Transskriptionsfaktoren FOXO4 er nedreguleret og hæmmer tumor spredning og metastaser i gastrisk kræft

Transskriptionsfaktoren FOXO4 er nedreguleret og hæmmer tumor spredning og metastaser i mavekræft
Abstract
Baggrund
FOXO4, et medlem af FOXO familie af transkriptionsfaktorer, er i øjeblikket genstand for en intens undersøgelse. Dens rolle og funktion i gastrisk kræft er ikke blevet fuldt belyst. Den foreliggende undersøgelse havde til formål at undersøge ekspressionen profil FOXO4 i gastrisk cancer og virkningen af ​​FOXO4 på cancercellevækst og metastase.
Methods
Immunhistokemi, Western blotting og QRT-PCR blev udført for at detektere FOXO4 ekspression i gastrisk cancer celler og væv. Cellebiologiske assays, subkutan tumorigenicitet og halevenen metastatisk assay i kombination med lentivirus konstruktion blev udført for at påvise virkningen af ​​FOXO4 til gastrisk cancer i proliferation og metastase in vitro og in vivo. Konfokal og QRT-PCR blev udført for at undersøge mekanismerne.
Resultater
Vi fandt, at ekspressionen af ​​FOXO4 faldt betydeligt i de fleste gastrisk cancer væv og i forskellige humane gastriske cancercellelinier. Opregulering FOXO4 hæmmede væksten og metastasen af ​​gastriske cancercellelinier in vitro og førte til dramatiske dæmpning af tumorvækst, og lever og lunge metastase in vivo, hvorimod nedregulering FOXO4 med specifikke siRNA'er fremmet vækst og metastase af gastrisk cancercellelinie linjer. Desuden fandt vi, at opregulering FOXO4 kunne fremkalde en betydelig G1 anholdelse og S reduktion fase og nedregulering af ekspressionen af ​​vimentin.
Konklusion
Vores data tyder på, at tabet af FOXO4 udtryk bidrager til gastrisk kræft vækst og metastase , og det kan tjene som et potentielt terapeutisk mål for mavekræft.
Nøgleord
FOXO4 mavekræft spredning Metastase EMT Baggrund
Selvom forekomsten af ​​mavekræft (GC) er faldende, er det stadig den fjerde mest almindelige kræftform og næststørste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1]. De vigtigste molekyler, der er involveret i celleproliferation og metastase i GC progression kan støtte i klinisk diagnosticering eller forudsigelse af progression af denne sygdom.
Tumorvækst og metastase afhænger af forskellige faktorer, herunder transskriptionsfaktorer [2-5]. Den FOXO transkriptionsfaktorer familie består af fire yderst relaterede medlemmer: FOXO1, FOXO3, FOXO4, og FOXO6 [6-8]. I de senere år har FOXO vist sig at spille vigtige roller i et væld af cellulære processer, herunder proliferation, apoptose, differentiering, stress modstand, og metaboliske reaktioner [9], og kan derfor være lovende mål for nye lægemidler inden for onkologi [10, 11].
Vores tidligere resultater viste, at FOXO4 mRNA-ekspression niveau var dramatisk nedreguleret i lymfeknudeceller-positive colorectalt carcinom væv sammenlignet med lymfeknude-negativ væv, foreslog det kan fungere som en negativ regulator af metastase af colorektal carcinom [12]. Imidlertid blev ekspressionen og funktionen af ​​FOXO4 i gastrisk cancer ikke kendt endnu. Målet med vores arbejde har været at undersøge den mulige rolle FOXO4 i mavekræft carcinogenese. Her rapporterer vi, at FOXO4 undertrykke celledeling og metastase i gastrisk kræft i forordningen G1 celle-cyklus anholdelse og vimentin.
Metoder
Vævsprøver
For vævsprøver, alle patienter forudsat informeret samtykke til at bruge overskydende patologisk prøver til forskningsformål. Protokollerne anvendt i denne undersøgelse blev godkendt af hospitalets beskyttelse af personmotiver Udvalg. Brugen af ​​humane væv blev godkendt af institutionelle gennemgang bestyrelsen for fjerde Military Medical University og var i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen, samt lokal lovgivning. Patienter stille prøver til undersøgelsen underskrevet informeret samtykke former.
