Ekspression af en LINE-1 endonuclease variant i mavekræft: dens association med klinisk-patologisk parameters

udtryk for en LINE-1 endonuclease variant i mavekræft: dens association med klinisk-patologiske parametre
Abstract
Baggrund
Lang spækket nukleare element- 1 (LINE-1 eller L1), den mest udbredte og kun autonomt aktiv familie af ikke-LTR-retrotransposoner i det humane genom, udtrykkes ikke blot i de kim linjer, men også i somatiske væv. Det bidrager til genetisk ustabilitet, aldring, og aldersrelaterede sygdomme, såsom kræft. Vores tidligere undersøgelse identificeret i human gastrisk adenocarcinom en opreguleret transskript GCRG213, som delte 88% homologi med humant L1-sekvens og indeholdt et formodet konserveret apurin- /apyrimidinisk endonucleas1 domæne.
Metoder Salg Immunhistokemi blev udført ved anvendelse af et monoklonalt muse-anti -human GCRG213 protein (GCRG213p) antistof fremstillet i vores laboratorium, på væv microarray konstrueret med prøver fra 175 gastrisk adenocarcinom patienter. Sammenhængen mellem GCRG213p udtryk og patient klinisk-patologiske parametre blev evalueret. GCRG213p ekspression i gastrisk cancer cellelinier blev undersøgt ved anvendelse Western blotting-analyse. L1 promotor status for methylering af gastriske cancerceller blev testet under anvendelse methyleringsspecifik PCR. BLASTP blev anvendt ved NCBI Blast serveren til at identificere GCRG213p sekvens til eventuelle justeringer i Protein Data Bank-databaser.
Resultater
Most primær mavekræft, lymfeknudemetastaser og gastriske tarm metaplasi kirtler viste positiv GCRG213p immunreaktivitet. Høj GCRG213p immunfarvning score i den primære mavekræft var positivt korreleret med tumor differentiering (godt differentieret, p = 0,001), Lauren klassificering (tarm type, p < 0,05) og en sen alder debut af gastrisk adenocarcinom (≥65 år; p <0,05). GCRG213p udtryk har ingen forbindelse med andre klinisk-patologiske parametre, herunder overlevelse. Western blotting-analyse af GCRG213p ekspression i gastriske cancerceller indikerede, at GCRG213p niveau var højere i gastriske cancercellelinier end i humant normalt gastrisk epitel udødeliggjort cellelinie GES-1. Delvis methylering af L1 i gastriske cancerceller blev bekræftet ved methylering-specifik PCR. BLASTP program analyse afslørede, at GCRG213p peptid delt 83,0% tilpasning til den C-terminale region af L1-endonuclease (L1-EN). GCRG213p sekvens besidder den vigtige rester, der udgør de konserverede træk ved L1-DA.
Konklusioner Salg GCRG213p kunne være en variant af L1-DA, et funktionelt medlem af L1-EN familie. Overekspression af GCRG213p er almindelig i både primær gastrisk cancer og lymfeknudemetastase. Disse resultater fremlægge dokumentation for somatisk L1 udtryk i mavekræft, og dens mulige konsekvenser i form af tumor.
Nøgleord
Gastric karcinom Længe spækket nuklear element-1 endonuclease GCRG213 protein Tissue microarray Baggrund
Lang spækket nukleare element -1 (LINE-1 eller L1) er den mest rigelige og kun autonomt aktiv familie af ikke-LTR-retrotransposoner i det humane genom og omfatter ca. 17% af det humane genom [1]. Langt størstedelen af ​​de ca. 500.000 samlede kopier af L1 i det humane genom er ikke i stand gennemførelse på egen hånd på grund af forskellige mekanismer som trunkeringer og inaktiverende mutationer. Men en anslået 80-100 fuld længde, retrotranspositionshastigheder kompetente L1S (RC-L1S) er til stede i en typisk diploid humane genom, og et lille antal, betegnet "hot L1S" udviser høje retrotranspositionshastigheder virkningsgrader [2].
