Фактор транскрипции FOXO4 подавляется и подавляет пролиферацию опухоли и метастаз при раке желудка

Фактор транскрипции FOXO4 подавляется и подавляет пролиферацию опухоли и метастаз при раке желудка
Аннотация
Справочная информация
FOXO4, член семьи FOXO факторов транскрипции, в настоящее время является центром интенсивного изучения. Его роль и функции при раке желудка не были полностью выяснены. Настоящее исследование было направлено на изучение профиля экспрессии FOXO4 при раке желудка и влияние FOXO4 на рост и метастазирование раковых клеток.
Методы
иммуногистохимия, вестерн-блоттинга и QRT-ПЦР проводили для определения экспрессии FOXO4 в клетки рака желудка и тканей. биологические анализы клетки, подкожная туморогенность и хвостовую вену метастатическим анализа в сочетании с лентивирусов конструкции были выполнены, чтобы определить влияние FOXO4 к раку желудка в пролиферации и метастазирования в пробирке и в естественных условиях. Конфокальной и QRT-ПЦР проводили с целью изучения механизмов.
Результаты
Мы обнаружили, что экспрессия FOXO4 было значительно снижено в большинстве желудочных раковых тканей и в различных желудочных линий раковых клеток человека. Повышающей регуляции FOXO4 ингибирует рост и метастазирование желудочного линий раковых клеток в пробирке и привело к резкому ослаблению роста опухоли, и печени и легких метастаз в естественных условиях, в то время как вниз для регулирования FOXO4 с конкретными киРНК способствовал рост и метастазирование клеток желудка, линии. Кроме того, мы обнаружили, что до регулирующего FOXO4 может вызвать значительный арест G1 и уменьшение фазы S и понижающей регуляции экспрессии виментину.
Заключение
Наши данные свидетельствуют о том, что потеря экспрессии FOXO4 способствует желудочной роста и метастазирования рака , и он может служить в качестве потенциальной терапевтической мишени для рака желудка.
Ключевые слова
FOXO4 рак желудка Пролиферация Метастазирование EMT Справочная
Хотя заболеваемость раком желудка (GC) снижается, она остается четвертым наиболее распространенным видом рака и второй ведущей причиной рака, связанных смерти во всем мире [1]. Основные молекулы, участвующие в клеточной пролиферации и метастазированию в прогрессии GC может помочь в клинической диагностики или прогнозирования прогрессирования этого заболевания.
Рост опухоли и метастазирование зависит от различных факторов, в том числе факторов транскрипции [2-5]. FOXO факторы транскрипции семейство состоит из четырех высоко связанных членов: foxo1, FOXO3, FOXO4 и FOXO6 [6-8]. В последние годы FOXO было показано, играют решающую роль в многочисленных клеточных процессов, включая пролиферацию, апоптоз, дифференцировка, устойчивость к стрессу, и метаболические реакции [9], и, следовательно, могут быть перспективными объектами для новых лекарственных препаратов в области онкологии [10, 11].
Наши предыдущие результаты показали, что уровень экспрессии мРНК FOXO4 резко вниз регулируется в лимфатических узлах-положительных колоректального рака тканей по сравнению с лимфатическими лимфоузлов тканей, предположил, что это может функционировать в качестве отрицательного регулятора метастаз колоректального рака [12]. Тем не менее, выражение и функции FOXO4 при раке желудка еще не были известны. Целью нашей работы было изучение возможной роли FOXO4 в желудочном канцерогенезе рака. Здесь мы сообщаем, что пролиферацию клеток FOXO4 репрессируют и метастазирование при раке желудка по остановке клеточного цикла регулирования G1 и виментину.
Методы
образцов тканей
Для образцов тканей, все пациенты дали информированное согласие на использование избытка патологических образцы для исследовательских целей. Протоколы, используемые в данном исследовании, были утверждены защиты больницы прав субъектов Комитета. Использование человеческих тканей было одобрено этическими комитетами Четвертого военного медицинского университета и соответствовали Хельсинской декларации, а также местного законодательства. Пациенты, предоставление образцов для исследования подписали формы информированного согласия.