Immunhistokemi
Immunhistokemisk farvning blev udført under anvendelse af avidin-biotin kompleks immunperoxidase metode. Det primære antistof mod FOXO4 (1: 100, ab63254, Abcam) fortyndet i PBS indeholdende 1% (vægt /volumen) bovint serumalbumin (BSA). Negative kontroller blev udført ved at erstatte det primære antistof med præ-immunt museserum. Billeder blev opnået under et lysmikroskop (Olympus BX51, Olympus, Japan) udstyret med en DP70 digitalkamera. Observatøren blev blindet til identiteten af ​​prøverne, når scorer immunoreaktivitet.
Evaluering af farvning Hus Til evaluering af cellefarvning blev snittene undersøgt af to uafhængige patologer uden forudgående kendskab til klinikken-patologiske status af enhederne . Celler, som blev farvet brunt blev anset for at være positiv. Ekspressionen af ​​FOXO4 blev evalueret i henhold til forholdet mellem positive celler pr prøve (R) og farvningsintensitet (I). Forholdet mellem positive celler pr prøve blev scoret som følger: 0 til farvning af < 1%, 1 til farvning af 2% til 25%, 2 til farvning af 26% til 50%, 3 for farvning af 51% til 75%, og 4 for farvning af > 75% af de undersøgte celler. Intensiteten blev gradueret som følger: 0, ingen signal; 1, svag farvning; 2, moderat farvning; og 3, stærk farvning. En samlet score (R × I) fra 0 til 12 blev endeligt opgjort og klassificeret som negativ (-Score: 0-2). Eller positive (+, 3-12)
Tissue samling
Tissue arrays blev købt fra den Aomei selskab (Aomei C0124H, AM01C09, Aomei Biotechnology Co. Ltd., Xi'an, Kina) (Ekstra fil 1: tabel S1 og Yderligere fil 2: tabel S2). Til western blot analyse blev GC væv og tilstødende nontumorous væv opnået fra otte patienter, som havde gennemgået kirurgi ved Institut for Almen Kirurgi i vores hospital. Alle tilfælde af GC og normal maveslimhinden blev klinisk og patologisk bevist. De protokoller, der bruges i undersøgelserne blev godkendt af hospitalets beskyttelse af personmotiver Udvalg. Patienter, der har bidraget frisk kirurgisk væv for undersøgelsen havde underskrevet informeret samtykke former.
RNA-ekstraktion og real-time PCR
Totalt RNA fra cellerne blev ekstraheret ved anvendelse af Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), og cDNA blev syntetiseret under anvendelse af Prime Script RT reagenskittet (Takara Biotechnology, Dalian, Kina) i henhold til producentens anbefalinger. En Light Cycler Fast Start DNA Master SYBR Green I System (Roche, Basel, Schweiz) blev anvendt til real-time PCR. GAPDH mRNA blev anvendt som intern kontrol, og reaktionsblandingen uden template-DNA blev anvendt som negativ kontrol. Alle prøverne blev målt uafhængigt tre gange. Primersekvenserne var som følger: GAPDH: (fremad) 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 'og (revers) 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'; FOXO4: (frem) 5'-CTTTCTGAAGACTGGCAGGAATGTG-3 'og (tilbage) 5'-GATCTAGGTCTATGATCGCGGCAG-3'; E-cadherin: (frem) 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3'and (omvendt) 5'AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 '; og vimentin: (frem) 5'-CAGGCAAAGCAGGAGTCCAC -3'and (reverse) 5'-GCAGCTTCAACGGCAAAGTTC -3 ". Alle real-time PCR-reaktioner blev udført tre gange.
