Faktor transkripcije FOXO4 se regulirati na dolje i inhibira proliferaciju tumora i metastaza u želučanom cancer

faktor transkripcije FOXO4 se regulirati na dolje i inhibira proliferaciju tumora i metastaza kod raka želuca pregled apstraktne pregled pozadine
FOXO4, član obitelj FOXO transkripcijskih faktora, trenutno je fokus intenzivnom studiju. Njegova uloga i funkcija kod raka želuca nisu u potpunosti razjašnjeni. Ova studija imala je za cilj istražiti profile ekspresije FOXO4 u rak želuca i učinak FOXO4 na rast stanica raka i metastaza. Pregled Metode pregled imunohemije, Western hibridizacija i QRT-PCR su izvedene za otkrivanje izraz FOXO4 u rak želuca stanice i tkiva. Stanica bioloških testova, subkutano tumorogenosti i repnu venu metastatski ispitivanje u kombinaciji s lentivirusa konstrukcije su provedena za otkrivanje učinka FOXO4 na rak želuca u proliferaciji i metastaze in vitro i in vivo. Osnove optike i QRT-PCR su izvedene za istraživanje mehanizama. Pregled Rezultati pregled Otkrili smo da je izraz FOXO4 je znatno smanjena u većini želučanog tkiva raka i na raznim ljudskim staničnim linijama karcinoma želuca. Doreguliranje FOXO4 inhibirali su rast i metastaziranje želučanog staničnih linija karcinoma in vitro i dovelo do dramatičnog atenuacije rasta tumora, a jetra i metastaze in vivo, dok je podreguliranje FOXO4 sa specifičnim iRNK promovirao rast i metastaziranje želučanog stanici raka linije. Nadalje, utvrdili smo da se reguliraju FOXO4 mogao izazvati značajan G1 uhićenje i smanjenje S faze i dolje regulaciji ekspresije vimentin. Pregled Zaključak
Naši podaci ukazuju da gubitak FOXO4 izražavanja doprinosi želuca rasta karcinoma i metastaza , a može poslužiti kao potencijalni terapijski cilj za rak želuca.
ključne riječi
FOXO4 rak želuca proliferacije Metastaza EMT Pozadina pregled Iako je incidencija karcinoma želuca (GC) je u opadanju, i dalje je četvrti najčešći rak i drugi vodeći uzrok karcinoma povezanih smrti u svijetu [1]. Ključni molekule uključene u proliferaciju stanica i metastaziranje u GC progresijom može pomoći u kliničkoj dijagnosticiranje ili predviđanje napredovanja bolesti.
Rast tumora i metastaze ovisi o raznim faktorima, uključujući faktore transkripcije [2-5]. FOXO transkripcijski faktori obitelj se sastoji od četiri vrlo srodne Članovi: FOXO1, FOXO3, FOXO4 i FOXO6 [6-8]. Posljednjih godina FOXO pokazano je da imaju vrlo bitnu ulogu u mnoštvo staničnih procesa, uključujući proliferaciju, apoptozu, diferencijacijom, otpornosti na stres i metabolički odgovora [9], te stoga mogu biti obećavajuće mete za novih lijekova u području onkologije [10, 11].
našim prethodnim rezultati pokazuju da FOXO4 mRNA razina ekspresije bila je značajno podregulirani u limfnim čvorovima-pozitivnih kolorektalnim karcinomom u usporedbi s tkivima limfnih čvorova-negativne tkiva predlaže se može funkcionirati kao negativan regulator metastaza kolorektalnog karcinoma [12]. Međutim, izraz i funkcija FOXO4 u rak želuca još nisu poznati. Cilj našeg rada bio je istražiti moguću ulogu FOXO4 u želučanom karcinogeneze raka. Evo, javili mi da je proliferacija FOXO4 potisnuti stanica i metastaziranje kod raka želuca od staničnog ciklusa uhićenje regulacija G1 i vimentin.