Иммуногистохимия
Иммуногистохимическое окрашивание проводили с использованием комплексного метода иммунопероксидазой авидинбиотиновом. Первичное антитело против FOXO4 (1: 100, ab63254, Abcam) разводили в PBS, содержащем 1% (вес /объем) бычьего сывороточного альбумина (БСА). Отрицательные контроли были выполнены путем замены первичного антитела с предварительно иммуносывороткой мыши. Изображения были получены под световым микроскопом (Olympus BX51, Olympus, Япония), оборудованного цифровой камерой DP70. Наблюдатель был ослеплен к идентичности образцов, когда забил
иммунореактивности. Оценка окрашивания
Для оценки окрашивания клеток, секции были рассмотрены двумя независимыми патологоанатомами без предварительного знания клинико-патологическое состояние образцов , Клетки, которые окрашивали коричневый считались положительными. Выражение FOXO4 оценивали по соотношению положительных клеток на образец (R) и интенсивности окрашивания (I). Соотношение положительных клеток на образце оценивали следующим образом: 0 для окрашивания ≪ 1%, 1 для окрашивания 2% до 25%, 2 для окрашивания 26% до 50%, 3 для окрашивания 51% до 75%, и 4 для окрашивания > 75% клеток, исследованных. Интенсивность оценивали следующим образом: 0, отсутствие сигнала; 1, слабое окрашивание; 2, умеренное окрашивание; и 3, сильное окрашивание. Общий счет (R × I) от 0 до 12 была, наконец, рассчитывали и оцениваемый как отрицательный (-score: 0-2). Или положительной (+, 3-12)
коллекция тканей
тканей массивов были приобретены у компания Aomei (Aomei C0124H, AM01C09, Aomei Biotechnology Co. Ltd., Сиань, Китай) (Дополнительный файл 1: Таблица S1 и Дополнительный файл 2: Таблица S2). Для Вестерн-блот-анализа, GC ткани и прилегающих к ним неопухолевых тканей были получены из восьми пациентов, перенесших операцию на кафедре общей хирургии в нашей больнице. Все случаи GC и нормальной слизистой оболочки желудка были клинически и патологически доказана. Протоколы, используемые в исследованиях были одобрены защите больницы прав субъектов Комитета. Пациенты, которые внесли вклад свежую хирургическую ткани для исследования подписали формы информированного согласия.
Выделение РНК и ПЦР в реальном времени
Суммарную РНК из клеток экстрагируют с помощью тризола (Invitrogen, Carlsbad, CA) и кДНК синтезировали с использованием набор реагентов Prime Script RT (Takara Biotechnology, Далянь, Китай) в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя. Свет Циклование быстрый старт ДНК мастер SYBR Green I Система (Roche, Basel, Switzerland) использовали для ПЦР в реальном времени. GAPDH мРНК использовали в качестве внутреннего контроля, и реакционную массу без ДНК-матрицы использовали в качестве отрицательного контроля. Все образцы были измерены независимо друг от друга три раза. Последовательности праймеров были следующими: GAPDH: (вперед) 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 'и (обратный) 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'; FOXO4: (вперед) 5'-CTTTCTGAAGACTGGCAGGAATGTG-3 'и (обратный) 5'-GATCTAGGTCTATGATCGCGGCAG-3'; E-кадгерин: (вперед) 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3'and (обратный) 5'- AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 '; и Виментин: (вперед) 5'-CAGGCAAAGCAGGAGTCCAC -3'and (обратный) 5'-GCAGCTTCAACGGCAAAGTTC -3 '. Все ПЦР в реальном времени реакции проводили в трех повторностях.