Oligonucleotid konstruktion og lentivirus produktion
Tre par siRNA oligonukleotider målrettet FOXO4 blev syntetiseret af GenePharma Co., Ltd. GAPDH-sekvenser blev anvendt som en positiv kontrol. En ubeslægtet sekvens blev anvendt som en negativ kontrol (leveret af GenePharma). Sekvenserne var som følger: FOXO4 siRNA oligo-1: 5'-CGCGAUCAUAGACCUAGAUTTAUCUAGGUCUAUGAUCGCGTT-3 '(sense); FOXO4 siRNA oligo-2: 5'-CAGCUUCAGUCAGCAGUUATTUAACUGCUGACUGAAGCUGTT-3 '(sense); FOXO4 siRNA oligo-3: 5'-GUGACAUGGAUAACAUCAUTTAUGAUGUUAUCCAUGUCACTT-3 '(sense); GAPDH siRNA oligo (positiv kontrol): 5'-GUAUGACAACAGCCUCAAGTT-3 '(sense); og negativ kontrol: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 '. (sense)
Ifølge producentens vejledning, FOXO4 siRNA oligoer blev transficeret ind i celler ved anvendelse af siRNA-Mate ™ reagens (GenePharma Ltd., Shanghai, Kina). Efter dyrket i 2 til 3 dage blev totalt RNA og protein ekstraheret. For stabil transfektion blev en lentiviral overekspression vektor (Lenti-FOXO4) konstrueret (Shanghai GeneChem Co, Ltd, Shanghai, Kina). Ved hjælp af en GV166-puro Vector (GeneChem Co., Ltd., Shanghai, Kina), en lentiviral vektor, udtrykte GFP alene (LV-kontrol) blev anvendt som en negativ kontrol (NC).
Western blot
Equal mængder af proteiner blev separeret ved anvendelse af natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel (SDS-PAGE) elektroforese og overført til en nitrocellulosemembran (Bio-Rad, Hercules, CA). FOXO4 kanin polyklonalt antistof (Abcam, 1: 500), CyclinD1 kanin-polyklonalt antistof (ImmunoWay, 1: 1000), β-actin-monoklonalt museantistof (Sigma, 1: 2.000), E-cadherin og vimentin kanin-polyklonalt antistof (Santa Cruz, CA, 1:. 1000) antistoffer blev anvendt til Western blot eksperimenter
Celleproliferationsassay
3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid (MTT) assay blev udført for at vurdere hastigheden af ​​celleproliferation, og blev udført ifølge standardprocedurer. Hver cellelinje blev påvist i tre eksemplarer
Migration og invasion assay
Transwell migration assays blev udført i modificerede Boyden kamre (Transwell; Corning Inc. Lowell, MA, USA). Ved en tæthed på 5 x 10 3 brønd. Efter 24 timers inkubation ved 37 ° C blev cellerne på den nedre overflade af brøndene fikseret med 4% paraformaldehyd, farvet med 1% krystalviolet og talt.
High-content screeningsassay
Cellemotilitet var adspurgte bruger en Cellomics Array Scan VTI 1700 plus (Thermo Scientific, USA). Kort fortalt blev celler i log-fase, høstet og udpladet i 96-brønds plader (5 x 10 3 celler /brønd). Efter dyrkning natten over ved 37 ° C i adhæsion, blev dyrkningsmediet erstattet med serumfrit RPMI1640 medium, og kulturen blev fortsat i yderligere 24 timer. Derefter blev cellerne vasket to gange med iskold PBS og farvet med Hoechst 33342 i 15 minutter i en inkubator. Efterfølgende blev cellerne igen vasket to gange med iskold PBS og udsat for forskellige behandlinger. Cellemotilitet blev påvist under anvendelse af Cellomics Array Scan VTI 1700 plus (Thermo Scientific) ifølge fabrikantens protokol (hver gruppe omfattede fem gentagne brønde).
Konfokal mikroskopi Hus Til konfokal mikroskopi eksperimenter blev celler dyrket på Lab-Tek 24-brønds kammer slides (Thermo Fisher Scientific, USA). Efter natten over dyrkning blev cellerne fikseret, vasket og permeabiliseret med 0,3% Triton X-100 i PBS i 10 min. Derefter blev cellerne inkuberet med primære antistoffer mod E-cadherin og vimentin (fortynding 1: 300, Abcam) natten over ved 4 ° C. Cellerne blev også inkuberet med Cy3-konjugeret anti-kanin IgG (fortynding 1:. 200 (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, USA) i 1 time ved stuetemperatur i mørke Den cellekernen blev modfarvet ved anvendelse af DAPI i 5 min . Fluorescens blev overvåget og fotograferet med et konfokalt mikroskop (Thermo Fisher Scientific, USA).
