transkripcijski faktor FOXO4 IS navzdol urejen in zavira tumorskih in metastaz pri raku želodca

transkripcijski faktor FOXO4 IS navzdol regulirano in zavira tumorskih in metastaz pri raku želodca
Abstract
Ozadje
FOXO4, član družine FOXO transkripcijskih faktorjev, je trenutno v središču intenzivnega študija. Njegova vloga in funkcija pri raku želodca niso bili v celoti pojasnjeni. Sedanje raziskave je bil raziskati profila ekspresije FOXO4 na raka želodca in učinek FOXO4 na rast rakavih celic in metastaz.
Metode
imunohistokemija, Western blot in QRT-PCR smo izvedli za odkrivanje izraz FOXO4 v želodca rakave celice in tkiva. Celične biološki testi, podkožne tumorogenosti in rep venska metastatskega vsebnosti v kombinaciji z lentivirusom konstrukcijo smo izvedli za ugotavljanje učinka FOXO4 do raka želodca v proliferacije in metastaz in vitro in in vivo. Konfokalni in QRT-PCR smo izvedli raziskati mehanizme.
Rezultati
Ugotovili smo, da je bil izraz FOXO4 v večini želodčnih tkiva raka in v različnih človeških želodčnih raka celičnih linijah bistveno zmanjšala. Up-regulacijo FOXO4 zaviral rast in metastaze želodčnih linij rakavih celic in vitro in privedlo do dramatične slabljenja rasti tumorja, in jeter in pljuč metastaze in vivo, pa navzdol ureja FOXO4 s posebnimi siRNAs spodbuja rast in metastaze želodčnega rakave celice linije. Poleg tega smo ugotovili, da up-urejanje FOXO4 lahko povzroči pomembno G1 aretaciji in S zmanjšanje fazo in down-regulacije izražanja vimentina.
Zaključek
Naši podatki kažejo, da izguba FOXO4 izražanja prispeva k želodca rasti in metastaz raka in lahko služi kot potencialnega terapevtskega cilja za raka želodca.
Ključne besede
FOXO4 rak želodca orožja Metastasis EMT Ozadje
Čeprav se je incidenca raka želodca (GC) se zmanjšuje, je še četrti najpogostejši rak in drugi vodilni vzrok smrti zaradi raka na svetu [1]. Ključne molekule, ki sodelujejo v celično proliferacijo in metastaz pri napredovanju GC lahko pomaga v klinični diagnosticiranje ali napovedujejo napredovanje te bolezni.
Rast tumorjev in metastaz odvisna od različnih dejavnikov, vključno transkripcijskih faktorjev [2-5]. Družina FOXO transkripcijski faktorji obsega štiri zelo sorodne članov: FOXO1, FOXO3, FOXO4 in FOXO6 [6-8]. V zadnjih letih so bili FOXO pokazale, da igrajo ključne vloge v množico celičnih procesov, vključno orožja, apoptoza, diferenciacija, odpornost na stres, in presnovnih odzivov [9], in so zato lahko obetavne tarče za nova zdravila na področju onkologije [10, 11].
Naši rezultati prejšnjih pokazala, da je raven izražanja FOXO4 mRNA močno navzdol urejeno v bezgavk pozitivnih debelega črevesa in tkiv karcinoma v primerjavi z bezgavk negativne tkiv, je predlagal, da lahko deluje kot negativni regulator metastaze kolorektalnega raka [12]. Vendar pa izraz in funkcija FOXO4 raka želodca še niso bili znani. Namen našega dela je bil, da razišče morebitno vlogo FOXO4 v želodcu rakotvornost raka. Tu poročajo, da FOXO4 zatiranje proliferacija celic in metastaz pri raku želodca s prijetjem je celičnega cikla ureditev G1 in vimentina.
Metode
tkiva osebki
Za vzorcev tkiva, vsi bolniki če soglasja za uporabo prekomerne patološke vzorci za raziskovalne namene. Protokoli, ki se uporabljajo v tej študiji so bili odobreni z zaščito bolnišnice o ljudeh odbora. Uporaba človeških tkiv je odobril Institutional Review Board četrtega vojaške Medical University in je skladna s Helsinške deklaracije, kot tudi lokalno zakonodajo. Bolniki, ki zagotavljajo vzorcev za raziskavo podpisali premišljene oblike soglasij.
