D'Transkriptiouns Faktor FOXO4 Minus-reglementéiert an bremst entholl Prolifératioun an Metastasen zu gastric cancer

der Transkriptiouns Faktor FOXO4 Minus-reglementéiert an bremst entholl Prolifératioun an Metastasen zu gastric Kriibs VerfÜgung méiglech VerfÜgung Background VerfÜgung FOXO4, e Member vun der FOXO Famill vun Transkriptiouns Faktoren, ass am Moment de Schwéierpunkt vun intensiv studéieren. Seng Roll an Aufgab vun gastric Kriibs net vollstänneg opgekläert ginn. Déi heiteg Etude war fir den Ausdrock Profil vun FOXO4 zu gastric Kriibs an den Effet vun FOXO4 op Kriibs Zell Wuesstem an Metastasen ze ermëttelen. VerfÜgung Method VerfÜgung Immunohistochemistry, Western blotting an qRT-Hinnen alleguer gesuergt huet de FOXO4 Ausdrock ze entdecken an gastric Kriibs Zellen an Stoffer. Zell biologescher assays, subcutaneous tumorigenicity an Schwäif verfeelt metastatic assay a Kombinatioun mat lentivirus Konstruktioun waren standing den Impakt vun FOXO4 zu gastric Kriibs zu Prolifératioun an Metastasen kënschtlech an VIVO z'entdecken. Confocal an qRT-Hinnen alleguer waren standing de Mechanismen ze entdecken. VerfÜgung Resultater VerfÜgung Mir hu fonnt, datt de Begrëff vun FOXO4 war am meeschte gastric Kriibs Stoffer vill rofgaang ass an zu verschiddenen Mënsch gastric Kriibs Zell Linnen. Up-Regulatioun inhibited FOXO4 de Wuesstem an Metastasen vun gastric Kriibs Zell Linnen kënschtlech an Nerve dramatesch attenuation vun entholl Wuesstem, a Liewer an haett Metastasen zu VIVO hierkommen verwandelt-Regulatioun FOXO4 mat spezifesche siRNAs de Wuesstem an Metastasen vun gastric Kriibs Zell gefördert Linnen. Doriwwer eraus, hunn mir dass FOXO4 up-Regulatioun bedeitendst G1 verhaft an S Phase Reduktioun induce konnt an Ugrëff-Regulatioun vun den Ausdrock vun vimentin. VerfÜgung Conclusioun VerfÜgung Eis Daten hindeit, datt Verloscht vun FOXO4 Ausdrock dréit zu gastric Kriibs Wuesstem an Metastasen , an et kënnt wéi e Potential therapeutesch Zil fir gastric Kriibs déngen. VerfÜgung Schlësselwieder VerfÜgung FOXO4 gastric Kriibs prolifération Metastasen EMT Background VerfÜgung Obwuel d'Heefegkeet vun gastric Kriibs (GC) zréckgeet, dat bleift d'véiert stäerkste gemeinsam Kriibs an zweete Spëtzekandidat Ursaach vum Kriibs-Zesummenhang Doud weltwäit [1]. De Schlëssel Molekülle an Zell Prolifératioun an Metastasen am GC Werdegang Équipe kann zu Medeziner diagnosing Hëllef oder de Werdegang vun dëser Krankheet virausgesot. VerfÜgung entholl Wuesstem an Metastasen op verschiddene Facteuren ofhänken, dorënner Transkriptiouns Faktoren [2-5]. D'FOXO Transkriptiouns Faktoren Famill regruppéiert véier héich wëssenschaftlech Memberen: FOXO1, FOXO3, FOXO4, an FOXO6 [6-8]. An de leschte Joeren, goufen FOXO dës Distanz an eng Onmass vun bewosst Prozesser entscheedende Roll ze spillen, dorënner Prolifératioun, apoptosis, dat, Stress Resistenz, an metabolic Äntwerte [9], an dofir versprécht Ziler fir nei Medikamenter op de Beräich vun der Zukunft kënnen [10, 11]. VerfÜgung Eis virdrun Resultater bewisen, dass d'FOXO4 mRNA Ausdrock Niveau vun lymph Node-positiv colorectal carcinoma Stoffer Verglach zu lymph Node-negativ Stoffer dramatesch verwandelt-reglementéiert war, proposéiert et als negativ regulator vun der Funktioun kënnen Metastasen vun colorectal carcinoma [12]. Allerdéngs huet den Ausdrock a Funktioun vun FOXO4 zu gastric Kriibs nach net bekannt. D'Zil vun eiser Aarbecht ass méiglech Roll vun FOXO4 zu gastric Kriibs carcinogenesis ze ermëttelen. Hei, mir Rapport datt FOXO4 géint Zell Prolifératioun an Metastasen zu gastric Kriibs vun der Regulatioun G1 Zell-Zyklus verhaft an vimentin. VerfÜgung Method VerfÜgung Ray uplanzen VerfÜgung Fir Otemschwieregkeeten uplanzen, all Patienten Awëllegung gëtt iwwerschësseg agebousst ze benotzen uplanzen fir Fuerschung Zwecker. D'Ëmwelt- an dëser Etude benotzt sech duerch d'Spidol d'Protectioun