Transkripčný faktor FOXO4 je down-regulovaná a inhibuje proliferáciu nádoru a metastázy do žalúdka cancer

Faktor FOXO4 transkripcie je down-regulovaná a inhibuje proliferáciu nádoru a metastáz u karcinómu žalúdka
abstraktné
pozadia
FOXO4, člen rodina FOXO transkripčných faktorov, je v súčasnej dobe ohnisko intenzívneho štúdia. Jej úloha a funkcie u karcinómu žalúdka neboli plne objasnené. Táto štúdia bola zameraná na vyšetrovanie expresné profil FOXO4 v karcinómu žalúdka a účinok FOXO4 na rast nádorových buniek a metastáz.
Metódy
imunohistochémia, Western blot a QRT-PCR boli vykonané, aby detekciu expresie v FOXO4 žalúdočné rakovinové bunky a tkanivá. Bunkové biologické testy, subkutánnu karcinogenity a chvostové žila metastatický testu v kombinácii s lentivirem konštrukcia boli vykonané pre detekciu dopadu FOXO4 k rakovine žalúdka proliferácie a metastáz in vitro a in vivo. Konfokálna a QRT-PCR boli vykonané, aby preskúmať mechanizmy.
Výsledky
Zistili sme, že expresia FOXO4 bol vo väčšine žalúdočných rakovinové tkanive a v rôznych ľudských nádorových bunkových línií žalúdočných výrazne znížila. Up-regulácia FOXO4 inhibuje rast a metastázy karcinómu žalúdka bunkových línií in vitro, čo viedlo k dramatickému útlmu rastu nádoru, a pečeňové a pľúcne metastázy in vivo, zatiaľ čo down-reguláciu FOXO4 so špecifickými molekulami siRNA podporoval rast a metastázy žalúdočné nádorové bunky linky. Ďalej sme zistili, že up-regulácia FOXO4 by mohlo vyvolať významnú fázu G1 a znižovanie S fázy a down-reguláciu expresie vimentin.
Záver
Naše údaje ukazujú, že strata expresie FOXO4 prispieva k žalúdočnej rastu a metastáz rakoviny , a môže slúžiť ako potenciálny terapeutický cieľ pre rakovinu žalúdka.
Kľúčové
FOXO4 karcinóm žalúdka proliferation metastázy EMT pozadí
aj keď je výskyt rakoviny žalúdka (GC) klesá, zostáva štvrtou najčastejšou rakovinou a druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu spojených s po celom svete [1]. Kľúčové molekuly zapojené do bunkovej proliferácie a metastázy v progresii GC môže pomôcť v klinickej diagnostike a predikciu progresie tohto ochorenia.
Rast nádoru a metastázy závisieť od rôznych faktorov, vrátane transkripčných faktorov [2-5]. Rodina FOXO transkripčné faktory sa skladá zo štyroch vysoko príbuzné členov: FOXO1, FOXO3, FOXO4 a FOXO6 [6-8]. V posledných rokoch, FOXO bolo preukázané, že hrá rozhodujúcu úlohu v celej rade bunkových procesov, vrátane proliferácie, apoptózy, diferenciácie, odolnosť proti stresu, a metabolických reakcií [9], a môžu teda byť sľubné ciele pre nové lieky v oblasti onkológie [10, 11].
Naše predchádzajúce výsledky ukazujú, že hladina expresie mRNA FOXO4 bola dramaticky down-regulované v lymfatických uzlín pozitívnych kolorektálneho karcinómu v porovnaní s tkanivom lymfatických uzlín-negatívnych tkanív, navrhol, že to môže fungovať ako negatívny regulátor metastázy kolorektálneho karcinómu [12]. Avšak výraz a funkcie FOXO4 u karcinómu žalúdka neboli doteraz známe. Cieľom našej práce bolo preskúmať možnú úlohu FOXO4 v žalúdku rakoviny rakoviny. Tu sme správu, že proliferácia FOXO4 REPRESS buniek a metastáz u karcinómu žalúdka nariadením G1 bunkového cyklu a vimentin.
Metódy
Vzorky tkanív Apartmán V tkanivových vzoriek, všetci pacienti za predpokladu, informovaný súhlas na použitie prebytočnej patologickú vzorky na vedecké účely. Protokoly použité v tejto štúdii boli schválené ochrane nemocnice ľudských subjektov výboru. Využitie ľudských tkanív bol schválený inštitucionálnu etickou komisiou štvrtého Vojenské lekárskej univerzity a v zhode s Helsinskej deklarácie, rovnako ako miestne legislatívou. Pacienti poskytnutia vzorky pre štúdium podpísanej súhlasu vo formy.