Metode pregled tkiva primjerci
Za uzorke tkiva, svi pacijenti pod uvjetom informirani pristanak za korištenje viška patoloških primjeraka za istraživačke svrhe. Protokoli koji se koriste u ovom istraživanju su odobreni od strane bolnice zaštitu ljudskih subjekata odbora. Korištenje ljudskih tkiva odobrila je institucionalni pregled odbora Vojnomedicinsku Sveučilišta u Četvrtoj i uskladiti s Helsinškom deklaracijom, kao i lokalnim propisima. Bolesnici daju uzorke za istraživanje la informirani pristanak oblika. Pregled Imunohistokemija pregled Imunokemijsko bojenje je izvedena korištenjem na avidin-biotin kompleks metoda imunoperoksidaznog. Primarna antitijela na FOXO4 (1: 100, ab63254, Abcam) razrijeđena u PBS koji sadrži 1% (m /V) bovinog serumskog albumina (BSA). Negativne kontrole su izvedeni zamjenom primarno antitijelo s prethodno imunološkog mišjeg seruma. Slike su dobiveni pod svjetlosnim mikroskopom (Olympus BX51, Olympus, Japan) opremljen s DP70 digitalnom kamerom. Promatrač je oslijepio na identitet uzoraka pri bodovanju imunoreaktivnost. Pregled Vrednovanje bojenje pregled Za procjenu stanične bojenja, sekcije su ispitana dva neovisna patologa, bez prethodnog znanja o klinici-patološka stanja uzoraka , Stanice koje su obojeni smeđe smatrani su za pozitivne. Izraz FOXO4 procijenjena je prema omjeru pozitivnih stanica po uzorku (R) i bojenje intenziteta (I). Omjer pozitivnih stanica po uzorku je postignuto na slijedeći način: 0 za bojenje < 1%, 1 za bojanje 2% do 25%, 2 za bojenje 26% do 50%, 3 za bojenje 51% do 75%, i 4 za bojenje > 75% stanica ispitanih. Intenzitet je ocijenjena kako slijedi: 0, nema signala; 1, slaba bojenje; 2, umjereno bojenje; i 3, intenzivno obojenje. Ukupno rezultat (R × I) od 0-12 konačno je izračunat i ocijenjena kao negativni (-score: 0-2). Ili pozitivnom (+, 3-12) pregled, skup tkiva pregled tkiva polja su kupljeni od tvrtka Aomei (Aomei C0124H, AM01C09, Aomei Biotehnologija Co Ltd, Xi'an, Kina) (Dodatni file 1: Tablica S1 i dodatno datoteka 2: Tablica S2). Za Western blot analizom, GC tkiva i susjedne nontumorous tkiva dobiveni su od osam pacijenata koji su bili podvrgnuti operaciji na Odjelu za opću kirurgiju u našoj bolnici. Svi slučajevi GC i normalne sluznice želuca klinički i patološki su dokazano. Protokoli koji se koriste u istraživanjima su odobreni od strane bolnice zaštitu ljudskih subjekata odbora. Pacijenti koji su pridonijeli svježe kirurški tkiva za proučavanje su potpisali informirani pristanak oblike. Pregled, ekstrakcija RNA i real-time PCR pregled Ukupna RNA iz stanica je izvađen pomoću Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), a cDNA se sintetizira reagens kit premijer Script RT (Takara Biotechnology, Dalian, Kina) u skladu s preporukama proizvođača. Svjetlo Cycler Fast Start DNA Master SYBR Green I System (Roche, Basel, Švicarska) korišten je za real-time PCR. GAPDH mRNA je korišten kao unutarnje kontrole i reakcijska smjesa bez templatnoj DNA se koristi kao negativna kontrola. Svi uzorci su mjereni neovisno tri puta. Nizovi primera su kao što slijedi: GAPDH: (naprijed) 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 'i (reverse) 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'; FOXO4: (naprijed) 5'-CTTTCTGAAGACTGGCAGGAATGTG-3 'i (natrag) 5'-GATCTAGGTCTATGATCGCGGCAG-3'; E-kadherina: (naprijed) 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3'and (natrag) 5'AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 '; i vimentin: (naprijed) 5'-CAGGCAAAGCAGGAGTCCAC -3'and (natrag) 5'-GCAGCTTCAACGGCAAAGTTC -3 '. Sve u realnom vremenu PCR reakcije provedene su u triplikatu. Pregled Oligonucleotide konstrukcija i lentivirus proizvodnje pregled Tri para siRNA oligonukleotida ciljaju FOXO4 su sintetizirani GenePharma Co., Ltd. GAPDH sekvence su