 0,01) .Be Priešingai, BGC823 ląstelių linija, kuri turi santykinai endogeninio išraiška, buvo laikinai transfekuota su FOXO4 siRNA arba neigiamoje kontrolėje. Trys poros siRNA oligonukleotidų skirtomis FOXO4 susintetinti ir perkeltų į BGC823 ląstelių (BGC823-FOXO4si1, BGC823-FOXO4si2 ir BGC823-FOXO4si3) ir ląstelės transfektuotose siRNA oligo neigiama kontrolė buvo paženklinti BGC823-Sinc. KRL-PGR ir Vakarų dėmė parodė, kad siRNR oligo skaičius 1 buvo efektyviausia, todėl šis konstruktas buvo pasirinktas dėl papildomos studijos (pav 2B1-B2). Taigi, augimo kreivės rodo, kad žemyn reglamentuojantys FOXO4 išraiška lėmė padidėjusios platinimu tarp GC ląstelių (2B3 pav) Mes taip pat atliko plokštės kolonija formavimo tyrimą. Šie rezultatai parodė, kad SGC7901-FOXO4 ląstelės gaminamos mažiau ląstelių kolonijas, palyginti su SGC7901-NC kontrolinių ląstelių (pav 2C1-C2, P < 0,05). Be to, mes naudojome FACS analizę išnagrinėti FOXO4 poveikį ląstelių ciklą. SGC7901-FOXO4 ląstelės rodomas didelės G1 suėmimą ir S fazės mažinimas (pav 2D1-D2), kuri nurodė, kad FOXO4 slopino GC platinimu kaip G1 ląstelės ciklo arešto rezultatas. Siekiant sustiprinti šią pastabą, mes nustatėme, kad CyclinD1 išraišką kuri yra G1 fazės su Vakarų dėmė žymeklis, jis parodė, kad CyclinD1had santykinai didesnis išraiška 7801-NC ląstelių linijos, nei 7901-FOXO4 ląstelių (pav 2E1-E2). 2 pav poveikis FOXO4 ant reguliavimo GC ląstelių proliferaciją. (A1-A2) Santykinis išraiška FOXO4 į SGC-7901 ląstelių transfektuotose LV-FOXO4 ar LV-kontrolės, kuri buvo patvirtinta realiojo laiko PGR ir Vakarų dėmė analizė. Reikšmės atstovauti priemones iš trijų atskirų eksperimentų ir klaidų barai atstovauti SEM (** p < 0,01). (A3) proliferaciją normos ląstelių buvo matuojamas naudojant MTT. Vertės atstovauja priemones iš trijų atskirų eksperimentų, ir klaidų stulpelis rodo SEM (* p < 0,05). (B1-B2), santykinė išraiška FOXO4 į BGC-823 ląstelių transfektuotose FOXO4 oligo nukleotidų inhibitoriumi arba oligo nukleotidų kontrolės, kuri buvo patvirtinta realiojo laiko PGR ir Vakarų dėmė analizė. Reikšmės atstovauti priemones iš trijų atskirų eksperimentų ir klaidų barai atstovauti SEM (** p < 0,01). (B3) proliferaciją normos ląstelių buvo matuojamas naudojant MTT. Vertės atstovauja priemones iš trijų atskirų eksperimentų ir klaidų stulpelis rodo SEM (* P < 0,05). (C1-C2) kolonija formavimas SGC07901 ląstelių, transfekuotų su KS-FOXO4 ir LV-kontrolės buvo atliktas, pasėjant ląsteles ant plokščių 2 savaites, ir tada buvo suskaičiuotos kolonijų skaičius. Vertės atstovauja priemones iš trijų atskirų eksperimentų, ir klaidų stulpelis rodo SEM (* p < 0,05). (D1-D2) ląstelės ciklo platinimas SGC-7901 ląstelių transfektuotose LV-FOXO4 ar LV-kontrolė. Mobilusis ciklo analizė buvo atlikta 24 h po transfekciją. Ląstelės ciklo pasiskirstymas buvo apskaičiuotas ir išreikštas kaip vidurkis ± SD trijų atskirų eksperimentų. * P < 0,05. (E1 E2), santykinė išraiška CyclinD1 į SGC-7901 ląstelių transfektuotose LV-FOXO4 ar LV-kontrolės, kuri buvo patvirtinta Vakarų dėmė analizė. Reikšmės atstovauti priemones iš trijų atskirų eksperimentų ir klaidų barai atstovauti SEM (* p < 0,05).