Строительство олигонуклеотида и Лентивирус производство
Три пары миРНК олигонуклеотиды, ориентированных FOXO4 были синтезированы GenePharma Co., Ltd. GAPDH последовательности использовали в качестве положительного контроля. Неродственного последовательность была использована в качестве негативного контроля (предоставленной GenePharma). Последовательности были следующими: FOXO4 миРНК олиго-1: 5'-CGCGAUCAUAGACCUAGAUTTAUCUAGGUCUAUGAUCGCGTT-3 '(смысловой); FOXO4 миРНК олиго-2: 5'-CAGCUUCAGUCAGCAGUUATTUAACUGCUGACUGAAGCUGTT-3 '(смысловой); FOXO4 миРНК олиго-3: 5'-GUGACAUGGAUAACAUCAUTTAUGAUGUUAUCCAUGUCACTT-3 '(смысловой); GAPDH-миРНК олиго (положительный контроль): 5'-GUAUGACAACAGCCUCAAGTT-3 '(смысловой); и отрицательный контроль: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 '. (смысл)
По словам производителей инструкции, FOXO4 миРНК Олигонуклеотиды трансфицировали в клетки с использованием реагента миРНК-Mate ™ (GenePharma Ltd., Шанхай, Китай). После того, как культивировали в течение 2-х до 3 дней, были извлечены тотальную РНК и белка. Для стабильной трансфекции лентивирусов вектор гиперэкспрессия (Ленти-FOXO4) был построен (Shanghai GeneChem Co., Ltd., Шанхай, Китай). Использование GV166-Puro Vector (GeneChem Co., Ltd., Шанхай, Китай), лентивирусного вектор, который выражается GFP в покое (LV-контроль) был использован в качестве отрицательного контроля (НК).
Вестерн-блот
Равное количества белков были разделены с использованием додецилсульфата-полиакриламидном геле (SDS-PAGE) электрофорез натрия и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad, Hercules, CA). FOXO4 кроличьи поликлональные антитела (Abcam, 1: 500), CyclinD1 кроличьи поликлональные антитела (ImmunoWay, 1: 1000), β-актина мышиные моноклональные антитела (Sigma, 1: 2000), Е-кадгерин и Виментин кроличьи поликлональные антитела (Santa Cruz, Калифорния., 1: 1000) антитела использовали для западных экспериментов блоттинга
пролиферации клеток
3- [4,5-диметилтиазол-2-ил] -2,5-дифенил-тетразолия (МТТ) анализ проводили для оценки скорости пролиферации клеток, и проводили в соответствии со стандартными процедурами. Каждая клеточная линия была обнаружена в трех экземплярах
Миграция и анализ вторжения
миграции анализы Transwell были выполнены в модифицированных камерах Бойдена (Transwell, Corning Inc. Lowell, MA, USA). При плотности 5 × 10 3 клеток на лунку. Через 24 ч инкубации при 37 ° С клетки на нижней поверхности лунок, фиксировали 4% параформальдегидом, окрашивали 1% кристаллическим фиолетовым и подсчитывали.
Скрининге высокого содержания
подвижности клеток было обследовали с помощью Cellomics массива Scan VTI 1700 плюс (Thermo Scientific, США). Вкратце, клетки в логарифмической фазе собирали и высевали в 96-луночные планшеты (5 × 10 3 клеток /лунку). После культивирования в течение ночи при 37 ° С для обеспечения необходимой адгезии, культуральную среду заменяли бессывороточной средой RPMI1640, после чего культивацию продолжали еще в течение 24 ч. Затем клетки дважды промывали охлажденным на льду PBS и окрашивали Hoechst 33342 в течение 15 мин в термостате. Впоследствии клетки были вновь дважды промывали охлажденным льдом PBS и подвергали воздействию различных обработок. Подвижность клеток был обнаружен с помощью Cellomics массива Scan VTI 1700 плюс (Thermo Scientific) в соответствии с протоколом производителя (каждая группа включала пять повторных лунок).
Конфокальной микроскопии
Для конфокальной микроскопии экспериментов клетки выращивали на Lab-Tek 24-луночные камерные слайды (Thermo Fisher Scientific, США). После ночного культивирования клетки фиксировали, промывали и проницаемыми с 0,3% Тритон Х- 100 в PBS в течение 10 мин. Затем клетки инкубировали с первичными антителами против E-кадгерина и виментину (разведение 1: 300, Abcam) в течение ночи при температуре 4 ° С. Клетки инкубировали также с Cy-3 конъюгированного IgG против кролика (разведение 1:. 200 (Джексон Иммуно исследований, Вест-Гроув, штат Пенсильвания, США) в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте Ядро клетки контрастно с использованием DAPI в течение 5 мин . Флуоресцентная контролировали и фотографировали с помощью конфокальной микроскопии (Thermo Fisher Scientific, США).