Humant RC-L1S er omkring 6,5 kb og koder for to proteiner (ORF1p og ORF2p), der kræves for retrotransposition [3]. ORF1p er en 40-kDa protein med RNA bindende [4] og nukleinsyre chaperone aktiviteter [5]. ORF2p er et 150 kDa protein med endonuclease (L1-EN) [6] og revers transkriptase (L1-RT) [7] aktiviteter. L1 element kan integrere i flere hundrede tusinde genomiske placeringer, ved en løst defineret konsensus (5'-TTTT /AA-3 '), som er nicked af L1-EN [8]. Værten begrænser spredningen af ​​sådanne elementer ved transskriptionelle og post-transkriptionelle lyddæmpende mekanismer, der reducerer aktivitet til tolerable niveauer [9].
L1 udtrykte ikke kun i kim linjer, men også i somatiske væv. Det foreslås, at selv lave niveauer af somatiske DNA-skader på grund af L1-aktivitet har potentiale til at bidrage til genetisk ustabilitet, aldring, og aldersrelaterede sygdomme, såsom kræft [10, 11]. L1-ORF1 og ORF2 blev opreguleret i en række forskellige maligniteter, såsom brystcancer, pancreascancer og maligne kimcelletumorer, etc. [12-14]. L1 hypometylering blev observeret i en række forskellige maligniteter såsom hoved og hals, esophageal og mavekræft, og i præmaligne læsioner [15, 16]. Graden af ​​L1 hypometylering var også forbundet med et mere fremskredet stadium og dårligere prognose [17, 18].
L1-induceret indflydelse til celler er ikke sandsynligt begrænset til fuldt aktive elementer. Selv L1 elementer med defekte ORF1 kodende regioner kan gøre en RNA, der splejser at udtrykke en funktionel ORF2 med en række negative konsekvenser for cellen [19]. Mange væv producerer oversættes splejset ORF2 (SpORF2) afskrift [20]. En splejset L1 transkript, som indbefatter integrant revers transkriptase-sekvensen af ​​ORF 2, viste sig at være essentiel for human hepatoma celleproliferation [21].
Vores tidligere undersøgelse [22] identificerede et opreguleret transkript, opkaldt gastrisk cancer relateret gen 213 (GCRG213) , i human gastrisk adenocarcinom. BLAST analyse af GCRG213 sekvens angivet 88% homologi med human LI og afslørede en formodet konserveret domæne, apurin- /apyrimidinisk endonucleas1 (APE), i GCRG213-ORF. Vores seneste søgen efter den opdaterede GenBank databasen viser GCRG213-ORF indeholder en L1-EN bevaret domæne. Dette papir rapporterer vores nuværende undersøgelse, der har bekræftet GCRG213 protein (GCRG213p) udtryk i gastrisk cancer cellelinjer ved anvendelse af monoklonalt muse-anti-GCRG213p antistof fremstillet i vores laboratorium (Geriatrisk institut, Kina PLA General Hospital, Beijing, Kina). Derudover immunhistokemi (IHC) påført på væv microarray (TMA) blev anvendt til at evaluere GCRG213p ekspression i gastrisk cancer og normal gastrisk mucosa. Yderligere analyser blev udført for at se, om der er nogen sammenhæng mellem GCRG213p udtryk og klinisk-patologiske parametre og overlevelse.
Metoder
Patienter
patienter, som gennemgik gastrektomi for mavekræft i PLA General Hospital, Beijing, Kina 1991-2003 blev anset kandidater til denne undersøgelse. Kriterierne prøveudtagning var som følger: gender (mænd eller kvinder), alder (20 år eller ældre); nydiagnosticerede (hændelse) gastrisk karcinom uden forudgående behandling; diagnose histologisk bekræftet; paraffinindlejret tumor, parret omgivende ikke-tumorale ventrikelslimhinder væv til rådighed, med carcinomer metastatiske til lymfekirtel om muligt; og positive opfølgende resultater på tidspunktet for TMA konstruktion. Som følge heraf blev 175 tilfælde rekrutteret i denne undersøgelse, der omfatter 144 mænd og 31 kvinder (27 ~ 84 år, middelværdi = 58,58 år). Blandt dem, tres syv sager har carcinomer ledsaget med lymfeknude metastaser, og seks tilfælde af formalin-fikseret, blev paraffinindlejrede normale gastriske væv også opnået fra ikke-tumor patienter, der blev opereret på grund af godartede gastriske sygdomme.
