De transcriptiefactor FOXO4 is down-gereguleerd en remt de tumor proliferatie en metastase bij maagkanker

De transcriptiefactor FOXO4 neerwaarts gereguleerd en remt tumor proliferatie en metastase bij maagkanker
Abstract achtergrond
FOXO4, lid van de FOXO familie van transcriptiefactoren, is momenteel de focus van intens onderzoek. De rol en functie bij maagkanker niet volledig opgehelderd. Deze studie was gericht op het expressieprofiel van FOXO4 bij maagkanker en het effect van FOXO4 op de groei van kankercellen en metastase te onderzoeken.
Methods
immunohistochemie, Western blotting en qRT-PCR werd uitgevoerd om de expressie te detecteren FOXO4 maagkanker cellen en weefsels. Celbiologische assays, subcutane tumorvorming en metastase staartader assay in combinatie met lentivirus constructie uitgevoerd om het effect van FOXO4 maagkanker proliferatie en metastase te detecteren in vitro en in vivo. Confocale en qRT-PCR werden uitgevoerd om de mechanismen te onderzoeken.
Resultaten
We vonden dat de expressie van FOXO4 aanzienlijk maagkanker meeste weefsels en in verschillende menselijke maagkanker cellijnen werd verlaagd. Opreguleren FOXO4 remde de groei en metastase van maagkanker cellijnen in vitro leidde tot dramatische vermindering van tumorgroei en lever en long metastase in vivo, terwijl downregulatie FOXO4 specifieke siRNAs bevorderde de groei en metastase van maagkanker cel lijnen. Verder vonden we dat up-reguleren FOXO4 kon belangrijke G1 arrestatie en S reductie fase en down-regulatie van de expressie van vimentine induceren.
Conclusie
Onze gegevens suggereren dat het verlies van FOXO4 meningsuiting bijdraagt ​​aan de maag de groei van kanker en metastase en het kan dienen als een therapeutisch doelwit voor maagkanker.
Sleutelwoorden
FOXO4 maagkanker proliferatie Metastase EMT Achtergrond
Hoewel de incidentie van maagkanker (GC) afneemt, blijft de vierde meest voorkomende kanker en de tweede belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd [1]. De belangrijkste moleculen betrokken bij proliferatie en metastase cel GC progressie kunnen helpen bij klinische diagnose of voorspellen van de progressie van deze ziekte.
Tumorgroei en metastase afhankelijk van verschillende factoren, waaronder transcriptiefactoren [2-5]. De FOXO transcriptiefactoren familie bestaat uit vier zeer verwante leden: FOXO1, FOXO3, FOXO4 en FOXO6 [6-8]. De laatste jaren zijn FOXO aangetoond cruciale rol spelen in verschillende cellulaire processen, waaronder proliferatie, apoptose, differentiatie, stressbestendigheid en metabole reacties [9], en kan daarom veelbelovende doelen voor nieuwe medicijnen op het gebied van oncologie [10, 11].
Onze eerdere resultaten toonden aan dat de FOXO4 mRNA expressie niveau was dramatisch down-gereguleerd in lymfeklier-positieve colorectaal carcinoom weefsels in vergelijking met lymfeklier-negatieve weefsels, suggereerde dat het kan functioneren als een negatieve regulator van de metastase van dikke darmkanker [12]. Echter, de expressie en functie van FOXO4 bij maagkanker nog niet bekend. Het doel van ons werk is geweest om de mogelijke rol van FOXO4 bij maagkanker carcinogenese te onderzoeken. Hier vermelden wij dat FOXO4 Repress celproliferatie en metastase bij maagkanker door de verordening G1 celcyclus arrestatie en vimentine.
Methods
weefselmonsters
Voor weefselmonsters, alle patiënten op voorwaarde geïnformeerde toestemming om overtollig pathologische gebruiken specimens voor onderzoeksdoeleinden. De protocollen die in deze studie werden goedgekeurd door het ziekenhuis Protection of Human Subjects Committee. Het gebruik van menselijke weefsels werd goedgekeurd door de institutionele review board van de Vierde Militaire Medische Universiteit en voldeden aan de Verklaring van Helsinki, evenals lokale wetgeving. Patiënten verschaffen monsters voor de studie ondertekende geïnformeerde toestemming vormen.