vun de Mënscherechter Themen Comité ofgeseent. D'Benotze vu mënschlechen Stoffer war vun der institutioneller review Verwaltungsrot vun der véierter Military Medical Universitéit an conformed zu der Helsinki Deklaratioun, souwéi lokal Gesetzgebung guttgeheescht. Patienten Echantillon vun der Etude, déi ënnerschriwwen Awëllegung Formen. VerfÜgung Immunohistochemistry VerfÜgung Immunohistochemical staining war d'der avidin-biotin komplex immunoperoxidase Method standing benotzt. Der Primärschoul antibody géint FOXO4 (1: 100, ab63254, Abcam) verdënntem vun PBS mat 1% (virstellen /vol) Bovine serum albumin (BSA). Negativ kontrolléiert goufen duerch z'ersetzen der Primärschoul antibody mat Pre-immun Maus serum gesuergt. Biller waren mat engem DP70 digital Kamera equipéiert ënnert engem Liicht microscope (Olympus BX51, Olympus, Japan) kritt. Den Observatoire gouf den Identitéit vum demolege blinded wann ukomm immunoreactivity. VerfÜgung Evaluatioun vun staining VerfÜgung Fir Evaluatioun vun der Zell staining, de Rubriken vun zwee onofhängegen pathologists ouni Wësse vun der Klinik-agebousst Status vun der uplanzen iwwerpréift goufen . Zellen déi brong Kierchefënster huet sech gin positiv geduecht. Den Ausdrock vun FOXO4 war no der Verhältnis vu positive Zellen pro specimen (R) an staining Intensitéit (ech) bewäert. D'Verhältnis vu positive Zellen pro specimen Faarwen war wéi follegt zesummen: 0 fir staining vu &Si besteet; 1%, 1 fir staining vun 2% bis 25%, 2 fir staining vun 26% bis 50%, 3 fir staining vun 51% bis 75%, an 4 fir staining vu > 75% vun der iwwerpréift Zellen. D'Intensitéit graded sech wéi follegt: 0, kee Signal; 1, schwaach staining; 2, moderéiert staining; an 3, staark staining. . Oder positiv (+, 3-12) VerfÜgung Ray Kollektioun VerfÜgung Ray flamenden Ofgrond vum goufen kaaft: Eng total stoung (R × ech) vun 0 bis 12 Joer war et endlech esou negativ (0-2 -score) berechent an graded der Aomei Firma (Aomei C0124H, AM01C09, Aomei déi Co. Ltd., Xian, China) (Zousätzleche Fichier 1: Table S1 an Weider Fichier 2: Table S2). Fir d'westlech blot Analyse, GC Stoffer an bascht nontumorous Stoffer sech aus aacht Patiente kritt deen Agrëff an d'Pompjeeën vun General befënnt an eiser Spidol weiderentwéckelt huet. All Fäll vun GC an normal gastric mucosa sech klinesch an pathologically bewisen. D'Ëmwelt- an de Studien gebraucht goufen vun der Klinik an d'Protectioun vun de Mënscherechter Themen Comité ofgeseent. Patienten déi frësch chirurgesch Otemschwieregkeeten fir d'Etude matgehollef hat Awëllegung Formen ënnerschriwwen. VerfÜgung RNS erauszéien a real-Zäit Hinnen alleguer VerfÜgung Total RNS aus der Zellen war mat Trizol (Invitrogen, Karlsbad CA) ofgebaut, an cDNA Wierderbuch war mat de Premier Audiodateien RT reagent Kit (TaKaRa déi, Dalian, China) laut der Recommandatiounen d'Hiersteller. Eng Light LS Fast Start DNA Master SYBR Green ech System (Roche, Basel, Schwäiz) war fir d'real-Zäit Hinnen alleguer benotzt. GAPDH mRNA war wéi d'intern Kontroll, an d'Reaktioun Mëschung ouni de Skelett DNA gouf benotzt als negativ Kontroll benotzt. All vun der Echantillon waren onofhängeg dräimol gemooss. D'primer Message sech wéi follegt zesummen: GAPDH: (no) 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 "a (ëmgedréint) 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3"; FOXO4: (no) 5'-CTTTCTGAAGACTGGCAGGAATGTG-3 "a (ëmgedréint) 5'-GATCTAGGTCTATGATCGCGGCAG-3"; E-cadherin: (no) 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3'and (ëmgedréint) 5'- AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 "; an Vimentin: (no) 5'-CAGGCAAAGCAGGAGTCCAC -3'and (ëmgedréint) 5'-GCAGCTTCAACGGCAAAGTTC -3 ". All real-Zäit Hinnen alleguer Reaktioune waren am triplicate gesuergt. VerfÜgung Oligonucleotide Bau an lentivirus Produktioun VerfÜgung Dräi Puer siRNA oligonucleotides FOXO4 Reklamme vun GenePharma Co., Ltd. waren