L'espressione di un LINE-1 variante endonucleasi nel carcinoma gastrico: la sua associazione con clinicopatologica parameters

espressione di un LINE-1 variante endonucleasi nel carcinoma gastrico: la sua associazione con i parametri clinico-patologici
Abstract
sfondo Quanto tempo intervallati elemento- nucleare 1 (LINE-1 o L1), il più abbondante e solo autonomamente attiva famiglia di retrotrasposoni non-LTR nel genoma umano, espresso non solo nelle linee germinali ma anche nei tessuti somatici. Contribuisce alla instabilità genetica, l'invecchiamento e le malattie legate all'età, come il cancro. Il nostro precedente studio identificato nel adenocarcinoma gastrico umano un GCRG213 trascrizione upregulated, che ha condiviso 88% omologia con la sequenza L1 umana e conteneva un dominio endonucleas1 apurinico /apyrimidinic conservato putativo
. Metodi
immunoistochimica è stata effettuata utilizzando un anticorpo monoclonale di topo -human proteine ​​GCRG213 (GCRG213p) anticorpi prodotti nel nostro laboratorio, su microarray tessuto costruito con campioni provenienti da 175 pazienti con adenocarcinoma gastrico. La correlazione tra l'espressione GCRG213p e parametri clinico-patologici dei pazienti è stata valutata. espressione GCRG213p in linee cellulari di cancro gastrico sono stati studiati utilizzando l'analisi Western blotting. L1 stato di metilazione del promotore di cellule di cancro gastrico è stata testata utilizzando metilazione-specifica PCR. BLASTP è stato utilizzato sul server Blast NCBI per identificare la sequenza GCRG213p per eventuali allineamenti nella proteina database banca dati.
Risultati
maggior parte dei tumori gastrici primaria, metastasi linfonodali e gastrici ghiandole metaplasia intestinale hanno evidenziato immunoreattività GCRG213p positivo. Alta GCRG213p immunocolorazione punteggio nella carcinoma gastrico primaria è stata positivamente correlata con la differenziazione del tumore (ben differenziato, p = 0,001), la classificazione di Lauren (tipo intestinale, p < 0,05) e un esordio tarda età di adenocarcinoma gastrico (≥ 65 anni; p <0,05). espressione GCRG213p non ha alcuna associazione con altri parametri clinico-patologici, tra cui la sopravvivenza. Analisi Western blotting dell'espressione GCRG213p in cellule di cancro gastrico ha indicato che il livello GCRG213p era più alto nelle linee di cellule di cancro gastrico rispetto al normale epitelio gastrico immortalato linea cellulare umana GES-1. metilazione parziale di L1 nelle cellule di cancro gastrico è stata confermata da metilazione-specifica PCR. analisi del programma BLASTP rivelato che GCRG213p peptide condiviso allineamento 83,0% con la regione C-terminale della L1 endonucleasi (L1-IT). GCRG213p sequenza possiede i residui importanti che compongono le caratteristiche conservate della L1-EN.
Conclusioni
GCRG213p potrebbe essere una variante di L1-IT, un membro della famiglia funzionale L1-IT. Sovraespressione di GCRG213p è comune sia primaria cancro gastrico e metastasi linfonodali. Questi risultati forniscono la prova di espressione L1 somatiche nel cancro gastrico, e le sue potenziali conseguenze in forma di tumore.
Parole
gastrica carcinoma lungo intervallati nucleare elemento-1 endonucleasi proteina GCRG213 Tissue microarray Sfondo Quanto tempo intervallati elemento nucleare -1 (LINE-1 o L1) è il più abbondante e solo in autonomia attiva famiglia di retrotrasposoni non-LTR nel genoma umano e comprende circa il 17% del genoma umano [1]. La stragrande maggioranza dei circa 500.000 copie complessive di L1 nel genoma umano non sono in grado di trasposizione sul proprio a causa di vari meccanismi come troncamenti e mutazioni inattivanti. Tuttavia, si stima 80-100 full-length, retrotrasposizione L1S competenti (RC-L1S) sono presenti in un tipico genoma umano diploide, e un piccolo numero, definito "caldo L1S" presentano elevati rendimenti retrotrasposizione [2] |. Umana RC-L1S sono circa 6,5 ​​kb e codificano due proteine ​​(ORF1p e ORF2p) necessari per retrotrasposizione [3]. ORF1p è una proteina di 40 kDa con RNA binding [4] e attività chaperone acidi nucleici [5]. ORF2p è una proteina di 150 kDa con endonucleasi (L1-IT) [6] e trascrittasi inversa (L1-RT) [7] attività. elemento L1 può integrare in diverse centinaia di migliaia posizioni genomiche, in un sito di consenso vagamente definito (5'-TTTT /AA-3 '), che viene intaccato da L1-IT [8]. L'host limita la diffusione di tali elementi da meccanismi silenziamento trascrizionale e post-trascrizionale che riducono l'attività a livelli tollerabili [9].
