Expression av en LINE-1 endonukleas variant magcancer: dess association med kliniskt patologiska parametrar

Expression av en LINE-1 endonukleas variant magcancer: dess association med kliniskt patologiska parametrar Bild Sammanfattning
Bakgrund
Long varvat kärnelement en (LINE-1 eller L1), den vanligast förekommande och endast självständigt aktiv familj av icke-LTR-retrotransposoner i det mänskliga genomet, uttrycks inte bara i könslinjer utan också i somatiska vävnader. Det bidrar till genetisk instabilitet, åldrande och åldersrelaterade sjukdomar, såsom cancer. Vår tidigare studie identifierades i human gastrisk adenokarcinom en uppregleras transkriptet GCRG213, som delade 88% homologi med humant L1-sekvensen och innehöll en förmodad konserverad apurinic /apyrimidinic endonucleas1 domän.
Metoder
Immunohistokemi utfördes genom användning av en monoklonal mus-anti humant GCRG213 protein (GCRG213p) antikropp framställd i vårt laboratorium, på vävnad microarray konstrueras med prover från 175 magsäckscancerpatienter. Korrelationen mellan GCRG213p uttryck och patient kliniskt patologiska parametrar utvärderades. GCRG213p uttryck i magcancer cellinjer studerades med hjälp av Western blotting analys. L1 promotor metylering status av gastric cancerceller testades med metylering-specifik PCR. BLASTP användes vid NCBI Blast servern för att identifiera GCRG213p sekvens till eventuella anpassningar i Protein Data Bank databaser.
Resultat
mest primära magcancer, lymfkörtelmetastaser och mag tarm metaplasi körtlar visade positiv GCRG213p immunreaktivitet. Hög GCRG213p immunfärgning poäng i den primära magsäckscancer positivt korrelerad med tumördifferentiering (väl differentierade, p = 0,001), Lauren klassificering (intestinal typ, p < 0,05) och en sen ålder debut av magcancer (≥65 år; p < 0,05). GCRG213p uttryck har inget samband med andra kliniskt patologiska parametrar, inklusive överlevnad. Western blotting analys av GCRG213p uttryck i gastric cancerceller indikerade att GCRG213p nivån var högre i magcancer cellinjer än i humant normalt gastric epitel odödlig cellinje GES-1. Partiell metylering av L1 i gastriska cancerceller bekräftades genom metylering-specifik PCR. BLASTP program analys visade att GCRG213p peptid delade 83,0% anpassning till C-terminala regionen av L1 endonukleas (L1-EN). GCRG213p sekvens besitter de viktiga rester som utgör de konserverade egenskaperna hos L1-EN.
Slutsatser
GCRG213p kan vara en variant av L1-EN, en funktionell medlem av L1-EN familj. Överuttryck av GCRG213p är vanligt i både primär magsäckscancer och lymfkörteln metastasering. Dessa resultat ger belägg för somatisk L1 uttryck i magcancer, och dess eventuella konsekvenser i form av tumören.
Nyckelord
magcancer Long varvat kärnelement ett endonukleas GCRG213 protein Tissue microarray Bakgrund
Long varvas kärnelementet -1 (LINE-1 eller L1) är den mest förekommande och endast autonomt aktiv familj av icke-LTR-retrotransposoner i det mänskliga genomet och innefattar ca 17% av det humana genomet [1]. De allra flesta av de cirka 500 tusen totalt kopior av L1 i det mänskliga genomet inte kan införlivas på egen hand på grund av olika mekanismer som stympningar och inaktiverande mutationer. Emellertid uppskattningsvis 80-100 full längd, retrotranspositions behöriga L1s (RC-L1s) är närvarande i en typisk diploida humana genomet, och ett litet antal, benämnd "hot L1s" uppvisar höga retrotranspositions effektiviteter [2] Human.
RC-L1s är ca 6,5 ​​kb och kodar två proteiner (ORF1p och ORF2p) som krävs för retrotransposition [3]. ORF1p är ett protein 40-kDa med RNA-bindande [4] och nukleinsyra eskorte verksamhet [5]. ORF2p är ett protein 150-kDa med endonukleas (L1-EN) [6] och omvänt transkriptas (L1-RT) [7] aktiviteter. L1 elementet kan integreras i flera hundra tusen genomiska platser, vid en löst definierad konsensusställe (5'-TTTT /AA-3 '), som är nicked av L1-EN [8]. Värden begränsar spridningen av sådana element genom transkriptionella och posttranskriptionella tystande mekanismer som minskar aktiviteten till tolerabla nivåer [9].