Déi GAPDH Message Wierderbuch sech als eng positiv Kontroll benotzt. An stinn Haaptrei war als negativ Kontroll (gëtt duerch GenePharma) benotzt. De Message sech wéi follegt zesummen: FOXO4 siRNA oligo-1: 5'-CGCGAUCAUAGACCUAGAUTTAUCUAGGUCUAUGAUCGCGTT-3 "(Sënn); FOXO4 siRNA oligo-2: 5'-CAGCUUCAGUCAGCAGUUATTUAACUGCUGACUGAAGCUGTT-3 "(Sënn); FOXO4 siRNA oligo-3: 5'-GUGACAUGGAUAACAUCAUTTAUGAUGUUAUCCAUGUCACTT-3 "(Sënn); GAPDH siRNA oligo (positiv Kontroll): 5'-GUAUGACAACAGCCUCAAGTT-3 "(Sënn); an negativ Kontroll: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ". (Sënn) VerfÜgung Laut den Hiersteller" kritt, FOXO4 siRNA oligos waren an Zellen transfected mat der siRNA-Mate ™ reagent (GenePharma Ltd., Shanghai, China). No cultured fir 2 bis 3 Deeg, goufen am Ganzen RNS an FAQ ofgebaut. Fir stabil transfection, engem lentiviral overexpression Vecteure (Lenti-FOXO4) gouf (Shanghai GeneChem Co., Ltd., Shanghai, China). Mat Hëllef vun engem GV166-Puro Vecteure (GeneChem Co., Ltd., Shanghai, China), engem lentiviral Vecteure datt GFP eleng ausgedréckt (LV-Kontroll) war als negativ Kontroll (NC). VerfÜgung Western blot VerfÜgung Gläich benotzt Montanten vun Proteinen sech mat Natrium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelies (SDS-PAGE) electrophoresis an transferéiert zu engem nitrocellulose Membran (Bio-Rad, Hercules, CA) getrennt. FOXO4 Kanéngchen polyclonal antibody (Abcam, 1: 500), CyclinD1 Kanéngchen polyclonal antibody (ImmunoWay, 1: 1000), β-actin Maus monoclonal antibody (Fläch, 1: 2.000), E-cadherin an Vimentin Kanéngchen polyclonal antibody (Santa Cruz, CA, 1:. 1000) antibodies fir der westlecher blot Experimenter benotzt goufen VerfÜgung Zell Prolifératioun assay VerfÜgung d'3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) assay war standing d'Vitesse vun Zell Prolifératioun ze diskutéieren, a war no normale Prozeduren gesuergt. Vunenee Linn war zu triplicate fonnt VerfÜgung Migratioun an Invasioun assay VerfÜgung Transwell Migratioun assays sech zu geännert Boyden CHAMBERS gesuergt (Transwell; Corning Galaxy Lowell, MA, USA). Op eng Dicht vu 5 × 10 3 Zellen pro gutt. No 24 h vu incubation bei 37 ° C, d'Zellen op den ënneschten Uewerfläch vun der Wells sech mat 4% paraformaldehyde, Kierchefënster mat 1% glaskloer mauve fix, an gezielt. VerfÜgung High-Inhalt Duerchmusterung assay VerfÜgung Zell motility war mat engem Cellomics Singular Scan VTI 1700 plus (Thermo wëssenschaftlech, USA) vermooss. An dowéinst, sech Zellen am Logbuch Phase gesammelt an plated an 96-gutt Placke (5 × 10 3 Zellen /gutt). No Iwwernuechtung Kultur bei 37 ° C fir Haftung, war d'Kultur mëttelfristeg mat serum-gratis RPMI1640 mëttelfristeg ersat, an der Kultur huet fir eng zousätzlech 24 h weider. Dunn, goufen Zellen zweemol mat Äis-kal PBS gewäsch a Kierchefënster mat Hoechst 33342 fir 15 min an eng incubator. Duerno, sech nees d'Zellen zweemol mat Äis-kal PBS gewäsch a fir verschidden Traitementer ausgesat. Zell motility war mat der Cellomics Singular Scan VTI 1700 plus (Thermo Wëssenschaftlech) nogewise no de Protokoll d'Hiersteller (all Grupp abegraff fënnef widderholl Wells). VerfÜgung Confocal microscopy VerfÜgung Fir confocal microscopy Experimenter, goufen Zellen ugebaut op déngt-Tek 24-gutt Chambre drënner (Thermo Fisher wëssenschaftlech, USA). No Iwwernuechtung culturing, goufen d'Zellen fix, gewäsch, a fir 10 min mat 0.3% Triton X 100 vun PBS permeabilized. Nuecht op 4 ° C: Dunn huet den Zellen mat Primärschoul antibodies géint E-cadherin an vimentin (300, Abcam dilution 1) incubated. . D'Zellen sech och mat Cy3-conjugated anti-Kanéngchen IgG (dilution 1 incubated: 200 (Jackson Jonker Fuerschung, West Grove, PA, USA) fir 1 h bei Raumtemperatur am däischteren der Zell ervirgaangen ass fir 5 min counterstained DAPI benotzt . Fluorescence war mat engem confocal microscope (Thermo Fisher wëssenschaftlech, USA).
