Transkriptiotekijän FOXO4 säätyy alas ja estää kasvaimen leviämisen ja etäpesäkkeiden mahasyövän

Transkriptiotekijän FOXO4 on alassäädetty ja estää kasvaimen leviämisen ja etäpesäkkeiden mahasyövän
tiivistelmä
tausta
FOXO4, jäsen FOXO perheen transkriptiotekijöiden, on tällä hetkellä kiivasta tutkimusta. Sen tehtävä ja toiminta mahasyövän ei ole täysin selvitetty. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää ilmaisun profiilia FOXO4 mahasyövän ja vaikutus FOXO4 syövän solujen kasvua ja etäpesäkkeitä. Tool Menetelmät
immunohistokemia, Western blotting ja qRT-PCR suoritettiin havaita FOXO4 ilmaisun mahasyövän soluja ja kudoksia. Cell biologisia määrityksiä, ihonalainen tuumorigeenisyyteen ja häntälaskimoon metastaattisen määrityksessä yhdessä lentiviruksen rakentaminen tehtiin havaita vaikutusta FOXO4 mahalaukun syövän leviämisen ja etäpesäkkeiden in vitro ja in vivo. Konfokaaliset ja qRT-PCR suoritettiin tutkimaan mekanismeja.
Tulokset
Huomasimme, että ilmaus FOXO4 väheni merkittävästi suurimmassa mahasyövän kudoksissa ja erilaisissa ihmisen mahasyövän solulinjoissa. Up säätelevä FOXO4 esti kasvua ja etäpesäkkeiden mahasyövän solulinjojen in vitro ja johti dramaattiseen vaimennus kasvaimen kasvua, ja maksan ja keuhkojen etäpesäke in vivo, kun taas alaspäin säätäminen FOXO4 erityisiä siRNA edisti kasvua ja etäpesäkkeiden mahalaukun syöpäsolun linjat. Lisäksi olemme havainneet, että jopa säätelevä FOXO4 voisi aiheuttaa merkittäviä G1 pidätyksen ja S-vaiheessa vähentäminen ja alas-säätely ilmentymisen vimentiinista.
Päätelmä
Tuloksemme viittaavat siihen, että menetys FOXO4 ilmaisun edistää mahalaukun syövän kasvua ja etäpesäkkeiden ja se voi toimia mahdollisena terapeuttisena kohteena mahasyövän.
avainsanat
FOXO4 mahasyöpää leviämisen metastaasin EMT tausta
Vaikka esiintyvyys mahasyövän (GC) on vähenemässä, se pysyy neljänneksi yleisin syöpä ja toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti [1]. Avain, jotka osallistuvat solujen lisääntymistä ja etäpesäkkeiden GC etenemistä voi auttaa kliinisessä diagnosoimiseksi tai ennustamiseksi etenemistä tämän taudin.
Kasvaimen kasvu ja etäpesäkkeiden riippuu eri tekijöistä, kuten transkriptiotekijät [2-5]. FOXO transkriptiotekijöiden perheen neljä erittäin liittyvän jäsentä: FOXO1, FOXO3, FOXO4, ja FOXO6 [6-8]. Viime vuosina FOXO on osoitettu olevan keskeisessä asemassa ovat lukuisia solun prosesseja, kuten solujen lisääntymisen, apoptoosin, erilaistuminen, kestää rasitusta, ja metabolinen vastaukset [9], ja ne voivat siksi olla lupaavia kohteita uusien lääkkeiden alalla onkologian [10, 11].
aikaisemmat tulokset osoittivat, että FOXO4 mRNA ilmaisun taso oli huomattavasti alassäädetty imusolmuke-positiivisen kolorektaalisyöpää kudoksiin verrattuna imusolmuke-negatiivinen kudoksissa, ehdotti sitä voi toimia negatiivisena säätelijänä etäpesäke kolorektaalisyöpää [12]. Kuitenkin ilmentymistä ja toimintaa FOXO4 mahasyövän ei ole vielä tiedossa. Tavoitteena työmme on ollut tutkia mahdollista roolia FOXO4 mahasyövän karsinogeneesissä. Täällä me raportoimme että FOXO4 repressoivat solujen lisääntymistä ja etäpesäkkeiden mahasyövän asetuksessa G1 solusyklin pysähtymisen ja vimentiinista. Tool Menetelmät
Tissue yksilöitä
varten kudosnäytteet, kaikille potilaille tarjotaan tietoisen suostumuksen käyttää ylimääräinen patologinen yksilöt tutkimustarkoituksiin. Protokollat ​​Tässä tutkimuksessa käytetyt hyväksyi sairaalan koehenkilöiden suojelemiseen komitean. Käyttö ihmiskudosten hyväksyi Institutional Review Board neljännen Military Medical University ja sopeutui Helsingin julistusta, sekä paikallista lainsäädäntöä. Potilaat, jotka tarjoavat näytteitä tutkimusta varten allekirjoitettu tietoon perustuva suostumus muotoja.