Immunohistochemie Immunohistochemische kleuring werd uitgevoerd met de het avidine-biotine complex immunoperoxidase methode. Het primaire antilichaam tegen FOXO4 (1: 100, ab63254, Abcam) verdund in PBS bevattende 1% (gew /vol) runderserumalbumine (BSA). Negatieve controles werden uitgevoerd door het vervangen van het primaire antilichaam met pre-immuun muizenserum. Beelden werden verkregen onder een lichtmicroscoop (Olympus BX51, Olympus, Japan) uitgerust met een DP70 digitale camera. De waarnemer was blind voor de identiteit van de monsters bij het scoren immunoreactiviteit.
Evaluatie van kleuring
Voor de evaluatie van de cel kleuring werden de coupes door twee onafhankelijke pathologen onderzocht zonder voorkennis van de kliniek pathologische toestand van de specimens . Cellen die bruin werden gekleurd werden als positief beschouwd. De expressie van FOXO4 werd geëvalueerd volgens de verhouding van positieve cellen per monster (R) en kleuring intensiteit (I). De verhouding van positieve cellen per monster werd als volgt gewaardeerd: 0 voor kleuring van < 1%, 1 voor kleuring van 2% tot 25%, 2 voor het kleuren van 26% tot 50%, 3 voor het kleuren van 51% tot 75%, en 4 voor het kleuren van > 75% van de onderzochte cellen. De intensiteit werd als volgt beoordeeld: 0, geen signaal; 1, zwakke kleuring; 2, matige kleuring; en 3, sterke kleuring. Een totaalscore (R x I) van 0-12 werd uiteindelijk berekend en beoordeeld als negatief (-score: 0-2). Of positief (+, 3-12)
Tissue verzameling
Tissue arrays werden gekocht bij de Aomei bedrijf (Aomei C0124H, AM01C09, Aomei Biotechnologie Co, Ltd, Xi'an, China) (Extra file 1: Table S1 en bijkomende file 2: Tabel S2). Voor de western blot analyse werden GC weefsels en aangrenzende nontumorous weefsel van acht patiënten die een operatie op de afdeling Algemene Heelkunde in ons ziekenhuis had ondergaan. Alle gevallen van GC en de normale maagslijmvlies werden klinisch en pathologisch bewezen. De protocollen die worden gebruikt in de studies werden goedgekeurd door de bescherming van de menselijke onderwerpen commissie van het ziekenhuis. Patiënten die verse chirurgische weefsel bijgedragen de studie had toestemmingsformulieren getekend.
RNA-extractie en real-time PCR
Totaal RNA uit de cellen geëxtraheerd met behulp van Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) en cDNA werd gesynthetiseerd met behulp de minister-Script RT reagens kit (TaKaRa Biotechnology, Dalian, China) volgens de aanbevelingen van de fabrikant. A Light Cycler Fast Start DNA Master SYBR Green I System (Roche, Bazel, Zwitserland) werd gebruikt voor de real-time PCR. GAPDH-mRNA werd gebruikt als interne controle en het reactiemengsel zonder het matrijs-DNA werd gebruikt als negatieve controle. Alle monsters werden onafhankelijk driemaal gemeten. De primersequenties waren als volgt: GAPDH: (voorwaarts) 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 'en (achterwaarts) 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'; FOXO4: (voorwaarts) 5'-CTTTCTGAAGACTGGCAGGAATGTG-3 'en (omgekeerde) 5'-GATCTAGGTCTATGATCGCGGCAG-3'; E-cadherine: (voorwaarts) 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3'- (omgekeerde) 5'AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 '; en Vimentin: (voorwaarts) 5'-CAGGCAAAGCAGGAGTCCAC -3'and (reverse) 5'-GCAGCTTCAACGGCAAAGTTC -3 '. Alle real-time PCR-reacties werden uitgevoerd in drievoud.