L1 espresso non solo nelle linee germinali ma anche nei tessuti somatici. Si suggerisce che anche bassi livelli di danno al DNA somatici dovuti all'attività L1 hanno il potenziale per contribuire alla instabilità genetica, l'invecchiamento e le malattie legate all'età, come il cancro [10, 11]. L1-ORF1 e ORF2 sono stati upregulated in una varietà di tumori, come il cancro al seno, cancro al pancreas e tumori a cellule germinali maligni, ecc [12-14]. L1 ipometilazione è stata osservata in una varietà di tumori maligni, come testa e del collo, dell'esofago e dello stomaco, e nelle lesioni precancerose [15, 16]. Il grado di L1 hypomethylation stato anche associato a una fase più avanzata e più povera prognosi [17, 18].
Influenza L1 indotta a cellule non è probabilmente limitata solo agli elementi completamente attivi. Anche gli elementi L1 con difettosi regioni codificanti ORF1 potrebbe fare un RNA che giunzioni di esprimere un ORF2 funzionale con una serie di conseguenze negative per la cella [19]. Molti tessuti producono ORF2 impiombato (SpORF2) trascrizione traducibile [20]. Una trascrizione L1 impiombato che comprende la sequenza integrante della trascrittasi inversa di ORF2, è risultato essere essenziale per la proliferazione delle cellule di epatoma umano [21].
Nostro studio precedente [22] ha identificato una trascrizione upregulated, chiamato cancro gastrico correlato gene 213 (GCRG213) , in adenocarcinoma gastrico. analisi BLAST sequenza GCRG213 indicato 88% omologia con LI umana e ha rivelato un dominio conservato putativo, apurinico /apyrimidinic endonucleas1 (APE), in GCRG213-ORF. La nostra ultima ricerca del database GenBank aggiornato mostra GCRG213-ORF contiene un L1-EN conservata dominio. Questo articolo riporta il nostro studio attuale, che ha confermato l'espressione della proteina GCRG213 (GCRG213p) in linee cellulari di cancro gastrico utilizzando il mouse anticorpo monoclonale anti-GCRG213p prodotte nel nostro laboratorio (Istituto Geriatrico, Cina Ospedale PLA generale, Pechino, Cina). Inoltre, l'immunoistochimica (IHC) applicato su microarray tissutale (TMA) è stato utilizzato per valutare l'espressione GCRG213p nel cancro gastrico e normale mucosa gastrica. Ulteriori analisi sono state eseguite per vedere se non vi è alcuna correlazione tra l'espressione GCRG213p e parametri clinico-patologici e la sopravvivenza.
Metodi
Pazienti
pazienti sottoposti a gastrectomia per carcinoma gastrico in PLA General Hospital, Pechino, Cina 1991-2003 sono stati considerati candidati per questo studio. I criteri di campionamento sono stati i seguenti: di genere (maschi o femmine), età (20 anni o più); di nuova diagnosi (incidente) carcinoma gastrico senza trattamento preliminare; Diagnosi istologicamente confermata; paraffina del tumore incorporato, in coppia tessuti circostanti mucosa gastrica non tumorali disponibili, con carcinomi metastatici al linfonodo, se possibile; e positivi risultati di follow-up al momento della costruzione TMA. Di conseguenza, 175 casi sono stati reclutati in questo studio, composto da 144 uomini e 31 donne (27 ~ 84 anni, media = 58.58 anni). Tra questi, sessanta sette casi sono carcinomi accompagnati con metastasi linfonodali, e sei casi di fissate in formalina, tessuti gastrici normali inclusi in paraffina sono stati ottenuti anche da pazienti non-tumorali che sono stati operati a causa di malattie gastriche benigne.