исследования на животных
Для исследований на животных, голых мышей от 4 до 6-недельного возраста были приобретены из Центра животных китайской академии наук (Шанхай, Китай) и поддерживается в ламинарных шкафах потока под конкретного патогена условиях. Все процедуры для экспериментов на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами институционального ухода за животными и использование комитета проведения эксперимента центра животных Четвертого военного медицинского университета. <бр> Туморогенность в голых мышах
логарифмически растущие клетки собирали с помощью трипсина и промывали дважды PBS. Затем, 2 × 10 6 клеток в 0,2 мл вводили подкожно в правую верхнюю области спины мышей. Через четыре недели после инокуляции опухоль мышей забивали, и размер опухоли определяли путем измерения толщины подкожной опухолевой массы. Каждая экспериментальная группа состояла из 6 мышей. Два независимых эксперимента, и они дали сходные результаты.
Хвостовую вену метастатический анализ
Приблизительно 2 × 10 6 клеток суспендировали в 0,2 мл стерильной PBS и вводили в хвостовую вену 10 мышей. Затем мышей контролировали для объема опухоли и общего состояния здоровья, а также их легкие и печень регулярно наблюдали с использованием изображений микроскопии.
Статистический анализ
Все статистические анализы были проведены с использованием SPSS 17,0 статистического программного обеспечения (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс). Переменные со значением P менее 0,05 считались статистически значимыми. χ
2 испытания были использованы для оценки значимости различий в частоте экспрессии FOXO4 между ГЦ тканей и прилегающих к ним неопухолевых желудка тканей. Т
-test (односторонний ANOVA тест) проводили для оценки значимости разности между клеточной пролиферации, клонов пластин и анализов миграции. В целом кривые выживаемости были нанесены с использованием метода Каплана-Мейера и оценивали на статистическую значимость с помощью лог-рангового теста (Манна-Уитни U
тест и тест Крускала-Уоллиса H были приняты для других данных).
Результаты
выражение FOXO4 подавляется в GC тканей и клеточных линий
Чтобы проверить, был ли выражение FOXO4 изменено в GC, были изучены выражение и внутриклеточной локализации FOXO4 в ткани микрочипов 75 парных образцах с помощью GC иммуногистохимическое анализ. в основном выражается FOXO4 в ядрах эпителиальных клеток, расположенных в желудочных желез неопухолевых тканей (рис 1A1), но небольшое количество был локализован в цитоплазме. FOXO4 окрашивание в эпителиальных клетках из образцов GC была слабой. Тем не менее, FOXO4 окрашивание в неопухолевых тканях (NT), была последовательно сильнее, чем у образцов, GC, и существует значительная разница между результатами окрашивания ГХ и образцов NT (рисунок 1A2) (P &ЛТ; 0,05) .Мы следующий измеряли уровень FOXO4 в независимой ткани микрочипов панели, содержащей 40 первичных лимфатических узлов образцов метастазы ГКС и соответствующие. В целом, ШС показали более низкий уровень экспрессии FOXO4 в метастатических поражений по сравнению с соответствующими первичными образцов опухолей (рис 1A3-А4) .The уровни экспрессии FOXO4 были также исследованы с помощью Вестерн-блот и RT-PCR в GC и прилегающих к ним нормальных тканей, полученных из восемь пациентов (рис. 1В) В семи из восьми случаев FOXO4 было установлено, что снижение экспрессии в тканях раковых, в соответствии с результатами из иммуногистохимии analysis.We далее сравнивали относительные уровни FOXO4 мРНК и экспрессии белка среди 6 различных линий ГХ клеток (BGC-823, SGC7901 , MKN28, AGS, 9811 и MKN45) и бессмертная желудка эпителиальных клеток линии GES-1. Опять же, была выражена FOXO4 на относительно низком уровне во всех линиях 6 GC клеток по сравнению с нормальным бессмертной слизистой оболочки желудка эпителиального ГЭС-1 клеточной линии (рис 1C). Эти результаты свидетельствуют о том, что FOXO4 могут играть подавляющую роль в желудочном канцерогенезе. Рисунок 1 FoxO4 значительно вниз регулируется в GC тканях и клеточных линиях. (A1) IHC анализ экспрессии FOXO4 в 75 парного GC и прилегающих к нему неопухолевых тканей. (A2) Статистический анализ экспрессии FOXO4 в GC тканях и прилегающих к ним неопухолевых тканей желудка. (A3) Представитель FOXO4expression в первичных и метастатических тканях GC обнаруженных методами IHC. (А4) Статистический анализ экспрессии FOXO4 между ГЦ тканей с и без узла метастазирования. (B1-B2) ПЦР в реальном времени и вестерн-блот анализ экспрессии FOXO4 в 8 пар GC и прилегающих к нему неопухолевых тканей. (C1-C2) ПЦР в реальном времени и Вестерн-блоттинг анализ экспрессии FOXO4 в различных линиях клеток GC.