korišteni kao pozitivna kontrola. Nevezano sekvenca korištena je kao negativna kontrola (koje GenePharma). Sekvence su bile kako slijedi: FOXO4 siRNA oligo-1: 5'-CGCGAUCAUAGACCUAGAUTTAUCUAGGUCUAUGAUCGCGTT-3 '(smislena); FOXO4 siRNA oligo-2: 5'-CAGCUUCAGUCAGCAGUUATTUAACUGCUGACUGAAGCUGTT-3 '(smislena); FOXO4 siRNA oligo-3: 5'-GUGACAUGGAUAACAUCAUTTAUGAUGUUAUCCAUGUCACTT-3 '(smislena); GAPDH siRNA oligo (pozitivna kontrola): 5'-GUAUGACAACAGCCUCAAGTT-3 '(smislena); i negativna kontrola: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 '. (razum) pregled skladu s uputama proizvođača' upute, FOXO4 siRNA oligonukleotidima su preseli u stanice pomoću siRNA-Mate ™ reagens (GenePharma doo, Šangaj, Kina). Nakon kultivirani tijekom 2 do 3 dana, ukupna RNA i protein se ekstrahira. Za stabilne transfekcije, lentivirusni pojačanom ekspresijom vektora (Lenti-FOXO4) konstruirana (Shanghai GeneChem Co, Ltd, Shanghai, Kina). Korištenje GV166-puro Vector (GeneChem Co, Ltd, Shanghai, Kina), lentivirusni vektor koji je izrazio GFP sam (LV-kontrola) korištena je kao negativna kontrola (NC).
Western blot pregled Jednaka količine proteina su razdvojeni pomoću natrij dodecil sulfat-poliakrilamid gel (SDS-PAGE) elektroforezom i transferirana na nitroceluloznu membranu (Bio-Rad, Hercules, CA). FOXO4 poliklono zečje antitijelo (Abcam, 1: 500), CyclinD1 poliklono zečje antitijelo (ImmunoWay, 1: 1000), β-aktin monoklonsko antitijelo miša (Sigma, 1: 2000), E-kadherinom i vimentin poliklono zečje antitijelo (Santa Cruz, CA, 1. 1000) antitijela su eksperimentima korišteni metodom Western blot pregled stanične proliferacije pregled 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil-tetrazolijev bromid (MTT) analiza je izvršena na procjenu brzine proliferaciju stanica, te je provedena prema standardnim postupcima. Svaka stanična linija otkrivena je u tri primjerka pregled migracije i invazije Test pregled Transwell migracija testovi provedeni u izmijenjenim Boyden komora (transjažičnim; Corning Inc Lowell, MA, USA). Pri gustoći od 5 × 10 3 stanica po dobro. Nakon 24 sata inkubacije na 37 ° C, stanice se na donjoj površini jažice su fiksirane s 4% paraformaldehidom, boje sa 1% kristalno ljubičastog i broje.
Screening ispitivanja visoke sadržaj pregled pokretljivost stanica bila ispitanika korištenjem Cellomics Array Scan VTI 1700 plus (Thermo Scientific, USA). Ukratko, stanice u logaritamske faze su sakupljene i nasađene na ploče s 96 jažica (5 × 10 3 stanica /jažici). Nakon prekonoćne kulture na 37 ° C za prianjanje, medij je zamijenjen s medijem bez seruma RPMI1640 i uzgajanje je nastavljeno tijekom dodatnih 24 h. Zatim, stanice su isprane dva puta s ledeno hladnim PBS-om i obojene s Hoechst 33342 15 minuta u inkubator. Nakon toga, stanice su ponovno isprane dva puta s ledeno hladnim PBS-om, a izložen različitim tretmanima. Pokretljivost stanica je otkriven pomoću Cellomics Array Scan VTI 1700 plus (Thermo Scientific) prema protokolu proizvođača (svaka grupa uključeno pet višekratnim bunara). Pregled Konfokalna mikroskopija pregled za Osnove optike mikroskopije eksperimente, stanice su rasle u Lab-Tek 24-te komorni slajdovi (Thermo Fisher Scientific, USA). Nakon noći uzgoja, stanice su fiksirane, isprane i natopljeni s 0,3% Triton X- 100 u PBS-u tijekom 10 min. Zatim, stanice su inkubirane s primarnim antitijelima protiv E-kadherina i vimentin (razrjeđenje 1: 300, Abcam) preko noći na 4 ° C. Stanice su također inkubirane sa Cy3-konjugiranim anti-IgG kunića (razrjeđenje 1:. 200 (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, USA) tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi u mraku stanična jezgra je kontrastno koristeći DAPI 5 min . fluorescencije je pratila i fotografirala s konfokalne mikroskopom (Thermo Fisher Scientific, USA).