Demografico , stile di vita e dei dati clinico-patologici per i casi del campione sono stati riportati nella Tabella 1. Tutti i tumori sono stati classificati e messo in scena in base ai nuovi orientamenti, sostenuto dall'Unione internazionale contro il cancro. Il follow-up è stato fatto per valutare le loro ultime condizioni nel 2005 consultando i loro documenti di caso o attraverso telefonate ai pazienti (o dei loro familiari o medici di famiglia). Un intervallo minimo di 18 mesi è stato adottato, e il tempo mediano di follow-up per i pazienti che erano ancora vivi alla fine del 2005 era di 46 mesi (range era dal minimo 18 ai massimo 129 mesi). Il tempo di sopravvivenza è stato calcolato a partire dalla data di intervento chirurgico per la data della morte o l'ultima data nota alive.Table 1 parametri clinico-patologiche di pazienti affetti da cancro gastrico studiati in tessuto microarray
N (%)
GCRG213p negativo
GCRG213p positivo
valore P
genere
Maschio
144 (82.28%)
31
113
0.111
Donna
31 (17.72%)
11
20
Età
< 65 anni
104 (59.43%)
31
73
0,029
≥65 anni
71 (40.57%)
11
60
fumatori
Si
45 (27.27%) 7
38
0.278
No
120 (72.73%)
30
90
Alcol
Si
28 (16.97%) 2
26
0,060
No
137 (83.03%)
35
102 storia
familiare di tumore
Sì
14 (8,43%) 2
12
0,639
No
152 (91.57%)
36
116
localizzazione del tumore
cardiaca
48 (27.43%)
8
40
0,360
corpo
37 (21.14%) 10
27
Antrum
90 (51.43%)
24
66
Le dimensioni del tumore (cm)
≤1
11 (6,29%) 3
8
0,506
1-3
42 (24,00%)
13
29
> 3
122 (69.71%)
26
96
profondità dell'invasione
T1
46 (26.28%)
12
34
0.635
T2
21 (12,00%) 7
14
T3
33 (18,86%)
6
27
T4
75 (42.86%)
17
58
linfa nodo coinvolgimento
Si
75 (42.86%)
16
59
0,592
No
100 (57.14%)
26
74
grado di differenziazione del tumore
Bene
10 (5,71%)
0 10
0.001
moderato
40 (22.86%)
4
36
Poor
103 (58.86%)
27
76
Sigillo cella anello
22 (12,57%)
11
11
stadio del tumore (TNM)
0
21 (12,00%) 3
18
0.217
Ia
14 (8,00%) Pagina 6 Pagina 8
Ib
41 (23.43%) 10
31
II
60 (34.29%)
17
43
IIIa
39 (22.28% )
6
33
classificazione di Lauren
tipo intestinale
153 (87.43%)
31
122
0.015
diffuso tipo
22 (12.57 %)
11
11
resezione margine
Presenza
6 (3,43%)
0
6
0,361
Assenza
169 (96.57% )
42
127
invasione microvascolare
Presenza
20 (11,43%)
5
15
0.911
Assenza
155 (88.57%)
37
118
Stato
vivo
121 (71.18%)
30
91
0,483
morti 49 (28.82%)
9
40
5 anni di sopravvivenza
< 5 anni
47 (43.93%)
12
48
0,871
> = 5 anni
60 (50.07%) 10
37
Il permesso è stato dato dal Comitato Etico del Policlinico PLA, Pechino, Cina di usare il tessuto ei dati per questo progetto. Il consenso informato è stato ottenuto anche dai pazienti.
Tissue costruzione microarray, GCRG213p colorazione immunoistochimica e la valutazione
I microarray di tessuti (TMAs) sono stati costruiti come descritto in precedenza [23]. Dai campioni disponibili, sei blocchi di matrice di tessuto sono stati preparati, contenenti ciascuna 30 casi con tumore, normali e linfatici tessuti nodo, se disponibile
. Antigen recupero di diapositive TMA, e, sezioni di tessuto incluse in paraffina fissati in formalina sono stati eseguiti da pressione trattamento fornello per 10 min in una soluzione di antigene recupero (/L tampone citrato di sodio 10 mmol, pH 6,0). Monoclonale murino anti anticorpi GCRG213p umana, che è stato prodotto nel nostro laboratorio [24], è stato aggiunto ad una diluizione di 1: 200 e incubata per 2 ore a temperatura ambiente. I vetrini sono stati quindi incubati per 1 h in anticorpo secondario. Un kit EnVision (Dako, Carpinteria, CA, USA) è stato utilizzato per visualizzare anticorpi di legame, e le diapositive sono stati successivamente di contrasto con ematossilina. A PBS-unico campione colorazione è stato usato come controllo sfondo.