FOXO4 ингибирует пролиферацию GC в пробирке и индуцирует остановку клеточного цикла в фазе G0 /G1
Чтобы исследовать роль FOXO4 в росте GC, мы установили два стабильных клеточных линий (обозначается SGC7901-FoxO4 и SGC7901-NC) после заражения с лентивирусов LV- FoxO4 или LV-NC, соответственно. После повторного отбора пуромицин, ОТ-ПЦР и Вестерн-блот-анализ подтвердил, что SGC7901-FoxO4 показали более высокую экспрессию FOXO4 по сравнению с SGC7901-NC (рис 2A1-A2). МТТ-анализе показал, что повышающая регуляция экспрессии FOXO4 значительно ингибирует пролиферацию GC клеток (рис 2A3, Р ≪ 0,01) .В отличие от этого, клеточная линия BGC823, которая имеет относительно более высокую эндогенной экспрессии, был трансфицированы с FOXO4 миРНК или отрицательный контроль. Три пары миРНК олигонуклеотидов, направленных FOXO4 были синтезированы и трансфицировали в BGC823 клетки (BGC823-FOXO4si1, BGC823-FOXO4si2 и BGC823-FOXO4si3), и клетки, трансфицированные миРНК олиго отрицательный контроль были помечены BGC823-синк. QRT-PCR и Вестерн-блот показал, что миРНК олиго номер 1 является наиболее эффективным, поэтому, эта конструкция была выбрана для дальнейшего изучения (рис 2B1-B2). Соответственно, кривые роста показали, что с понижением регуляции экспрессии FOXO4 привело к увеличению пролиферации клеток среди GC (рис 2B3) .Мы также провели анализ образования колоний пластины. Эти результаты показали, что SGC7901-FOXO4 клетки получают меньше клеточных колоний по сравнению с контрольными клетками SGC7901-NC (рис 2C1-C2, P &ЛТ; 0,05). Далее, мы использовали анализ FACS для изучения влияния на FOXO4 клеточного цикла. SGC7901-FOXO4 клетки обнаруживают значительное арест G1 и уменьшение фазы S (рис 2D1-D2), в котором указано, что FOXO4 пролиферацию тормозится GC в результате ареста G1 клеточного цикла. Для усиления этого наблюдения, мы обнаружили экспрессию CyclinD1, который является маркером G1 фазы с вестерн-блоттинга, он показал, что CyclinD1had относительно более высокую экспрессию в клеточной линии 7801-NC, чем 7901-FOXO4 клеток (рис 2E1-E2). Рисунок 2 Влияние FOXO4 на регуляции пролиферации клеток GC. (A1-A2) Относительное выражение FOXO4 в SGC 7901-клеток, трансфицированных LV-FOXO4 или LV-контроля, которая была подтверждена ПЦР в реальном времени и Вестерн-блоттинга. Значения представляют собой средства из трех отдельных экспериментов, а планки погрешностей представляют SEM (** Р ≪ 0,01). (А3) Скорости пролиферации клеток измеряли с помощью анализа МТТ. Значения представляют собой средства из трех отдельных экспериментов, а планки погрешностей представляют SEM (* P ≪ 0,05). (B1-B2) Относительная экспрессия FOXO4 в клетках BGC-823, трансфецированных с ингибитором нуклеотида FOXO4 олиго или контролем нуклеотидной олиго, которая была подтверждена ПЦР в реальном времени и Вестерн-блоттинга. Значения представляют собой средства из трех отдельных экспериментов, а планки