FOXO4 slopina migracija ir invazija GC ląstelių in vitro
Įvertinti FOXO4 įtaką GC migracija ir invazija, kitą kartą įvertino FOXO4 raiškos poveikį invazinių ir migruojančių gebėjimų GC ląstelių naudojant in vitro transwell mėginiais. Rezultatai parodė, kad migracijos ir invazija SGC-7901-FOXO4 ląstelių abu buvo ypač sumažintas, palyginti su SGC-7901-AP kontrolės ląstelės (3A1 paveikslą). Priešingai, išeikvojimas FOXO4 gerokai skatinamas ląstelių migraciją ir invazija BGC823 ląstelių, palyginti su kontrolinės ląstelių (3A2 pav). Be to, aukštos turinys atrankos tyrimas parodė peristaltiką greitį SGC-7901-FOXO4 ląstelių yra gerokai mažesnis nei SGC-7901-NC ląstelių, 15/19 laiko taškai aiškiai parodė peristaltiką greitį SGC-7901-FOXO4 ląstelių yra mažesnė nei SGC-7901-NC ląstelės (3b pav.) Be to, žaizdų gijimo tyrimai parodė, kad SGC-7901-FOXO4 ląstelės uždarytas žaizdas lėčiau nei SGC-7901-NC ląstelės (Fig.3C) (p < 0,05). Kartu šie rezultatai parodė, kad FOXO4 žymiai pablogėti GC ląstelių migraciją ir invazija in vitro. 3 pav poveikis FOXO4 reguliuojant GC ląstelių metastazes. (A1-A2) Iki-reguliavimo FOXO4 raiškos LT-FOXO4 ląstelių sumažėjo SGC-7901 ląstelių migracija ir invazija in vitro, tuo tarpu FOXO4 raiškos slopinimo naudojant oligo nukleotidų inhibitoriaus FOXO4 sustiprintas BGC-823 ląstelių migracijos ir invazijos. (B), ląstelių migraciją pajėgumai buvo vertinami atliekant aukštos turinys ištirtas SGC-7901 ląstelių transfektuotose LV-FOXO4 ar LV-kontrolė. * P < 0,05 (C), ląstelių migraciją talpa taip pat buvo išbandytas atliekant žaizdų gijimo ištirtas SGC-7901 ląstelių transfektuotose LV-FOXO4 ar LV-kontrolė. * P < 0,05.
FOXO4 iki reguliavimą slopina tumorigenezei ir metastazes GC ląstelių in vivo
toliau patvirtinti apie FOXO4 poveikiui GC Tumorigenesis, navikas formavimas tyrimas buvo atliktas nuogas pelių. SGC7901-NC ir SGC7901-FOXO4 ląstelės buvo po oda pasėta į dešinę viršutinės nugaros srities nuogas pelių vienoje vietoje. Keturių savaičių, vėliau pelių, kurios buvo po oda Inokuliuotų buvo paaukotos, transplantuoto navikai buvo pašalintų, ir naviko dydžiai buvo įvertintas (pav 4A1-A3, P < 0,05). Tyrimo rezultatai atskleidė didelę sumažėjimas audiniuose, atsirandančių FOXO4 iki reguliuojama cells.To toliau tirti FOXO4 vaidmenį naviko metastazių in vivo dydžių, mes implantuoti SGC7901-NC ir SGC7901-FOXO4 ląsteles į nuogas pelių per šoninio uodegos venos , Atstovas Bioluminescent tomografijos (BLI) iš skirtingų grupių rodomas 4B1 paveiksle. Histologinis tyrimas dar kartą patvirtino, kad plaučių ir kepenų metastazių dažnis į SGC7901-FOXO4 grupės buvo gerokai sumažėjo, palyginti su SGC7901-NC grupės (4B2 paveiksle, B3). Plaučių metastazių mazgelių SGC7901-FOXO4 grupės skaičius taip pat buvo sumažintas, palyginti su SGC7901-NC grupės (duomenys neparodyti). Kepenų ir plaučių metastazės buvo toliau liudija hematoksilinu ir eozino