Imunohistokemija
Imunohistokemijsko je bila izvedena s pomočjo kompleksne metode imunoperoksidazni na avidin-biotin. Primarna protitelesa proti FOXO4 (1: 100, ab63254, Abcam) razredčimo v PBS, ki vsebuje 1% (mas /vol) govejega serumskega albumina (BSA). Negativne kontrole smo izvedli z zamenjavo primarnega protitelesa s predhodno imunskega seruma miške. Slike smo pridobili pod svetlobnim mikroskopom (Olympus BX51, Olympus, Japonska), ki je opremljen z digitalnim fotoaparatom DP70. Opazovalec je bil zaslepljen z identiteto vzorce, ko točkovanja radioinkorporacijo.
Vrednotenje obarvanje
Za oceno barvanje celic, so odseki pregledala dva neodvisna patologi brez predhodnega poznavanja statusa kliniki patoloških od vzorcev . Celice, ki so se obarvajo rjavo so menili, da je pozitivna. Izraz FOXO4 smo ovrednotili glede na razmerje pozitivnih celic na osebek (R) in barvanja intenzitete (I). Razmerje pozitivnih celic na vzorcu, je dosegel takole: 0 za barvanje < 1% 1 za obarvanje 2% do 25%, 2 za obarvanje 26% do 50%, 3 za obarvanje 51% do 75%, in 4 za barvanje > 75% celic pregledanih. Intenzivnost je bila ocenjena na naslednji način: 0, ni signala; 1, šibka madeži; 2, zmerno obarvanje; in 3, močno obarvanje. Skupna ocena (R × I), od 0 do 12 je bil na koncu izračuna in ocenjena kot negativna (-score: 0-2). Ali pozitivnega (+, 3-12)
Tissue zbirka
tkiva nizi so bili kupljeni od Aomei družba (Aomei C0124H, AM01C09, Aomei Biotechnology Co. Ltd., Xi'an, Kitajska) (Dodatni datoteka 1: Tabela S1 in dodatna datoteka 2: Tabela S2). Za zahodni blot analizo, so GC tkiva in sosednjih nontumorous tkiva, pridobljena iz osmih bolnikih, ki so prestali operacijo na Oddelku za splošne kirurgije v naši bolnišnici. Vsi primeri GC in normalno želodčne sluznice so klinično in patološko dokazano. Protokoli, ki se uporabljajo v študijah, so bili potrjeni s varstvu bolnišnici dne ljudeh odbora. Bolniki, ki so prispevali sveže kirurški tkiva za študijo je podpisala premišljene oblike soglasij.
Ekstrakcijo RNA in PCR v realnem času
Total RNA iz celic je izvlečejo z TRIzola (Invitrogen, Carlsbad, CA), in cDNA smo sintetizirali z uporabo Predsednik Script RT reagent kit (Takara Biotechnology, Dalian, Kitajska), v skladu s priporočili proizvajalca. Light ciklerja Fast Začni DNA Master SYBR Green I sistem (Roche, Basel, Švica) smo uporabili za PCR v realnem času. GAPDH mRNK uporabimo kot notranjo kontrolo in reakcijsko zmes brez šablonske DNA smo uporabili kot negativno kontrolo. Vsi vzorci so bili izmerjeni neodvisno trikrat. Temeljni premaz sekvence so bile naslednje: GAPDH: (naprej) 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 "in (nazaj) 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; FOXO4: (naprej) 5'-CTTTCTGAAGACTGGCAGGAATGTG-3 'in (nazaj) 5'-GATCTAGGTCTATGATCGCGGCAG-3'; E-kadherina: (naprej) 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3'and (nazaj) 5'AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 '; in vimentina: (naprej) 5'-CAGGCAAAGCAGGAGTCCAC -3'and (nazaj) 5'-GCAGCTTCAACGGCAAAGTTC -3 ". Vse v realnem času PCR reakcije smo izvedli v treh izvodih.