Demografisk , livsstil og klinisk-patologiske data for prøve tilfælde blev vist i tabel 1. Alle tumorer blev klassificeret og iscenesat i henhold til de reviderede retningslinjer der anbefales af den Internationale Union mod Kræft. Opfølgningen blev foretaget for at vurdere deres seneste forhold i 2005 ved at konsultere deres sagsakter eller via telefonopkald til patienter (eller deres familiemedlemmer eller praktiserende læger). En minimal interval på 18 måneder blev vedtaget, og den mediane follow-up tid til patienter, der stadig var i live ved udgangen af ​​2005 var 46 måneder (området var fra minimum 18 til de maksimale 129 måneder). Overlevelse tid blev beregnet fra datoen for kirurgi til datoen for død eller datoen sidst kendte alive.Table 1 klinisk-patologisk parametre for mavecancerpatienter undersøgt i væv microarray
N (%)
GCRG213p negativ
GCRG213p positiv
P-værdi
Køn
Mand
144 (82,28%)
31
113
0,111
Female
31 (17,72%)
11
20
Age
< 65 år
104 (59,43%)
31
73
0,029
≥65 år
71 (40,57%)
11
60
Rygning
Ja
45 (27,27%)
7
38
0,278
Nej
120 (72,73%)
30
90
Drinking
Ja
28 (16,97%)
2
26
0,060
ingen
137 (83,03%)
35
102
Familie historie tumor
Ja
14 (8,43%)
2
12
0,639
Nej
152 (91,57%)
36
116
Tumor placering
Cardiac
48 (27,43%)
8
40
0,360
Krop
37 (21,14%)
10
27
antrum
90 (51,43%)
24
66
Tumor størrelse (cm)
≤1
11 (6,29%)
3
8
0,506
1-3
42 (24,00%)
13
29
> 3
122 (69,71%)
26
96
dybde invasion
T1
46 (26,28%)
12
34
0,635
T2
21 (12,00%)
7
14
T3
33 (18,86%)
6
27
T4
75 (42,86%)
17
58
Lymfeknude involvering
Ja
75 (42,86%)
16
59
0,592
Ingen
100 (57,14%)
26
74 Turklasse tumor differentiering
Nå
10 (5,71%)
0
10
0.001
Moderat
40 (22,86%)
4
36
Dårlig
103 (58,86%)
27
76
Signet ring celle
22 (12,57%)
11
11
Tumor etape (TNM)
0
21 (12,00%)
3
18
0,217
Ia
14 (8,00%)
6
8
Ib
41 (23,43%)
10
31
II
60 (34,29%)
17
43
IIIa
39 (22,28% )
6
33
Laurens klassificering
Intestinal typen
153 (87,43%)
31
122
0,015
Diffus typen
22 (12,57 %)
11
11
resektion margin
Presence
6 (3,43%)
0
6
0,361
Fravær
169 (96,57% )
42
127
mikrovaskulær invasion
Presence
20 (11,43%)
5
15
0,911
Fravær
155 (88,57%)
37
118
status
live
121 (71,18%)
30
91
0,483
døde
49 (28,82%)
9
40
5 års overlevelse
< 5 års
47 (43,93%)
12
48
0,871
> = 5 års
60 (50,07%)
10
37
Tilladelse blev givet af den etiske komité af PLA General Hospital, Beijing, Kina til at bruge væv og dataene for dette projekt. Informeret samtykke blev også opnået fra patienterne.
Tissue microarray konstruktion, GCRG213p immunhistokemisk farvning og vurdering
vævet microarrays (TMAS) blev konstrueret som tidligere [23] beskrevet. Fra prøverne til rådighed, blev seks væv array-blokke forberedt, hver indeholdende 30 tilfælde med tumor, normal og lymfeknuder node væv hvis de er tilgængelige.