Déieren Studien fir Déier Fuerschung, Sauna Mais 4 bis 6 Wochen vun Alter sech aus dem Déieren Center vun der chinesescher Academy vun Science kaaft iwwerwaacht a fotografeschen (Shanghai, China) an zu laminar Flux cabinets ënner bestëmmten pathogen-gratis Konditiounen haten. All Prozedure fir Déier trotzdeem sech am Aklang mat den institutionnelle Déieren Care an Benotzt Comité Richtlinnen vun der fonnt Déieren Center vun der véierter Military Medical University gesuergt.
Tumorigenicity zu VerfÜgung Sauna Mais Logarithmically wuessen Zellen sech mat trypsin an Katakombe zweemol mat PBS recoltéiert. Dunn, 2 × 10 6 Zellen vun 0,2 ml sech subcutaneously an uewen riets zréck Regioun vun der Mais heijen. Véier Wochen no inoculation, entholl-Träger Mais sech geaffert, an d'Gréisst vun der entholl war vun caliper Miessung vun der subcutaneous entholl Mass alles. All experimentell Grupp mat 6 Mais. Zwee onofhängeg Experiment gesuergt, an se Kriseperiod ähnleche Resultater. VerfÜgung Schwäif verfeelt metastatic assay VerfÜgung ongeféier 2 × 10 6 Zellen vun 0,2 ml vun steril PBS suspendéiert goufen an heijen de Schwäif z'eliminéieren vun 10 Mais. De Mais sech dann fir entholl Volumen a Punkto Gesondheet iwwerwaacht, an hiren Longen an livers goufen observéiert regelméisseg Imaging microscopy benotzt. VerfÜgung statistique Analyse VerfÜgung All statistesch Analyse gemaach goufen benotzt SPSS 17,0 statistesch Software (SPSS Galaxy, Chicago, Illinois). Verännerlechen mat engem P Wäert manner wéi 0,05 sech als statistesch relevant ze ginn. χ VerfÜgung 2 Tester benotzt goufen d'Bedeitung vun Differenzen an FOXO4 Ausdrock Frequenz tëschent GC Stoffer an bascht nontumorous gastric Stoffer ze diskutéieren. D't VerfÜgung Azeton (eng een-Manéier ANOVA Test) war standing d'Bedeitung vun der Differenz tëschent Zell Prolifératioun, zappen clones, a Migratioun assays ze diskutéieren. Allgemeng Survival Kéiren sech mat der Kaplan-Meier Method opgezeechent an sech fir statistesch Bedeitung benotzt Dir e Log-Platz Test (de Mann-Whitney U VerfÜgung Test an Kruskal-Wallis H Test fir aner Date goufen ugeholl) bewäert. VerfÜgung Resultater VerfÜgung Expression vun FOXO4 Minus-reglementéiert GC Stoffer an Zell Linnen VerfÜgung ze iwwerpréifen, ob de FOXO4 Ausdrock am GC verännert huet, d'Expressioun an subcellular Lokalisatioun vun FOXO4 sech zu engem Otemschwieregkeeten microarray vun 75 vläit GC Echantillon studéiert andems eng immunohistochemical assay. FOXO4 gouf haaptsächlech an de Kären vun epithelial Zellen am gastric Glands vun nontumorous Stoffer (Dorënner 1A1), mee eng kleng Zomm gouf un d'Zytoplasma en der wellkomm ausgedréckt. D'FOXO4 staining zu epithelial Zellen aus GC Echantillon war schwaach. Allerdéngs war d'FOXO4 staining zu nontumorous Stoffer (Wees) konsequent méi staark wéi déi vun de GC Echantillonen, an et gouf e groussen Ënnerscheed tëschent der staining Resultater vun de GC an Wees Echantillon (Dorënner 1A2) (P &Si besteet; 0,05) .We nächst gemooss erschéngt d'FOXO4 Niveau an eng onofhängeg Otemschwieregkeeten microarray 40 Primärschoul GCs an entspriechend lymph Node Metastasen uplanzen mat. Am Allgemengen, zougedréckt GCs engem nidderegen Ausdrock Niveau vun FOXO4 zu metastatic lesions Verglach zu den entspriechende Primärschoul entholl Echantillon (Sauerdall 1A3-A4) Éislek Ausdrock Niveau vun FOXO4 och aus kritt duerch westlech blot an RT-Hinnen alleguer am GC an bascht normal Stoffer iwwerpréift goufen aacht Patienten (Dorënner 1B). Am Kapitel vun der aacht Fäll, war FOXO4 fonnt reduzéiert Ausdrock vun kriibserreegend Stoffer ze hunn, konsequent mat de Resultater vun der immunohistochemistry analysis.We Verglach weider d'famill FOXO4 mRNA an FAQ Ausdrock Niveauen ënnert 6 verschidden GC Zell Linnen (BGC-823, SGC7901 , MKN28, AGS, 