Konstrukcija Oligonukleotid in lentivirusom produkcija
trije pari siRNA oligonukleotidov ciljajo FOXO4 smo sintetizirali GenePharma Co., Ltd GAPDH sekvence smo uporabili kot pozitivno kontrolo. Nepovezan sekvenco uporabimo kot negativno kontrolo (ki ga GenePharma). Sekvence so bile: FOXO4 siRNA oligo-1: 5'-CGCGAUCAUAGACCUAGAUTTAUCUAGGUCUAUGAUCGCGTT-3 '(smisel); FOXO4 siRNA oligo-2: 5'-CAGCUUCAGUCAGCAGUUATTUAACUGCUGACUGAAGCUGTT-3 '(smisel); FOXO4 siRNA oligo-3: 5'-GUGACAUGGAUAACAUCAUTTAUGAUGUUAUCCAUGUCACTT-3 '(smisel); GAPDH siRNA oligo (pozitivna kontrola): 5'-GUAUGACAACAGCCUCAAGTT-3 "(občutek); in negativna kontrola: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ". (občutek)
Po proizvajalcev navodilih, so FOXO4 siRNA oligo transfektirali v celice, ki uporabljajo siRNA-Mate ™ reagenta (GenePharma Ltd, Šanghaj, Kitajska). Po kultivirali za 2 do 3 dni, smo ekstrahirali skupno RNA in proteinov. Za stabilno transfekciji bil lentivirusni prekomerno vektor (Lenti-FOXO4) zgrajeno (Shanghai GeneChem Co, Ltd, Šanghaj, Kitajska). Z uporabo GV166-puro Vector (GeneChem Co., Ltd, Šanghaj, Kitajska), lentivirusni vektor, ki je izrazil GFP sam (LV-kontrola) je bil uporabljen kot negativne kontrole (NK).
Western blot
Enako količine proteinov smo ločili z natrijevim dodecil sulfat, poliakrilamid gel (SDS-PAGE) elektroforeze in prenesli na nitrocelulozno membrano (Bio-Rad, Hercules, CA). FOXO4 zajec poliklonsko protitelo (Abcam, 1: 500), CyclinD1 zajec poliklonsko protitelo (ImmunoWay, 1: 1000), β-aktin miške monoklonsko protitelo (Sigma, 1: 2000), E-kadherina in vimentina zajec poliklonsko protitelo (Santa Cruz, CA, 1:. bile uporabljene 1000) protitelesa za Western blot poskusih preizkus
mobilnega proliferacijo
3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil-tetrazolijevega bromida (MTT) test smo izvedli oceniti hitrost širjenja celic, in je bila izvedena v skladu s standardnimi postopki. Vsaka celica linija je bila odkrita v treh izvodih
migracije in invazije test
so Transwell migracije teste izvedli v spremenjenih Boyden komorah (Transwell; Corning Inc Lowell, MA, ZDA). Pri gostoti 5 x 10 3 celic na jamico. Po 24 urah inkubacije pri 37 ° C, so bile celice na spodnji površini vrtine pritrjen s 4% paraformaldehida, obarvamo z 1% kristal vijoličnim in prešteti.
Visoko vsebnost presejalni test
je mobilni motilitete anketiranih uporablja Cellomics Array Scan VTI 1700 plus (Thermo Scientific, ZDA). Na kratko smo celice v fazi dnevniku poberemo in zasadili na 96-vdolbinami (5 x 10 3 celic /jamico). Po noči kulturi pri 37 ° C za oprijemljivost smo gojišče zamenjali z seruma RPMI1640 mediju in kulturo smo nadaljevali dodatni 24 h. Nato smo celice dvakrat izprali z ledeno mrzlo PBS in obarvamo z Hoechst 33342 za 15 minut v inkubatorju. Pozneje smo celice še dvakrat sprali z ledeno mrzlo PBS in izpostavljeni različnim zdravljenja. Cell gibljivost je bila odkrita s pomočjo Cellomics Array Scan VTI 1700 plus (Thermo Scientific) po protokolu proizvajalca (vsaka skupina je vključevala pet ponavljanja vodnjakov).
Konfokalni mikroskopija
Za konfokalna mikroskopija eksperimentov, smo celice gojili na Lab-Tek 24-ter komorne diapozitive (Thermo Fisher Scientific, ZDA). Po noči gojenja, so bile določene celice, izperemo in permeabiliziramo z 0,3% Triton X-100 v PBS 10 minut. Nato smo celice inkubirali s primarnimi protitelesi proti E-kadherina in vimentina (redčenje 1: 300, Abcam) preko noči pri 4 ° C. Celice inkubiramo tudi Cy3-konjugiranim anti-kunčjega IgG (redčenje 1:. 200 (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, ZDA) 1 uro pri sobni temperaturi v temi celica jedro smo jih nasprotno pomočjo DAPI 5 minut . fluorescence smo spremljali in fotografirali s konfokalnim mikroskopom (Thermo Fisher Scientific, ZDA).