Antigen genfinding af TMA lysbilleder, og formalin, paraffinindstøbte vævssnit blev udført ved tryk komfur behandling i 10 minutter i et antigen hentning opløsning (10 mmol /l natriumcitrat, pH 6,0). Monoklonalt muse anti human GCRG213p antistof, som blev produceret i vores laboratorium [24], blev tilsat ved en fortynding på 1: 200 og inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur. Objektglassene blev derefter inkuberet i 1 time i sekundært antistof. En EnVision kit (Dako, Carpinteria, CA, USA) blev anvendt til at visualisere antistofbinding, og objektglassene blev efterfølgende modfarvet med hematoxylin. En PBS-only farvning prøve blev anvendt som en baggrundskontrol.
Specifik gulbrune immunfarvning for GCRG213p udelukkende blev placeret i cytoplasmaet. Det blev scoret selvstændigt og i et blindet måde af to efterforskere (GJ og XL). De inter-observatør uenigheder (ca. 6% af de samlede sager) blev revideret for anden gang, efterfulgt af en endelig dom, som begge observatører. Formel scoring blev efterfølgende udført af en investigator (WG). Den farvningsintensitet blev kategoriseret som 0 (fraværende), 1 (svag), 2 (moderat) og 3 (kraftig). Procentdelen af ​​positivt farvede celler blev scoret som 0 (0% positive), 1 (1-30%), 2 (31-60%), og 3 (> 60%). Kombineret vurdering af farvningsintensitet og forlængelsen blev anvendt til at evaluere GCRG213p ekspression. Den mindste score, når summeres (intensitet + udvidelse) var 0, og den maksimale var 6 [25]. Samlet score på ≥2 blev anset GCRG213p positiv.
Western blotting analyse
mavekræft cellelinjer, herunder SGC-7901, BGC-823 og humant normalt gastrisk epitel udødeliggjort cellelinie GES-1 blev dyrket, indsamlet og lyseret med RIPA buffer på is, før det underkastes Western blotting-analyse. Proteinkoncentrationen blev påvist ved Bradford-metoden med BSA (Sigma-Aldrich) som standard. Lige mængder af celleekstrakt (40 ug) blev underkastet 8% SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid-membran (Bio-Rad) til antistof-blotting. Membranen blev derefter blokeret, inkuberet med muse-anti-GCRG213p antistof (1: 500) i 2 timer ved stuetemperatur, efterfulgt af inkubation med et peberrodperoxidase-konjugeret sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. Signalet blev visualiseret med en forøget kemiluminescens påvisningsreagens. Den muse-anti-β-actin-antistof (1: 5000, Sigma). Blev detekteret samtidigt som en loading kontrol
Påvisning af methylering status LINE-1 med MSP
Validering af LINE-1 status for methylering blev udført under anvendelse methyleringsspecifik PCR (MSP). Total DNA af SGC-7901, blev BGC-823, MGC803 og GES-1 celler udvundet i henhold til instruktionerne i DNA-ekstraktion kit. DNA'et var bisulfit modificeret som tidligere beskrevet [26] i 16 timer ved 50 ° C. Bisulfit omdannet DNA blev PCR-amplificeret ved anvendelse af Taq-polymerase (Invitrogen, USA). Primere blev anvendt, var [27]:
Linea: umethyleret LINE-1 forward primer, TGTGTGTGAGTTGAAGTAGGGT;
LINEb: umethyleret LINE-1 reverse primer, ACCCAATTTTCCAAATACAACCATCA;
LINEc: methylerede LINE-1 forward primer, CGCGAGTCGAAGTAGGGC;
foret: methyleret LINE-1 revers primer, ACCCGATTTTCCAAATACGACCG
PCR-amplifikation var:. 4 ° C, 5 min; 94 ° C, 30s, 58 ° C, 45s, 72 ° C, 61 S, 40 cykler; 72 ° C, 10 min. De resulterende PCR-produkter blev visualiseret på en 2% agarosegel. Methylerede DNA Standarder fra Zymo Research blev anvendt som positiv kontrol, dobbelt destilleret vand som negativ kontrol
Sequence lighed og bevaret domæne søgning
PSI-Blast blev anvendt ved NCBI Blast serveren [28] (søg dato:. 20 th januar 2012) for at identificere GCRG213p sekvens på eventuelle justeringer i Protein Databank databaser herunder alle ikke-redundante GenBank CDS oversættelser, FBF, SwissProt, PIR og PRF. Det blev udført med en standard indledende BLASTP søgning.