Immunohistokemia
immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin käyttäen avidiini-biotiini-kompleksin immunoperoksidaasimenetelmällä. Primaarista vasta-ainetta vastaan ​​FOXO4 (1: 100, ab63254, Abcam) laimennettuna PBS: ään, joka sisälsi 1% (paino /tilavuus) naudan seerumin albumiinia (BSA). Negatiiviset kontrollit tehtiin korvaamalla primaarinen vasta-aine, jossa esi-immuuni hiiren seerumin. Kuvat saatiin valomikroskoopilla (Olympus BX51, Olympus, Japani) varustettu DP70 digitaalikamera. Tarkkailija sokaisi identiteettiä näytteiden kun pisteytys immunoreaktiivisuus.
Arviointi värjäystä
arviointia varten solujen värjäytymisen, leikkeet tutkittiin kaksi riippumatonta patologia ilman aiempaa tietoa klinikan-patologinen tila yksilöiden . Solut, jotka värjättiin ruskea katsottiin olevan positiivinen. Ilmentyminen FOXO4 on arvioitu suhde positiivisia soluja per näyte (R) ja värjäyksen voimakkuuden (I). Suhde positiivisia soluja per yksilö pisteytettiin seuraavasti: 0 värjäykseen < 1%, 1 värjäykseen 2%: sta 25%, 2 värjäykseen 26%: sta 50%, 3 värjäykseen 51%: sta 75%, ja 4 värjäykseen > 75% soluista tutkittiin. Intensiteetti luokiteltiin seuraavasti: 0, ei signaalia; 1, heikko värjäytyminen; 2, kohtalainen värjäytyminen; ja 3, vahva värjäytyminen. Kokonaispistemäärä (R x I) 0-12 lopulta laskettiin ja luokiteltiin negatiiviseksi (-score: 0-2) tai positiivisia (+, 3-12).
Tissue kokoelma
kudosmatriisien ostettiin Aomei yhtiö (Aomei C0124H, AM01C09, Aomei Biotekniikka Co Ltd, Xi'an, Kiina) (Additional tiedosto 1: Taulukko S1 ja Additional tiedosto 2: Taulukko S2). Western blot analyysi, GC kudosten ja viereisten nontumorous kudokset saatiin kahdeksan potilasta, joille oli tehty leikkaus laitoksella General Surgery meidän sairaalassa. Kaikki tapaukset GC ja normaali mahan limakalvoa olivat kliinisesti ja patologisesti todistettu. Käytetyt protokollat ​​tutkimuksissa oli hyväksynyt sairaalan koehenkilöiden suojelemiseen komitean. Potilaat, jotka osallistuivat tuore kirurginen kudosta tutkimukseen olivat allekirjoittaneet tietoisen suostumuksen muotoja.
RNA ja reaaliaikaisen PCR
Yhteensä RNA soluista uutettiin käyttäen Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), ja cDNA syntetisoitiin käyttämällä Prime Script RT reagenssipakkauksen (TaKaRa Biotechnology, Dalian, Kiina) mukaan valmistajan suositusten. Light Cycler Fast Start DNA Master SYBR Green I System (Roche, Basel, Sveitsi) käytettiin reaaliaikainen PCR. GAPDH mRNA käytettiin sisäisen valvonnan, ja reaktioseos ilman templaatti-DNA: ta käytettiin negatiivisena kontrollina. Kaikki näytteet mitattiin itsenäisesti kolme kertaa. Alukesekvenssit olivat seuraavat: GAPDH: (eteenpäin) 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 'ja (reverse) 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'; FOXO4: (eteenpäin) 5'-CTTTCTGAAGACTGGCAGGAATGTG-3 'ja (reverse) 5'-GATCTAGGTCTATGATCGCGGCAG-3'; E-kadheriinin: (eteenpäin) 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3'and (reverse) 5'AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 '; ja vimentiinista: (eteenpäin) 5'-CAGGCAAAGCAGGAGTCCAC -3'and (reverse) 5'-GCAGCTTCAACGGCAAAGTTC -3 ". Kaikki reaaliaikaiset PCR-reaktiot suoritettiin kolminkertaisina.