Dyreforsøg
for dyr forskning, nøgne mus 4 til 6 ugers alderen blev købt fra Animal center of Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina) og vedligeholdes i laminare flow kabinetter under specifikke patogenfrie betingelser. Alle procedurer for dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de institutionelle Animal Care og brug Udvalg retningslinjer for Experiment Animal center for fjerde Military Medical University.
Tumorigenicitet i nøgne mus Salg logaritmisk voksende celler blev høstet under anvendelse af trypsin og vasket to gange med PBS. Derefter 2 × 10 6 celler i 0,2 ml blev injiceret subkutant i den højre øvre ryg region af musene. Fire uger efter podning blev tumorbærende mus aflivet, og størrelsen af ​​tumoren blev bestemt ved caliper måling af den subkutane tumormasse. Hver eksperimentel gruppe indeholdt 6-mus. blev udført to uafhængige forsøg, og de gav lignende resultater.
halevene metastatisk assay
Ca. 2 × 10 6 celler blev suspenderet i 0,2 ml sterilt PBS og injiceret i halevenerne på 10 mus. Musene blev derefter overvåget for tumor volumen og generelle sundhed, og deres lunger og lever blev regelmæssigt observeret ved hjælp imaging mikroskopi.
Statistisk analyse
Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS 17,0 statistisk software (SPSS, Inc., Chicago, Illinois). Variabler med en P-værdi mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. χ
2 test blev anvendt til at vurdere betydningen af ​​forskelle i FOXO4 udtryk frekvens mellem GC væv og tilstødende nontumorous gastriske væv. T
-test (en envejs ANOVA-test) blev udført for at vurdere betydningen af ​​forskellen mellem celleproliferation, plade kloner, og migration assays. Samlet overlevelse kurver blev plottet ved hjælp af Kaplan-Meier-metoden og blev evalueret for statistisk signifikans ved hjælp af en log-rank test (Mann-Whitney U
test og Kruskal-Wallis H testen blev vedtaget for andre data).
Resultater
ekspression af FOXO4 nedreguleres i GC væv og cellelinjer
for at undersøge, om FOXO4 udtryk blev ændret i GC, blev udtrykket og subcellulære lokalisering af FOXO4 undersøgt i et væv microarray af 75 parrede GC prøver ved hjælp af en immunhistokemisk assay. FOXO4 blev hovedsageligt udtrykt i kernerne i epitelceller beliggende i de gastriske kirtler nontumorous væv (figur 1A1), men en lille mængde blev lokaliseret til cytoplasmaet. Den FOXO4 farvning i epitelceller fra GC-prøver var svag. Imidlertid FOXO4 farvning i nontumorous væv (NT) var konsekvent stærkere end de GC-prøver, og der var en signifikant forskel mellem farvningsresultaterne af GC og NT prøver (figur 1A2) (P < 0,05) .Vi næste målte FOXO4 niveau i et uafhængigt væv microarray panel indeholder 40 primære GCS og tilsvarende lymfeknudemetastase prøver. Samlet viste GC'er et lavere ekspressionsniveau af FOXO4 i metastatiske læsioner sammenlignet med de tilsvarende primære tumorprøver (figur 1A3-A4) .De ekspressionsniveauer af FOXO4 blev også undersøgt ved Western blot og RT-PCR i GC og tilstødende normale væv fra otte patienter (figur 1b). I syv af de otte tilfælde blev FOXO4 sig at have reduceret ekspression i ondartede væv, i overensstemmelse med resultaterne fra immunhistokemi analysis.We yderligere i forhold relative FOXO4 mRNA og protein udtryk niveauer blandt 6 forskellige GC cellelinier (BGC-823, SGC7901 , MKN28, AGS, 9811, og MKN45), og den udødelige gastrisk epitelcelle linje GES-1. Igen FOXO4 blev udtrykt på et relativt lavere niveau i alle 6 GC cellelinjer sammenlignet med det normale udødelige maveslimhinden epitel GES-1 cellelinje (figur 1C). Disse resultater antyder, FOXO4 kan spille en suppressiv rolle i gastrisk carcinogenese. Figur 1 FoxO4 er signifikant nedreguleret i GC væv og cellelinier. (A1) IHC analyser af FOXO4 ekspression i 75 parrede GC og tilstødende ikke-tumor-væv. (A2) Statistisk analyse af FOXO4 ekspression i GC væv og tilstødende ikke-tumor-mave væv. (A3) Repræsentant FOXO4expression i primære og metastatiske GC væv opdaget af IHC metoder. (A4) Statistisk analyse af FOXO4 udtryk mellem GC væv med og uden node metastaser. (B1-B2) Real-time PCR og western blot analyse af FOXO4 ekspression i 8 par GC og tilstødende ikke-tumor-væv. (C1-C2) Real-time PCR og western blotting-analyse af FOXO4 ekspression i forskellige GC cellelinier.