Oligonucleotide constructie en productie lentivirus
Drie paren van oligonucleotiden siRNA gericht FOXO4 werden gesynthetiseerd door GenePharma Co., Ltd GAPDH sequenties werden gebruikt als een positieve controle. Een ongerelateerde sequentie werd gebruikt als een negatieve controle (door GenePharma). De sequenties waren als volgt: FOXO4 siRNA oligo-1: 5'-CGCGAUCAUAGACCUAGAUTTAUCUAGGUCUAUGAUCGCGTT-3 '(sense); FOXO4 siRNA oligo-2: 5'-CAGCUUCAGUCAGCAGUUATTUAACUGCUGACUGAAGCUGTT-3 '(sense); FOXO4 siRNA oligo-3: 5'-GUGACAUGGAUAACAUCAUTTAUGAUGUUAUCCAUGUCACTT-3 '(sense); GAPDH siRNA oligo (positieve controle): 5'-GUAUGACAACAGCCUCAAGTT-3 '(sense); en negatieve controle: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 '. (sense)
Volgens de fabrikant instructies FOXO4 siRNA oligo's werden getransfecteerd in cellen met behulp van de siRNA-Mate ™ reagens (GenePharma Ltd., Shanghai, China). Na gekweekt gedurende 2-3 dagen, werden totale RNA en proteïne geëxtraheerd. Voor stabiele transfectie, een lentivirale overexpressie vector (Lenti-FOXO4) werd geconstrueerd (Shanghai GeneChem Co, Ltd, Shanghai, China). Met behulp van een GV166-puro Vector (GeneChem Co, Ltd, Shanghai, China), een lentivirale vector die GFP alleen uitgedrukt (LV-controle) werd gebruikt als een negatieve controle (NC).
Western blot
Equal hoeveelheden eiwitten werden gescheiden met natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) elektroforese en overgebracht naar een nitrocellulosemembraan (Bio-Rad, Hercules, CA). FOXO4 konijnen polyklonaal antilichaam (Abcam, 1: 500), CyclinD1 konijnen polyklonaal antilichaam (ImmunoWay, 1: 1000), β-actine monoklonaal antilichaam (Sigma, 1: 2000), E-cadherine en vimentine konijnen polyklonaal antilichaam (Santa Cruz, CA, 1:. 1000) antilichamen werden gebruikt voor western blot experimenten
celproliferatie assay
3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-difenyl-tetrazoliumbromide (MTT) assay werd uitgevoerd om de snelheid van celproliferatie te evalueren, en werd uitgevoerd volgens standaardprocedures. Elke cellijn werd gedetecteerd in drievoud
migratie en invasie assay
Transwell migratie assays werden uitgevoerd in gewijzigde Boyden kamers (Transwell; Corning Inc. Lowell, MA, USA). Bij een dichtheid van 5 x 10 3 cellen per putje. Na 24 uur incubatie bij 37 ° C werden de cellen op het onderoppervlak van de putjes gefixeerd met 4% paraformaldehyde, gekleurd met 1% kristalviolet en geteld.
High content assay
celmotiliteit was ondervraagde met behulp van een Cellomics Array Scan VTI 1700 plus (Thermo Scientific, USA). In het kort, cellen in de log-fase werden geoogst en uitgeplaat in 96-putjes platen (5 x 10 3 cellen /putje). Na overnacht kweken bij 37 ° C aanhechting werd het kweekmedium vervangen door serumvrij RPMI 1640 medium en de kweek werd nog 24 uur voortgezet. Vervolgens werden de cellen tweemaal met ijskoud PBS gewassen en gekleurd met Hoechst 33342 gedurende 15 minuten in een incubator. Vervolgens werden de cellen opnieuw tweemaal met ijskoud PBS gewassen en blootgesteld aan verschillende behandelingen. Celmotiliteit werd gedetecteerd met de Cellomics Array Scan VTI 1700 plus (Thermo Scientific) volgens het protocol van de fabrikant (elke groep omvatte vijf herhaalde putjes).
Confocale microscopie
Voor confocale microscopie experimenten werden cellen gekweekt op Lab-Tek 24-well kamer dia's (Thermo Fisher Scientific, USA). Na overnacht kweken werden de cellen gefixeerd, gewassen en gepermeabiliseerd met 0,3% Triton X- 100 in PBS gedurende 10 min. Daarna werden de cellen geïncubeerd met primaire antilichamen tegen E-cadherine en vimentine (verdunning 1: 300, Abcam) overnacht bij 4 ° C. De cellen werden geïncubeerd met Cy3-geconjugeerd anti-konijnen IgG (verdunning 1:. 200 (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, USA) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker de celkern werd tegengekleurd met behulp DAPI gedurende 5 min . Fluorescentie werd gevolgd en gefotografeerd met een confocale microscoop (Thermo Fisher Scientific, USA).