Oligonukleotidi rakentamiseen ja lentivirus tuotannon
Kolme paria siRNA oligonukleotidien kohdistaminen FOXO4 syntetisoitiin GenePharma Co., Ltd GAPDH sekvenssejä käytettiin positiivisena kontrollina. Liity sekvenssiä käytettiin negatiivisena kontrollina (jotka GenePharma). Sekvenssit olivat seuraavat: FOXO4 siRNA oligo-1: 5'-CGCGAUCAUAGACCUAGAUTTAUCUAGGUCUAUGAUCGCGTT-3 '(sense); FOXO4 siRNA oligo-2: 5'-CAGCUUCAGUCAGCAGUUATTUAACUGCUGACUGAAGCUGTT-3 '(sense); FOXO4 siRNA oligo-3: 5'-GUGACAUGGAUAACAUCAUTTAUGAUGUUAUCCAUGUCACTT-3 '(sense); GAPDH siRNA oligo (positiivinen kontrolli): 5'-GUAUGACAACAGCCUCAAGTT-3 '(sense); ja negatiivinen kontrolli: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 '(sense).
mukaan valmistajan ohjeiden, FOXO4 siRNA oligoja transfektoitiin soluihin käyttämällä siRNA-Mate ™ reagenssia (GenePharma Ltd., Shanghai, Kiina). Sen jälkeen viljeltiin 2-3 päivää, kokonais-RNA ja proteiini uutettiin. Tukeviin transfektiosta lentiviraalinen yliekspressio vektorin (Lenti-FOXO4) rakennettiin (Shanghai GeneChem Co., Ltd., Shanghai, Kiina). Käyttämällä GV166-puro-vektori (GeneChem Co., Ltd., Shanghai, Kiina), lentivirusvektoria joka ilmaistaan ​​GFP yksin (LV-kontrolli) käytettiin negatiivisena kontrollina (NC).
Western blot
Equal määriä proteiineja erotettiin käyttämällä natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidi- geelillä (SDS-PAGE) elektroforeesilla ja siirrettiin nitroselluloosamembraanille (Bio-Rad, Hercules, CA). FOXO4 kanin polyklonaalinen vasta-aine (Abcam, 1: 500), CyclinD1 kanin polyklonaalinen vasta-aine (ImmunoWay, 1: 1000), β-aktiini hiiren monoklonaalinen vasta-aine (Sigma, 1: 2000), E-kadheriinin ja vimentiinin kanin polyklonaalista vasta-ainetta (Santa Cruz, CA, 1: 1000) vasta-aineet käytettiin western blot kokeissa.
Soluproliferaatiomääritys
3- [4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli] -2,5-difenyyli-tetratsolium (MTT) määritys suoritettiin arvioimaan nopeuden solujen lisääntymisen, ja suoritettiin standardimenetelmien mukaisesti. Kukin solulinja havaittiin kolmena kappaleena.
Muuttoliike ja invaasiomääritys
TranswellTM muuttoliike määritykset suoritettiin muutettu Boyden kammioissa (TranswellTM; Corning Inc. Lowell, MA, USA) tiheydellä 5 x 10 3 solua kuoppaa kohti. 24 tunnin inkuboinnin 37 ° C: ssa, solut alemmalla pinnalla kuopat kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä, värjättiin 1% kristallivioletilla ja laskettiin.
Korkean sisällön seulonta-analyysissä
Cell motiliteetti oli tutkituista käyttämällä Cellomics Array Scan VTI 1700 plus (Thermo Scientific, USA). Lyhyesti, solut log-vaiheen kerättiin ja maljattiin 96-kuoppalevyille (5 x 10 3 solua /kuoppa). Yön yli viljelmää 37 ° C: ssa adheesion, elatusaine korvattiin seerumittomalla RPMI1640, ja viljelyä jatkettiin vielä 24 tuntia. Sitten solut pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä ja värjättiin Hoechst 33342: ssa 15 minuutin ajan inkubaattorissa. Tämän jälkeen solut pestiin jälleen kahdesti jääkylmällä PBS: llä ja altistettiin erilaisia ​​hoitoja. Soluliikkuvuus havaittiin käyttämällä Cellomics Array Scan VTI 1700 plus (Thermo Scientific) mukaan valmistajan protokollan (kukin ryhmä mukana viisi toistuvasti kaivot).
Konfokaalimikroskopia
For konfokaalimikroskopia kokeita soluja kasvatettiin Lab-Tek 24-kaivokammio dioja (Thermo Fisher Scientific, USA). Yön yli Viljelyn jälkeen solut kiinnitettiin, pestiin ja läpäiseviksi 0,3% Triton X-100 PBS: ssa 10 min. Sitten soluja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla vastaan ​​E-kadheriinin ja vimentiinin (laimennus 1: 300, Abcam) yön yli 4 ° C: ssa. Soluja inkuboitiin myös Cy3-konjugoitu anti-kani-IgG (laimennus 1: 200 (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, USA) 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa pimeässä. Solujen tuma vastavärjättiin käyttäen DAPI 5 min . Fluoresenssi seurattiin ja valokuvattiin -konfokaalimikroskoopilla (Thermo Fisher Scientific, USA).