Imunohistochémia
Imunohistochemické farbenie bolo vykonané za použitia avidín-biotín komplex imunoperoxidázové metódy. Primárne protilátka proti FOXO4 (1: 100, ab63254, abca) zriedený v PBS obsahujúcom 1% (hmotnosť /objem) hovädzí sérový albumín (BSA). Negatívne kontroly boli vykonané výmene primárnej protilátky s pre-imunitným myšiam sérom. Snímky boli získané pod svetelným mikroskopom (Olympus BX51, Olympus, Japonsko) vybavenom digitálnou kamerou DP70. Pozorovateľ bol oslepený, aby totožnosť vzoriek pri vyhodnocovaní imunoreaktivita.
Vyhodnotenie škvŕn
Pre vyhodnotenie farbenie buniek, rezy boli skúmané dvoma nezávislými patológov bez predchádzajúcej znalosti kliniky-patologický stav exemplárov , Bunky, ktoré boli zafarbené hnedé boli považované za pozitívne. Expresia FOXO4 bola hodnotená podľa pomeru pozitívnych buniek na vzorke (R) a farbiacim intenzity (I). Pomer pozitívnych buniek na vzorke bola hodnotená nasledovne: 0 pre farbenie < 1%, 1 na farbenie 2% až 25%, 2 na farbenie o 26% až 50%, 3 pre farbenie 51% až 75%, a 4 na farbenie > 75% buniek vyšetrených. Intenzita bola odstupňovaná nasledovne: 0, žiadny signál; 1, slabé farbenie; 2, mierne farbenie; a 3, silné farbenie. Celkom skóre (R x I) 0-12 bol nakoniec vypočítaná a označená ako negatívne (-score: 0-2). Alebo pozitívny (+, 3-12)
kolekcia Tissue
tkanivových poliach boli zakúpené od spoločnosť aome (aome C0124H, AM01C09, aome Biotechnology Co. Ltd., Xi'an, Čína) (Ďalší súbor 1: Tabuľka S1 a ďalší súbor 2: Tabuľka S2). Pre western blot analýze GC tkaniva a priľahlé nontumorous tkanivá boli získané od ôsmich pacientov, ktorí podstúpili operáciu na oddelenie všeobecnej chirurgie v našej nemocnici. Všetky prípady GC a normálne žalúdočnej sliznice boli klinicky a patologicky preukázaná. Protokoly používané v týchto štúdiách boli schválené ochrane nemocnici v ľudských subjektov výboru. Pacienti, u ktorých sa podieľali čerstvé chirurgické tkaniva pre štúdium podpísali informovaný súhlas formy.
Extrakcia RNA a PCR v reálnom čase
Celková RNA z buniek sa extrahuje za použitia TRIzolu (Invitrogen, Carlsbad, CA), a cDNA sa syntetizuje za použitia reagenčný súpravy Prime Script RT (Takara Biotechnology, Dalian, Čína) podľa odporúčania výrobcu. Light Cycler Fast štart DNA Hlavné SYBR Green I System (Roche, Bazilej, Švajčiarsko) bol použitý pre real-time PCR. GAPDH mRNA bol použitý ako vnútorná kontrola a reakčná zmes bez templátu DNA bola použitá ako negatívna kontrola. Všetky vzorky boli merané trikrát nezávisle na sebe. Sekvencie primérov boli nasledovné: GAPDH: (dopredu) 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 'a (reverznej) 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'; FOXO4: (dopredu) 5'-CTTTCTGAAGACTGGCAGGAATGTG-3 'a (reverznej) 5'-GATCTAGGTCTATGATCGCGGCAG-3'; E-cadherin: (dopredu) 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3'and (reverznej) 5'-AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 '; a Vimentin: (dopredu) 5'-CAGGCAAAGCAGGAGTCCAC -3'and (reverznej) 5'-GCAGCTTCAACGGCAAAGTTC -3 ". Všetky real-time PCR reakcie boli vykonávané v triplikátech.