Statistisk analyse
Chi-square test eller Fishers eksakte sandsynlighed var ansat til at vurdere forholdet mellem GCRG213p udtryk og klinisk-patologiske variabler. Samlet overlevelse blev undersøgt af GCRG213p udtryk med Kaplan-Meier kurver. Alle p-værdier var tosidet og betragtet som statistisk signifikant, hvis p < 0,05. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af SPSS 13.0 til Windows (SPSS Inc., Chicago, IL).
Resultater
GCRG213p ekspressionsmønstre i normal maveslimhinden og gastrisk adenocarcinom
Distinct GCRG213p farvning blev observeret i primære gastrisk adenocarcinomer, lymfe node metastase tumorer og ikke-tumoral gastrisk mucosa (figur 1). I den ikke-tumorale maveslimhinden fra esopheageal-gastrisk vejkryds og antrumområdet, cytoplasma differentieret overflade epitel og mucosale kirtler viste negativ farvning, men blev observeret positiv GCRG213p farvning i basalmembranen af ​​de normale kirtler. 133 af 175 primære gastriske adenokarcinomer, og 51 af 67 tumorer metastatiske til lymfeknude udviste positiv GCRG213p immunreaktivitet, som var placeret i cytoplasmaet af carcinomacellerne. Figur 1 GCRG213p ekspression i humane maligne og ikke-maligne maveslimhinden. Både (A) primær gastrisk adenocarcinom (100 ×) og (B) adenocarcinom invaderet i lymfeknuderne (100 ×) viste positiv GCRG213p stainging i cytoplasmaet; (A ') og (B') demonstrerede højere forstørrelse (400 x) fra det område (A) og (B). (C) I den ikke-malign gastrisk epitel, blev positiv farvning observeret i basalmembranen, men ikke i cytoplasmaet; GCRG213p immunreaktivitet blev påvist i cytoplasmaet af gastriske intestinal metaplasi kirtler (pile) (100 ×); . (C ') demonstrerede højere forstørrelse (400 x) fra det område (C)
Ifølge Lauren klassificering, er mavecancer opdelt i to histologiske typer: intestinal-type eller diffundere-typen. Vi har 153 tarm-typen tilfælde og 22 diffus-TYE tilfælde i denne undersøgelse. Blandt tilfælde 153 tarm-type, 34 intestinal metaplasi og 28 intraepitelialneoplasi prøver adjecent til kræften blev identificeret. Den alder (år, betyder ± SD) af den intestinale type gruppe med intestinal metaplasi (59,67 ± 12,30) var ældre end den diffuse type gruppe (51,05 ± 11,29) (p = 0,004). 31 af 34 intestinal metaplasi, og 27 af 28 lav- /høj kvalitet intraepitelial neoplasi viste GCRG213p immunoreaktivitet. De fleste af de positive tilfælde viste milde til moderate farvning (tabel 2) .table 2 GCRG213 udtryk i gastrisk vævsprøver
Grupper
Number
GCRG213 udtryk
Samlet score ‡
PR§ (%) Vejviser 0-1
2-3
4-5

6
ikke-tumoral gastrisk epitel
112
112
0
0
0
0.00
Intestinal metaplasi
34
3
18
11
2
91,18 *
Lav- /high-grade intraepitelialneoplasi
28
1
17
10
0
96,43 *
adenocarcinom uden LNM †
100
26
50
21
3
74.00 *
adenocarcinom med LNM
75
16
40
16
3
78,67 *
tumor metastatisk til lymfeknude
67
16
42
8
1
76.12 *
† LNM
lymfeknudemetastase; ‡ Samlet score beregnes som (intensitet score) plus (procent celler positiv score) som beskrevet i metoder; §PR
Positiv sats
* Sammenlignet med non-tumoral maveslimhinden, s <.; 0,001.