Eläinkokeet
eläintutkimukseen nude-hiiret 4-6 viikkoa ikäisiä ostettiin animal Center of Kiinan Academy of Science (Shanghai, Kiina) ja ylläpidetään laminaarisen virtauksen kaappien erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa. Kaikki menettelyt eläinkokeiden tehtiin mukaisesti Institutional animal Care ja käyttö komitean suuntaviivat Experiment animal Centerin neljännen Military Medical University.
tuumorigeenisyyden nude-hiirissä
logaritmisesti kasvavat solut kerättiin käyttäen trypsiiniä ja pestiin kahdesti PBS: llä. Sitten 2 x 10 6 solua 0,2 ml ihonalaisesti oikeaan yläselän alueelle hiirillä. Neljä viikkoa siirrostuksen jälkeen, tuumoreita kantavaa hiirtä tapettiin, ja kasvaimen koko määritettiin mittaamalla mittaharpilla ihonalaisen kasvaimen massaan. Jokainen koeryhmä sisälsi 6 hiirtä. Kaksi itsenäistä koetta suoritettiin, ja ne tuottivat samankaltaisia ​​tuloksia.
Häntälaskimoon metastaattinen määrityksessä
Noin 2 x 10 6 solut suspendoitiin 0,2 ml: aan steriiliä PBS: ää ja injektoitiin hännän laskimoihin 10 hiirtä. Sitten hiiriä seurattiin kasvaimen tilavuus ja yleistä terveyttä, ja niiden keuhkot ja maksat säännöllisesti havaittiin käyttämällä kuvantamisen mikroskopian.
Tilastollinen analyysi
Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS 17.0 tilasto-ohjelmalla (SPSS, Inc., Chicago, Illinois). Muuttujat, joiden P-arvo alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. χ
2 testejä käytettiin arvioitaessa merkitystä erojen FOXO4 ilmaisun taajuuden välillä GC kudosten ja viereisten nontumorous mahalaukun kudoksiin. T
-testi (yksisuuntainen ANOVA) suoritettiin arvioimaan merkitystä eroa solujen lisääntymistä, levy klooneja, ja muuttoliike määritykset. Kokonaiselossaoloaika käyrät piirrettiin käyttäen Kaplan-Meier menetelmää ja arvioitiin tilastollista merkittävyyttä käyttäen log-rank-testi (Mann-Whitney U
testi ja Kruskal-Wallisin H testi tehtiin muita tietoja).
Tulokset
ilmentyminen FOXO4 säätyy alas GC kudoksissa ja solulinjoissa
tutkia, FOXO4 ilmentymistä muuttunut GC, ilmaisun ja solunosasijaintia FOXO4 tutkittiin kudoksen microarray 75 pariksi GC näytteiden avulla immunohistokemiallinen määritys. FOXO4 pääasiassa ilmaistu ytimet epiteelisolujen sijaitsee mahalaukun rauhasten nontumorous kudosten (kuvio 1A1), mutta pieni määrä paikallistettiin sytoplasmaan. FOXO4 värjäytyminen epiteelisoluissa GC näytteistä oli heikko. Kuitenkin FOXO4 värjäytymistä nontumorous kudoksissa (NT) oli jatkuvasti vahvempi kuin GC näytteiden, ja oli merkittävä ero värjäyksen tulokset GC: n ja NT näytteet (kuvio 1A2) (P < 0,05) Meillä seuraavalle mittasi FOXO4 tason itsenäisessä kudoksessa microarray paneeli sisältää 40 ensisijaista GC ja vastaavien imusolmuke etäpesäke yksilöitä. Kaiken GC osoitti alhaisempi ekspressiotaso FOXO4 metastaattisessa leesioita verrattuna vastaavaan primaarikasvaimen näytteitä (kuviot 1A3-A4) kantavassa ekspressiotasot FOXO4 tutkittiin myös Western blot ja RT-PCR: llä GC ja viereisten normaaleissa kudoksissa on saatu kahdeksan potilasta (kuvio 1 B). Seitsemän kahdeksasta tapauksista, FOXO4 havaittiin pienentää ilmentymisen syöpäkudoksiin, sopusoinnussa tulokset immunohistokemian analysis.We edelleen verrattuna suhteellisen FOXO4 mRNA ja proteiinin ilmentyminen tasot 6 eri GC solulinjoja (BGC-823, SGC7901 , MKN28, AGS, 9811, ja MKN45) ja kuolematon mahalaukun epiteelisolujen linja GES-1. Jälleen FOXO4 ilmentyi suhteellisesti pienemmällä tasolla kaikissa 6 GC solulinjoihin verrattuna normaaliin kuolematon mahalaukun limakalvon epiteelin GES-1-solulinjassa (kuvio 1 C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että FOXO4 voi olla tukahduttava rooli mahasyövän. Kuvio 1 FoxO4 on merkittävästi säädellä vähentävästi GC kudoksissa ja solulinjoissa. (A1) IHC analyysi FOXO4 ilmentymisen 75 pariksi GC ja viereisen ei-syöpäkudoksissa. (A2) tilastollinen analyysi FOXO4 ilmentymisen GC kudoksissa ja viereisen ei-tumorous mahan kudoksissa. (A3) edustaja FOXO4expression perus- ja metastaattinen GC kudoksissa havaita IHC menetelmillä. (A4) tilastollinen analyysi FOXO4 ilmaisun välillä GC kudosten kanssa ja ilman etäpesäke. (B1-B2) Reaaliaikainen PCR ja western blot-analyysi FOXO4 ilmaisun 8 paria GC ja viereisen ei-syöpäkudoksissa. (C1-C2) Reaaliaikainen PCR ja western blotting-analyysi FOXO4 sen erilaisissa GC solulinjoissa.