Oligonukleotidové konštrukcia a výroba lentivirus
Tri páry oligonukleotidov siRNA cielia FOXO4 boli syntetizované GenePharma Co., Ltd. GAPDH sekvencie boli použité ako pozitívna kontrola. Nepríbuzných sekvencia bola použitá ako negatívna kontrola (zaisťuje GenePharma). Sekvencie boli nasledovné: FOXO4 siRNA oligo-1: 5'-CGCGAUCAUAGACCUAGAUTTAUCUAGGUCUAUGAUCGCGTT-3 '(sense); FOXO4 siRNA oligo-2: 5'-CAGCUUCAGUCAGCAGUUATTUAACUGCUGACUGAAGCUGTT-3 '(sense); FOXO4 siRNA oligo-3: 5'-GUGACAUGGAUAACAUCAUTTAUGAUGUUAUCCAUGUCACTT-3 '(sense); GAPDH siRNA oligo (pozitívna kontrola): 5'-GUAUGACAACAGCCUCAAGTT-3 '(sense); a negatívna kontrola: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 '. (sense)
Podľa výrobcov inštrukcií, FOXO4 siRNA oligonukleotidy boli transfekovány do buniek pomocou činidlo siRNA-Mate ™ (GenePharma Ltd., Shanghai, Čína). Po kultivujú počas 2 až 3 dni, celková RNA a proteínov boli extrahované. Pre stabilné transfekciu, lentivirovým nadmerná expresia vektor (Lenti-FOXO4) bola postavená (Shanghai génoch Co., Ltd., Shanghai, Čína). Pomocou GV166-puro Vector (génoch Co., Ltd., Shanghai, Čína), lentivirovým vektor, ktorý vyjadrené GFP samostatne (LV-kontrola) bola použitá ako negatívna kontrola (NC).
Western blot
Rovné množstvo proteínov boli oddelené za použitia dodecylsulfát-polyakrylamidovom gélu (SDS-PAGE), elektroforéza sodného a prenesené na nitrocelulózové membránu (Bio-Rad, Hercules, CA). FOXO4 králičie polyklonálne protilátky (abca, 1: 500), CyclinD1 králičie polyklonálne protilátky (ImmunoWay, 1: 1000), β-aktínu myší monoklonálne protilátky (Sigma, 1: 2000), E-cadherin a Vimentin králičie polyklonálne protilátky (Santa Cruz, CA, 1 :. 1000) protilátky boli použité pre experimenty westernovým prenosom
Cell test proliferácie
3- [4,5-dimetyl-thiazol-2-yl] -2,5-difenyl-tetrazolium bromidu (MTT) test bol vykonaný pre vyhodnotenie rýchlosti bunkovej proliferácie, a bola vykonávaná podľa štandardných postupov. Každá bunková línia bola detekovaná v troch vyhotoveniach
migrácie a invázie test
testy Transwell migračných boli vykonávané v upravených Boyden komory (Transwell; Corning Inc. Lowell, MA, USA). V hustote 5 x 10 3 buniek na jamku. Po 24 hodinách inkubácie pri teplote 37 ° C, bunky na spodnom povrchu jamiek boli fixované 4% paraformaldehydom, farbené 1% kryštálovú violeťou a počítajú.
Testovacím skríningu s vysokým obsahom
pohyblivosť buniek bol oslovovanie Cellomics Array Scan VTI 1700 Plus (Thermo Scientific, USA). V stručnosti, bunky v log fáze zozbieraného a umiestnené do 96-jamkových doštičiek (5 x 10 3 buniek /jamku). Po kultivácii cez noc pri teplote 37 ° C počas priľnavosti, kultivačné médium bolo nahradené RPMI1640 médiu bez séra a kultúra sa pokračuje počas ďalších 24 h. Potom boli bunky dvakrát premyjú ľadovo chladným PBS a zafarbené Hoechst 33342 po dobu 15 minút v inkubátore. Následne boli bunky opäť premyté dvakrát ľadovo chladným PBS a vystavené rôznym ošetrenie. Pohyblivosti buniek bola detekovaná pomocou Cellomics Array Scan VTI 1700 a (Thermo Scientific) podľa protokolu výrobcu (každá skupina zahŕňala päť opakované jamky).
Konfokálna mikroskopia
pre konfokálna mikroskopia pokusy boli bunky pestované na Lab-Tek 24-jamkové kĺzačky komora (Thermo Fisher Scientific, USA). Po celonočnej kultivácii boli bunky fixované, premyté, a permeabilizovány 0,3% Triton X- 100 v PBS po dobu 10 minút. Potom boli bunky inkubované s primárnymi protilátkami proti E-cadherinu a vimentinu (riedenie 1: 300, abca) cez noc pri 4 ° C. Bunky boli tiež inkubované s Cy3 konjugovanou anti-králičie IgG (riedenie 1 :. 200 (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, USA) po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti v tme bunkové jadro sa kontrastne pomocou DAPI po dobu 5 minút . Fluorescencia bola monitorovaná a fotografovaný s konfokálním mikroskopom (Thermo Fisher Scientific, USA).