Dierproeven
voor dierproeven, naakt muizen 4-6 weken oud werden gekocht bij de Animal Center van de Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China) en onderhouden in laminaire stroming kabinetten onder specifieke pathogeen-vrije omstandigheden. Alle procedures voor dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care en gebruik Comite richtlijnen van het Experiment Animal Center van de Vierde Militaire Medische Universiteit.
tumorgeniciteit in naakt muizen
Logaritmisch groeiende cellen werden geoogst via trypsine en tweemaal met PBS gewassen. Vervolgens 2 x 10 6 cellen in 0,2 ml werd subcutaan geïnjecteerd in de rechter bovenrug gebied van de muizen. Vier weken na inoculatie werden tumordragende muizen opgeofferd en de grootte van de tumor werd bepaald door meting van de dikte subcutane tumormassa. Elke experimentele groep bevatte 6 muizen. Twee onafhankelijke experimenten werden uitgevoerd, en ze leverden vergelijkbare resultaten op.
Tail ader uitgezaaide assay
Ongeveer 2 × 10 6 cellen werden gesuspendeerd in 0,2 ml steriele PBS en geïnjecteerd in de staart aderen van 10 muizen. De muizen werden vervolgens gecontroleerd op volume van de tumor en de algehele gezondheid, en hun longen en levers werden regelmatig geobserveerd met behulp van imaging microscopie.
Statistische analyse Leer Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van SPSS 17.0 statistische software (SPSS, Inc., Chicago, Illinois). Variabelen met een p-waarde van minder dan 0,05 werden als statistisch significant beschouwd. χ
2 tests werden gebruikt om de betekenis van verschillen in FOXO4 expressiefrequentie tussen GC en aangrenzende weefsels nontumorous gastrische weefsels te evalueren. De t-test
(a one-way ANOVA test) uitgevoerd om de significantie van het verschil tussen celproliferatie, plaat klonen en migratie assays te evalueren. Overall survival curves werden uitgezet met behulp van de Kaplan-Meier-methode en werden geëvalueerd op statistische significantie met behulp van een log-rank test (de Mann-Whitney U Electronics Test en Kruskal-Wallis H-test werden voor andere data goedgekeurd).
Results
expressie van FOXO4 is down-gereguleerd in GC weefsels en cellijnen Belgique Om te onderzoeken of de FOXO4 expressie werd gewijzigd in GC, werden de expressie en subcellulaire lokalisatie van FOXO4 in een tissue microarray van 75 gepaarde GC monsters onderzocht door gebruik te maken een immunohistochemische assay. FOXO4 werd voornamelijk in de kernen van epitheelcellen in de maagklieren van nontumorous weefsels (figuur 1A1), maar een kleine hoeveelheid was gelokaliseerd in het cytoplasma. De FOXO4 kleuring in epitheelcellen van GC monsters was zwak. De FOXO4 kleuring in nontumorous weefsels (NT) was consistent sterker dan die van de GC monsters, en er was een significant verschil tussen de kleuring resultaten van de GC en NT monsters (figuur 1A2) (P < 0,05) Wij next gemeten de FOXO4 niveau in een onafhankelijk weefsel microarray paneel met 40 primaire GC en de bijbehorende lymfeklieren metastase exemplaren. Overall, GC toonde een lager expressieniveau van FOXO4 in metastasen vergeleken met de overeenkomstige primaire tumormonsters (Figuren 1A3-A4) .De expressieniveaus van FOXO4 werden met western blot en RT-PCR onderzocht GC en aangrenzend normaal weefsel van acht patiënten (Figuur 1B). Bij zeven van de acht gevallen werd FOXO4 gevonden dat verlaagde expressie in kankerweefsel, in overeenstemming met de resultaten van de immunohistochemische analysis.We bijkomende vergeleken de relatieve FOXO4 mRNA en eiwitexpressie niveaus tussen 6 verschillende GC cellijnen (BGC-823, SGC7901 , MKN28, AGS, 9811, en MKN45) en de onsterfelijke maag epitheel cellijn GES-1. Opnieuw FOXO4 expressie kwam relatief lager in alle 6 GC cellijnen met de normale onsterfelijke maagslijmvlies epitheliale GES-1 cellijn (Figuur 1C). Deze resultaten suggereren dat FOXO4 een onderdrukkende rol in de maag carcinogenese kunnen spelen. Figuur 1 FoxO4 significant neerwaarts gereguleerd in GC weefsels en cellijnen. (A1) IHC analyse van FOXO4 expressie in 75 gekoppelde GC en naburige niet-tumor weefsels. (A2) Statistische analyse van FOXO4 GC expressie in weefsels en naburige niet-tumor weefsels maag. (A3) Vertegenwoordiger FOXO4expression in primaire en metastatische GC weefsels gedetecteerd door IHC methoden. (A4) Statistische analyse van FOXO4 expressie tussen GC weefsels met en zonder knooppunt metastase. (B1-B2) Real-time PCR en Western blot analyse van FOXO4 expressie in 8 paren van GC en de aangrenzende niet-tumor weefsel. (C1-C2) Real-time PCR en western blotting analyse van FOXO4 expressie in verschillende GC cellijnen.