Associering mellem GCRG213 udtryk og klinisk-patologiske parametre
High GCRG213p immunfarvning score i den primære mavekræft var positivt korreleret med tumor differentiering (p = 0,001) (figur 2). I mellemtiden blev GCRG213p udtryk korreleret med Laurens klassifikation (p < 0,05). Andelen af ​​positive GCRG213p farvning i alderen gruppe (> = 65 år) var højere end i den ikke-alderen gruppe (< 65 år) (60/71 = 84,51% vs. 73/104 = 70,19%, p < 0,05). Imidlertid blev GCRG213p udtryk ikke fundet at være forbundet med andre klinisk-patologiske parametre som de i tabel 1 (p > 0,05). I de 67 patienter med både den primære tumor og lymfeknude metastatiske tumorprøver, GCRG213p var positiv i 51 lymfeknudemetastase prøver og 52 primære tumorprøver (76,12% versus 77,61%), henholdsvis, hvilket indikerer, at forhøjede GCRG213p ekspression i lymfekirtel metastatisk tumor er overensstemmende med GCRG213p udtryk i den primære gastrisk karcinom. GCRG213p ekspression i lymfeknudemetastaser var også forbundet med kvaliteter af tumor differentiering (p = 0,015), men ikke med andre klinisk-patologiske parametre (p 0,05). Figur 2 Korrelation af GCRG213p immunfarvning score i primær mavekræft med tumor differentiering. Samlet Score (OS) af immunfarvning er højere i veldifferentieret kræft end i de fattige-opdelte (p = 0,001).
Relation af GCRG213 udtryk med overlevelse
Opfølgning oplysninger var tilgængelige på 175 mavekræft patienter for perioder fra 18 måneder til 14 år. Samlet overlevelsesrater er som følger: 91,42% (1 år), 78,28 %% (2 år), 56,57% (3 år), 39,43% (4 år), og 23,43% (5 år). Den mediane overlevelse er 41 måneder.
Baseret på GCRG213p udtryk i primære tumorer, var der ingen signifikant forskel i overlevelse mellem patienter i GCRG213p negative kategori i forhold til GCRG213 positive kategori (X
2
= 2,072, p = 0,558). Tilsvarende blev der ikke observeret nogen korrelation mellem GCRG213p udtryk i lymfeknude metastaser og overlevelse (X
2
= 3,272, p = 0,195).
GCRG213p udtryk i maligne og normale maveslimhinden cellelinjer
Western blotting-assays blev udført på gastriske cancerceller herunder SGC-7901, BGC-823 og ikke-malign gastrisk mucosal cellelinie GES-1, med henblik på yderligere validere den differentielle ekspression af GCRG213p. Proteinbånd på ca. 35 kDa blev identificeret. Tre testede cellelinier udtrykte GCRG213p på forskellige niveauer. GCRG213p niveau blev fundet højere i cancercellelinier end i GES-1 (figur 3). Dette fund svarer med IHC resultat rapporteret i denne undersøgelse, dvs. GCRG213p blev fundet overudtrykt i mavekræft. Figur 3 Western blotting-analyse af hel-celle ekstrakt fra gastriske maligne og ikke-maligne celler under anvendelse af anti-GCRG213p antistof. Celler udtrykker GCRG213p med proteinbånd af 35-kDa. 1: GES-1,2: SGC-7901; 3: BGC-823. Filteret blev genprobet med anti-β-actin-antistof til at kontrollere for lige belastning (nederste panel).