životinja studije
Za životinjskog istraživanja golih miševa 4 do 6 tjedana starosti su kupljeni od životinja središte kineske akademije znanosti (Shanghai, Kina) i održava se u pločastim ormarića protoka u specifičnim uvjetima bez patogena. Svi postupci za pokuse na životinjama su provedena u skladu sa smjernicama Institucionalni Animal Care and Use Odbora pokusa na životinjama Center of Vojnomedicinsku Sveučilišta Četvrte.
tumorogenosti na miševe
logaritamski rastuće stanice sakupljene pomoću tripsina i ispere dva puta s PBS. Potom se dodaju 2 × 10 6 stanice u 0,2 ml ubrizgano je subkutano u desnu gornji dio leđa regiji miševa. Četiri tjedna nakon inokulacije, miševi koji nose tumor su žrtvovane, a veličina tumora je određen šestarskim mjerenjem potkožnog mase tumora. Svaka eksperimentalna skupina sadržavala 6 miševa. Dva neovisna eksperimenta, i dali su slične rezultate. Pregled repnu venu metastatski Test
približno 2 x 10 6 stanice su suspendirane u 0,2 ml sterilne PBS i injektira u repne vene 10 miševa. Miševi su tada prati za volumen tumora i cjelokupno zdravlje, a njihova pluća i jetre su redovito promatraju pomoću imaging mikroskopije.
Statistička analiza pregled Sve statističke analize provedene su pomoću SPSS 17.0 statističkog softvera (SPSS Inc., Chicago, Illinois). Varijable s P vrijednosti manje od 0,05 smatrane su statistički značajnima. χ pregled korištene su 2 testovi za procjenu značajnosti razlika u FOXO4 izražavanja frekvenciji između GC tkiva i susjednih nontumorous želučanog tkiva. T pregled -test (jednosmjerna ANOVA test) izvršena je procijeniti značaj razlika između stanične proliferacije, plate klonova i migracija testovima. Ukupni krivulje preživljavanja crtano pomoću Kaplan-Meier metodi i su procijenjeni na statističku značajnost pomoću log-rank testa (Mann-Whitney U pregled, testiranje i Kruskal-Wallis H testa su usvojene za ostale podatke). Pregled Rezultati pregled izražavanje FOXO4 je dolje regulirana u GC tkiva i staničnih linija
ispitati da li se FOXO4 promijenjen u GC, ekspresija i subcelularni lokalizacija FOXO4 su studirali u mikročipa tkiva od 75 uparenih uzoraka GC pomoću an immunohistochcmical test. FOXO4 uglavnom izražen u jezgrama epitelnih stanica koje su smještene u želučanim žlijezdama nontumorous tkiva (slika 1A1), a mala količina je lokaliziran u citoplazmu. FOXO4 bojenja u epitelnim stanicama iz uzoraka GC je bio slab. Međutim, FOXO4 bojanje u nontumorous tkivima (NT) je stalno jači od onog uzoraka GC, a tu je značajna razlika između rezultata bojanja u GC i uzoraka NT (Slika 1A2) (P < 0,05) Mi sljedeći mjeriti razinu FOXO4 na neovisan microarray tkiva ploči sadrži 40 osnovnih GCS i odgovarajuće limfnog čvora metastaziranja primjeraka. Sve u svemu, GCS je pokazao nižu razinu ekspresije FOXO4 u metastatskih lezija u odnosu na odgovarajuće uzorke primarnih tumora (Slike 1A3-A4) .The razinu ekspresije FOXO4 također ispituju Western analizom i RT-PCR na GC i susjednih normalnim tkivima dobivenim od osam bolesnika (slika 1B). U sedam od osam slučajeva FOXO4 je utvrđeno da imaju smanjenu ekspresiju u kancerogenih tkiva, u skladu s rezultatima iz imunohistokemijski analysis.We dalje u odnosu na relativne FOXO4 mRNA i proteina razina među 6 različitih GC staničnih linija (BGC-823, SGC7901 , MKN28, AGS, 9811, i MKN45) i besmrtni želuca epitelnih stanica linija GES-1. Ponovno, FOXO4 izražena je relativno nižim razinama sve