FOXO4 estää GC lisääntymistä in vitro ja aiheuttaa solukierron pysähtymisen G0 /G1 vaihe
tutkimiseksi roolin FOXO4 GC kasvun, loimme kaksi stabiilia solulinjoja (merkitty SGC7901-FoxO4 ja SGC7901-NC) infektoinnin jälkeen LV- FoxO4 tai LV-NC lentivirus, vastaavasti. Toistuvan puromysiiniselektion, RT-PCR: llä ja western blot-analyysi vahvisti, että SGC7901-FoxO4 osoittivat korkeampia FOXO4 ilmentymistä verrattuna SGC7901-NC (kuvio 2A1-A2). MTT-määritystä osoitti, että säätely ylöspäin FOXO4 ilmentymisen merkittävästi inhiboivat GC-solujen (kuvio 2A3, P < 0,01) .Vuonna vastoin BGC823 solulinja, jolla on suhteellisesti suurempi endogeeninen ilmentyminen oli transfektoitu tilapäisesti FOXO4 siRNA tai negatiivinen kontrolli. Kolme paria siRNA oligonukleotidien kohdistaminen FOXO4 syntetisoitiin ja transfektoitiin BGC823 soluihin (BGC823-FOXO4si1, BGC823-FOXO4si2, ja BGC823-FOXO4si3), ja solut transfektoitiin siRNA: oligo negatiivisen kontrollin leimattiin BGC823-sinc. qRT-PCR: ää ja western blot osoitti, että siRNA oligo numero 1 oli tehokkain, joten tämä rakenne valittiin lisätutkimuksia varten (kuvio 2B1-B2). Näin ollen, kasvukäyrät osoitti, että alas-ekspressiota sääteleviä FOXO4 lisännyt proliferaatiota keskuudessa GC-soluja (kuvio 2B3) Meillä myös suorittaa levyn pesäkemuodostusta. Nämä tulokset paljastivat, että SGC7901-FOXO4 solut tuottivat vähemmän solun pesäkkeitä verrattuna SGC7901-NC-ohjaus soluissa (kuvio 2C1-C2, P < 0,05). Seuraavaksi käytimme FACS-analyysi tutkia vaikutuksia FOXO4 on solusyklin. SGC7901-FOXO4 soluilla merkittävää G1 pidätyksen ja S-vaiheessa vähentäminen (Kuva 2D1-D2), joka osoitti, että FOXO4 esti GC leviämisen seurauksena G1 solusyklin pidätyksen. Vahvistaa Tämän havainnon, havaitsimme ilmaus CyclinD1 joka on merkkiaine G1 vaiheeseen western blot, se osoitti, että CyclinD1had suhteellisesti korkeampaa ilmaisua 7801-NC solulinja kuin 7901-FOXO4 soluissa (kuvio 2E1-E2). Kuvio 2 vaikutus FOXO4 sääntelystä GC solujen lisääntymistä. (A1-A2) Suhteellinen ilmentyminen FOXO4 in SGC-7901 transfektoitujen solujen LV-FOXO4 tai LV-ohjaus, joka vahvistettiin reaaliaikainen PCR ja western blot-analyysi. Arvot ovat keinot kolmesta erillisestä kokeesta, ja virhepylväät edustavat SEM (** P < 0,01). (A3) lisääntyminen määriä soluja mitattiin käyttäen MTT-määritystä. Arvot ovat keinot kolmesta erillisestä kokeesta, ja virhepylväät edustavat SEM (* P < 0,05). (B1-B2) Suhteellinen ilmentyminen FOXO4 in BGC-823-solut transfektoitu FOXO4 oligo nukleotidin estäjän tai oligo nukleotidin ohjaus, joka vahvistettiin reaaliaikainen PCR ja western blot-analyysi. Arvot ovat keinot kolmesta erillisestä kokeesta, ja virhepylväät edustavat SEM (** P < 0,01). (B3) lisääntyminen määriä soluja mitattiin käyttäen MTT-määritystä. Arvot ovat keinot kolmesta erillisestä kokeesta ja virhepalkit edustavat SEM (* P < 0,05). (C1-C2) Colony muodostumista SGC07901 transfektoitujen solujen LV-FOXO4 ja LV-ohjaus suoritettiin ymppäämällä solut levyille 2 viikkoa, ja pesäkkeiden lukumäärä laskettiin sitten. Arvot ovat keinot kolmesta erillisestä kokeesta, ja virhepylväät edustavat SEM (* P < 0,05). (D1-D2) Cell cycle jakelu SGC-7901 transfektoitujen solujen LV-FOXO4 tai LV-ohjaus. Solusyklin analyysi suoritettiin 24 tuntia transfektion jälkeen. Solusyklin jakautumisen laskettiin ja ilmaistiin keskiarvona ± SD kolmesta erillisestä kokeesta. * P < 0,05. (E1-E2) Suhteellinen ilmentyminen CyclinD1 in SGC-7901-soluja transfektoitiin LV-FOXO4 tai LV-ohjaus, joka vahvistettiin western blot-analyysi. Arvot edustavat keinot kolmesta eri kokeesta, ja virhepalkkien edustavat SEM (* P < 0,05).