štúdie na zvieratách Apartmán v výskumu na zvieratách, holých myší 4 až 6 týždňov veku boli zakúpené zo zvieracieho centra čínskej akadémie vied (Shanghai, Čína) a udržiavané v laminárnym skrine prietokových za určitých patogénov bez podmienok. Všetky postupy pokusov na zvieratách boli vykonané v súlade s pokynmi pre inštitucionálnych Animal Care and Use Výboru experimentu Animal stredu štvrtého Vojenskej lekárskej univerzity.
tumorigenicity u nahých myší
logaritmicky rastúce bunky boli zozbierané za použitia trypsínu a dvakrát premyté PBS. Potom, 2 x 10 6 buniek v 0,2 ml boli injikované subkutánne do pravej hornej zadnej oblasti myšou. Štyri týždne po inokulácii myší nádorom boli usmrtené, a veľkosť nádoru bola stanovená meraním strmeňa z podkožnej nádorovej hmoty. Každá experimentálna skupina obsahovala 6 myší. Dva nezávislé pokusy boli vykonané, a poskytli podobné výsledky.
Chvostový žily metastatické test
Približne 2 x 10 6 bunky boli suspendované v 0,2 ml sterilného PBS a podať do chvostovej žily po 10 myšiach. Myši potom boli sledované na objeme nádoru a celkové zdravie, a ich pľúca a pečeň bola pravidelne pozorované za použitia zobrazovacie mikroskopia.
Štatistická analýza
Všetky štatistické analýzy boli vykonávané s použitím SPSS 17.0 štatistického software (SPSS, Inc., Chicago, Illinois). Premenné s hodnotou P menšie ako 0,05 boli považované za štatisticky významné. χ
2 testy boli použité pre vyhodnotenie významnosti rozdielov v FOXO4 expresnom frekvencii medzi GC tkanív a priľahlých nontumorous žalúdočné tkaniva. T-test
(jednosmerné ANOVA test) bol vykonávaný pre vyhodnotenie významnosti rozdielu medzi bunkovej proliferácie, doskových klonov a migračné testy. Celkové Krivky prežitia boli vynesené pomocou metódy Kaplan-Meierovej a boli hodnotené na štatistickú významnosť s použitím log-rank testu (Mann-Whitney U
test a Kruskal-Wallis H testu boli prijaté pre ďalšie dáta).
Výsledky
expresie FOXO4 je down-regulovaná v GC tkanivách a bunkových líniách
skúmať, či výraz FOXO4 bol zmenený v GC, expresie a subcelulárnu lokalizácia FOXO4 boli študované v mikroskopickej sústavy tkanív 75 ​​párových vzoriek pomocou GC imunohistochemická skúška. FOXO4 bola exprimované hlavne v jadrách epiteliálnych buniek umiestnených v žalúdočných žľazách nontumorous tkanív (obr 1A1), ale malé množstvo bol lokalizovaný do cytoplazmy. Farbenie FOXO4 v epitelové bunky zo vzoriek GC bola slabá. Avšak, farbenie FOXO4 v nontumorous tkanivách (NT) bolo trvalo silnejšie ako u vzoriek GC, a tam bol významný rozdiel medzi výsledkami farbenie GC a vzoriek NT (obr 1A2), (P 0,05) WE ďalšie meraná hladina FOXO4 v nezávislom tkanivo microarray panelom obsahujúcim 40 primárnych lymfatických uzlín vzorky GCS a zodpovedajúce. Celkovo možno povedať, GC vykazovali nižšiu úroveň expresie FOXO4 v metastatických lézií v porovnaní so zodpovedajúcimi primárnych nádorových vzoriek (obr 1A3-A4) .v expresné hladiny FOXO4 boli skúmané aj Western blot a RT-PCR v GC a priľahlých normálnych tkanív získaných z osem pacientov (obrázok 1b). V siedmich z ôsmich prípadoch bolo zistené, že FOXO4 majú zníženú expresiu v rakovinových tkanivách, v súlade s výsledkami z imunohistochémia analysis.We ďalej porovnané relatívnej úrovne FOXO4 mRNA a expresie proteínov medzi 6 rôznych GC bunkových líniách (BGC-823, SGC7901 , MKN28, AGS, 9811 a MKN45) a nesmrteľná žalúdočné epiteliálne bunkové línie GES-1. Opäť platí, že FOXO4 bol vyjadrený na relatívne nižšej úrovni vo všetkých bunkových líniách 6 GC v porovnaní s normálnou nesmrteľné žalúdočnej sliznice epiteliálne bunkové línie GES-1 (obrázok 1C). Tieto výsledky naznačujú, že FOXO4 môže hrať úlohu v potláčajúce žalúdočnú karcinogenéze. Obrázok 1 FoxO4 je významne down-regulované v GC tkanív a bunkových línií. (A1) IHC analýza FOXO4 expresie v 75 párových GC a priľahlých non-nádorových tkanivách. (A2) Štatistická analýza FOXO4 expresie v tkanivách GC a priľahlých non-nádorové žalúdočné tkaniva. (A3) Zástupca FOXO4expression v primárnych a metastatických GC tkanív odhalených IHC metódami. (A4) Štatistická analýza FOXO4 expresie medzi GC tkaniva s a bez uzlín. (B1-B2) Real-time PCR a Western blot analýza FOXO4 expresie v 8 párov GC a priľahlé non-nádorových tkanivách. (C1-C2) Real-time PCR a western blot analýza FOXO4 expresie v rôznych bunkových líniách GC.