stanične linije 6 GC u usporedbi sa normalnom besmrtne želučane sluznice epitela GES-1 stanične linije (Slika 1C). Ovi rezultati sugeriraju da FOXO4 mogu igrati ulogu u supresijski želuca karcinogeneze. Slika 1 FoxO4 je značajno pale regulirano u GC tkivima i stanicama. (A1) IHC analiza FOXO4 izražavanja u 75 uparenim GC i susjednih ne-tumorskih tkiva. (A2) Statistička analiza FOXO4 izražavanja u GC tkiva i susjednih ne-tumorskih želučanog tkiva. (A3) predstavnik FOXO4expression u primarnih i metastatskih GC tkiva otkrivenih IHC metodama. (A4) Statistička analiza FOXO4 izražavanja između GC tkiva sa i bez čvorova metastaza. (B1-B2) Real-time PCR i Western blot analiza FOXO4 izražavanja u 8 parova GC i susjednih ne-tumorskih tkiva. (C1-C2) Real-time PCR i Western blot analiza ekspresije FOXO4 u različitim GC staničnim linijama. Pregled FOXO4 inhibira proliferaciju GC in vitro i potiče staničnog ciklusa u fazi G0 /G1
Istražiti ulogu FOXO4 u rastu GC, osnovali smo dvije stabilne stanične linije (označen SGC7901-FoxO4 i SGC7901-NK) nakon infekcije s LV- FoxO4 ili LV-NC lentivirus, respektivno. Nakon ponovljenih izbora puromicinskom, RT-PCR i Western blot analiza je potvrdila da SGC7901-FoxO4 pokazuju višu ekspresiju FOXO4 odnosu na SGC7901-NC (Slika 2A1-A2). MTT je pokazalo da se na regulaciju FOXO4 ekspresije značajno inhibira proliferaciju GC stanicama (Slika 2A3, P 0,01) .U Nasuprot tome, stanična linija BGC823, koji ima relativno visoku ekspresije endogenog, se transfektirane sa FOXO4 siRNA ili negativna kontrola. Tri para siRNA oligonukleotida ciljaju FOXO4 sintetizirani su i transfektirani u BGC823 stanica (BGC823-FOXO4si1, BGC823-FOXO4si2 i BGC823-FOXO4si3), a stanice transficirane s siRNA oligonukleotidom negativna kontrola su označene BGC823-sinc. QRT-PCR i Western blot je pokazala da siRNA oligo broj 1 je bio najučinkovitiji, tako, ovaj konstrukt izabran je za daljnje proučavanje (Slika 2B1-B2). Prema tome, krivulje rasta ukazuje da podreguliranje ekspresija FOXO4 rezultirala je povećanom proliferacijom među GC stanicama (slika 2B3) Mi također izvesti test formiranje kolonija mikrotitarskih. Ovi rezultati su otkrili da SGC7901-FOXO4 stanice proizvele manje stanične kolonije u usporedbi sa stanicama SGC7901-NC kontrole (Slika 2C1-C2, P 0,05). Sljedeći, koristili smo FACS analizu da se ispitali efekti FOXO4 na stanični ciklus. SGC7901-FOXO4 stanice prikazuju značajan G1 uhićenje i S smanjenje faze (slika 2D1-D2) koja je pokazala da FOXO4 inhibiran GC proliferaciju kao rezultat G1 staničnog ciklusa uhićenje. Da bi pojačali ovu opasku, otkrio je izraz CyclinD1 koji je biljeg G1 faze s western blot, pokazalo se da CyclinD1had relativno veći izraz u staničnoj liniji od 7801-NC nego 7901-FOXO4 stanica u (Slika 2E1-E2). Slika 2 Učinak FOXO4 na regulaciju proliferacije GC stanica. (A1-A2) Relativna izraz FOXO4 u SGC-7901 stanicama zaraženim s LV-FOXO4 ili LV-kontrole, što je potvrđeno u realnom vremenu PCR i Western blot analize. Vrijednosti predstavljaju srednju iz tri odvojena pokusa, i granice pogreške predstavljaju SEM (** P 0,01). (A3) na proliferaciju stope stanica su mjereni primjenom MTT pokusa. Vrijednosti predstavljaju srednju iz tri odvojena pokusa, i granice pogreške predstavljaju SEM (* P 0,05). (B1-B2) Relativna izraz FOXO4 u BGC-823 stanicama zaraženim s inhibitorom FOXO4 oligo nukleotida ili kontrole nukleotida oligo, što je potvrđeno u realnom