погрешностей представляют SEM (** Р ≪ 0,01). (В3) Скорости пролиферации клеток измеряли с помощью анализа МТТ. Значения представляют собой средства из трех отдельных экспериментов и Столбики ошибок обозначают помощью сканирующего электронного микроскопа (* Р ≪ 0,05). образование (С1-С2) Колонии SGC07901 клеток, трансфицированных LV-FOXO4 и LV-контроль осуществляли посевом клеток на планшетах в течение 2-х недель, и число колоний были затем подсчитаны. Значения представляют собой средства из трех отдельных экспериментов, а планки погрешностей представляют SEM (* P ≪ 0,05). (D1-D2) распределение клеточного цикла SGC 7901-клеток, трансфицированных LV-FOXO4 или LV-контролем. Анализ клеточного цикла проводили через 24 ч после трансфекции. Распределение клеточного цикла рассчитывалась и выражали как среднее ± стандартное отклонение трех отдельных экспериментов. * P &л; 0.05. (E1-E2) Относительное выражение CyclinD1 в SGC 7901-клеток, трансфицированных LV-FOXO4 или LV-контроля, которая была подтверждена Вестерн-блоттинга. Значения представляют собой средства из трех отдельных экспериментов, а планки погрешностей представляют SEM (* P &л; 0,05).
FOXO4 ингибирует миграцию и вторжение в GC клетки в пробирке
Для оценки влияния FOXO4 на GC миграции и вторжения, мы затем оценивали эффект экспрессии FOXO4 на инвазивные и миграционных способностей GC клеток с использованием в анализах пробирке Transwell. Результаты показали, что миграция и вторжение SGC-7901-FOXO4 клеток и значительно снижены по сравнению с SGC-7901-NC контрольные клетки (рис 3A1). В противоположность этому, истощение FOXO4 значительно способствовало клеточную миграцию и вторжение BGC823 клеток по сравнению с контрольными клетками (рис 3A2). Кроме того, анализ высокого содержания скрининга показали скорость моторики клеток SGC-7901-FOXO4 значительно ниже, чем клетки SGC-7901-NC, 15/19 временных точек ясно показал скорость моторики SGC-7901-FOXO4 клеток ниже, чем клетки SGC-7901-NC (рис. 3б) Кроме того, ранозаживляющие анализы показали, что SGC-7901-FOXO4 клетки закрыты раны медленнее, чем SGC-7901-NC клетки (рис 3C) (P < 0,05). В совокупности эти результаты показывают, что FOXO4 значительно ухудшается миграцию клеток ГХ и инвазии в пробирке. Рисунок 3 Влияние FOXO4 в регуляции GC клеток метастазирование. (A1-A2) повышающей регуляции экспрессии FOXO4 в LV-FOXO4 клетках снизился SGC-7901 миграции клеток и вторжения в пробирке, в то время как ингибирование экспрессии FOXO4 с использованием ингибитора олиго нуклеотидов в FOXO4 усиливается миграции клеток BGC-823 и вторжения. Емкость (B) Миграция клеток оценивали путем выполнения высоким содержанием анализа в SGC 7901-клеток, трансфицированных LV-FOXO4 или LV-контролем. * P &л; 0,05 (C) Миграция клеток емкость была также проверена путем проведения ранозаживляющим анализа в SGC 7901-клеток, трансфицированных LV-FOXO4 или LV-контролем. * P &л; 0,05.