FOXO4 inhibuje GC proliferáciu in vitro a indukuje zástavu bunkového cyklu v G0 /G1 fáze
Pre zistenie role FOXO4 rastu GC, vznikajú dve stabilné bunkové línie (označené SGC7901-FoxO4 a SGC7901-NC) po infekcii LV- FoxO4 alebo LV-NC lentivirus, resp. Po opakovanom výbere puromycin, RT-PCR a western blot analýza potvrdila, že SGC7901-FoxO4 vykazovali vyššiu FOXO4 expresie v porovnaní s SGC7901-NC (obr 2A1-A2). MTT test ukázal, že up-regulácia FOXO4 expresie významne inhibujú proliferáciu GC buniek (obr 2A3, P-0,01) .V Naopak, bunková línia BGC823, ktorá má relatívne vyšší endogénnej expresie, bol prechodne transfekovány FOXO4 siRNA alebo negatívna kontrola. Tri páry oligonukleotidov siRNA cielia FOXO4 boli syntetizované a transfekovány do buniek (BGC823 BGC823-FOXO4si1, BGC823-FOXO4si2 a BGC823-FOXO4si3), a bunky transfekované siRNA oligo negatívna kontrola boli označené BGC823-since. QRT-PCR a western blot ukazuje, že siRNA oligonukleotid číslo 1 bol najúčinnejší, takže tento konštrukt bol vybraný pre ďalšie štúdium (obr 2B1-B2). V súlade s tým, krivky rastu naznačila, že down-reguláciu expresie FOXO4 za následok zvýšenú proliferáciu u GC buniek (obr 2B3) WE tiež vykonať test tvorby kolónií tanier. Tieto výsledky odhalili, že SGC7901-FOXO4 bunky sú produkované menej bunkových kolónií v porovnaní s kontrolnými bunkami SGC7901-NC (obr 2C1-C2, P menšie ako 0,05). Ďalej sme použili FACS analýzu skúmať účinky FOXO4 na bunkový cyklus. SGC7901-FOXO4 bunky zobrazená významnú fázu G1 a S zníženie fázy (obr 2D1-D2), čo naznačuje, že FOXO4 inhibovala proliferáciu GC v dôsledku zástavy G1 bunkového cyklu. K posilneniu tohto pozorovania sme zistili, expresiu CyclinD1, ktorý je markerom G1 fáze s westernovým prenosom, sa ukázalo, že CyclinD1had relatívne vyšší expresie v bunkovej línii 7801-NC než 7901-FOXO4 bunkách (obr 2E1-E2). Obrázok 2 Vplyv FOXO4 na reguláciu proliferácie GC buniek. (A1-A2) Relatívna expresie FOXO4 v SGC-7901 buniek transfektovaných LV-FOXO4 alebo LV-kontroly, ktorá bola potvrdená PCR v reálnom čase a western blot analýzy. Hodnoty predstavujú prostriedky z troch oddelených pokusov a chybové úsečky predstavujú SEM (** P 0,01). (A3) Sadzby proliferáciu buniek boli merané pomocou MTT testu. Hodnoty predstavujú prostriedky z troch oddelených pokusov a chybové úsečky predstavujú SEM (* p 0,05). (B1-B2) Relatívna expresie FOXO4 v BGC-823 buniek transfektovaných s inhibítorom FOXO4 oligo nukleotidu alebo riadenie nukleotidu oligo, čo bolo potvrdené pomocou real-time PCR a analýzy western blot. Hodnoty predstavujú prostriedky z troch oddelených pokusov a chybové úsečky predstavujú SEM (** P 0,01). (B3) Rýchlosti proliferácie buniek bola meraná s použitím testu MTT. Hodnoty predstavujú prostriedky z troch oddelených pokusov a chybové úsečky predstavujú SEM (* P menšie ako 0,05). (C1-C2) Colony tvorba SGC07901 buniek transfekciou LV-FOXO4 a LV-kontrola sa vykonáva naočkovaním buniek na doštičky po dobu 2 týždňov, a počet kolónií bol potom spočítané. Hodnoty predstavujú prostriedky z troch oddelených pokusov a chybové úsečky predstavujú SEM (* p 0,05). (D1-D2) distribúcie bunkového cyklu z SGC-7901 buniek transfektovaných LV-FOXO4 alebo LV-control. Analýza bunkového cyklu sa uskutočnila 24 hodín po transfekciu. Distribúcia bunkového cyklu bola vypočítaná a vyjadrené ako priemer ± SD z troch oddelených pokusov. * P < 0.05. (E1-E2) Relatívna expresie CyclinD1 v SGC-7901 buniek transfektovaných LV-FOXO4 alebo LV-kontrole, ktorá bola potvrdená analýzou Western blot. Hodnoty predstavujú prostriedky z troch oddelených pokusov a chybové úsečky predstavujú SEM (* P menšie ako 0,05).
FOXO4 inhibuje migráciu a inváziu GC buniek in vitro
Pre vyhodnotenie vplyvu FOXO4 na GC migrácie a invázie, máme ďalšiu hodnotený vplyv FOXO4 prejave na invazívne a migračné schopnosťou GC buniek za použitia v testoch in vitro Transwell. Výsledky ukázali, že migrácia a invázia SGC-7901-FOXO4 bunky boli obaja najmä znížené v porovnaní s SGC-7901-NC kontrolné bunky (obr 3A1). Na rozdiel od toho vyčerpania FOXO4 významne podporovať migráciu a inváziu buniek v BGC823 buniek v porovnaní s kontrolnými bunkami (obr 3A2). Okrem toho, testovacím skríningu s vysokým obsahom ukázala rýchlosť pohyblivosť SGC-7901-FOXO4 buniek je významne nižšia ako SGC-7901-NC buniek, 15/19 časových bodov jasne ukázali, že rýchlosť pohyblivosť SGC-7901-FOXO4 buniek je nižší ako SGC-7901-NC bunky (Obrázok 3b). Navyše, testy hojenie rán ukázali, že SGC-7901-FOXO4 bunky uzavreté rany pomalšie než SGC-7901-NC bunky (obrázok 3C) (P menšie ako 0,05). Spoločne tieto výsledky ukazujú, že FOXO4 významne narušená migráciu GC buniek a invázie in vitro. Obrázok 3 Účinok FOXO4 v regulácii GC buniek metastáz. (A1-A2) Up-regulácia expresie v FOXO4 LV-FOXO4 buniek znížila SGC-7901 migrácie a invázie buniek in vitro, zatiaľ čo inhibícia FOXO4 expresie s použitím inhibítora oligo nukleotidu FOXO4 zvýšenú BGC-823 migráciu a inváziu buniek. (B) Migrácia buniek kapacita bola vyhodnotená prevedením s vysokým obsahom testu v SGC-7901 buniek transfektovaných LV-FOXO4 alebo LV-kontrolou. * P < 0.05 (C) Migrácia buniek kapacita bola tiež testovaná prevedením testu pre hojenie rany v SGC-7901 buniek transfektovaných LV-FOXO4 alebo LV-control. * P < 0.05.