vremenu PCR i Western blot analize. Vrijednosti predstavljaju srednju iz tri odvojena pokusa, i granice pogreške predstavljaju SEM (** P 0,01). (B3) proliferacijom stope stanica su mjereni primjenom MTT pokusa. Vrijednosti predstavljaju sredstvo iz tri odvojena pokusa i odstupanja predstavljaju SEM (* P 0,05). (C1-C2) kolonija formiranje SGC07901 stanica transficiranih LV-FOXO4 i NN-kontrolu se provode cijepljenjem stanica na ploče tijekom 2 tjedna, a zatim se broje broj kolonija. Vrijednosti predstavljaju srednju iz tri odvojena pokusa, i granice pogreške predstavljaju SEM (* P 0,05). (D1-D2) distribucija staničnog ciklusa SGC-7901 stanicama zaraženim s LV-FOXO4 ili LV-kontrolu. Analiza staničnog ciklusa izvedena je 24 h nakon transfekcije. Raspodjelu staničnog ciklusa je izračunata i izražena kao srednja vrijednost ± SD za tri odvojena pokusa. * P < 0.05. (E1-E2) Relativna izraz CyclinD1 u SGC-7901 stanicama zaraženim s LV-FOXO4 ili LV-kontrole, što je potvrđeno Western blot analize. Vrijednosti predstavljaju sredstvo iz tri odvojena pokusa, i odstupanja predstavljaju SEM (* P < 0,05). Pregled FOXO4 inhibira migraciju i invaziju GC stanicama in vitro pregled Procijeniti utjecaj FOXO4 na GC migraciju i invaziju, mi pored ocjenjuje učinak FOXO4 izražavanja na invazivne i migracijskim sposobnostima GC stanice pomoću in vitro Transwell® testovima. Rezultati su pokazali da se migracija i invazija SGC-7901-FOXO4 stanica i posebno smanjene u usporedbi sa SGC-7901-NC kontrolne stanice (Slika 3A1). Nasuprot tome, iscrpljivanje FOXO4 značajno promovira staničnu migraciju i invaziju u BGC823 stanica uspoređeno s kontrolnim stanicama (slika 3A2). Nadalje, test visokog sadržaja probir je pokazao brzinu pokretljivosti SGC-7901-FOXO4 stanica je znatno niže od SGC-7901-NC stanica, 15/19 vremenskih točaka jasno su pokazali brzinu pokretljivosti SGC-7901-FOXO4 stanica je niža od SGC-7901-NC stanice (Slika 3b). Pored toga, testovi za liječenje rana pokazali da SGC-7901-FOXO4 stanice sporije zatvorene rane od SGC-7901-NC stanice (Slika 3C) (P 0,05). Ovi rezultati pokazuju da FOXO4 značajno ugrožena migraciju GC stanice i invaziju in vitro. Slika 3 Učinak FOXO4 u reguliranju GC stanica metastaza. (A1-A2) doreguliranjem ekspresije FOXO4 u LV-FOXO4 stanica smanjio SGC-7901 migracija stanica i prodiranje in vitro, a inhibicija FOXO4 ekspresije pomoću inhibitora oligo nukleotida FOXO4 poboljšane BGC-823 stanične migracije i invazije. (B) migracija stanica kapacitet procijenjen je izvođenjem visokog sadržaja test u SGC-7901 stanicama zaraženim s LV-FOXO4 ili LV-kontrolu. * P < 0.05 (C) migracija stanica kapaciteta također je ispitan izvođenjem testa za liječenje rana u SGC-7901 stanicama zaraženim s LV-FOXO4 ili LV-kontrolu. * P < 0.05. Pregled FOXO4 up-regulaciji inhibira tumorigenezi i metastaza GC stanicama in vivo pregled Kako bi dodatno potvrdili učinke FOXO4 na tumorigenezi GC, test formiranje tumora je provedeno na miševe. SGC7901-NC i SGC7901-FOXO4 stanice su potkožno nasadi se u desnom gornjem stražnjem dijelu golih miševa na jednom mjestu. Četiri tjedna kasnije, miševi koji su potkožno Inokulirane su žrtvovane, transplantirane tumori su bili odstranjeni i veličine tumora su ispitani (Slika 4A1-A3, P 0,05). Rezultati su pokazali značajno smanjenje u veličinama ksenografta proizlaze iz FOXO4 doregulirani cells.To daljnje istraživanje uloge FOXO4 tumorskih metastaza in