študije na živalih
za raziskave na živalih, nude miši 4 do 6 tednov starosti so bile kupljene iz centra živali kitajske akademije znanosti (Shanghai, Kitajska) in vzdržuje v ploščatih omare toka pod določenimi pogoji brez patogenov. Vsi postopki za poskuse na živalih so bili opravljeni v skladu s smernicami za institucionalno varstvo živali in uporaba odborov eksperiment Center živali četrtega vojaške Medical University.
tumorjev pri golih miših
logaritmično gojenje celice požanjemo s pomočjo tripsina in dvakrat speremo s PBS. Potem, 2 x 10 6 celic v 0,2 ml smo podkožno injicirali v zgornjem desnem zadnji regiji miši. Štiri tedne po okužbi, smo žrtvovali miši s tumorjem smer in velikost tumorja smo določili z merjenjem čeljusti iz podkožnega mase tumorja. Vsak eksperimentalna skupina je vsebovala 6 miši. Dva neodvisna eksperimenti so bili izvedeni in so dale podobne rezultate.
Tail venska metastatskega test
Približno 2 x 10 6 celice smo suspendirali v 0,2 ml sterilne PBS in vbrizga v žile rep po 10 miši. Miši so nato spremljali na volumen tumorja in splošno zdravje, in njihove pljuča in jetra so redno opazili s pomočjo slikovnega mikroskopijo.
Statistična analiza
so vse statistične analize, izvedene z uporabo SPSS 17.0 statistične programske opreme (SPSS, Inc., Chicago, Illinois). Spremenljivke z vrednostjo P manj kot 0,05 naj bi bile statistično značilne. χ
2 testa smo uporabili za oceno pomembnosti razlik v FOXO4 izražanja frekvenco med GC tkiva in sosednjih nontumorous želodčnega tkiva. T
-test (enosmerna test ANOVA) je bila izvedena za oceno pomembnosti razlike med celično proliferacijo, tablice klonov in migracijskih testih. Splošni Krivulje preživetja so izrisani po metodi Kaplan-Meier in so ocenili za statistične značilnosti uporablja test log-rang (v Mann-Whitney U
in poskusno Kruskal-Wallis H so bili sprejeti za druge podatke).
Rezultati
izražanje FOXO4 je navzdol urejena v GC tkiv in celičnih linij PODJETJA
Da bi preverili, ali je izraz FOXO4 spremenila v GC, so izraz in subceličnih lokalizacija FOXO4 raziskali v mikromrež tkiva 75 parnih vzorcih GC s pomočjo imunohistokemični test. FOXO4 je v glavnem izražena v jedrih epitelnih celic, ki se nahajajo v želodcu žlezah nontumorous tkiv (slika 1A1), toda majhno količino bil lokaliziran v citoplazmo. FOXO4 obarvanje v epitelijskih celic iz vzorca GC je bila slaba. Vendar pa je bil FOXO4 obarvanje v nontumorous tkivih (NT) dosledno močnejša kot pri vzorcih GC, in je bila velika razlika med rezultati barvanja v GC in NT vzorcev (slika 1A2) (P < 0,05) Mi Naslednja merili raven FOXO4 in neodvisno tkivo mikromrež plošči, ki vsebuje 40 osnovnih GCS in ustrezne bezgavk, metastaze primerkov. Na splošno, GK pokazala nižjo stopnjo ekspresije FOXO4 v metastatskih lezij v primerjavi z ustreznimi primarnih tumorskih vzorcev (sliki 1A3-A4) .The ekspresijski nivoji FOXO4 jih western blot in RT-PCR pregledanih tudi GC in sosednjih normalnih tkiv, pridobljenih iz osem bolnikov (slika 1B). V sedmih od osmih primerih je bil FOXO4 ugotovljeno, da imajo zmanjšano izražanje v rakastih tkivih, v skladu z rezultati iz imunohistokemiji analysis.We dodatno primerjali relativne stopnje FOXO4 mRNA in izražanja proteina med 6 različnimi GC celičnih linijah (BGC-823, SGC7901 , MKN28, AGS, 9811, in MKN45) in nesmrtni želodca epitelijskih celic linija GES-1. Ponovno smo FOXO4 izražena na relativno nižji ravni v vseh celičnih linijah 6 GC v primerjavi z običajnim nesmrtno želodčne sluznice epitelnega ges-1 celične linije (slika 1C). Ti rezultati kažejo, da lahko FOXO4 igrajo omejevalno vlogo v želodcu rakotvornost. Slika 1 FoxO4 občutno navzdol urejena v GC tkiv in celičnih linij. (A1) IHK analiza FOXO4 izražanja v 75 paru GC in sosednjih niso tumorskih tkiv. (A2) Statistična analiza FOXO4 izražanja v GC tkivih in sosednjih non-tumorskih želodčne tkivih. (A3) Predstavnik FOXO4expression v osnovnih in metastatskih GC tkiva z metodami IHC odkritih. (A4) Statistična analiza FOXO4 izražanja med GC tkiva z in brez vozlišča metastaz. (B1-B2) Real-time PCR in western blot analiza FOXO4 izražanja v 8 parov GC in sosednjih non-tumorskih tkivih. (C1-C2) Real-time PCR in western blot analiza FOXO4 izražanja v različnih GC celičnih linijah.