Methylering-specifik PCR-analyse af LINE-1
Methylering-specifik PCR (MSP) analyser blev udført på gastriske cancerceller og ikke-malign gastrisk mucosal cellelinie GES-1, for at teste status L1 promotor-methylering i disse cellelinier. Bortset fra gastrisk cancer cellelinjer SGC-7901 og BGC-823, vi også studeret mavekræft cellelinje MGC-823, til formål at give mere information om L1 methylering i gastrisk cancer cellelinjer. PCR-produkterne amplificeret med methylerede-specifikke primere (MSPM) og ikke-methylerede-specifikke primere (MSPU) var 116 bp og 111 bp, hhv. I GES-1-celler, blev PCR-produktet amplificeret med MSPM, men ikke med MSPU, hvilket antyder, at L1 promotorer i GES-1-celler blev komplet methylering; I SGC-7901 celler, BGC-823-celler og MGC-803-celler, kan de tilsvarende bånd amplificeres med både MSPM og MSPU, indikerer delvis methylering (figur 4). Figur 4 Methylering-specifik PCR (MSP) analyse af LINE-1. Agarosegelelektroforese af MSP produkter. M: produkt amplificeret med methyleret primer; U: produkt amplificeret med methyleret primer. PC: positiv kontrol, menneskelige denatureret DNA standard; W: dobbelt destilleret vand kontrol. Bemærk, at prøverne GES-1 alene vise denatureret PCR-produkter, mens MGC-803, SGC-7901 og BGC-823 prøver viser både methylerede og umethylerede PCR-produkter.
Bioinformatik identifikation af GCRG213p som medlem af L1-EN familie
BLASTP programmet analyse som nævnt ovenfor, afslørede, at GCRG213p peptid delt 83,0% tilpasning til den C-terminale region af L1-DA. Konserveret Domænesøgning af GCRG213p sekvens i konserverede Domain Database over NCBI rammer store exonuklease /endonuklease /phosphatase (EEP) superfamilien, herunder endonuklease domæne af den ikke-LTR retrotransposon LINE-1, exonuklease III (ExoIII) -lignende apurin- /apyrimidinisk ( AP) endonukleaser osv
Yderligere analyse ved hjælp BLASTP viser, at der er i GCRG213p sekvens nogle rester, som er vigtige for de konserverede funktioner i L1-EN, såsom formodede fosfat bindingssted [ion bindingssted] (Y115 /N145 /H230), formodet metal bindingssted [ion bindingssted] (D229) og formodede katalytiske site [aktive site] (Y115 /D145 /N147 /D229 /H230) (figur 5). Figur 5 Tilpasning af GCRG213p og L1-EN. Rød skrift repræsenterer høj konsensus, blå eller sort skrift repræsenterer lav konsensus. GCRG213p indeholdt rester (med pil), der er vigtige for endonukleaseaktiviteten af ​​L1-EN.
Diskussion
Det er klart, at L1 retrotranspositionshastigheder indtruffet begivenheder i somatiske og kønsceller. På trods af, at fuld længde L1 mRNA er helt sikkert den dominerende kilde til L1 retrotransposition, endogene L1 ORF2 splejsning varianter med potentielle biologiske relevans er fundet udtryk i forskellige somatiske væv. Belancio etc. [20] detekteret SpORF2 transkript i forskellige voksne humane væv og ekspressionen af ​​SpORF2 mRNA udviser vævsspecifik variation. Således L1 funktion er usandsynligt at være begrænset kun til fuldt aktive elementer. Den SpORF2 kan også producere funktionelt ORF2-protein. De fleste ikke-LTR retrotransposoner er APE-typen ikke-LTR-retrotransposoner [29]. Krystalstrukturen analyser af det humane L1-DA viser, at det er en prototype for AP-lignende retrotransposonregulatoriske kodet endonukleaser, som nick DNA med variabel specificitet og er ansvarlige for millioner af retrotransposonregulatoriske indsættelser i eukaryote genomer [30]. Både APE1 og L1-EN hører til den store EEP superfamilien, der deler det samme protein stillads og de samme katalytiske rester.
Betragtning af at GCRG213p aksjer høj sekvensopstillinger med L1-EN og besidder konserverede rester, som er afgørende for L1 -DA fosfat binding, metal binding og katalytisk aktivitet, foreslår vi, at GCRG213 er en splejset L1-ORF2. GCRG213p kunne være en funktionel medlem af L1-DA familien, en variant af L1-DA.