Specifico immunostaining giallo-marrone per GCRG213p trovava esclusivamente nel citoplasma. E 'stato segnato in modo indipendente e in modo cieco da due investigatori (GJ e XL). I disaccordi inter-osservatore (circa il 6% dei casi totali) sono stati rivisti per la seconda volta, seguita da un giudizio conclusivo da entrambi gli osservatori. punteggio formale è stata successivamente effettuata da uno sperimentatore (WG). L'intensità della colorazione è stato classificato come 0 (assente), 1 (debole), 2 (moderato), e 3 (forte). La percentuale di cellule colorate positivamente è stato ottenuto come 0 (0% positivo), 1 (1-30%), 2 (31-60%), e 3 (> 60%). Combinato valutare di intensità di colorazione e l'estensione è stato utilizzato per valutare l'espressione GCRG213p. Il punteggio minimo quando sommati (intensità + estensione) è stata dello 0, e il massimo è stato di 6 [25]. Punteggio totale di ≥2 è stato ritenuto GCRG213p positivo.
analisi Western blotting
linee di cellule di cancro gastrico tra SGC-7901, BGC-823 e normale linea di cellule dell'epitelio gastrico immortalato umana GES-1 sono state coltivate, raccolte e lisato con il RIPA tampone sul ghiaccio prima di essere sottoposto ad analisi Western blotting. La concentrazione proteica è stata rilevata con il metodo di Bradford con BSA (Sigma-Aldrich) come standard. Uguali quantità di estratto cellulare (40 mg) sono stati sottoposti a 8% SDS-PAGE e trasferite su membrana di polivinilidene difluoruro (Bio-Rad) per l'anticorpo blotting. La membrana è stata quindi bloccata, incubate con anticorpo di topo anti-GCRG213p (1: 500) per 2 ore a temperatura ambiente, seguito da incubazione con un anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano per 1 ora a temperatura ambiente. Il segnale è stato visualizzato con un reagente di rilevamento chemiluminescente. L'anticorpo-β-actina anti- topo (1: 5.000, Sigma). È stata rilevata simultaneamente come controllo di caricamento
rilevamento dello stato di metilazione di LINE-1 con MSP
convalida dello status LINE-1 metilazione è stata effettuata utilizzando metilazione-specifica PCR (MSP). DNA totale di SGC-7901, BGC-823, MGC803 e GES-1 le cellule è stato estratto secondo le istruzioni del kit di estrazione del DNA. Il DNA è stato modificato bisolfito come precedentemente descritto [26] per 16 ore a 50 ° C. Bisolfito-convertito DNA era PCR-amplificato utilizzando Taq polimerasi (Invitrogen, USA). Primer utilizzati sono stati [27]:
Linea: non metilato LINE-1 Forward Primer, TGTGTGTGAGTTGAAGTAGGGT;
LINEb: non metilato LINE-1 primer reverse, ACCCAATTTTCCAAATACAACCATCA;
Linec: metilato LINE-1 Forward Primer, CGCGAGTCGAAGTAGGGC;
allineato: metilato LINE-1 primer reverse, ACCCGATTTTCCAAATACGACCG
condizioni di amplificazione PCR sono stati:. 4 ° C, 5 min; 94 ° C, 30, 58 ° C, 45 giri, 72 ° C, 61S, 40 cicli; 72 ° C, 10 min. I prodotti di PCR ottenuti sono stati visualizzati su un gel di agarosio al 2%. Denaturato DNA standard da Zymo ricerca sono state usate come controllo positivo, acqua bidistillata come controllo negativo
similarità di sequenza e conservata dominio di ricerca
PSI-Blast è stato utilizzato a livello di server NCBI Blast [28] (data della ricerca:. 20 gennaio 2012) per identificare la sequenza GCRG213p ad eventuali allineamenti nella proteina database Banca dati compresi tutti i non ridondanti GenBank CDS traduzioni, PDB, SwissProt, PIR e PRF. E 'stata eseguita con uno standard di ricerca iniziale BLASTP.