dažymo (4c pav). Be to, SGC7901-FOXO4 grupė nuogas pelės parodė ilgiau bendro išgyvenamumo laiką, lyginant su SGC7901-NC grupės (4d pav.) Šie duomenys rodo, kad FOXO4 slopino GC mobilųjį tumorigenezei ir metastazes in vivo. 4 pav in vivo platinimu ir metastazes tyrimu. (A1-A3) SGC-7901 ląstelių transfektuotose LV-FOXO4 ar LV-kontrolė buvo persodinami po oda. Po šešių savaičių, augliai buvo aiškiau matyti pelėms implantuoti su 7901-NC ląstelių, palyginti su 7901-FOXO4 grupes: (6/6 per 7901-NC grupių ir 3/6 į 7901-FOXO4 grupių). Augliai buvo išpjaustytų ir matuojamas. (B1-B3) SGC-7901 ląstelių transfektuotose LV-FOXO4 ar LV-kontrolė buvo švirkščiamas į uodegą venose nuogas pelių. Dešimt savaičių pelių implantuoti su 7901-NC ląstelių parodė metastazes plaučiuose ir kepenyse, o metastazių keletas buvo aptikta pelių implantuoti su 7901-FOXO4 ląstelių: (plaučių metastazių, 6/10 per 7901-NC grupių ir 1/10 kad 7901-FoxO4 grupes, metastazių kepenyse, 3/10 ir 7901-NC grupių ir 0/10 ir 7901-FoxO4 grupėms. (C) vaizdai, rodantys atstovybę hematoksilinu ir eozinas dažymas plaučių ir kepenų audinių mėginių iš skirtingų eksperimentinių grupių * "P <.. 0,05 (d), bendrasis išgyvenamumas nuogas pelių kiekvienoje GROUP UAB molekuliniai mechanizmai FOXO4 į GC metastazių
ištirti galimą mechanizmus FOXO4 vaidmenį GC metastazių, mes išnagrinėjo išraiška metastazių susijusių molekulių, įskaitant E-cad, vimentin į SGC-7901-FOXO4 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901-NC kontrolinių ląstelių naudojant RT-PGR (pav 5A1-A2). rezultatai parodė, kad FOXO4 raiška ženkliai represuoti į vimentin išraišką, nors ne akivaizdu pakeitimas buvo pastebėtas E-cad. Imunofluorescenciniam confocal rezultatai taip pat davė panašius išvadas (pav 5B1-B2). 5 pav FOXO4 slopina EMT GC ląsteles. (A1-A2) Realaus laiko PGR parodė reguliuojama išraišką epitelio žymekliai (E-cad) bei pūkai reguliuojama išraiška mezenchiminių žymekliai (vimentin) į 7901-FOXO4 ląsteles. (B1-B2), imunofluorescenciniam parodė reguliuojama išraišką epitelio žymekliai (E-cad) ir žemyn reguliuojama išraiška mezenchiminių žymekliai (vimentin) į 7901-FOXO4 ląstelių.
Šie duomenys rodo, kad FOXO4 iš dalies gali paveikti GC ląstelių metastazės reguliuojant EMT procese, ir papildomus molekulinius mechanizmus bus tiriamas ateityje darbą.
Diskusijos
forkhead dėžutė klasės o (FOXO) šeimos transkripcijos veiksnių evoliuciškai užkonservuoti ir pasižymi vadinamuoju forkhead laukelį DNA- rišantis domenas. Žinduolių, The FOXO genų šeima susideda iš keturių narių: FOXO1, FOXO3A, FOXO4 ir FOXO6. Daug tyrimai parodė, kad FOXO baltymai vaidina svarbų vaidmenį įvairių įprastomis biologinių procesų metu, įskaitant ląstelių proliferacija, ląstelės ciklo suėmimo, stresas, ir apoptozės [10, 13, 14], taip pat ligų, tokių kaip vėžys ir cukrinis diabetas [15]. Tačiau yra mažai tyrimas pranešė apie FOXO4 vaidina GC vaidmenį.