FOXO4 inhiberer GC proliferation in vitro og inducerer standsning af cellecyklus i G0 /G1-fasen
For at undersøge den rolle, FOXO4 i GC vækst, etablerede vi to stabile cellelinier (betegnet SGC7901-FoxO4 og SGC7901-NC) efter infektion med LV- FoxO4 eller LV-NC lentivirus hhv. Efter gentagen puromycinselektion, RT-PCR og en Western blot-analyse bekræftede, at SGC7901-FoxO4 udviste højere FOXO4 ekspression sammenlignet med SGC7901-NC (figur 2A1-A2). MTT-assayet viste, at opregulering af FOXO4 ekspression signifikant inhiberede proliferation af GC-celler (figur 2A3, P < 0,01) .I modsætning hertil BGC823 cellelinien, som har relativt højere endogen ekspression, blev forbigående transficeret med FOXO4 siRNA eller den negative kontrol. Tre par siRNA oligonukleotider målrettet FOXO4 blev syntetiseret og transficeret ind BGC823 celler (BGC823-FOXO4si1, BGC823-FOXO4si2, og BGC823-FOXO4si3), og celler transficeret med siRNA oligo negativ kontrol blev mærket BGC823-SINC. QRT-PCR og western blot viste, at siRNA oligo nummer 1 var den mest effektive, så er denne konstruktion blev valgt til yderligere undersøgelse (Figur 2B1-B2). Følgelig vækstkurverne indikerede, at nedregulering af ekspressionen af ​​FOXO4 resulterede i øget proliferation blandt GC-celler (Figur 2B3) .Vi også udført en plade kolonidannelse assayet. Disse resultater viste, at SGC7901-FOXO4 celler produceret færre celle kolonier i forhold til SGC7901-NC kontrol celler (Figur 2C1-C2, P < 0,05). Dernæst brugte vi FACS-analyse for at undersøge effekten af ​​FOXO4 på cellecyklus. SGC7901-FOXO4 celler viste betydelig G1 anholdelse og S-fasen reduktion (figur 2D1-D2), som viste, at FOXO4 hæmmede GC spredning som følge af G1 celle-cyklus anholdelse. At styrke denne observation har vi registreret ekspressionen af ​​CyclinD1 som er en markør for G1-fasen med western blot, det viste, at CyclinD1had en relativt højere ekspression i 7801-NC-cellelinje end 7901-FOXO4 celler (Figur 2E1-E2). Figur 2 Virkning af FOXO4 om regulering GC celleproliferation. (A1-A2) Relativ udtryk for FOXO4 i SGC-7901 celler transficeret med LV-FOXO4 eller LV-kontrol, hvilket blev bekræftet af real-time PCR og western blot analyse. Værdierne repræsenterer midlerne fra tre separate forsøg, og fejlsøjlerne repræsenterer SEM (** P < 0,01). (A3) De proliferationshastigheder af celler blev målt under anvendelse af MTT-assayet. Værdierne repræsenterer midlerne fra tre separate forsøg, og fejlsøjlerne repræsenterer SEM (* P < 0,05). (B1-B2) Relativ udtryk for FOXO4 i BGC-823 celler transficeret med FOXO4 oligo nukleotid-hæmmer eller oligo nukleotid kontrol, hvilket blev bekræftet af real-time PCR og western blot analyse. Værdierne repræsenterer midlerne fra tre