FOXO4 up-regulácia inhibuje tumorigenezi a metastázovaniu GC buniek in vivo
Pre ďalšie potvrdenie účinkov FOXO4 na vzniku nádorov GC, test formácia nádoru bola vykonaná u nahých myší. SGC7901-NC a SGC7901-FOXO4 bunky boli podkožne Inokulované do pravého horného zadného regiónu holých myší v jedinom mieste. O štyri týždne neskôr myši, ktoré boli podkožne Inokulované boli usmrtené, transplantované nádory boli vybraté a veľkosti nádoru bola hodnotená (obrázok 4A1-A3, P menšie ako 0,05). Výsledky ukázali významné zníženie vo veľkosti xenoimplantátů vyplývajúce z FOXO4 up-regulované cells.To ďalej skúmať úlohu FOXO4 v nádorových metastáz in vivo, sme implantované SGC7901-NC a SGC7901-FOXO4 buniek do nahých myší cez laterálna chvostovej žily , Zástupca bioluminiscenční zobrazovanie (BLI) z rôznych skupín je znázornené na obrázku 4B1. Histologická analýza ďalej potvrdili, že výskyt pľúc a pečeňových metastáz v skupine SGC7901-FOXO4 sa významne znížil, v porovnaní so skupinou SGC7901-NC (obr 4B2, B3). Počet metastatických pľúcnych uzlíkov v skupine SGC7901-FOXO4 sa tiež znížila, v porovnaní so skupinou SGC7901-NC (dáta nie sú uvedené). Pečeňové a pľúcne metastázy boli ďalej dokladá hematoxylínom a eosínu (obrázok 4C). Okrem toho skupina nahých myší SGC7901-FOXO4 preukázané dlhšej celkovej doby prežitia v porovnaní s SGC7901-NC skupiny (obrázok 4D). Tieto dáta ukázali, že FOXO4 potlačené GC buniek tumorigenezi a metastáz in vivo. Obrázok 4 proliferácie in vivo a metastáz testu. (A1-A3) SGC-7901 buniek transfekciou LV-FOXO4 alebo LV-kontroly boli transplantované pod kožu. O šesť týždňov neskôr boli nádory jasnejšie vidieť u myší s implantovanými 7901-NC buniek v porovnaní s 7901-FOXO4 skupín: (6/6 v 7901-NC skupín a 3/6 do 7901-FOXO4 skupín). Nádory boli vybraté a merané. (B1-B3) SGC-7901 buniek transfekciou LV-FOXO4 alebo LV-kontroly boli injikované do chvostovej žily u nahých myší. O desať týždňov neskôr, myši implantované 7901-NC buniek ukázala, pľúcne a pečeňové metastázy, vzhľadom na nízky počet metastáz bola u myší s implantovanými 7901-FOXO4 buniek detekovaná: (pre pľúcne metastázy, 6/10 v 7901-NC skupín a 1/10 v na 7901-FoxO4 skupín, pečeňových metastáz, 3/10 v 7901-NC skupín a 0/10 v 7901-FoxO4 skupín. (C) Snímky ukazujú reprezentatívne hematoxylínom a eosínu pľúc a pečene tkanivových vzoriek z rôznych experimentálnych skupín * P < .. 0,05 (D) Celkové prežívanie holých myší v každej skupine
Molekulárne mechanizmy FOXO4 v metastázy GC
Ak chcete preskúmať potenciálne mechanizmy pre rolu FOXO4 v GC metastázy sme skúmali expresiu molekúl metastáz súvisiacich, vrátane E-cadherinu, vimentin v SGC-7901-FOXO4 a bunky SGC-7901-NC ovládanie pomocou RT-PCR (Obrázok 5A1-A2). výsledky ukázali, že FOXO4 nadmerná expresia výrazne potlačená expresia vimentin, aj keď žiadna zrejmá zmena nebola pozorovaná pre E-cadherinu. Výsledky imunofluorescencie konfokálna tiež prinieslo podobným záverom (obr 5B1-B2). Obrázok 5 FOXO4 inhibuje EMT v GC buniek. (A1-A2) PCR v reálnom čase ukázala, up-regulovaná expresia epitelových markerov (E-cadherinu) a down-regulované expresiu mezenchymálnych markerov (vimentin) v 7901-FOXO4 buniek. (B1-B2) Imunofluorescenčný farbenie ukázalo up-regulovaná expresia epitelových markerov (E-cadherinu) a down-regulovaná expresia mezenchymálnych markerov (vimentin) v 7901-FOXO4 buniek.
Tieto údaje naznačujú, že FOXO4 môže čiastočne ovplyvniť GC bunku metastázy regulovaním EMT procesu a ďalších molekulárnych mechanizmov budú študované v ďalšej práci.
Diskusia
forkhead box triedy o (FOXO) rodina transkripčných faktorov je evolučne konzervovaný a je charakterizovaný tzv forkhead box DNA väzbové domény. U cicavcov, gén rodiny FOXO sa skladá zo štyroch členov: FOXO1, FOXO3A, FOXO4 a FOXO6. Početné štúdie preukázali, že FOXO proteíny hrajú dôležitú úlohu v celej rade normálnych biologických procesov, vrátane bunkovej proliferácie, zastavenie bunkového cyklu, odpovede na stres a apoptózy [10, 13, 14], ako aj pri ochoreniach, ako je rakovina a diabetes mellitus [15]. Avšak, je tu malá štúdia uvádza, o úlohe FOXO4 hrá v GC.