FOXO4 повышающая регуляция ингибирует образование опухолей и метастаз GC клеток in vivo на
Для дальнейшего подтверждения эффектов FOXO4 на онкогенеза ГХ, пробирного образование опухолей проводили в голых мышах. SGC7901-NC и SGC7901-FOXO4 клетки подкожно инокулировали в правом верхнем задней области голых мышей в одном месте. Спустя четыре недели у мышей, которые были подкожно инокулировали забивали, пересаженные опухоли вырезали, а размеры опухоли были оценены (рисунок 4A1-A3, P &лт; 0,05). Результаты показали значительное уменьшение размеров ксенографтов в результате FOXO4 до регулируемого cells.To дальнейшего изучения роли FOXO4 в метастазирования опухоли в естественных условиях, мы имплантировали SGC7901-NC и SGC7901-FOXO4 клетки в голых мышей через боковую хвостовую вену , Представитель биолюминесценции томография (BLI) различных групп показан на рисунке 4B1. Гистологический анализ также подтвердил, что заболеваемость легких и метастазов в печени в группе SGC7901-FOXO4 значительно уменьшалось, по сравнению с группой SGC7901-NC (рис 4B2, В3). Число метастатических легких узелков в группе SGC7901-FOXO4 также была снижена, по сравнению с группой SGC7901-NC (данные не показаны). Печень и метастазов в легких дополнительно подтверждается гематоксилином и эозином (рис 4С). Кроме того, SGC7901-FOXO4 группа голых мышей продемонстрировали более общей выживаемости по сравнению с группой SGC7901-NC (рис 4D). Эти данные свидетельствуют о том, что FOXO4 подавлено GC клеток туморогенез и метастазирование в естественных условиях. Рисунок 4 В естественных условиях пролиферации и метастазирования анализа. (А1-А3) SGC-7901 клетки, трансфицированные LV-FOXO4 или LV-контроль трансплантировали под кожу. Шесть недель спустя, опухоли были более отчетливо видно у мышей с имплантированными клетками 7901-NC по сравнению с 7901-FOXO4 группы: (6/6 в 7901-NC групп и 3/6 в 7901-FOXO4 группах). Опухоли были разрезаны и измерены. (В1-В3) SGC-7901 клетки, трансфицированные LV-FOXO4 или LV-контроля вводили в хвостовую вену безволосых мышей. Десять недель спустя, мышей имплантировали 7901-NC клеток показали, легких и печени метастазы, в то время как несколько метастазы были обнаружены у мышей с имплантированными 7901-FOXO4 клеток: (для метастазов в легких, 6/10 в группах 7901-NC и 1/10 в в 7901-FoxO4 группы, для метастазов в печени, 3/10 в 7901-NC групп и 0/10 в 7901-FoxO4 групп. (C) изображения, показывающие репрезентативную гематоксилином и эозином окрашивания легких и тканей печени образцов из различных экспериментальных групп * P &л;.. 0,05 (D) Общая выживаемость обнаженном мышей в каждой группе
Молекулярные механизмы FOXO4 в метастаз GC
Чтобы изучить возможные механизмы для роли FOXO4 в ГК метастазирования, мы исследовали экспрессию метастазирования связанных молекул, в том числе E-кадгерина, виментину в SGC-7901-FOXO4 и контрольными клетками-NC SGC-7901 с использованием оТ-ПЦР (рис 5A1-A2). результаты показали, что FOXO4 избыточная экспрессия заметно подавлял экспрессию виментину, хотя никаких очевидных изменений не наблюдалось для Е-кадгерина. Результаты иммунофлюоресценции конфокальной также получены аналогичные выводы (рис 5B1-B2). Рисунок 5 FOXO4 ингибирует EMT в клетках GC. (A1-A2) ПЦР в реальном времени показал, повышающей регуляции экспрессии эпителиальных маркеров (E-кадгерин) и понижающей регуляции экспрессии мезенхимных маркеров (виментина) в 7901-FOXO4 клетках. (В1-В2) иммунофлуоресценции окрашивание показало, повышающей регуляции экспрессии эпителиальных маркеров (Е-кадгерин) и понижающей регуляции экспрессии маркеров мезенхимальных (виментина) в 7901-FOXO4 клетках.
Эти данные указывают на то, что FOXO4 могут частично влиять на GC клетки метастазирование путем регулирования процесса ЕМТ, а также дополнительные молекулярные механизмы будут изучены в дальнейшей работе.
Обсуждение
Класс Forkhead коробка O (FOXO) семейство факторов транскрипции эволюционно консервативны и характеризуется так называемой Forkhead поле ДНК- связывающий домен. У млекопитающих семейства генов FOXO состоит из четырех членов: foxo1, Foxo3a, FOXO4 и FOXO6. Результаты многочисленных исследований показали, что FOXO белки играют важную роль в широком диапазоне нормальных биологических процессов, в том числе клеточной пролиферации, клеточного цикла, реакции на стресс и апоптоз [10, 13, 14], а также при таких заболеваниях, как рак и сахарный диабет [15]. Тем не менее, есть небольшое исследование сообщило о роли FOXO4 играет в GC.