separate forsøg, og fejlsøjlerne repræsenterer SEM (** P < 0,01). (B3) De proliferationshastigheder af celler blev målt under anvendelse af MTT-assayet. Værdierne repræsenterer midlerne fra tre separate forsøg og fejlsøjlerne repræsenterer SEM (* P < 0,05). (C1-C2) Kolonidannelse af SGC07901 celler transficeret med LV-FOXO4 og LV-kontrol blev udført ved podning celler på plader i 2 uger, og antallet af kolonier blev derefter talt. Værdierne repræsenterer midlerne fra tre separate forsøg, og fejlsøjlerne repræsenterer SEM (* P < 0,05). (D1-D2) Celle cyklus fordeling af SGC-7901 celler transficeret med LV-FOXO4 eller LV-kontrol. Cellecyklusanalyse blev udført 24 timer efter transfektion. Fordelingen cellecyklus blev beregnet og udtrykt som middelværdien ± SD af tre separate forsøg. * P < 0,05. (E1-E2) Relativ ekspression af CyclinD1 i SGC-7901 celler transficeret med LV-FOXO4 eller LV-kontrol, hvilket blev bekræftet western blot analyse. Værdierne repræsenterer midlerne fra tre separate forsøg, og fejlsøjlerne repræsenterer SEM (* P < 0,05).
FOXO4 inhiberer migration og invasion af GC-celler in vitro
For at evaluere indflydelsen af ​​FOXO4 på GC migration og invasion, vi næste evalueret effekten af ​​FOXO4 udtryk på de invasive og vandrende evner GC celler ved hjælp af in vitro Transwell analyser. Resultaterne viste, at migration og invasion af SGC-7901-FOXO4 celler blev begge især reduceret i forhold til SGC-7901-NC kontrolceller (figur 3A1). I modsætning hertil udtømning af FOXO4 væsentligt fremmet celle migration og invasion i BGC823 celler sammenlignet med kontrol celler (figur 3A2). Endvidere viste højinformativ screeningsassay motiliteten hastighed SGC-7901-FOXO4 celler væsentligt lavere end SGC-7901-NC-celler, 15/19 tidspunkter viste tydeligt motilitet hastighed SGC-7901-FOXO4 celler er lavere end SGC-7901-NC-celler (figur 3B). Derudover viste sårhelende analyser, som SGC-7901-FOXO4 celler lukkede sår langsommere end SGC-7901-NC-celler (figur 3C) (P < 0,05). Sammen disse resultater viste, at FOXO4 væsentligt forringet GC celle migration og invasion in vitro. Figur 3 Virkning af FOXO4 i regulering GC celle metastase. (A1-A2) opregulering af FOXO4 ekspression i LV-FOXO4 celler faldt SGC-7901 cellemigration og invasion in vitro, hvorimod inhibering af FOXO4 ekspression under anvendelse af oligo nukleotid inhibitor af FOXO4 forbedret BGC-823 cellemigration og invasion. (B) Cell migration kapacitet blev evalueret ved at udføre en højinformativ assay i SGC-7901 celler transficeret med LV-FOXO4 eller LV-kontrol. * P < 0,05 (C) Cell migration kapacitet blev også testet ved at udføre en sårhelende assay i SGC-7901 celler transficeret med LV-FOXO4 eller LV-kontrol. * P < 0,05.