L1 som uttrycks inte bara i könslinjer utan också i somatiska vävnader. Det föreslås att även låga nivåer av somatisk DNA-skada på grund av L1 aktivitet har potential att bidra till genetisk instabilitet, åldrande och åldersrelaterade sjukdomar, såsom cancer [10, 11]. L1-ORF1 och ORF2 var uppreglerad i en mängd olika maligniteter, såsom bröstcancer, pankreascancer och maligna tumörer könsceller, etc. [12-14]. L1 hypometylering observerades i en mängd olika maligniteter, såsom huvud och nacke, esofagus och mage cancer, och i premaligna lesioner [15, 16]. Graden av L1 hypometylering var också förenad med ett mer avancerat stadium och sämre prognos [17, 18].
L1-inducerad påverkan på celler inte sannolikt begränsad till fullt aktiva element. Även L1 element med defekta ORF1 kodande regionerna kan göra en RNA som splitsar att uttrycka en funktionell ORF2 med en rad negativa konsekvenser för cellen [19]. Många vävnader producerar översättas skarvade ORF2 (SpORF2) utskrift [20]. En skarvas L1 transkript som innehåller grant omvänt transkriptas sekvens av ORF2, visade sig vara avgörande för människors hepatom celltillväxt [21].
Vår tidigare studie [22] identifierade ett uppregleras transkript, som heter gastric cancerrelaterad gen 213 (GCRG213) i human magcancer. BLAST-analys av GCRG213 sekvens indikerade 88% homologi med humant LI och avslöjade en förmodad konserverad domän, apurinic /apyrimidinic endonucleas1 (APE), i GCRG213-ORF. Vårt senaste jakt efter den uppdaterade GenBank databasen visar GCRG213-ORF innehåller en L1-EN bevarad domän. Detta dokument rapporterar vår nuvarande studie som har bekräftat GCRG213 protein (GCRG213p) uttryck i gastric cancercellinjer med hjälp av monoklonal mus-anti-GCRG213p antikropp producerad i vårt laboratorium (Geriatric institut, Kina PLA General Hospital, Beijing, Kina). Dessutom, immunohistokemi (IHC) appliceras på vävnad microarray (TMA) användes för att utvärdera GCRG213p expression i gastric cancer och normal magslemhinna. Ytterligare analyser utfördes för att se om det finns något samband mellan GCRG213p uttryck och kliniskt patologiska parametrar och överlevnad.
Metoder
patienter
patienter som genomgick gastrektomi för magcancer i PLA allmänna sjukhus, Beijing, Kina 1991-2003 ansågs kandidater för denna studie. Kriterierna för provtagning var följande: kön (män eller kvinnor), ålder (20 år eller äldre); nydiagnostiserade (incident) gastric cancer utan föregående behandling; diagnos histologiskt bekräftad; paraffininbäddad tumör, parat omgivande icke-tumör magslemhinnan vävnader finns, med karcinom metastatiska till lymfkörtel om möjligt; och positiva uppföljningsresultat vid tidpunkten för TMA konstruktion. Som ett resultat har 175 fall rekryterades i denna studie, som omfattar 144 män och 31 kvinnor (27 ~ 84 år, medelvärde = 58,58 år). Bland dem, sextio sju fall har karcinom tillsammans med lymfkörtelmetastaser och sex fall av formalinfixerade, paraffininbäddade normala gastriska vävnader också erhållas från icke-tumörpatienter som opererade på grund av godartade gastric sjukdomar.
Demografiska , livsstil och kliniskt patologiska data för prov fall visades i Tabell 1. Alla tumörer klassificerades och iscensatt enligt de reviderade riktlinjerna förespråkas av International Union mot cancer. Uppföljningen gjordes för att bedöma deras senaste förhållanden i 2005 genom att konsultera sina fall handlingar eller genom telefonsamtal till patienter (eller deras familjemedlemmar, eller familjeläkare). En minsta intervall om 18 månader antogs, och median uppföljningstid tid för patienter som fortfarande levde i slutet av 2005 var 46 månader (intervallet var från minimum 18 till högst 129 månader). Överlevnadstiden beräknades från och med dagen för kirurgi till dagen för dödsfall eller den dag senast kända alive.Table 1 kliniskt patologiska parametrar gastric cancerpatienter studerats i vävnadsmicroarray
N (%)
GCRG213p negativ
GCRG213p positiv
P-värde
Kön
Man
144 (82,28%) katalog 31
113
0,111
Kvinna
31 (17,72%) katalog 11
20
Age Hotel < 65 år
104 (59,43%) katalog 31
73
0,029
≥65 år
71 (40,57%) katalog 11
60
Rökning
Ja