В настоящем исследовании, мы нашли выражение FOXO4 в неопухолевых тканях был последовательно сильнее, чем у образцов ГХ и ШС показали более низкую экспрессию уровень FOXO4 в метастатических поражений по сравнению с соответствующими образцами первичной опухоли. Уровни FOXO4 мРНК и экспрессии белка, как уменьшенный в различных типах линий GC клеток по сравнению с нормальной слизистой оболочки желудка линии эпителиальных клеток, предполагая, что FOXO4 могут служить в качестве отрицательного регулятора для GC. Кроме того, повышенная экспрессия экспрессии FOXO4 ингибирует рост опухолевых клеток, инвазию и метастазирование в пробирке и в естественных условиях, указывая, что FOXO4 может играть определенную роль в прогрессировании ГХ и метастазирования.
Механизмы, ответственные за воздействия FOXO4 изменений на развитие GC и прогрессирование остаются неясными. Несколько недавних исследований показали, что FOXO регулирует многие аспекты биологии рака. Например, FOXO обычно сдерживалось PI3K /Akt сигнального пути, который предотвращает FOXO транслокации в ядро, и FOXO регулируют транскрипционные реакции независимо от прямого связывания ДНК с помощью ассоциации с различными неродственных факторов транскрипции [16]. Наши исследования показали, что FOXO4 индуцируется значительное арест G1 и уменьшение фазы S в GC клетки, что указывало, что FOXO4 тормозится пролиферация GC может по меньшей мере, частично в результате остановки клеточного цикла G1.
Один важный шаг в метастатического каскада является процесс эпителиальные к мезенхимальных перехода (EMT) [17, 18]. Во время процесса ЕМТ, выражение Е-кадгерина часто вниз регулируется, в то время как из которых виментину часто обнаруживается Регулируют [19]. FOXO4 может регулировать EMT при раке желудка. Чтобы проверить эту гипотезу, мы оценили выражения Е-кадгерина и виментину в клеточных моделях выше. Хотя никаких очевидных изменений не наблюдалось для Е-кадгерина, резкое снижение экспрессии виментина отображалась в FOXO4 избыточной экспрессии клеток по сравнению с контрольными клетками, как показано с помощью анализа иммунофлуоресценции и QRT-PCR. Эти исследования убедительно показывают, что FOXO4 могли бы ингибировать желудочную метастазирования рака, регулируя EMT.
Заключение
В заключение, наше исследование показывает критическую функцию FOXO4 в подавлении пролиферации GC и метастазирование посредством регуляции остановки клеточного цикла G1 и EMT, предполагает, что это может служить в качестве потенциальной терапевтической мишени для рака желудка
Notes
Linna Су, Xiangqiang Лю, Na Chai способствовали в равной степени к этой работе
Сокращения
FOXO4:..
Forkhead окно O4


БСА:
бычий сывороточный альбумин


DAB:
диаминобензидин


QRT-PCR:
в режиме реального времени количественный ПЦР


МТТ:
3- [4,5-диметилтиазол-2-ил] -2, 5-дифенил-тетразолия бромид


PBS:
фосфатный солевой буфер


ДМСО:.
диметилсульфоксиде


декларациях
Выражение признательности
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант номер 81172062, 81270445). Мы благодарим профессора Zengshan Ли (отделение патологии на Xijing больницы) за его помощь в патологическом анализе. Мы также благодарим г-жу Zuhong Tian за помощь в экспериментах с изображениями животных. Авторы не раскрывают ни одного потенциального конфликта интересов
Электронный дополнительный материал
12885_2014_4601_MOESM1_ESM.doc Дополнительный файл 1:. Таблица S1: Информация о массиве тканей (человеческой аденокарциномы желудка с совпавших прилегающих тканей). Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• LIM фактор транскрипции гомеодоменовый Isl1 направляет нормальное развитие привратника путем ориентации Gata3
• Генетические полиморфизмы промотора остеопонтина увеличивает риск метастазирования расстояния и смерти у к…