9811, an MKN45) an der onstierwlechen gastric epithelial Zell Linn GES-1. Erëm, FOXO4 war bei enger relativ niddreg Niveau vun all 6 GC Zell Linnen am Verglach zu der normaler onstierwlechen gastric mucosal epithelial GES-1 Zell Linn (Dorënner 1c) ausgedréckt. Dës Resultater hindeit, datt FOXO4 engem suppressive Roll an gastric carcinogenesis spille kann. Figur 1 FoxO4 ass bedeitend erof-reglementéiert GC Stoffer an Zell Linnen. (A1) IHC Analyse vun FOXO4 Ausdrock vun 75 vläit GC an bascht Net-tumorous Stoffer. (A2) statistique Analyse vun FOXO4 Ausdrock am GC Stoffer an bascht Net-tumorous Mo. Stoffer. (A3) Vertriederin FOXO4expression an der Primärschoul an metastatic GC Stoffer vun IHC Methode fonnt. (A4) statistique Analyse vun FOXO4 Ausdrock tëscht GC Stoffer mat an ouni Node Metastasen. (B1-B2) Real-Zäit Hinnen alleguer a westlech blot Analyse vun FOXO4 Ausdrock vun 8 Puer GC an bascht Net-tumorous Stoffer. (C1-C2) Real-Zäit Hinnen alleguer a westlech blotting Analyse vun FOXO4 Ausdrock vun verschidden GC Zell Linnen. VerfÜgung FOXO4 bremst GC Prolifératioun kënschtlech an induces Zell Zyklus verhaft am G0 /G1 Phase VerfÜgung d'Roll vun z'ënnersichen FOXO4 am GC Wuesstem, gegrënnt mir zwee stabil Zell Linnen (mat SGC7901-FoxO4 an SGC7901-NC) an der Wonn mat der LV- FoxO4 oder LV-NC lentivirus, bzw.. No widderholl puromycin Auswiel, RT-Hinnen alleguer an engem westlech blot Analys confirméiert datt SGC7901-FoxO4 héich FOXO4 Ausdrock zougedréckt Verglach zu SGC7901-NC (Dorënner 2A1-A2). D'MTT assay gewisen datt vill weider-Regulatioun vun FOXO4 Ausdrock d'Prolifératioun vu GC Zellen inhibited (Dorënner 2A3, P &Si besteet; 0.01) .In Kontrast, de BGC823 Zell Linn, déi relativ héich endogenous Ausdrock huet, war transiently mat FOXO4 siRNA transfected oder déi negativ Kontroll. Dräi Puer siRNA oligonucleotides FOXO4 gezielt goufen Wierderbuch a transfected an BGC823 Zellen (BGC823-FOXO4si1, BGC823-FOXO4si2, an BGC823-FOXO4si3), an Zellen mat siRNA oligo transfected negativ Kontroll goufen BGC823-siNC ausgezeechent. qRT-Hinnen alleguer a westlech blot zougedréckt datt siRNA oligo Nummer 1 war déi effektiv, sou, dat bauen fir weider studéieren (Dorënner 2B1-B2) ausgewielt gouf. An anere Wierder, uginn de Wuesstem Kéiren datt verwandelt-Regulatioun den Ausdrock vun FOXO4 zu fräi Prolifératioun ënnert GC Zellen schéinen (Dorënner 2B3) .We och eng Schossel Kolonie Opstellung assay gesuergt. Dës Resultater Teamchef SGC7901-FOXO4 Zellen manner Zell Kolonien produzéiert Verglach zu SGC7901-NC Kontroll Zellen (Dorënner 2C1-C2, P &Si besteet; 0,05). Nächst, déi mer FACS Analyse de Folge vun FOXO4 op der Zell Zyklus ze iwwerpréifen. SGC7901-FOXO4 Zellen ugewisen bedeitendst G1 verhaft an S Phase Reduktioun (Dorënner 2D1-D2), deen déi FOXO4 inhibited GC Prolifératioun wéi d'Resultat vun G1 Zell-Zyklus verhaft uginn. Fir dës Observatioun stäerken, mir den Ausdrock vun CyclinD1 fonnt déi e Bewaacher vun G1 Phas mat westlecher blot ass, ass et awer, datt CyclinD1had eng relativ héich Ausdrock an der 7801-NC Zell Linn wéi den 7901-FOXO4 Zellen (Dorënner 2E1-E2). Figur 2 Effekt vun FOXO4 op GC Zell Prolifératioun Regulatioun. (A1-A2) famill Ausdrock vun FOXO4 zu SGC-7901 Zellen transfected mat LV-FOXO4 oder LV-Kontrollen, déi vun real-Zäit Hinnen alleguer a westlech blot Analys confirméiert gouf. Déi Wäerter genügend Mëttelen aus dräi separat Experimenter, an de Feeler Baren vertrieden Sem (** P &Si besteet; 0.01). (A3) D'Verbreedung Tariffer vun Zellen sech gemooss der MTT assay benotzt. Déi Wäerter genügend Mëttelen aus dräi separat Experimenter, an de Feeler Baren vertrieden Sem (* P &Si besteet; 0,05). (B1-B2) famill Ausdrock vun FOXO4 zu BGC-823 Zellen transfected mat FOXO4 oligo Nukleotid inhibitor oder oligo Nukleotid Kontroll, déi vun real-Zäit