FOXO4 zavira GC proliferacijo in vitro in inducira aretacijo celičnega cikla v fazi G0 /G1
Da bi raziskali vlogo FOXO4 rasti GC, smo vzpostavili dve stabilne celične linije (označena SGC7901-FoxO4 in SGC7901-NC) po okužbi s LV- FoxO4 ali LV-NC lentivirusom oz. Po večkratnem izboru puromicina, RT-PCR in zahodni blot analiza je potrdila, da SGC7901-FoxO4 pokazala višjo izraz FOXO4 primerjavi SGC7901-NC (Slika 2A1-A2). MTT testom so pokazali, da se regulacijo FOXO4 izražanja znatno inhibira proliferacijo GC celic (slika 2A3, P < 0,01) .V Nasprotno, celična linija BGC823, ki ima relativno visoko endogenega ekspresijo smo prehodno transfektirali z FOXO4 siRNA ali negativna kontrola. Trije pari siRNA oligonukleotidov, namenjenih FOXO4 smo sintetizirali in transfektirali v BGC823 celic (BGC823-FOXO4si1, BGC823-FOXO4si2 in BGC823-FOXO4si3), in celice, transfektirane z siRNA oligo negativna kontrola bili označeni BGC823-Sync. QRT-PCR in western blot pokazala, da je siRNA oligo številka 1 najučinkovitejši, da ta konstrukt je bil izbran za nadaljnje raziskave (Slika 2B1-B2). V skladu s tem krivulje rasti je pokazala, da down-regulacijo izraz FOXO4 povzročilo povečano proliferacijo med GC celice (Slika 2B3) Smo izvedli tudi ploščo nastanek kolonija testa je. Ti rezultati so pokazali, da SGC7901-FOXO4 celice proizvajajo manj celične kolonije v primerjavi s kontrolnimi celicami SGC7901-NC (Slika 2C1-C2, P < 0,05). Dalje, smo uporabili FACS analize, naj preuči učinke FOXO4 na celičnega cikla. SGC7901-FOXO4 celice prikaže pomembno G1 aretaciji in S znižanje faze (Slika 2D1-D2), ki je nakazalo, da FOXO4 zaviral GC orožja kot posledica aretacije G1 celičnega cikla. Za krepitev te ugotovitve, smo zaznali izražanje CyclinD1, ki je označevalec G1 fazi z Western Blot, je pokazala, da CyclinD1had relativno višji izraz v celične linije 7801-NC kot 7901-FOXO4 celic (Slika 2E1-E2). Slika 2 Vpliv FOXO4 o urejanju proliferacijo GC celic. (A1-A2) Relativna izraz FOXO4 v SGC-7901 celic transfekciji s LV-FOXO4 ali LV-nadzor, ki je bila potrjena s PCR v realnem času in zahodni blot analizo. Vrednosti predstavljajo sredstva iz treh ločenih eksperimentih, in so palice napak pomenijo SEM (** P < 0,01). (A3) Stopnje orožja celic so bile izmerjene z uporabo MTT testom. Vrednosti predstavljajo sredstva iz treh ločenih eksperimentih, in so palice napak pomenijo SEM (* P &0.05). (B1-B2) Relativna izraz FOXO4 v BGC-823 celic, transfektiranih s FOXO4 oligo nukleotidov zaviralca ali nadzora nukleotidov oligo, ki je bila potrjena s PCR v realnem času in zahodni blot analizo. Vrednosti predstavljajo sredstva iz treh ločenih