Analisi statistica
test quadrati Chi o probabilità esatta di Fisher è stato impiegato per valutare la relazione tra espressione GCRG213p e variabili clinico-patologiche. La sopravvivenza globale è stata esaminata dal espressione GCRG213p con curve di Kaplan-Meier. Tutti i valori di p erano a due code e considerato statisticamente significativo se p < 0.05. L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando SPSS 13.0 per Windows (SPSS Inc., Chicago, IL).
Risultati
pattern di espressione GCRG213p in normale mucosa gastrica e adenocarcinoma gastrico
distinta colorazione GCRG213p è stata osservata negli adenocarcinomi gastrici primarie, linfa tumori metastasi nodo, e la mucosa gastrica non tumorale (Figura 1). Nella mucosa gastrica non tumorale dallo svincolo esopheageal-gastrica e zona antro, citoplasma di differenziata epiteli superficiali e ghiandole mucose mostrato colorazione negativa, ma colorazione GCRG213p positivo è stato osservato nella membrana basale delle ghiandole normali. 133 di 175 primari adenocarcinomi gastrici, e 51 su 67 tumori metastatici al linfonodo mostrato immunoreattività GCRG213p positivo, che si trovava nel citoplasma delle cellule di carcinoma. Figura 1 espressione GCRG213p nella mucosa gastrica maligna e non maligne umana. Entrambi (A) adenocarcinoma gastrico primario (100 ×) e (B) adenocarcinoma invaso nel linfonodo (100 ×) mostravano GCRG213p positiva stainging nel citoplasma; (A ') e (B') hanno dimostrato l'alto ingrandimento (400x) dall'area in (A) e (B). (C) In epiteli gastrico non maligno, colorazione positiva è stata osservata nella membrana basale, ma non nel citoplasma; GCRG213p immunoreattività è stata rilevata nel citoplasma delle ghiandole gastriche intestinali metaplasia (freccia) (100 ×); . (C ') hanno dimostrato l'ingrandimento più elevato (400 ×) dall'area in (C)
Secondo la classificazione Lauren, il cancro gastrico è diviso in due tipi istologici: intestinale-tipo o diffondere-tipo. Abbiamo 153 casi di tipo intestinale e 22 casi diffusa-tye in questo studio. Tra i 153 casi di tipo intestinale, 34 metaplasia intestinale e 28 campioni neoplasia intraepiteliale adjecent al cancro sono stati identificati. L'età (anno, media ± DS) del gruppo di tipo intestinale con metaplasia intestinale (59.67 ± 12.30) era più vecchio del gruppo diffuso tipo (51.05 ± 11.29) (p = 0,004). 31 di 34 metaplasia intestinale, e 27, del 28 basso /alto grado neoplasia intraepiteliale mostrato GCRG213p immunoreattività. La maggior parte dei casi positivi hanno mostrato lieve a moderata colorazione (Tabella 2) .table 2 GCRG213 espressione nei campioni di tessuto gastrico
Gruppi
Numero
espressione GCRG213
Punteggio totale ‡
PR§ (%)
0-1
2-3
4-5

6
non tumorale epiteli gastrica
112
112
0 0

0
0.00
intestinale metaplasia
34
3
18
11 2
91.18 *
Low /alto grado neoplasia intraepiteliale
28
1 17 10
0
96.43 *
adenocarcinoma senza LNM †
100 | 26
50 | 21 3
74.00 *
adenocarcinoma con LNM
75
16
40
16 3
78.67 *
tumore metastatico al linfonodo
67
16
42 Pagina 8
1 76.12 *
† LNM
metastasi linfonodali; ‡ Punteggio totale calcolato come (punteggio intensità) più (cellule per cento punteggio positivo) come descritto nei metodi; §PR
tasso positivo
* Rispetto ai non-tumorale mucosa gastrica, p <.; 0.001.