Hinnen alleguer a westlech blot Analys confirméiert gouf. Déi Wäerter genügend Mëttelen aus dräi separat Experimenter, an de Feeler Baren vertrieden Sem (** P &Si besteet; 0.01). (B3) D'Verbreedung Tariffer vun Zellen sech gemooss der MTT assay benotzt. Déi Wäerter genügend Mëttelen aus dräi separat Experimenter an de Feeler Baren vertrieden Sem (* P &Si besteet; 0,05). (C1-C2) Kolonie Équipe vun SGC07901 Zellen transfected mat LV-FOXO4 an LV-Kontroll war fir 2 Wochen duerch Morden Zellen op Placke higeriicht, an d'Zuel vun de Kolonien huet dann gezielt. Déi Wäerter genügend Mëttelen aus dräi separat Experimenter, an de Feeler Baren vertrieden Sem (* P &Si besteet; 0,05). (D1-D2) Zell Zyklus Verdeelung vun SGC-7901 Zellen transfected mat LV-FOXO4 oder LV-Kontroll. Zell Zyklus Analyse huet 24 h der transfection gesuergt. D'Zell Zyklus Verdeelung war berechent an ausdrécke well heeschen ± Fils vun dräi separat Experimenter. * P &Si besteet; 0,05. (E1-E2) famill Ausdrock vun CyclinD1 zu SGC-7901 Zellen transfected mat LV-FOXO4 oder LV-Kontrollen, déi westlech blot Analys confirméiert gouf. Déi Wäerter genügend Mëttelen aus dräi separat Experimenter, an de Feeler Baren vertrieden Sem (* P &Si besteet; 0,05). VerfÜgung FOXO4 der Migratioun an Invasioun vun GC Zellen kënschtlech VerfÜgung bremst den Afloss vun FOXO4 op GC ze diskutéieren Migratioun an Invasioun, mir bewäert nächst den Effet vun FOXO4 Ausdrock op d'invasiv an Opbau Fähegkeeten vun GC Zellen kënschtlech transwell assays benotzt. D'Resultater weisen, datt d'Migratioun an Invasioun vun SGC-7901-FOXO4 Zellen sech virun allem am Verglach zu SGC-7901-NC reduzéiert souwuel Kontroll Zellen (Dorënner 3A1). Am Géigesaz, Ausschöpfung vun FOXO4 vill Zell Wanderung an Invasioun an BGC823 Zellen gefördert Verglach Zellen ze kontrolléieren (D'Grondidee 3A2). Ausserdeem, huet den héich-Inhalt Duerchmusterung assay der motility Vitesse vun SGC-7901-FOXO4 Zellen ass vill manner wéi SGC-7901-NC Zellen, 15/19 Kéier Punkten haut de motility Vitesse vun SGC-7901-FOXO4 Zellen zougedréckt ass manner wéi SGC-7901-NC Zellen (Dorënner 3B). Zousätzlech Meter-verkënnegt assays zougedréckt datt SGC-7901-FOXO4 Zellen Wonnen méi lues wéi SGC-7901-NC Zellen (Dorënner 3C) (P &Si besteet; 0,05) zougemaach. Zesumme, uginn dës Resultater datt FOXO4 vill GC Zell Wanderung an Invasioun kënschtlech leider. Figur 3 Effekt vun FOXO4 am GC Zell Metastasen Regulatioun. (A1-A2) Up-Regulatioun vun FOXO4 Ausdrock am LV-FOXO4 Zellen ofgeholl SGC-7901 Zell Wanderung an Invasioun kënschtlech hierkommen d'inhibition vun FOXO4 Ausdrock der oligo Nukleotid inhibitor vun FOXO4 verstäerkte BGC-823 Zell Wanderung an Invasioun benotzt. (B) Zell Migratioun Muecht war duerch eng héich-Inhalt assay zu SGC-7901 Zellen transfected mat LV-FOXO4 oder LV-Kontroll bewäert. * P &Si besteet; 0,05 (C) Zell Migratioun Muecht war och vun enger performanter e gudde Meter-verkënnegt assay zu SGC-7901 Zellen transfected mat LV-FOXO4 oder LV-Kontroll getest. * P &Si besteet; 0,05. VerfÜgung FOXO4 up-Regulatioun tumorigenesis an Metastasen vun GC Zellen zu VIVO VerfÜgung bremst Fir weider bestätegen d'Auswierkunge vun FOXO4 op der tumorigenesis vun GC, entholl Opstellung assay war an Sauna Mais gesuergt. SGC7901-NC an SGC7901-FOXO4 Zellen sech subcutaneously op engem eenzege Site un der riets uewen am Réck Regioun vun Sauna Mais inoculated. Véier Woche méi spéit, Mais datt subcutaneously inoculated sech geaffert huet, waren d'transplantéiert erhéijen excised, an der entholl Gréisste sech bewäert (Dorënner 4A1-A3, P &Si besteet; 0,05). D'Resultater e groussen Verloscht am Gréissten vun xenografts réischt doraus FOXO4 up-reegelen cells.To weider d'Roll vun FOXO4 zu entholl Metastasen zu VIVO beschen, implanted mir SGC7901-NC an SGC7901-FOXO4 