FOXO4 opregulering inhiberer tumorgenese og metastase af GC celler in vivo
For yderligere at bekræfte virkningerne af FOXO4 om tumorigenese af GC, blev en tumordannelse assay udført i nøgne mus. SGC7901-NC og SGC7901-FOXO4 celler blev subkutant indpodet i øverste højre back region nøgne mus på et enkelt sted. Fire uger senere, mus, som blev subkutant inokuleret blev aflivet, blev de transplanterede tumorer udskåret, og tumorstørrelserne blev evalueret (figur 4A1-A3, P < 0,05). Resultaterne viste et signifikant fald i størrelsen af ​​xenotransplantater skyldes FOXO4 opreguleret cells.To yderligere at undersøge rollen af ​​FOXO4 i tumormetastase in vivo, vi implanteret SGC7901-NC og SGC7901-FOXO4 celler i nøgne mus via den laterale halevene . Repræsentative bioluminiscerende imaging (BLI) i de forskellige grupper er vist i figur 4B1. Histologisk analyse bekræftede yderligere, at hyppigheden af ​​lungecancer og levermetastaser i SGC7901-FOXO4 gruppe signifikant var reduceret, sammenlignet med SGC7901-NC-gruppen (fig 4B2, B3). Antallet af lunge metastatiske knuder i SGC7901-FOXO4 gruppe blev også reduceret, sammenlignet med SGC7901-NC-gruppen (data ikke vist). Lever og lunge metastase blev yderligere dokumenteret ved hematoxylin og eosin-farvning (figur 4C). Desuden SGC7901-FOXO4 gruppe nøgne mus demonstrerede længere samlet overlevelse tid i forhold til den SGC7901-NC-gruppe (figur 4D). Disse data viste, at FOXO4 undertrykt GC celle tumorigenese og metastase in vivo. Figur 4 In vivo proliferation og metastase assay. (A1-A3) SGC-7901 celler transficeret med LV-FOXO4 eller LV-kontrol blev transplanteret under huden. Seks uger senere, tumorer blev mere tydeligt ses i mus implanteret med 7901-NC-celler sammenlignet med 7901-FOXO4 grupper: (6/6 i 7901-NC-grupper og 3/6 i 7901-FOXO4 grupper). Tumorerne blev dissekeret og måles. (B1-B3) SGC-7901 celler transficeret med LV-FOXO4 eller LV-kontrol blev injiceret i halevenerne af nøgne mus. Ti uger senere, mus implanteret med 7901-NC celler viste lunge- og levermetastaser, hvorimod der ikke blev påvist få metastaser i mus implanteret med 7901-FOXO4 celler: (for lunge- metastase, 6/10 i 7901-NC grupper og 1/10 i de 7901-FoxO4 grupper, levermetastaser, 3/10 i 7901-NC-grupper og 0/10 i 7901-FoxO4 grupper. (C) billeder, der viser repræsentative hematoxylin og eosin-farvning af lunge og lever vævsprøver fra de forskellige eksperimentelle grupper * P <.. 0,05 (D) Samlet overlevelse nøgne mus i hver gruppe
Molekylære mekanismer i FOXO4 i metastase af GC
for at udforske mulige mekanismer til rollen som FOXO4 i GC metastase, vi undersøgte udtrykket af metastase-relaterede molekyler, herunder E-cadherin, vimentin i SGC-7901-FOXO4 og SGC-7901-NC kontrolceller anvendelse af RT-PCR (figur 5A1-A2). resultaterne viste, at FOXO4 overekspression markant undertrykt ekspression af vimentin, selvom ikke blev observeret nogen oplagt ændring for E-cadherin. De immunofluorescens konfokale Resultaterne gav også lignende konklusioner (Figur 5B1-B2). Figur 5 FOXO4 inhiberer EMT i GC-celler. (A1-A2) Real-time PCR viste opreguleret ekspression af epiteliale markører (E-cadherin) og nedreguleret ekspression af mesenchymale markører (vimentin) i 7901-FOXO4 celler. (B1-B2) Immunfluorescensfarvning viste opreguleret ekspression af epiteliale markører (E-cadherin) og nedreguleret ekspression af mesenchymale markører (vimentin) i 7901-FOXO4 celler.
Disse data indikerer, at FOXO4 delvist kan påvirke GC celle metastase ved at regulere EMT proces, og yderligere molekylære mekanismer vil blive undersøgt i det fremtidige arbejde.
diskussion
forkhead box klasse O (FOXO) familie af transkriptionsfaktorer er evolutionært bevaret og præget af den såkaldte forkhead box DNA- bindende domæne. I pattedyr, den FOXO gen familien består af fire medlemmer: FOXO1, FOXO3A, FOXO4, og FOXO6. Talrige undersøgelser har vist, at FOXO proteiner spiller en vigtig rolle i en lang række normale biologiske processer, herunder cellulær proliferation, standsning af cellens cyklus, stressrespons, og apoptose [10, 13, 14], samt i sygdomme, såsom cancer og diabetes mellitus [15]. Men der er, lidt undersøgelse rapporteret om den rolle, FOXO4 spiller i GC.