Associazione tra espressione GCRG213 e parametri clinico-patologici
alta GCRG213p punteggio immunocolorazione nel carcinoma gastrico primaria è stata positivamente correlata con la differenziazione del tumore (p = 0,001) (Figura 2). Nel frattempo, l'espressione GCRG213p è stata correlata con la classificazione di Lauren (p < 0,05). La percentuale di colorazione GCRG213p positivo nel gruppo di età (> = 65 anni) era superiore a quella nel gruppo non-età (< 65 anni) (60/71 = 84.51% vs. 73/104 = 70.19%, p < 0,05). Tuttavia, l'espressione GCRG213p non è stato trovato per essere associato ad altri parametri clinicopatologiche come quelli elencati nella Tabella 1 (p > 0,05). Nei 67 pazienti sia con il tumore primario e dei linfonodi metastatici campioni tumorali, GCRG213p è stato positivo nel 51 linfatici esemplari nodo metastasi e 52 campioni tumorali primari (76,12% vs 77,61%), rispettivamente, il che indica che l'espressione GCRG213p elevata nel linfonodo metastatico tumore è concorde con l'espressione GCRG213p nel carcinoma gastrico primaria. espressione GCRG213p in metastasi linfonodali è stata anche associata con gradi di differenziazione del tumore (p = 0,015), ma non con altri parametri clinico-patologici (p > 0,05). Figura 2 Correlazione di GCRG213p punteggio immunocolorazione nel cancro gastrico primaria con differenziazione del tumore. Punteggio globale (OS) di immunocolorazione è più elevato nel cancro ben differenziato rispetto a quello nel povero differenziata (p = 0,001).
Rapporto di espressione GCRG213 con la sopravvivenza
follow-up erano disponibili informazioni sulla 175 cancro gastrico i pazienti per periodi che vanno da 18 mesi a 14 anni. i tassi di sopravvivenza globale sono le seguenti: 91.42% (1 anno), 78.28 %% (2 anni), 56.57% (3 anni), 39.43% (4 anni), e il 23.43% (5 anni). Il tasso di sopravvivenza media è di 41 mesi. Commercio basato sull'espressione GCRG213p nei tumori primari, non vi era alcuna differenza significativa nella sopravvivenza tra i pazienti nella categoria negativo GCRG213p rispetto alla categoria positivo GCRG213 (X
2
= 2.072, p = 0,558). Allo stesso modo, è stata osservata alcuna correlazione tra l'espressione GCRG213p in metastasi linfonodali e la sopravvivenza (X
2
= 3.272, p = 0.195).
Espressione GCRG213p in linee cellulari della mucosa gastrica maligni e normali
saggi di Western blotting sono stati eseguiti su cellule di cancro gastrico tra SGC-7901, BGC-823 e non-maligne gastrica linea di cellule della mucosa GES-1, al fine di validare ulteriormente l'espressione differenziale delle GCRG213p. Sono stati identificati bande proteiche di circa 35 kDa. Tre linee cellulari testate espressi GCRG213p a diversi livelli. Livello GCRG213p stata trovata superiore nelle linee cellulari tumorali rispetto GES-1 (Figura 3). Questo dato corrisponde al risultato IHC riportata in questo studio, vale a dire, GCRG213p è stato trovato sovraespresso nel cancro gastrico. Figura 3 Analisi Western blotting di tutto estratto cellulare di cellule maligne e non maligne gastrici con anticorpo anti-GCRG213p. Le cellule esprimono GCRG213p con bande di proteine ​​di 35 kDa. 1: GES-1,2: SGC-7901; 3: BGC-823. Il filtro è stato reprobed con l'anticorpo anti-β-actina per il controllo per la parità di carico (pannello inferiore).