V tejto štúdii sme zistili, že FOXO4 expresie v non-nádorových tkanivách bol trvale silnejší ako u vzoriek GC a GC vykazovali zníženú expresiu úroveň FOXO4 v metastatických lézií v porovnaní so zodpovedajúcimi vzorkami primárneho nádoru. Hladiny FOXO4 mRNA a expresie proteínu bola znížená a to ako v rôznych typoch bunkových línií GC v porovnaní s normálnou žalúdočnej sliznice epitelové bunkové línie, čo naznačuje, že FOXO4 by mohlo slúžiť ako negatívny regulátor pre GC. Ďalej, zvýšená expresia FOXO4 expresia inhibuje rast nádorových buniek, invázia a metastáz in vitro a in vivo, čo naznačuje, že FOXO4 môže hrať úlohu v progresii GC a metastáz.
Mechanizmy zodpovedné za vplyvu FOXO4 zmien na vývoj GC a progresie zostávajú nejasné. Niekoľko nedávnych štúdií ukázali, že FOXO reguluje mnoho aspektov biológie rakoviny. Napríklad FOXO je zvyčajne obmedzený PI3K /Akt signálne dráhy, ktorá zabraňuje FOXO translokáciu do jadra, a FOXO regulujú transkripčný reakcie nezávisle priamej väzby DNA pomocou spojenia s radom nepríbuzných transkripčných faktorov [16]. Naše zistenia ukazujú, že FOXO4 indukované významný G1 zatknutie a S zníženie fázový GC buniek, ktoré by naznačovali, že FOXO4 potlačený GC proliferáciu môže aspoň čiastočne v dôsledku G1 bunkového cyklu zatknutie.
Jedna zásadný krok v metastatické kaskády je proces epitelových na mezenchýme prechodu (EMT) [17, 18]. V priebehu procesu EMT, expresia E-cadherinu často down-regulované, zatiaľ čo ktoré z vimentinu sa často ukazuje, up-regulované [19]. FOXO4 môžu regulovať EMT v rakoviny žalúdka. Pre testovanie tejto hypotézy sme hodnotili prejavy E-cadherinu a vimentin v bunkových modeloch vyššie. Aj keď žiadna zrejmá zmena nebola pozorovaná pre E-cadherin, bol vystavený k dramatickému poklesu vimentin expresiu v bunkách FOXO4 nadmerná expresia v porovnaní s kontrolnými bunkami, ako je naznačené výsledkom imunofluorescenčného testom a QRT-PCR. Tieto štúdie silne naznačujú, že by mohli inhibovať FOXO4 žalúdočné nádorových metastáz regulovaním EMT.
Záver
Na záver, naše štúdia ukazuje kritickú funkciu FOXO4 v inhibíciu proliferácie GC a metastáz pomocou regulácie G1 bunkového cyklu zástave a EMT, navrhne, že to môže slúžiť ako potenciálny terapeutický cieľ pre rakovinu žalúdka
Poznámky
Linna Nie, Xiangqiang Liu, na Chai prispelo rovnakou mierou k tejto práci
Skratky
FOXO4: ..
Forkhead box O4
BSA:
hovädzie sérum albumín
DAB:
Diaminobenzidine

QRT-PCR:
Real-time kvantitatívne PCR
MTT:
3- [4,5-dimetyl-thiazol-2-yl] -2, 5-difenyl-tetrazoliumbromid
PBS:
tlmený soľný roztok fosfáty
DMSO :.
dimetylsulfoxid

deklarácia
Poďakovanie
Táto práca bola podporená Národnej prírodnej Science Foundation Číny (grant číslom 81172062, 81270445). Ďakujeme Prof. Zengshan Li (Department of Pathology na Xijing nemocnice) za pomoc pri patologickej analýze. Ďakujeme tiež pani Zuhong Tian za pomoc s zobrazovacími pokusy na zvieratách. Autori nevyplýva žiadny potenciálny konflikt záujmov
elektronický doplnkový materiál
12885_2014_4601_MOESM1_ESM.doc Ďalší súbor 1: Tabuľka č. S1: Informácie o tkanivá pole (ľudského adenokarcinóme žalúdka s zladených okolitého tkaniva). Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• LIM homeodoména transkripčný faktor Isl1 riadi normálny pyloric vývoj zacielením Gata3
• Genetické polymorfizmy v promótorom osteopontínu zvyšuje riziko vzdialenosť metastázy a úmrtia u čínskych pacientov s rakovinou žalúdka