vivo, ugrađuju se SGC7901-NC i SGC7901-FOXO4 stanica u golim miševima kroz bočnu repnu venu , Prikazuje bioluminiscentni imaging (BLI) različitih skupina prikazana je na slici 4B1. Histološka analiza nadalje potvrđeno je da je incidencija raka pluća i metastaze jetre u SGC7901-FOXO4 skupine bio je značajno smanjen u odnosu na SGC7901-NC skupine (Slika 4B2, B3). Broj pluća metastatskih čvorova u SGC7901-FOXO4 grupe također je smanjen, u usporedbi s SGC7901-NC skupini (podaci nisu prikazani). Jetre i metastaze su dalje pokazuje hematoksilinskom i eozinskom bojenju (slika 4c). Nadalje, SGC7901-FOXO4 grupa miševe pokazala više sveukupno vrijeme preživljenja u odnosu na SGC7901-NC skupine (slika 4D). Ovi podaci pokazuju da FOXO4 potisnuti GC stanica tumorigenezi i metastaza in vivo. Slika 4 u proliferaciji vivo i metastaza testu. (A1-A3) sGC 7901 stanice transficirane s LV-FOXO4 ili LV kontrole transplantirani pod kožu. Šest tjedana kasnije, tumori su jasnije vidjeti u miševa usađene 7901-NC stanica u usporedbi s 7901-FOXO4 skupine: (6/6 u 7901-NC i 3/6 u 7901-FOXO4 skupine). Tumori su izrezani i izmjeriti. (B1-B3) sGC 7901 stanice transficirane s LV-FOXO4 ili LV kontrole se injektira u repne vene golih miševa. Deset tjedana kasnije, miševi implantirani 7901-NC stanicama pokazali pluća i jetre metastaze, dok su nekoliko metastaze otkrivena u miševa implantanog 7901-FOXO4 stanica: (za plućne metastaze, 6/10 u 7901-NC skupina i 1/10 u u 7901-FoxO4 skupina, metastaze jetre, 3/10 u 7901-NC i 0/10 u 7901-FoxO4 skupina. (C) Slike prikazuju reprezentativne hematoksilinskom i eozinskom bojenju pluća i jetre uzorci tkiva iz različitih eksperimentalnih skupina * P '.. 0.05 (D) Ukupno preživljenje od golih miševa u svakoj grupi
Molekularni mehanizmi FOXO4 u metastazi GC
Kako bi istražili potencijalne mehanizme za ulogu FOXO4 u GC metastaza, ispitali smo izraz molekula metastaza povezanih, uključujući i E-kadherina, vimentin u SGC-7901-FOXO4 i SGC-7901-NC kontrolnim stanicama pomoću RT-PCR (Slika 5A1-A2). Rezultati su pokazali da FOXO4 pojačana ekspresija značajno potisnuti ekspresiju vimentin, iako nema očitih promjena zabilježena je za E-kadherina. Rezultati imunofluorescencija konfokalnom također dala slične zaključke (Slika 5B1-B2). Slika 5 FOXO4 inhibira EMT u GC stanicama. (A1-A2) Real-time PCR pokazala regulira prema gore ekspresiju epitelnih markera (E-kadherina) i dolje-regulira ekspresiju mezenhimalnim markera (vimentin) u 7901-FOXO4 stanica. (B1-B2) Imunofluorescencija bojenje je pokazalo doregulira ekspresiju epitelnih markera (E-kadherin), a podregulirani ekspresija mezenhimalnih markera (vimentin) u 7901-FOXO4 stanicama.
Ovi podaci ukazuju da FOXO4 može djelomično utjecati GC stanice metastaze reguliranjem procesa EMT i dodatne molekularnim mehanizmima će se proučavati u budućem radu. pregled Rasprava pregled The forkhead kutija klase o (FOXO) obitelj transkripcijskih faktora je evolucijski konzerviran i karakterizira tzv forkhead kutiji DNA- vezna domena. U sisavaca, gen obitelj FOXO sastoji se od četiri člana: FOXO1, FOXO3A, FOXO4 i FOXO6. Brojne studije su pokazale da FOXO proteini imaju važnu ulogu u širokom rasponu normalnih bioloških procesa, uključujući staničnu proliferaciju, staničnog ciklusa, odgovoru na stres i apoptozu [10, 13, 14], kao i kod bolesti kao što je rak i dijabetes melitus [15]. Međutim, malo je studija izvijestila je o ulozi FOXO4 igra u GC.