45 (27,27%) katalog 7
38
0,278
Nej
120 (72,73%) katalog 30
90
dricka
Ja
28 (16,97%) 2
26
0,060
Ingen
137 (83,03%) katalog 35
102
Släkten tumör
Ja
14 (8,43%) 2
12
0,639
Nej
152 (91,57%) katalog 36
116
tumörlokalisation
Cardiac
48 (27,43%) katalog 8
40
0,360
Body
37 (21,14%) katalog 10
27
Antrum
90 (51,43%) katalog 24
66
Tumörstorlek storlek~~POS=HEADCOMP (cm) Review ≤1
11 (6,29%) Review 3
8
0,506
1-3
42 (24,00%) katalog 13
29 Hotel > 3
122 (69,71%)
26 96
djup invasion
T1
46 (26,28%) katalog 12
34
0,635
T2
21 (12,00%) katalog 7
14
T3
33 (18,86%) katalog 6
27
T4
75 (42,86%) katalog 17
58
Lymfkörtel engagemang
Ja
75 (42,86%) katalog 16
59
0,592
Ingen
100 (57,14%) katalog 26
74
Grad av tumördifferentiering Review Väl
10 (5,71%) katalog 0
10
0,001
Medel
40 (22,86%) Review 4
36
Dålig
103 (58,86%) katalog 27
76
Klackring ring~~POS=HEADCOMP cell
22 (12,57%) katalog 11
11
tumör~~POS=TRUNC (TNM) Review 0
21 (12,00%) katalog 3
18
0,217
Ia
14 (8,00%) katalog 6
8
Ib
41 (23,43%) katalog 10
31
II
60 (34,29%) katalog 17
43
IIIa
39 (22,28% ) katalog 6
33
Laurens klassificering
Intestinal typ
153 (87,43%) katalog 31
122
0,015
Diffus typ
22 (12,57 %) katalog 11
11
resektion marginal
Presence
6 (3,43%) katalog 0
6
0,361
Frånvaro
169 (96,57% ) katalog 42
127
Mikrovaskulära invasion
Presence
20 (11,43%) Review 5
15
0,911
Frånvaro
155 (88,57%)
37
118
Status
levande
121 (71,18%) katalog 30
91
0,483
döda
49 (28,82%)
9
40
5 års överlevnad Hotel < 5 år
47 (43,93%) katalog 12
48
0,871 Hotel > = 5 år
60 (50,07%) katalog 10
37
Tillstånd gavs av den etiska kommitté PLA General Hospital, Peking, Kina använda vävnad och data för detta projekt. Informerat samtycke erhölls också från patienterna.
Tissue microarray konstruktion, GCRG213p immunhistokemisk färgning och bedömning
Vävnads microarrays (TMAS) konstruerades såsom beskrivits tidigare [23]. Från proverna som har sex vävnadsuppsättning block beredd, var och en innehållande 30 fall med tumör, normala och lymfkörtelvävnad om det finns.
Antigenåtervinning av TMA diabilder, och formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadssnitt utfördes av tryck spis behandling under 10 minuter i en antigenåtervinning lösning (10 mmol /L natrium-citrat-buffert, pH 6,0). Monoklonal mus-anti human GCRG213p antikropp, som producerades i vårt laboratorium [24], tillsattes vid en utspädning av 1: 200 och inkuberades under 2 h vid rumstemperatur. Objektglasen inkuberades sedan under 1 h i sekundär antikropp. En EnVision kit (Dako, Carpinteria, CA, USA) användes för att visualisera antikroppsbindning, och glider därefter motfärgades med hematoxylin. En PBS-endast färgning prov användes som bakgrundskontroll.
Specifik gulbrun immunfärgning för GCRG213p uteslutande beläget i cytoplasman. Det poängsattes självständigt och i en blindad sätt av två forskare (GJ och XL). Inter-observatörsmeningsskiljaktigheter (cirka 6% av den totala fall) granskades för andra gången, följt av en avgörande dom båda observatörer. Formellt poäng därefter genomförs av en utredare (WG). Färgningsintensiteten var kategoriseras som 0 (frånvarande), 1 (svagt), 2 (måttlig) och 3 (stark). Den procentuella andelen av positivt färgade celler räknades som 0 (0% positiv), en (1-30%), 2 (31-60%), och 3 (> 60%). Kombinerad bedömning av färgningsintensitet och förlängning användes för att utvärdera GCRG213p expression. Den minsta poäng när summeras (intensitet + förlängning) var 0, och den maximala var 6 [25]. Totalpoäng på ≥2 ansågs GCRG213p positiv.
Western blotting analys
magcancer cellinjer inklusive SGC-7901, BGC-823 och humant normalt gastric epitel odödlig cellinje GES-1 odlades, samlas in och lyserades med RIPA buffert på is innan de utsattes för Western blot-analys. Proteinkoncentrationen detekteras av Bradford-metoden med BSA (Sigma-Aldrich) som standard. Lika stora mängder av cellextrakt (40

• Alkoholkonsumtion och risken för magcancer: en kohortstudie av män i Kaunas, Litauen, med upp till 30 år uppföljning up
• Induktion av kromosom instabilitet och magcancer genom att förändra uttrycksmönstret för mitotiska kontrollpunkts gener i möss som exponerats för arekanötter-nut