eksperimentih, in so palice napak pomenijo SEM (** P < 0,01). (B3) Stopnje orožja celic so bile izmerjene z uporabo MTT testom. Vrednosti predstavljajo sredstva iz treh ločenih eksperimentih in palice napak pomenijo SEM (* P &0.05). (C1-C2) kolonija tvorba SGC07901 celic, transfektiranih s LV-FOXO4 in LV kontrole smo izvedli s sejanjem celic na ploščah za 2 tedna, in število kolonij smo nato prešteti. Vrednosti predstavljajo sredstva iz treh ločenih eksperimentih, in so palice napak pomenijo SEM (* P &0.05). (D1-D2) distribucija Cell cikel SGC-7901 celic transfekciji s LV-FOXO4 ali LV-kontrolo. Analiza celičnega cikla smo izvedli 24 ur po transfekciji. Porazdelitev celični cikel je bila izračunana in izražena kot srednja vrednost ± SD treh ločenih poskusih. * P < 0,05. (E1-E2) Relativna izraz CyclinD1 v SGC-7901 celic transfekciji s LV-FOXO4 ali LV-nadzor, ki je bila potrjena Western blot analizo. Vrednosti predstavljajo sredstva iz treh ločenih poskusih, in bari napak predstavljajo SEM (* P < 0,05).
FOXO4 zavira migracije in vdor GC celic in vitro
Za oceno vpliva FOXO4 na GC migracije in invazije, smo poleg ocenili učinek FOXO4 izražanja na invazivne in selitvenih sposobnosti GC celic, ki uporabljajo in vitro transwell testih. Rezultati so pokazali, da so migracije in vdor SGC-7901-FOXO4 celic tako znatno zmanjšala v primerjavi z letom SGC-7901-NC krmilni celice (Slika 3A1). V nasprotju s tem, izčrpavanje FOXO4 bistveno spodbujati migracije celic in vdor v BGC823 celic v primerjavi s kontrolo celice (Slika 3A2). Poleg tega visoko vsebnost presejalni test je pokazal hitrost gibljivost SGC-7901-FOXO4 celic je bistveno nižja od SGC-7901-NC celic, 15/19 časovne točke je jasno pokazala, hitrost gibljivost SGC-7901-FOXO4 celic, ki je nižja od SGC-7901-NC celic (slika 3B). Poleg tega celjenja ran testi so pokazali, da SGC-7901-FOXO4 celice zaprt rane počasneje kot SGC-7901-NC celice (slika 3C) (P < 0,05). Skupaj, ti rezultati so pokazali, da FOXO4 znatno poslabšalo migracije GC celic in invazijo in vitro. Slika 3 Vpliv FOXO4 pri urejanju GC celic metastaz. (A1-A2) Up-regulacijo FOXO4 izražanja v LV-FOXO4 celic zmanjšala SGC-7901 celične migracije in invazije in vitro, ker zaviranje FOXO4 izražanja z zaviralcem oligo nukleotidov v FOXO4 okrepljeno migracije in invazije BGC-823 celic. (B) Cell migracije zmogljivost je bila ocenjena z izvedbo visoko-vsebina testa v SGC-7901 celic transfekciji s LV-FOXO4 ali LV-kontrolo. * P < 0,05 (C) Cell migracije zmogljivosti smo testirali tudi z izvajanjem celjenje rane testa v SGC-7901 celic transfekciji s LV-FOXO4 ali LV-kontrolo. * P < 0.05.