FOXO4 remt GC proliferatie in vitro en induceert celcyclus arrestatie in de G0 /G1-fase Belgique Om de rol van de onderzoeken FOXO4 in GC groei, hebben we twee stabiele cellijnen (aangeduid SGC7901-FoxO4 en SGC7901-NC) na infectie met de LV- FoxO4 of LV-NC lentivirus, respectievelijk. Na herhaalde puromycineselectie, RT-PCR en Western blot analyse bevestigde dat SGC7901-FoxO4 FOXO4 vertoonden hogere expressie in vergelijking met SGC7901-NC (figuur 2A1-A2). De MTT-test bleek dat opwaartse regulatie van FOXO4 expressie significant remde de proliferatie van GC cellen (figuur 2A3, P < 0,01) .In daarentegen de BGC823 cellijn die relatief hogere endogene expressie heeft, werd transiënt getransfecteerd met FOXO4 siRNA of de negatieve controle. Drie paren van siRNA oligonucleotides targeting FOXO4 werden gesynthetiseerd en getransfecteerd in BGC823 cellen (BGC823-FOXO4si1, BGC823-FOXO4si2 en BGC823-FOXO4si3), en cellen die met siRNA oligo negatieve controle werden bestempeld BGC823-SINC. qRT-PCR en Western-blot toonde aan dat siRNA oligo nummer 1 was het meest effectief, zo, dit construct werd geselecteerd voor verdere studie (Figuur 2B1-B2). Dienovereenkomstig, de groeicurven aangegeven dat downregulatie van de expressie van FOXO4 resulteerde in verhoogde proliferatie onder GC-cellen (Figuur 2B3) We hebben ook uitgevoerd een plaat kolonievorming assay. Deze resultaten bleek dat SGC7901-FOXO4 cellen geproduceerd minder cel kolonies in vergelijking met SGC7901-NC controle cellen (figuur 2C1-C2, P < 0,05). Vervolgens gebruikten we FACS-analyse de effecten van FOXO4 op de celcyclus te onderzoeken. SGC7901 FOXO4-cellen weergegeven significante G1 arrest en S-fase reductie (Figuur 2D1-D2), waaruit bleek dat GC FOXO4 remde proliferatie als gevolg van G1 celcyclus arrestatie. Om deze waarneming te versterken, we de expressie van CyclinD1 die een merker G1 fase western blot gedetecteerd, bleek dat CyclinD1had een relatief hogere expressie in de 7801-NC cellijn dan 7901-FOXO4 cellen (figuur 2E1-E2). Figuur 2 Effect van FOXO4 over de regulering van de proliferatie GC cel. (A1-A2) Relatieve expressie van FOXO4 in SGC-7901-cellen die met LV-FOXO4 of LV-controle, die werd bevestigd door real-time PCR en Western blotanalyse. De waarden vertegenwoordigen de middelen uit drie afzonderlijke experimenten, en de foutbalken vertegenwoordigen de SEM (** P < 0,01). (A3) De proliferatiesnelheden cellen werd gemeten met de MTT assay. De waarden vertegenwoordigen de middelen drie afzonderlijke experimenten, en de foutbalken vertegenwoordigen de SEM (* P < 0,05). (B1-B2) Relatieve expressie van FOXO4 in BGC-823 cellen getransfecteerd met FOXO4 oligonucleotide of oligonucleotide remmer controle, die werd bevestigd door real-time PCR en Western blotanalyse. De waarden vertegenwoordigen de middelen uit drie afzonderlijke experimenten, en