FOXO4 estää migraation ja invaasion GC-solujen in vitro
arvioimiseksi vaikutuksen FOXO4 GC muuttoliike ja invaasio, me seuraavaksi arvioitiin vaikutusta FOXO4 lausekkeen invasiivisia ja muuttavien kyvyt GC soluihin käyttäen in vitro Transvvell- määrityksissä. Tulokset osoittivat, että muuttoliike ja hyökkäys SGC-7901-FOXO4 solut sekä erityisesti alennettu verrattuna SGC-7901-NC-ohjaus soluissa (kuvio 3A1). Sen sijaan ehtyminen FOXO4 merkittävästi edistänyt solujen vaeltamiseen ja hyökkäyksen BGC823 soluissa verrattuna ohjata soluihin (kuvio 3A2). Lisäksi korkea-pitoisuus seulomismäärityksessä osoitti motiliteettia nopeus SGC-7901-FOXO4 solujen merkittävästi pienempi kuin SGC-7901-NC solua, 15/19 ajankohtina osoitti selvästi liikkuvuutta nopeus SGC-7901-FOXO4 soluissa on pienempi kuin SGC-7901-NC-soluja (kuvio 3B). Lisäksi haavan paranemista määritykset osoittivat, että SGC-7901-FOXO4 solut suljettu haavat hitaammin kuin SGC-7901-NC-solut (kuvio 3C) (P < 0,05). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että FOXO4 merkittävästi alentunut GC solujen vaeltamiseen ja invaasiota in vitro. Kuvio 3 vaikutus FOXO4 säätelyssä GC solussa etäpesäke. (A1-A2) Up-regulation of FOXO4 ilmentymisen LV-FOXO4 solut vähenivät SGC-7901 solumigraatio ja invaasiota in vitro, kun taas esto FOXO4 ilmaisun käyttäen oligo nukleotidin estäjä FOXO4 tehostetun BGC-823 solumigraation ja invaasiota. (B) Cell muuttoliike kapasiteettia arvioitiin suorittamalla korkean pitoisuus määrityksessä in SGC-7901 transfektoitujen solujen LV-FOXO4 tai LV-ohjaus. * P < 0,05 (C) solumigraation kapasiteettia testattiin myös suorittamalla haavan paranemista määritystä SGC-7901-soluja transfektoitiin LV-FOXO4 tai LV-ohjaus. * P < 0,05.