Šioje studijoje, mes nustatėme, FOXO4 išraiška ne tumoro audiniuose buvo nuolat stipresnis nei GC mėginių ir GCS parodė mažesnę raišką lygis FOXO4 į Metastazės palyginant su atitinkamais pagrindinis navikų mėginiuose. Į FOXO4 iRNR ir baltymų ekspresijos lygis buvo tiek sumažinti įvairių rūšių GC ląstelių linijų, lyginant su normalių skrandžio gleivinės epitelio ląstelių linijos, tai rodo, kad FOXO4 gali tarnauti kaip neigiamas reguliatorius GC. Be to, padidėjusi išraiška FOXO4 išraiškos slopina auglio ląstelių augimą, invazija, ir metastazes in vitro ir in vivo, rodo, kad FOXO4 gali vaidinti svarbų vaidmenį GC progresavimo ir metastazių.
Mechanizmus, atsakingus už FOXO4 pokyčių poveikį GC plėtros ir progresavimo lieka neaiški. Keli naujausi tyrimai parodė, kad FOXO reguliuoja daugelį aspektų vėžio biologija. Pavyzdžiui, FOXO paprastai suvaržytas iki PI3K /Akt signalinio kelio, kuris neleidžia FOXO perkėlimas į branduolį, o FOXO reguliuoti transkripcijos atsakymus nepriklausomai nuo tiesioginio DNR privalomas per asociacijos su nesusijusių transkripcijos veiksnių [16] įvairovė. Mūsų rezultatai parodė, kad FOXO4 sukelta didelės G1 suėmimą ir S fazių sumažinti GC ląstelių, kuriame nurodyta, kad FOXO4 slopino GC proliferacija gali bent iš dalies iki G1 ląstelės ciklo arešto rezultatas.
Vienas iš svarbiausių žingsnis metastazavusiu kaskados yra procesas epitelio į mezenchimos perėjimo (EMT) [17, 18]. EMT proceso metu E-cad išraiška dažnai žemyn reguliuojama, o kuris iš vimentin dažnai rodo reguliuojama [19]. FOXO4 gali reguliuoti EMT skrandžio vėžio. Norėdami patikrinti šią hipotezę, mes įvertino E-cad ir vimentin išraiškas ląstelių modelių aukščiau. Nors nėra aišku, pakeitimas buvo pastebėtas E-cad, dramatiškas sumažėjimas vimentin išraiška buvo rodomas FOXO4 raiška ląstelių, lyginant su kontrolinių ląstelių, kaip nurodyta imunofluorescencinių tyrimo ir KRL-PGR. Šie tyrimai aiškiai rodo, kad FOXO4 gali slopinti skrandžio vėžio metastazių reguliuojant EMT.
Išvada
Apibendrinant, mūsų tyrimai rodo kritinę funkciją FOXO4 į GC platinimu ir metastazių slopinimo per G1 ląstelės ciklo suėmimo reglamentavimo ir EMT, rodo ji gali tarnauti kaip galimą terapinį tikslą skrandžio vėžio
Pastabos
Linna ŠU, Xiangqiang Liu Na Chai prisidėjo vienodai prie šio darbo
Santrumpos
FOXO4:..
Forkhead dėžutė O4 kategorijų transporto
BSA: Rīga, jaučio serumo albuminas
TBP: Rīga, diaminobenzidinas

KRL-PGR: Rīga, Realaus laiko kiekybine PGR
MTT: Rīga, 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2, 5-difenilo-tetrazolio bromidas
PBS: Rīga, fosfato buferinis tirpalas
DMSO.
dimetilsulfoksido


deklaracijų
nusipelniusieji
šis darbas parėmė Nacionalinis gamtos mokslo fondo Kinijos (dotacija skaičius 81.172.062, 81.270.445). Dėkojame prof Zengshan Li (departamentas Patologijos ne Xijing ligoninės) už pagalbą patologinės analizė. Taip pat dėkojame ponia Zuhong Tian už pagalbą su gyvūnų vaizdavimo eksperimentams. Autoriai atskleidžia ne galimiems interesų konfliktams
Elektroninės papildomą medžiagą
12885_2014_4601_MOESM1_ESM.doc Papildoma failą 1:. Lentelė S1: Informacija audinių masyvo (žmogaus skrandžio adenokarcinoma su suderintų gretimuose audiniuose). Visi autoriai skaityti ir patvirtino galutinį rankraštį.

• LIM homeodomain transkripcijos faktorius Isl1 nukreipia normalų prievarčio plėtrą nukreipiant Gata3
• Genetiniai polimorfizmas į osteopontinu promotoriaus padidina atstumas metastazių ir mirties Kinijos pacientams, sergantiems skrandžio cancer