Metilazione-specifica analisi PCR di LINE-1
metilazione-specifica PCR (MSP) è stato analizzato cellule di cancro gastrico e non maligne delle cellule della mucosa gastrica linea GES-1, al fine di verificare lo stato di metilazione L1 promotore in queste linee cellulari. A parte le linee di cellule di cancro gastrico SGC-7901 e BGC-823, abbiamo anche studiato linee di cellule di cancro gastrico MGC-823, per la fine di fornire ulteriori informazioni su L1 metilazione nelle linee di cellule di cancro gastrico. I prodotti della PCR amplificati con primer specifici metilati (MSPM) e primer specifici non metilato (MSPU) erano 116 bp e 111 bp rispettivamente. Nelle cellule GES-1, prodotto di PCR è stato amplificato con MSPM, ma non con MSPU, suggerendo che i promotori L1 a GES-1 le cellule sono stati sottoposti a completa metilazione; Nelle cellule SGC-7901, BGC-823 cellule e MGC-803 cellule, le bande corrispondenti possono essere amplificati sia con MSPM e MSPU, indicativo di metilazione parziale (figura 4). Figura 4 PCR (MSP) analisi specifica-metilazione di LINE-1. Agarosio elettroforesi su gel di prodotti MSP. M: prodotto amplificato con primer metilato-specifica; U: prodotto amplificato con primer unmethylated-specifica. PC: controllo positivo, standard di DNA metilato umano; W: doppio controllo acqua distillata. Si noti che i campioni GES-1 mostrano esclusivamente prodotti di PCR denaturato, mentre il MGC-803, i campioni SGC-7901 e BGC-823 mostrano entrambi i prodotti di PCR denaturato e non metilato.
Individuazione bioinformatica di GCRG213p come un membro della famiglia L1-IT
BLASTP analisi del programma, come detto sopra, ha rivelato che GCRG213p peptide condivisa allineamento 83,0% con la regione C-terminale L1-EN. Conserve ricerca nel dominio della sequenza GCRG213p nel Database Conserve dominio del NCBI colpisce il esonucleasi grande /endonucleasi /fosfatasi (EEP) superfamiglia, compreso il dominio endonucleasi del non-LTR retrotrasposone LINE-1, esonucleasi III (ExoIII) -come apurinico /apyrimidinic ( AP) endonucleasi, ecc
Ulteriori analisi utilizzando BLASTP indica che ci sono in sequenza GCRG213p alcuni residui che sono importanti per le caratteristiche conservate della L1-IT, come ad esempio il fosfato putativo sito di legame [ione sito di legame] (Y115 /N145 /H230), metallo putativo sito di legame [ione sito di legame] (D229) e il sito catalitico putativo [sito attivo] (Y115 /D145 /N147 /D229 /H230) (Figura 5). Figura 5 Allineamento di GCRG213p e L1-EN. carattere rosso rappresenta High Consensus, carattere blu o nero rappresenta basso consenso. GCRG213p conteneva residui (freccia) che sono importanti per l'attività endonucleasi di L1-EN.
Discussione
E 'chiaro che gli eventi L1 retrotransposition si sono verificati nelle cellule somatiche e germinali. Nonostante il fatto che tutta la lunghezza L1 mRNA sono certamente la fonte principale di L1 retrotrasposizione, endogena L1 ORF2 giunzione varianti con potenziale rilevanza biologica si trovano espresse in diversi tessuti somatici. Belancio ecc [20] rilevato SpORF2 trascrizione in vari tessuti umani adulti e l'espressione di mRNA SpORF2 esibisce variazione tessuto-specifica. Così, la funzione L1 è improbabile che sia limitato solo ad elementi completamente attivi. La SpORF2 può anche produrre la proteina ORF2 funzionale. La maggior parte dei retrotrasposoni non-LTR sono APE-tipo non-LTR retrotrasposoni [29]. La struttura cristallina analisi dell'essere umano L1-IT indicano che si tratta di un prototipo per AP-come retrotrasposoni codificato endonucleasi, che nick DNA con specificità variabile e sono responsabili di milioni di inserzioni retrotrasposoni in genomi eucarioti [30]. Sia APE1 e L1-EN appartengono alla superfamiglia grande EEP che condivide lo stesso impalcatura proteine ​​e gli stessi residui catalitici.
Considerando il fatto che allineamenti azioni GCRG213p alta sequenza con L1-EN, e possiede residui conservati che sono cruciali per L1 fosfato -IT vincolante, rilegatura in metallo e l'attività catalitica, proponiamo che GCRG213 è un impiombato L1-ORF2. GCRG213p potrebbe essere un elemento funzionale della famiglia L1-IT, una variante di L1-EN.