FOXO4 up regulacija zavira tumorigeneze in metastaze GC celic in vivo
Da bi še dodatno potrjujejo učinke FOXO4 na tumorigeneze GC, je bil test tvorba tumor izvaja v golih miših. SGC7901-NC in SGC7901-FOXO4 celice so subkutano vcepimo v zgornji desni zadnji regiji golih miškah na enem mestu. Štiri tedne kasneje miši, ki so bile subkutano nasajenih smo žrtvovali smo izrezali presajene tumorjev in velikosti tumorja smo ovrednotili (slika 4A1-A3, P < 0,05). Rezultati so pokazali znatno zmanjšanje v velikosti presadkov, ki izhajajo iz FOXO4 reguliran cells.To nadalje raziskati vlogo FOXO4 tumorja metastaz in vivo, smo vsadili SGC7901-NC in SGC7901-FOXO4 celice v golih miškah z bočno repne vene . Predstavnik bioluminescentno slikanje (BLI) različnih skupin je prikazana na sliki 4B1. Histološka analiza potrjuje, da je bila pojavnost pljuč in jeter, metastaze v skupini SGC7901-FOXO4 bistveno zmanjšala, v primerjavi s skupino SGC7901-NC (Slika 4B2, B3). se je zmanjšala tudi število pljuč metastaznih gomoljev v skupini SGC7901-FOXO4, v primerjavi s skupino SGC7901-NC (podatki niso prikazani). Jeter in pljuč metastaze so se dokazuje hematoksilinom in eozinom obarvanje (slika 4C). Poleg tega je skupina golih miši SGC7901-FOXO4 je pokazala več na celotni čas preživetja v primerjavi s skupino SGC7901-NC (slika 4D). Ti podatki kažejo, da FOXO4 zatreti GC celic tumorigeneze in metastaze in vivo. Slika 4 vivo proliferacijo in metastaziranje testu. (A1-A3) celice SGC-7901 transficirane z LV-FOXO4 ali LV-nadzora je bilo presajenih pod kožo. Šest tednov kasneje so tumorji jasneje razvidno pri miših vsajenega s 7901-NC celic v primerjavi s 7901-FOXO4 skupin: (6/6 v 7901-NC skupin in 3/6 v 7901-FOXO4 skupinami). Tumorji so secirali in izmeriti. (B1-B3) SGC-7901 transfektiranih s LV-FOXO4 ali LV kontrolo smo injicirali v žilah rep golih miših. Deset tednov pozneje, miši vstavili 7901-NC celicah pokazali, pljuč in jeter metastaz, ker je bilo nekaj metastaze odkrili pri miših vsajenih s 7901-FOXO4 celic: (za pljučne metastaze, 6/10 v skupini 7901-NC in 1/10 v v 7901-FoxO4 skupine, za metastaz jeter, 3/10 v 7901-NC skupin in 0/10 v 7901-FoxO4 skupin. (C) Slike prikazujejo reprezentativni Hematoxylin in eozinom barvanje pljuč in jeter tkivnih vzorcev iz različnih eksperimentalnih skupin * P <.. 0.05 (D) Skupna preživetje golih miših v vsaki skupini
Molekularni mehanizmi FOXO4 v metastazami GC
raziskati možne mehanizme za vlogo FOXO4 v GC metastaze, smo pregledali izraz povezanih z metastazami molekul, vključno z e-kadherina, vimentina v SGC-7901-FOXO4 in kontrolnih celicah SGC-7901-NC pomočjo RT-PCR (Slika 5A1-A2). Rezultati so pokazali, da FOXO4 prekomerno izrazito potlačeno izražanje vimentina, čeprav niso opazili očitne spremembe za E-kadherina. Rezultati imunofluorescentni konfokalna dala podobne sklepe (Slika 5B1-B2). Slika 5 FOXO4 zavira EMT v GC celicah. (A1-A2) Real-time PCR pojavil regulirano ekspresijo epitelijskih označevalcev (E-kadherina) in navzdol regulirano ekspresijo mezenhimskih označevalcev (vimentina) v 7901-FOXO4 celic. (B1-B2) imunofluorescenco pojavil regulirano ekspresijo epitelijskih označevalcev (E-kadherina) in navzdol urejeno izraz mezenhimskih označevalcev (vimentina) v 7901-FOXO4 celic.
Ti podatki kažejo, da FOXO4 delno vplivajo GC celico metastaze, ki ureja postopek EMT in dodatnih molekularnih mehanizmov bodo raziskovali v prihodnje delo.
Razprava
razreda forkhead box o The (FOXO) družina transkripcijskih faktorjev je evolucijsko ohranjena in je značilna tako imenovana forkhead polju DNA- vezavno domeno. Pri sesalcih je FOXO gen družina je sestavljena iz štirih članov: FOXO1, FOXO3A, FOXO4 in FOXO6. Številne študije so pokazale, da FOXO proteini igrajo pomembno vlogo pri številnih običajnih bioloških procesov, vključno celične proliferacije, ustavitev celičnega cikla, stresni odziv, in apoptoze [10, 13, 14], kakor tudi bolezni, kot so rak in sladkorna bolezen [15]. Vendar pa je le malo študija poročal o vlogi FOXO4 igra v GC.