Zellen an Sauna Mais duerch d'lateral Schwäif verfeelt . Vertrieder bioluminescent Imaging (BLI) vun de verschiddene Gruppen ass am Dorënner 4B1 gewisen. Histological Analyse weider confirméiert, dass d'Heefegkeet vun haett an Liewer Metastasen an der SGC7901-FOXO4 Grupp war vill rofgaang ass, am Verglach zu der SGC7901-NC Grupp (Dorënner 4B2, B3). D'Zuel vun haett metastatic noverfollegt am SGC7901-FOXO4 Grupp war och reduzéiert, am Verglach zu der SGC7901-NC Grupp (Donnéeën net gewisen). Liewer an haett Metastasen weider duerch hematoxylin an eosin staining (Dorënner 4C) Siicht. Ausserdeem, Gewise SGC7901-FOXO4 Grupp Sauna Mais laang Zäit allgemeng Iwwerliewe Verglach zu der SGC7901-NC Grupp (Dorënner 4D). Dës Donnéeë uginn dass FOXO4 GC Zell tumorigenesis an Metastasen zu VIVO opgeléist. Figur 4 Am VIVO Prolifératioun an Metastasen assay. (A1-A3) SGC-7901 Zellen transfected mat LV-FOXO4 oder LV-Kontroll huet sech ënnert d'Haut transplantéiert. Sechs Woche méi spéit, erhéijen sech méi kloer am Mais mat 7901-NC Zellen implanted gesinn als Verglach zu den 7901-FOXO4 Gruppen: (6/6 vun den 7901-NC Gruppen an 3/6 vun 7901-FOXO4 Gruppen). D'erhéijen sech Leschten an gemooss. (B1-B3) SGC-7901 Zellen transfected mat LV-FOXO4 oder LV-Kontroll huet sech an de Schwanz z'eliminéieren vun Sauna Mais heijen. Zéng Woche méi spéit, Mais implanted mat 7901-NC Zellen zougedréckt haett an Liewer Investitiounen hierkommen puer Investitiounen am Mais mat 7901-FOXO4 Zellen implanted festgestallt goufen: (fir Hëftprothes Metastasen, 6/10 vun den 7901-NC Gruppen an 1/10 an der 7901-FoxO4 Gruppen, fir Liewer Metastasen, 3/10 vun 7901-NC Gruppen an 0/10 vun 7901-FoxO4 Gruppen. (C) Biller weisen Vertrieder hematoxylin an eosin staining vun haett an Liewer Otemschwieregkeeten Echantillon vun de verschiddene experimentell Gruppen * P &si besteet;.. 0,05 (d) Allgemeng Iwwerliewe vun der Sauna Mais vun all Grupp VerfÜgung cuisine Mechanisme vun FOXO4 an der Metastasen vun GC VerfÜgung fir Potential Mechanismen fir d'Roll vun FOXO4 am GC Metastasen beschen, iwwerpréift mir den Ausdrock vun Metastasen-Zesummenhang Molekülle, dorënner E-cadherin, vimentin zu SGC-7901-FOXO4 an SGC-7901-NC Kontroll Zellen mat RT-Hinnen alleguer (dorënner 5A1-A2). d'Resultater weisen, datt FOXO4 overexpression Ofstand den Ausdrock vun vimentin repressed, obwuel keng kloer Verfall war fir E-cadherin observéiert. D'immunofluorescence confocal Resultater Kriseperiod och ähnlech Conclusiounen (Dorënner 5B1-B2). Figur 5 FOXO4 bremst EMT am GC Zellen. (A1-A2) Real-Zäit Hinnen alleguer opgedaucht-reegelen Ausdrock vun epithelial lues (E-cadherin) an Ugrëff-reegelen Ausdrock vun mesenchymal lues (vimentin) vun 7901-FOXO4 Zellen. (B1-B2) Immunofluorescence staining opgedaucht-reegelen Ausdrock vun epithelial lues (E-cadherin) an Ugrëff-reegelen Ausdrock vun mesenchymal lues (vimentin) vun 7901-FOXO4 Zellen. VerfÜgung Dës Donnéeë weisen, datt FOXO4 deelweis GC Zell Afloss kënnen Metastasen vun Regulatioun EMT Prozess, an zousätzlech molekulare Mechanisme gëtt an Zukunft Aarbecht studéiert ginn. VerfÜgung Diskussioun VerfÜgung d'forkhead Këscht Klass O (FOXO) Famill vun Transkriptiouns Facteuren ass evolutionarily conserved an Zeeche vun der sougenannter forkhead Këscht DNA- verbindlech Domän. An Mamendéieren, besteet d'FOXO Gentherapie Famill vu véier Memberen: FOXO1, FOXO3A, FOXO4, an FOXO6. Vill Studie berichten iwwer propedeutësch FOXO Proteinen eng wichteg Roll an enger Panoplie vu normal biologesche Prozesser Leeschtung, dorënner bewosst Prolifératioun, Zell Zyklus verhaft, Stress Äntwert, an apoptosis [10, 13, 14], souwéi am Krankheeten wéi Kriips a Zockerkrank [15]. Mä, do wéineg Etude ass iwwer d'Roll vun FOXO4 spillt zu GC gemellt. Am Moment studéieren VerfÜgung, hunn mir d'FOXO4 