I den foreliggende undersøgelse, fandt vi FOXO4 udtryk i ikke-tumorform væv var konsekvent stærkere end GC prøverne, og GCS viste en lavere udtryk niveau af FOXO4 i metastatiske læsioner sammenlignet med de tilsvarende primære tumorprøver. De FOXO4 mRNA og protein ekspressionsniveauer blev begge reduceret i forskellige typer af GC cellelinjer sammenlignet med det normale maveslimhinden epitelcellelinje, hvilket antyder, at FOXO4 kunne tjene som en negativ regulator for GC. Derudover forhøjet udtryk for FOXO4 udtryk hæmmede tumorcellevækst, invasion, og metastase in vitro og in vivo, hvilket indikerer, at FOXO4 kan spille en rolle i GC progression og metastase.
Mekanismerne ansvarlige for konsekvenserne af FOXO4 ændringer på GC udvikling og progression fortsat uklare. Adskillige nyere undersøgelser har indikeret, at FOXO regulerer mange aspekter af kræft biologi. For eksempel er FOXO normalt fastholdes af PI3K /Akt-signalvejen, hvilket forhindrer FOXO translokation ind i kernen, og FOXO regulere transkriptionelle responser uafhængigt af direkte DNA binding via association med en række ikke-relaterede transkriptionsfaktorer [16]. Vores resultater viste, at FOXO4 inducerede betydelig G1 anholdelse og S reduktion fase i GC celler, som viste, at FOXO4 hæmmet GC spredning kan i det mindste delvis af resultatet af G1 celle-cyklus anholdelse.
Et afgørende skridt i den metastatiske kaskade er processen med epitelial til mesenkymale overgang (EMT) [17, 18]. Under EMT-processen, ekspressionen af ​​E-cadherin blev ofte nedreguleres, mens der af vimentin ofte viser opreguleret [19]. FOXO4 kan regulere EMT i mavekræft. For at teste denne hypotese, vi vurderede udtryk for E-cadherin og vimentin i cellen modellerne ovenfor. Selvom der ikke blev observeret nogen indlysende ændring for E-cadherin, blev et dramatisk fald af vimentin ekspression vises i FOXO4 overekspression celler sammenlignet med kontrolcellerne som angivet ved immunfluorescerende assay og QRT-PCR. Disse undersøgelser antyder kraftigt, at FOXO4 kan hæmme gastrisk cancer metastase ved kontrol af EMT.
Konklusion
Afslutningsvis vores undersøgelse viser en kritisk funktion af FOXO4 til inhibering af GC proliferation og metastase via reguleringen af ​​G1 celle-cellecyklusstandsnings og EMT, tyder det kan tjene som et potentielt terapeutisk mål for mavekræft
Noter
Linna Su, Xiangqiang Liu, Na Chai bidrog ligeligt til dette arbejde
Forkortelser
FOXO4:..
Forkhead box O4
BSA:
Okseserumalbumin
DAB:
Diaminobenzidin

QRT-PCR:
Real-time kvantitativ PCR
MTT:
3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyl-tetrazoliumbromid
PBS:
Fosfat saltopløsning
DMSO:.
dimethylsulfoxid


erklæringer
Tak
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (tilskud nummer 81.172.062, 81.270.445). Vi takker Prof. Zengshan Li (Patologisk Institut på Xijing Hospital) for hans hjælp i patologisk analyse. Vi takker også Mrs. Zuhong Tian for hjælp med dyr billeddannelse eksperimenter. Forfatterne afslører ingen potentielle interessekonflikter

• LIM homeodomæne transskription faktor Isl1 dirigerer normal pylorus udvikling ved at målrette Gata3
• Genetiske polymorfier i osteopontin promotor øger risikoen for afstanden metastaser og død i kinesiske patienter med gastrisk cancer