de foutbalken vertegenwoordigen de SEM (** P < 0,01). (B3) de proliferatiesnelheden van cellen werd gemeten met de MTT assay. De waarden vertegenwoordigen de middelen drie afzonderlijke experimenten en de foutbalken vertegenwoordigen de SEM (* P < 0,05). (C1-C2) kolonievorming van SGC07901 cellen getransfecteerd met LV-FOXO4 en LV-controle werd uitgevoerd door enten cellen op platen voor 2 weken uitgevoerd en het aantal kolonies werd vervolgens geteld. De waarden vertegenwoordigen de middelen drie afzonderlijke experimenten, en de foutbalken vertegenwoordigen de SEM (* P < 0,05). (D1-D2) celcyclusverdeling van SGC-7901-cellen die met LV-FOXO4 of LV-control. Celcyclus analyse werd uitgevoerd 24 uur na transfectie. De celcyclusverdeling werd berekend en uitgedrukt als het gemiddelde ± SD van drie afzonderlijke experimenten. * P < 0,05. (E1-E2) Relatieve expressie van CyclinD1 in SGC-7901-cellen die met LV-FOXO4 of LV-controle, die western blot analyse werd bevestigd. De waarden vertegenwoordigen de middelen drie afzonderlijke experimenten, en de foutbalken vertegenwoordigen de SEM (* P < 0,05).
FOXO4 inhibeert de migratie en invasie van GC cellen in vitro Belgique Om de invloed van GC op FOXO4 evalueren migratie en invasie, we vervolgens werd het effect van FOXO4 uitdrukking op het invasieve en migrerende vermogen van GC cellen toepassing van in vitro assays Transwell. De resultaten toonden aan dat de migratie en invasie van SGC-7901-FOXO4 cellen werden beide met name verlaagd in vergelijking met SGC-7901-NC controlecellen (figuur 3A1). In contrast, uitputting van FOXO4 aanzienlijk bevorderd cel migratie en invasie in BGC823 cellen in vergelijking met cellen (figuur 3A2) te controleren. Bovendien is de high-gehalte screening test toonde de beweeglijkheid snelheid van SGC-7901-FOXO4 cellen is aanzienlijk lager dan SGC-7901-NC cellen, 15/19 tijdstippen toonde duidelijk aan de beweeglijkheid snelheid van SGC-7901-FOXO4 cellen is lager dan SGC-7901-NC-cellen (Figuur 3B). Bovendien, wondgenezing tests toonden aan dat SGC-7901-FOXO4 cellen gesloten wonden langzamer dan SGC-7901-NC-cellen (Figuur 3C) (P < 0,05). Tezamen geven deze resultaten aan dat FOXO4 aanzienlijk verminderde GC celmigratie en invasie in vitro. Figuur 3 Effect van FOXO4 bij het reguleren GC cel metastase. (A1-A2) Up-regulatie van FOXO4 expressie in LV-FOXO4 cellen afgenomen SGC-7901 cel migratie en invasie in vitro, terwijl de remming van FOXO4 expressie met behulp van de oligo nucleotide remmer van FOXO4 verbeterde BGC-823 celmigratie en invasie. (B) Celmigratie capaciteit werd geëvalueerd door het uitvoeren van een hoog gehalte assay SGC-7901-cellen die met LV-FOXO4 of LV-control. * P < 0,05 (C) Celmigratie capaciteit werd ook getest door het uitvoeren van een wondhelend assay SGC-7901-cellen die met LV-FOXO4 of LV-control. * P < 0.05.