FOXO4 ylössäätöä estää kasvaimen kehittymisen ja etäpesäkkeiden GC-solujen in vivo
edelleen vahvistavat vaikutukset FOXO4 on tuumorigeneesiin GC, kasvaimen muodostumisen määritys suoritettiin nude-hiirissä. SGC7901-NC ja SGC7901-FOXO4 soluja inokuloitiin subkutaanisesti oikeaan yläselän alueelle nude-hiirten yhdellä sivustolla. Neljä viikkoa myöhemmin hiiret, jotka inokuloitiin subkutaanisesti tapettiin, istutetut kasvaimet leikattiin, ja kasvaimen kokoa arvioitiin (kuvio 4A1-A3, P < 0,05). Tulokset paljastivat merkittävä lasku kokojen ksenograftien johtuvat FOXO4 sääteli cells.To tutkia edelleen roolia FOXO4 tuumorimetastaasissa in vivo, meidän istutettu SGC7901-NC ja SGC7901-FOXO4 soluja nude-hiirissä siten sivusuunnassa häntälaskimoon . Edustavia bioluminesoiviin kuvantaminen (BLI) eri ryhmien on esitetty kuvassa 4B1. Histologinen analyysi vahvistivat lisäksi, että esiintyvyys keuhkojen ja maksan etäpesäke SGC7901-FOXO4 ryhmä pieneni merkitsevästi verrattuna SGC7901-NC ryhmä (kuvio 4B2, B3). Määrä keuhkojen etäpesäkenystyröiden on SGC7901-FOXO4 ryhmä vähensi myös, verrattuna SGC7901-NC-ryhmä (tuloksia ei ole esitetty). Maksa ja keuhkometastaasitestissä olivat edelleen osoituksena hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäytymistä (kuvio 4C). Lisäksi SGC7901-FOXO4 ryhmä karvattomia hiiriä osoitti pidentymistä elinaika verrattuna SGC7901-NC ryhmä (kuvio 4D). Nämä tulokset osoittivat, että FOXO4 tukahdutti GC solujen kasvainten synnyssä ja etäpesäkkeitä in vivo. Kuva 4 In vivo leviämisen ja etäpesäkkeiden määritys. (A1-A3) SGC-7901-soluja transfektoitiin LV-FOXO4 tai LV-ohjaus istutettiin ihon alle. Kuusi viikkoa myöhemmin kasvaimet nähdään selvemmin hiirissä istutettu 7901-NC-soluja verrattuna 7901-FOXO4 ryhmään: (6/6 vuonna 7901-NC ryhmiä ja 3/6 in 7901-FOXO4 ryhmät). Kasvaimet leikeltiin ja mitattiin. (B1-B3) SGC-7901-soluja transfektoitiin LV-FOXO4 tai LV-ohjaus injektoitiin häntälaskimoihin nude-hiirten. Kymmenen viikkoa myöhemmin hiiret istutettu 7901-NC-solut osoittivat keuhko- ja maksametastaaseista, kun taas harvat etäpesäkkeitä havaittiin hiirillä istutettu 7901-FOXO4 solujen: (keuhkojen etäpesäke, 6/10 vuonna 7901-NC ryhmiä ja 1/10 7901-FoxO4 ryhmiä, sillä maksan etäpesäkkeen, 3/10 in 7901-NC ryhmiä ja 0/10 in 7901-FoxO4 ryhmiä. (C) Kuvaa näytetään edustava hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäytyminen keuhkojen ja maksan kudosnäytteitä eri koeryhmään * P < 0,05. (D) Kokonaiselossaoloaika nude hiirtä kussakin ryhmässä.
Molecular mekanismeja FOXO4 että etäpesäkkeiden GC
tutkitaan mahdollisia mekanismeja roolin FOXO4 GC etäpesäkkeitä, selvitimme lauseke metastaasin liittyviä molekyylejä, kuten E-kadheriinin, vimentiinistä in SGC-7901-FOXO4 ja SGC-7901-NC ohjaus soluihin käyttäen RT-PCR (Kuva 5A1-A2). tulokset osoittivat, että FOXO4 yliekspressio selvästi tukahdutettu ilmaisun vimentiinista, vaikka mitään selvää muutos havaittiin E-kadheriinin. Immunofluoresenssitutkimukset konfokaali Tulokset myös tuottivat samanlaisia ​​johtopäätöksiä (kuva 5B1-B2). Kuva 5 FOXO4 estää EMT GC soluissa. (A1-A2) Reaaliaikainen PCR ilmaantui säädelty ilmentyminen epiteelin merkkiaineiden (E-kadheriinin) ja alassäädetty ilmentymä mesenkymaalisten merkkiaineiden (vimentiinista) in 7901-FOXO4 soluissa. (B1-B2) immunofluoresenssi ilmaantui säädelty ilmentyminen epiteelin merkkiaineiden (E-kadheriinin) ja alassäädetty ilmentymä mesenkymaalisten merkkiaineiden (vimentiinista) in 7901-FOXO4 soluissa.
Nämä tiedot osoittavat, että FOXO4 voi osittain vaikuttaa GC solu etäpesäke säätelemällä EMT prosessi, ja lisää molekyylitason mekanismeja tutkitaan tulevaisuudessa työtä.
keskustelu
forkhead laatikko luokka O (FOXO) perheen transkriptiotekijöiden on evoluutiossa säilyneitä ja ominaista ns forkhead box DNA- sitova alue. Nisäkkäillä FOXO geeni perheeseen kuuluu neljä jäsentä: FOXO1, FOXO3A, FOXO4, ja FOXO6. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että FOXO proteiineilla on tärkeä rooli monenlaisia ​​normaalien biologisten prosessien, mukaan lukien solujen proliferaatio, solusyklin pysähtymisen, stressivasteen, ja apoptoosin [10, 13, 14], samoin kuin sairauksien, kuten syövän ja diabetes mellitus [15]. On kuitenkin vain vähän tutkimus kertoo roolista FOXO4 pelaa GC.