V tej študiji smo ugotovili FOXO4 izraz v non-tumorskih tkiv bilo dosledno močnejša kot pri vzorcih GC in GK pokazala nižjo izraz stopnja FOXO4 v metastaznih poškodb v primerjavi z ustreznimi vzorci primarnega tumorja. Ravni FOXO4 mRNA in izražanje proteina sta zniža v raznih tipov celičnih linij GC primerjavi z običajnim želodčne sluznice celične linije epitelnega, kar kaže, da bi FOXO4 služi kot negativna regulator za GC. Poleg tega, povišana izraz FOXO4 izražanja zaviral rast tumorskih celic, invazijo in metastaze in vitro in in vivo, kar pomeni, da lahko FOXO4 igrajo vlogo pri napredovanju GC in metastaz.
Mehanizmov, ki so odgovorni za vpliv FOXO4 sprememb na razvoj GC in napredovanje ostajajo nejasne. Številne nedavne študije so pokazale, da FOXO ureja številne vidike biologije raka. Na primer, FOXO običajno zadržuje v PI3K /Akt signalne poti, ki preprečuje FOXO translokacijo v jedro in FOXO uravnavajo transkripcijske odzive neodvisno neposrednega DNA vezavo preko povezavi z različnimi nepovezanih transkripcijskih faktorjev [16]. Naše ugotovitve so pokazale, da FOXO4 povzroča znatno G1 aretaciji in S zmanjšanje faze v GC celic, ki bi kazali, da se lahko FOXO4 zaviral GC orožja vsaj deloma pa posledica G1 ustavitev celičnega cikla.
En pomemben korak v metastatskega kaskade je Postopek epitelnih do mezenhimskega prehoda (EMT) [17, 18]. Med procesom EMT izraz E-kadherina je pogosto navzdol regulirano, pri čemer ki vimentina pogosto kaže navzgor regulirano [19]. FOXO4 lahko urejajo EMT na raka želodca. Da bi to hipotezo preverili, smo ocenili izraze E-kadherina in vimentina v celičnih modelih zgoraj. Čeprav niso opazili očitne spremembe pri E-kadherina, je dramatično zmanjšanje vimentina izražanja prikazan v FOXO4 čezmernim celic v primerjavi s kontrolnimi celicami, kot imunofluorescenčnim testom in QRT-PCR označeno. Te študije nakazujejo, da bi lahko FOXO4 zavirajo želodčni metastaze raka, ki ga ureja EMT.
Zaključek
Skratka, naša raziskava kaže kritično funkcijo FOXO4 v inhibicijo GC orožja in metastaz preko urejanja G1 ustavitev celičnega cikla in EMT, kažejo, da lahko služi kot potencialnega terapevtskega cilja za rakom želodca
ugotavlja
Linna Su, Xiangqiang Liu, na Chai prav tako prispevali k temu delu
Kratice
FOXO4:..
Forkhead box O4
BSA:
goveji serum albumin
DAB:
Diaminobenzidine

QRT-PCR:
realnem času kvantitativne PCR
MTT:
3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2, 5-difenil-tetrazolijevega bromid
PBS:
fosfatnim pufrom
DMSO.
dimetilsulfoksid


deklaracij
Zahvala
to delo je podprl National Natural Science Foundation Kitajske (število nepovratna 81172062, 81270445). Zahvaljujemo se prof Zengshan Li (Department of Pathology v bolnišnici Xijing), za njegovo pomoč pri patoloških analizo. Zahvaljujemo se tudi gospe Zuhong Tian za pomoč pri poskusih slikanje živali. Avtorji razkriti nobenih morebitna nasprotja interesov
Electronic dodatno gradivo
12885_2014_4601_MOESM1_ESM.doc Dodatna datoteka 1:. Tabela S1: Informacije tkiv paleto (humani adenokarcinomom želodca z ujemanjem sosednjih tkiv). Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• LIM Homeodomena transkripcijski faktor Isl1 usmerja normalno pilorično razvoj z usmerjanjem Gata3
• Genetski polimorfizmi v promotorja osteopontinom povečuje tveganje za metastaze na daljavo in smrti pri kitajskih bolnikih z želodca cancer