FOXO4 up-regulatie remt het ontstaan ​​van tumoren en metastase van GC cellen in vivo Belgique Om verder te bevestigen de effecten van FOXO4 op het ontstaan ​​van tumoren van GC, werd een tumorvorming test uitgevoerd in naakt muizen. SGC7901-NC en SGC7901-FOXO4 cellen werden subcutaan geënt in het juiste bovenrug regio naakt muizen op één locatie. Vier weken later, muizen die subcutaan geïnoculeerd werden opgeofferd, de getransplanteerde tumoren werden uitgesneden en de tumorgrootten werden geëvalueerd (figuur 4A1-A3, P < 0,05). De resultaten toonden een significante afname van de grootte van xenotransplantaten gevolg van FOXO4 opwaarts gereguleerd cells.To verder de rol van FOXO4 verkennen in tumormetastase in vivo, we geïmplanteerd SGC7901-NC en SGC7901-FOXO4 cellen in naakt muizen via de laterale staartader . Representatieve bioluminescente beeldvorming (BLI) van de verschillende groepen wordt weergegeven in Figuur 4B1. Histologische analyse verder bevestigd dat de incidentie van long- en levermetastasen in de SGC7901 FOXO4-groep was significant verminderd in vergelijking met de SGC7901 NC-groep (Figuur 4B2, B3). Het aantal long metastasen in de SGC7901 FOXO4-groep ook verminderd in vergelijking met de SGC7901 NC-groep (gegevens niet getoond). Lever- en longmetastasen werden voorts uit hematoxyline en eosine kleuring (Figuur 4C). Bovendien is de SGC7901-FOXO4 groep naakt muizen aangetoond langere algemene overleving tijd in vergelijking met de SGC7901-NC-groep (Figuur 4D). Deze gegevens gaven aan dat FOXO4 onderdrukt GC cel tumorvorming en metastase in vivo. Figuur 4 In vivo proliferatie en metastase assay. (A1-A3) SGC-7901-cellen die met LV-FOXO4 of LV-controle werden getransplanteerd onder de huid. Zes weken later, tumoren werden duidelijker waargenomen bij muizen geïmplanteerd met 7901 NC-cellen in vergelijking met de 7901-FOXO4 groepen: (6/6 in de 7901-NC groepen en 3/6 in 7901 FOXO4-groepen). De tumoren werden uitgesneden en gemeten. (B1-B3) SGC-7901-cellen die met LV-FOXO4 of LV-controle werden geïnjecteerd in de staart aderen van naakt muizen. Tien weken later, muizen geïmplanteerd met 7901-NC-cellen vertoonden de longen en de lever uitzaaiingen, terwijl enkele uitzaaiingen in muizen geïmplanteerd met 7901-FOXO4 cellen werden ontdekt: (voor longkanker metastase, 10/06 in de 7901-NC groepen en 1/10 in de 7901-FoxO4 groepen, lever metastase, 3/10 in 7901 NC-groepen en 0/10 in 7901-FoxO4 groepen. (C) beelden die representatief hematoxyline en eosine kleuring van de longen en de lever weefselmonsters van de verschillende experimentele groepen * P <.. 0,05 (D) Totale overleving van het naakt muizen in elke groep
Moleculaire mechanismen van FOXO4 in de uitzaaiing van GC
Om mogelijke mechanismen te onderzoeken voor de rol van FOXO4 in GC metastase, onderzochten we de expressie van metastase gerelateerde moleculen, inclusief E-cadherine, vimentine in SGC-7901-FOXO4 en SGC-7901-NC controlecellen middels RT-PCR (figuur 5A1-A2). de resultaten toonden aan dat FOXO4 overexpressie sterk onderdrukt de expressie van vimentine, hoewel geen duidelijke verandering werd waargenomen voor E-cadherine. De immunofluorescentie confocale resultaten opgeleverd ook soortgelijke conclusies (Figuur 5B1-B2). Figuur 5 FOXO4 remt EMT GC cellen. (A1-A2) real-time PCR vertoonde opgereguleerd expressie van epitheliale merkers (E-cadherine) en down-gereguleerde expressie van mesenchymale markers (vimentine) in 7901 FOXO4-cellen. (B1-B2) Immunofluorescentie kleuring vertoonde opgereguleerd expressie van epitheliale merkers (E-cadherine) en down-gereguleerde expressie van mesenchymale markers (vimentine) in 7901 FOXO4-cellen.
Deze gegevens geven aan dat FOXO4 gedeeltelijk GC cel kan beïnvloeden metastase door het reguleren van EMT proces, en de extra moleculaire mechanismen zullen worden onderzocht in de toekomstige werkzaamheden.
Discussie
forkhead box klasse O (FOXO) familie van transcriptiefactoren is evolutionair geconserveerd en wordt gekenmerkt door de zogenaamde forkhead box DNA- bindend domein. In zoogdieren, de FOXO gen-familie bestaat uit vier leden: FOXO1, FOXO3A, FOXO4 en FOXO6. Talrijke studies hebben aangetoond dat FOXO eiwitten spelen een belangrijke rol in een groot aantal normale biologische processen, waaronder celproliferatie, celcyclus stressrespons en apoptose [10, 13, 14], en bij ziekten zoals kanker en diabetes mellitus [15]. Er is echter weinig onderzoek gerapporteerd over de rol van FOXO4 speelt in GC.