U ovoj studiji, pronašli smo FOXO4 izraz u ne-tumorskog tkiva, dosljedno je jači od onog uzoraka GC i GCS pokazali nižu ekspresiju razina FOXO4 u sekundarizma usporedbi s odgovarajućim uzorcima primarnog tumora. Razine FOXO4 mRNA i proteina se reduciraju u različitim vrstama staničnih linija GC odnosu na normalnu želučane sluznice stanična linija epitelnih stanica, što ukazuje da FOXO4 može poslužiti kao negativni regulator za GC. Osim toga, pojačana ekspresija FOXO4 izražavanja potiskivao rast tumorskih stanica, invaziju i metastaziranje in vitro i in vivo, što pokazuje da FOXO4 može igrati ulogu u GC progresije i metastaziranja.
Mehanizme odgovorne za utjecaj FOXO4 promjena na razvoj GC i napredovanje ostaju nejasni. Nekoliko nedavnih istraživanja su pokazala da FOXO regulira mnoge aspekte biologije raka. Primjerice FOXO normalno vezana od PI3K /Akt signalnog puta, čime se sprječava FOXO translokacije u jezgru, a FOXO regulaciju transkripcije odgovora neovisno izravno vezanje DNA putem zajedno s nepovezanih faktora transkripcije [16]. Naši rezultati su pokazali da FOXO4 izazvana značajan G1 uhićenje i S smanjenje faza u GC stanicama, što ukazuje da je FOXO4 inhibiran GC proliferacija može barem djelomice rezultat G1 staničnog ciklusa uhićenje.
Jedan ključan korak u metastatskim kaskadi je proces epitela na mczcnhimnog tranziciji (EMT) [17, 18]. Tijekom procesa EMT, izraz E-kadherina je često dolje regulirano, a koji je od vimentin često pokazuje se regulira prema [19]. FOXO4 mogu regulirati EMT u raka želuca. Da bi testirali tu hipotezu, procjenjuje iskaza E-kadherina i vimentin u modelima stanica iznad. Iako se više ne primjećuje očita promjena za E-kadherina, dramatičan pad vimentin izraza je prikazan u FOXO4 prekomjerne ekspresije stanica u usporedbi s kontrolnim stanicama, kao što je navedeno od strane imunofluorescentnim testom i QRT-PCR. Ove studije snažno sugeriraju da FOXO4 može spriječiti želučane metastaziranje raka reguliranjem EMT. Pregled Zaključak
U zaključku, naša studija pokazuje kritičnu funkciju FOXO4 u inhibiciju proliferacije GC i metastaza putem regulacije G1 staničnog ciklusa uhićenje i EMT, sugerira on može poslužiti kao potencijalni terapijski cilj za rak želuca pregled Bilješke pregled Linna Su, Xiangqiang Liu na Chai doprinijeli jednako na ovom poslu pregled Kratice pregled FOXO4..
Forkhead kutija O4
BSA: pregled goveđeg serumskog albumina
DAB: pregled Diaminobenzidin

QRT-PCR: pregled, u stvarnom vremenu kvantitativni PCR
MTT: pregled 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2, 5-difenil-bromida
PBS: pregled fosfatom puferirana slana otopina
DMSO.
dimetil sulfoksidu pregled
pregled deklaracija
Zahvale
ovaj rad je podržan od strane Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine (grant broj 81172062, 81270445). Zahvaljujemo prof Zengshan Li (Zavod za patologiju na Xijing bolnici) za pomoć u patološku analizu. Također zahvaljujemo gospođi Zuhong Tian za pomoć pri životinja imaging eksperimenata. Svi autori pročitali i odobrili konačnu rukopis. Pregled

• LIM homeodomain transkripcijski faktor Isl1 usmjerava normalan pilorusa razvoj ciljajući Gata3
• Genetski polimorfizmi u osteopontina promotora povećava rizik od udaljenosti metastaza i smrti kineskih pacijenata s rakom želuca