Ausdrock an Net-tumorous Stoffer déi konsequent méi staark war wéi vun der GC Echantillonen, an GCs zougedréckt engem nidderegen Ausdrock Niveau vun FOXO4 zu metastatic lesions Verglach zu den entspriechende Primärschoul entholl Echantillon. D'FOXO4 mRNA an FAQ Ausdrock Niveau sech zu verschiddenen Zorte vun GC Zell Linnen souwuel reduzéiert Verglach zu de normal gastric mucosal epithelial Zell Linn, suggeréiert datt FOXO4 als negativ regulator fir GC déngen kéinten. Ausserdeem, inhibited nik Ausdrock vun FOXO4 Ausdrock entholl Zell Wuesstem, Invasioun, an Metastasen kënschtlech an VIVO, wat beweist, datt FOXO4 eng Roll am GC Werdegang an Metastasen spille kann. D'Mechanisme verantwortlech fir den Impakt vun FOXO4 hire Restaurant op GC Entwécklung VerfÜgung an Werdegang bleiwen onkloer. Puer rezent Studien hunn uginn, datt FOXO vill Aspekter vun Kriibs Biologie reguléieren. Zum Beispill, ass FOXO normalerweis vun der PI3K /Akt sécher Passerelle schlau, déi FOXO br an den helle hält, an FOXO regléieren via Associatioun mat enger Rei vun stinn Transkriptiouns Faktoren transcriptional Äntwerte onofhängeg vun direkt DNA bindend [16]. Eis Conclusiounen zougedréckt datt FOXO4 bedeitendst G1 verhaft an S Phase Reduktioun vun GC Zellen entschlof, déi uginn datt FOXO4 inhibited GC Prolifératioun mannst deelweis kann duerch d'Resultat vun G1 Zell-Zyklus verhaft. VerfÜgung One kritescher Schrëtt an der metastatic CASCADE ass de Prozess vun epithelial zu mesenchymal Transitioun (EMT) [17, 18]. Während der EMT Prozess, huet den Ausdrock vun E-cadherin oft verwandelt-reegelen, während déi vun vimentin dacks weist-reegelen [19]. FOXO4 kann EMT zu gastric Kriibs regléieren. Fir dëst Hypothes Test, évaluéieren mir der Ausstralung vun E-cadherin an vimentin an der Zell Modeller uewen. Obwuel keng kloer Verfall fir E-cadherin, eng dramatesch Ofsenkung vun vimentin Ausdrock observéiert gouf an FOXO4 overexpression Zellen am Verglach zu der Kontroll Zellen gewisen, wéi vun immunofluorescent assay an qRT-Hinnen alleguer uginn. Dës Studien staark hindeit datt FOXO4 gastric Kriibs Metastasen inhibit kéint vun EMT Regulatioun. VerfÜgung Conclusioun VerfÜgung An Conclusioun, eiser Etude weist engem kriteschen Funktioun vun FOXO4 an der inhibition vun GC Prolifératioun an Metastasen via d'Regulatioun vun G1 Zell-Zyklus verhaft an EMT, proposéiert et als potentiell therapeutesch Zil fir gastric Kriibs déngen kann VerfÜgung Notes VerfÜgung Linna Su, Xiangqiang Liu, Na Chai matgehollef gläich un dëser Aarbecht VerfÜgung Croix VerfÜgung FOXO4:..
Forkhead Këscht O4
BSA: VerfÜgung Bovine serum albumin
botzt: VerfÜgung Diaminobenzidine

qRT-Hinnen alleguer: VerfÜgung Real-Zäit grouss Hinnen alleguer
MTT: VerfÜgung 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide
PBS: VerfÜgung Phosphate gefiermt Salins
DMSO:. VerfÜgung Police sulfoxide VerfÜgung
Deklaratioune VerfÜgung Merci VerfÜgung Dëst Wierk war déi National Natural Science Foundation of China (heimat Nummer 81172062, 81270445) ënnerstëtzt. Mir Merci Prof. Zengshan Li (Chiffer vun wirklech um Xijing Spidol) fir seng Hëllef an agebousst Analyse. Mir soen och Madame Zuhong Tian fir d'Hëllef mat Déier Imaging Experimenter. D'Auteuren verrode kee potentiell Konflikter vun Interessi VerfÜgung Electronic zousätzlecht Material VerfÜgung 12885_2014_4601_MOESM1_ESM.doc Weider Fichier 1:. Table S1: Information vun Otemschwieregkeeten vill (mënschlech gastric adenocarcinoma mat reagéiert bascht Stoffer). All Auteuren liesen an guttgeheescht der Finale mëttelalterlech Handschrëft. VerfÜgung

• LIM homeodomain Transkriptiouns Faktor Isl1 erfëllt normal pyloric Entwécklung vun Gata3
• Genetesch schiefgang an der osteopontin Promoteur erhéigt de Risiko vun Distanz Metastasen an Doud an Chinese Patienten mat gastric Kriibs