Overekspression af L1 i tumorer er blevet bredt præsenteret [12-14]. Den cellulære endogene L1-RT opstår som en konstitutiv funktionel komponent i tumorigene celler er karakteriseret ved en høj spredning og en lav differentiering status [31, 32]. Men der er nogle detaljerede undersøgelser af L1-DA i human tumor. Ergun etc. anvendes anti-L1-DA-antistof til påvisning af L1-ORF2 i voksne humane væv, fandt de stærke ORF2p ekspression i endotelceller i blodkar i normal human prostata, urinblære og testikelvæv, men der observeredes ingen ORF2p ekspression i cancercellerne undersøgt [33]. Oricchio etc. [34] rapporterede, at stabil L1 RNA-interferens kan reducere proliferation og fremme differentiering i A-375 melanom celler. De observerede også en reduktion af L1-ORF2 protein. Men forskerne har ikke identificeret, om spredning effekter var fra L1-EN og /eller L1-RT. Til dato er der ingen rapport findes om den rolle, L1-DA om celledeling og differentiering. I denne undersøgelse, vi bekræftede, at GCRG213p ekspression blev forhøjet i mavekræft på proteinniveau, både i cellen modellen og vævssnit undersøgte, hvilket er i overensstemmelse med vores tidligere resultater studere på mRNA-niveau [22]. L1 undergår hypomethylering i forskellige tumorvæv, herunder gastrisk cancer [35]. Shigaki etc. [36] anvendte bisulfit-pyrosekventering teknologi til at kvantificere L1 methylering status i reseceret gastrisk kræft prøver. De fandt, at patienter gennemgik L1 hypometylering oplevede væsentligt kortere samlet overlevelse end dem med hypermethylering. Vi fandt i denne undersøgelse, at L1 var helt methyleret i normal gastrisk mucosa cellelinie GES-1, men blev delvist methyleret i gastriske cancercellelinier. Disse resultater korrelerer med GCRG213p ekspressionsmønsteret i gastrisk cancer cellelinjer dermed give mere dokumentation for arten af ​​GCRG213 peptid. Men vi kunne ikke identificere en sammenhæng mellem GCRG213p udtryk og overlevelse i denne undersøgelse. Intraepitelialneoplasi menes at være et vigtigt skridt for malign transformation af gastrisk adenocarcinom, overekspression af GCRG213p i disse kirtler indebar en potentiel rolle GCRG213p i gastrisk onkogenese. Den høje immunfarvning score på GCRG213p i veldifferentieret mavekræft anførte, at det kan være involveret i mavekræft differentiering.
Mens kronisk atrofisk gastritis menes at være en aldersrelateret enhed blev intestinal metaplasi anset tegn på atrofisk gastritis, da specialiserede kirtler var blevet erstattet af tarm krypter, så intestinal metaplasi blev betragtet som alder-relaterede. Alder spiller en vigtig faktor om udvikling af gastrisk intestinal metaplasi, og individer med gastrisk tarm metaplasi var betydeligt ældre end dem uden metaplasi [37]. Intestinal metaplasi kirtler viste omfattende GCRG213p immunfarvning i denne undersøgelse. I mellemtiden observerede vi, at den positive rate af GCRG213p i gastrisk cancer væv i alderen gruppe var højere end i ikke-lagret gruppe. Disse kan medføre, at GCRG213p er forbundet med maveslimhinden aldring og aldersrelaterede enheder. Der er ingen undersøgelse af sammenhængen mellem L1 udtryk og alder på nuværende tidspunkt, men gennemsnitlig L1 methylering ikke variere over tid [38, 39]. Det menes, at nicking af genomisk DNA ved L1-DA kan inducere celletoksicitet, hvilket resulterer i cellecyklusstop, apoptose eller ældning. Ekspression af exogent fuld længde L1 og SpORF2 i normale humane fibroblaster, cancerceller og voksne stamceller har ført til detekterbar DNA-skader og resulterede i senescens-lignende fænotype [20]. Således har vi mistanke om, at akkumulerede aktivitet GCRG213p, en variant af L1-EN, kan udgøre en potentiel kilde til aldersrelateret cellulær transformation, som i sidste ende bidrager til celle aldring, eller modsat, at en ud-af-kontrollerede (maligne) Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• forbrug og risiko for mavekræft Alkohol: en kohorte undersøgelse af mænd i Kaunas, Litauen, med op til 30 års opfølgning
• Induktion af kromosom ustabilitet og mavekræft ved ændring ekspressionsmønsteret af mitotiske checkpoint gener i mus udsat for arecanødder-nut