In deze studie hebben we de FOXO4 expressie in niet-tumorachtige weefsels was consistent sterker dan die van de monsters GC en GC toonde een lagere expressie niveau van FOXO4 in metastatische laesies vergeleken met de overeenkomstige primaire tumor samples. De FOXO4 mRNA en eiwit expressie niveaus werden beide verlaagd diverse GC cellijnen vergeleken met de normale maagslijmvlies epitheliale cellijn, wat suggereert dat FOXO4 kan dienen als een negatieve regulator voor GC. Bovendien verhoogde expressie van FOXO4 expressie geremd tumorcel groei, invasie en metastase in vitro en in vivo, hetgeen aangeeft dat FOXO4 een rol in GC en metastase kunnen spelen. Ondernemingen De mechanismen die het effect van FOXO4 alteraties in GC ontwikkeling en progressie onduidelijk. Verschillende recente studies hebben aangetoond dat FOXO reguleert vele aspecten van kanker biologie. Zo wordt FOXO gewoonlijk tegengehouden door de PI3K /Akt signaalweg die FOXO voorkomt translocatie naar de kern en transcriptie reguleren FOXO reacties onafhankelijk van directe DNA-binding via associatie met een verscheidenheid van niet-verwante transcriptiefactoren [16]. Onze resultaten toonden dat FOXO4 induceerde significante G1 arrest en S reductiefase in GC cellen, waaruit bleek dat GC FOXO4 remde proliferatie ten minste gedeeltelijk door het resultaat van de G1 celcyclus arrestatie.
Kan een kritische stap in de metastatische cascade is de proces van epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) [17, 18]. Tijdens het EMT proces, de expressie van E-cadherine werd vaak neerwaarts gereguleerd, terwijl die van vimentine vertoont vaak opwaarts gereguleerd [19]. FOXO4 kan EMT bij maagkanker te reguleren. Om deze hypothese te testen, onderzochten we de uitingen van E-cadherine en vimentine in de cel bovenstaande modellen. Hoewel er geen duidelijke verandering werd waargenomen voor E-cadherine, werd een dramatische daling van vimentine expressie wordt weergegeven in FOXO4 overexpressie cellen in vergelijking met de controlecellen, zoals aangegeven door immunofluorescentie assay en qRT-PCR. Deze studies suggereren sterk dat FOXO4 maagkanker metastase kunnen remmen door het reguleren van EMT.
Conclusie
Samenvattend, onze studie toont een kritische functie van FOXO4 in de remming van GC proliferatie en metastase via de regulatie van de G1 celcyclus arrestatie en EMT, suggereert dat als een potentieel therapeutisch doel voor maagkanker kunnen dienen
Notes
Linna Su, Xiangqiang Liu, Na Chai eveneens bijgedragen aan dit werk
Afkortingen
FOXO4:..
Forkhead box O4
BSA:
Bovine serumalbumine
DAB:
Diaminobenzidine

qRT-PCR:
real-time kwantitatieve PCR
MTT:
3- [4,5-dimethyl-2-yl] -2, 5-difenyl-tetrazoliumbromide
PBS:
fosfaat gebufferde zoutoplossing
DMSO.
Dimethylsulfoxide


verklaringen
Dankwoord
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidie ​​nummer 81172062, 81270445). Wij danken Prof. Zengshan Li (afdeling Pathologie aan Xijing Hospital) voor zijn hulp bij pathologische analyse. We danken ook Mevr Zuhong Tian voor de hulp met dierlijke imaging experimenten. De auteurs onthullen geen potentiële belangenconflicten
Electronic aanvullend materiaal
12885_2014_4601_MOESM1_ESM.doc Extra file 1:. Tabel S1: Informatie weefsel array (menselijke adenocarcinoom van de maag met matchende aangrenzende weefsels). Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• LIM homeodomein transcriptiefactor Isl1 regisseert normale pyloric ontwikkeling door zich te richten Gata3
• Genetische polymorfismen in het osteopontine promotor verhoogt het risico op afstand metastase en dood in Chinese patiënten met maag cancer