Tässä tutkimuksessa, löysimme FOXO4 ilmaisua kuin syöpäkudoksissa oli johdonmukaisesti voimakkaampi kuin GC näytteiden ja GC osoitti alempaa ilme taso FOXO4 vuonna etäpesäkeleesioita verrattuna vastaavaan primaarikasvaimen näytteitä. FOXO4 mRNA ja proteiinin ilmentyminen tasot sekä pienentää eri GC solulinjojen verrattuna normaaliin mahalaukun limakalvon epiteelisolujen linja, viittaa siihen, että FOXO4 voisi toimia negatiivisena säätelijänä GC. Lisäksi kohonnut ilmentyminen FOXO4 ilmaisun esti kasvainsolujen kasvua, invaasiota ja etäpesäkkeiden in vitro ja in vivo, mikä osoittaa, että FOXO4 voi olla rooli GC etenemisen ja etäpesäkkeiden.
Mekanismit vastaava vaikutus FOXO4 muutosten GC kehitykseen ja eteneminen jäävät epäselviksi. Useat viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että FOXO säätelee monia näkökohtia syövän biologian. Esimerkiksi, FOXO yleensä pidättelee PI3K /Akt-signalointireitin, joka estää FOXO translokaation tumaan, ja FOXO säätelevät transkription vasteita riippumatta suoraan DNA: ta sitovan kautta yhdessä erilaisia ​​liity transkriptiotekijöiden [16]. Meidän Tulosten mukaan FOXO4 indusoi merkittäviä G1 pidätyksen ja S-vaiheessa väheneminen GC soluissa, mikä osoitti, että FOXO4 esti GC lisääntymistä voi ainakin osittain seurausta G1 solusyklin pidätyksen.
Yksi kriittinen vaihe metastaattisen Cascade on prosessi epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) [17, 18]. Aikana EMT prosessi, ilmaus E-kadheriinin usein alassäädetty, kun taas mitkä vimentiinista näkyy usein säädelty [19]. FOXO4 voi säädellä EMT mahasyövän. Tämän hypoteesin testaamiseksi, arvioimme ilmaisuja E-kadheriinin ja vimentiinista solussa mallien yllä. Vaikka ei ole ilmeistä muutos- havaittiin E-kadheriinin, dramaattinen lasku vimentiinista ekspressio näkyy FOXO4 yliekspression soluissa verrattuna kontrollisoluihin, kuten on osoitettu immunofluoresenssianalyysillä ja qRT-PCR: llä. Nämä tutkimukset viittaavat vahvasti siihen, että FOXO4 saattavat estää mahalaukun syövän etäpesäkkeiden säätelemällä EMT.
Päätelmä
Johtopäätöksenä Tutkimuksemme osoittaa kriittinen funktio FOXO4 estossa GC lisääntymistä ja etäpesäkkeiden kautta säätelyyn G1 solusyklin pidätyksen ja EMT, ehdottaa, että se voi toimia mahdollisena terapeuttisena kohteena mahasyövän.
toteaa
Linna Su, Xiangqiang Liu, Na Chai vaikuttanut yhtä tähän työhön.
lyhenteet
FOXO4:
Forkhead laatikko O4
BSA:
naudan seerumialbumiini
DAB:
Diaminobenzidine

qRT-PCR:
Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR
MTT:
3- [4,5-dimetyylitiatsol- 2-yyli] -2, 5-difenyyli liumbromidi
PBS:
Fosfaattipuskuroitu suolaliuos
DMSO:
Dimetyylisulfoksidi.


julistukset
Kiitokset
työtä tukivat National Natural Science Foundation of China (lupanumeroon 81172062, 81270445). Kiitämme Prof. Zengshan Li (patologian osaston Xijing sairaala) hänen apua patologinen analyysi. Kiitämme myös rouva Zuhong Tian avusta eläinten kuvantamisen kokeiluja. Kirjoittajat paljasta mitään mahdollisista eturistiriidoista.
Elektroninen oheismateriaali
12885_2014_4601_MOESM1_ESM.doc Additional tiedosto 1: Taulukko S1: Tiedot kudoksen array (ihmisen mahalaukun adenokarsinooman Hyväksytty viereisten kudosten). Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

• LIM homeodomain transkriptiotekijä Isl1 ohjaa normaali pyloric kehitystä suuntaamalla Gata3
• Geneettiset polymorfismit osteopontiinissa promoottori riskiä etäisyyden etäpesäke ja kuoleman Kiinan potilailla mahalaukun cancer