La sovraespressione di L1 nei tumori è stata ampiamente presentata [12-14]. Il cellulare endogena L1-RT emerge come componente funzionale costitutiva in cellule tumorali caratterizzate da un elevato proliferazione e uno stato di bassa differenziazione [31, 32]. Tuttavia, ci sono alcune indagini dettagliate di L1-IT nel tumore umano. Ergun ecc utilizzato-L1-IT anticorpo anti per rilevare la L1-ORF2 nei tessuti umani adulti, hanno trovato forte espressione ORF2p nelle cellule endoteliali dei vasi sanguigni normali della prostata umano, vescica e tessuto testicolare, ma nessuna espressione ORF2p è stata osservata in le cellule tumorali hanno studiato [33]. Oricchio ecc [34] hanno riportato che stabili RNA interferenza L1 potrebbe ridurre la proliferazione e promuovere la differenziazione nelle cellule di A-375 di melanoma. Hanno anche osservato una riduzione della proteina L1-ORF2. Ma i ricercatori non hanno identificato se gli effetti di proliferazione erano da L1-IT e /o L1-RT. Ad oggi, non vi è alcuna relazione trovata sul ruolo della L1-IT on proliferazione e differenziazione cellulare. In questo studio, abbiamo riconfermato che l'espressione GCRG213p è stata elevata nel carcinoma gastrico a livello proteico, sia nel modello di cellulare e le sezioni di tessuto studiato, che è coerente con i nostri risultati dello studio precedenti a livello di mRNA [22]. L1 subiscono ipometilazione in una varietà di tessuti tumorali, compreso il cancro gastrico [35]. Shigaki ecc [36] utilizzato la tecnologia bisolfito-pirosequenziamento per quantificare lo stato di metilazione L1 in campioni di cancro gastrico sottoposti a resezione. Essi hanno scoperto che i pazienti sono stati sottoposti a L1 ipometilazione sperimentato sopravvivenza complessiva significativamente più breve rispetto a quelli con ipermetilazione. Abbiamo trovato in questo studio che L1 era completamente metilato nei normale linea gastrico delle cellule della mucosa GES-1, ma è stato parzialmente metilato nelle linee di cellule di cancro gastrico. Questi risultati sono correlati con il pattern di espressione GCRG213p in linee cellulari di cancro gastrico, quindi, fornire ulteriori prove circa la natura del peptide GCRG213. Tuttavia, non siamo riusciti a individuare una correlazione tra l'espressione GCRG213p e la sopravvivenza in questo studio. neoplasia intraepiteliale si crede di essere un passo fondamentale di trasformazione maligna di adenocarcinoma gastrico, sovraespressione di GCRG213p in queste ghiandole implicava un ruolo potenziale di GCRG213p nell'oncogenesi gastrica. Il punteggio più alto immunocolorazione di GCRG213p nel carcinoma gastrico ben differenziato ha indicato che potrebbe essere coinvolto nella differenziazione cancro gastrico.
Mentre la gastrite cronica atrofica si crede di essere un'entità legata all'età, metaplasia intestinale è stata considerata la prova di gastrite atrofica, dal momento che ghiandole specializzate erano stati sostituiti da cripte intestinali, in modo metaplasia intestinale è stato considerato come l'età-correlate. Età gioca un fattore importante che disciplina lo sviluppo di metaplasia intestinale gastrica, e soggetti con metaplasia intestinale gastrici erano significativamente più anziani rispetto a quelli senza metaplasia [37]. ghiandole metaplasia intestinale visualizzati vasta immunostaining GCRG213p in questo studio. Nel frattempo, abbiamo osservato che il tasso positivo di GCRG213p nei tessuti di cancro gastrico nel gruppo di età era superiore a quella nel gruppo non-età. Questi potrebbe implicare che GCRG213p è associato con l'invecchiamento mucosa gastrica e le entità legate all'età. Non c'è nessuno studio sull'associazione tra espressione L1 ed età al momento, ma media metilazione L1 non è variata nel tempo [38, 39]. Si ritiene che intaccare di DNA genomico dal L1-IT può indurre tossicità cellulare, che si traduce in arresto del ciclo cellulare, apoptosi o senescenza. L'espressione di esogeno full-length L1 e SpORF2 in fibroblasti umani normali, le cellule tumorali e le cellule staminali adulte hanno portato a danni al DNA rilevabili e portato nel fenotipo simile alla senescenza [20]. Così, abbiamo il sospetto che l'attività accumulata GCRG213p, una variante di L1-EN, può rappresentare una fonte potenziale di trasformazione correlata all'età cellulare, che in ultima analisi contribuisce alla senescenza cellulare, o in senso opposto, ad un out-of-controllata (maligno) Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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